Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kykyä EVO pienentää solujen elinkelpoisuus ja edistää solukierron pysähtymisen ja apoptoosin pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) soluissa. Keuhkosyöpä on korkein ilmaantuvuus ja kuolleisuus kaikista syövistä. Kemoterapia on ensisijainen hoito SCLC; kuitenkin, lääkkeet, joita tällä hetkellä käytetään SCLC ovat vähemmän tehokkaita kuin ne, joita käytetään ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Siksi on tarpeen kehittää uusia lääkkeitä hoitoon SCLC. Tässä tutkimuksessa vaikutuksia evodiaminiyhdisteet (EVO) solun kasvuun, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin tutkittiin ihmisen SCLC solulinjoja NCI-H446 ja NCI-H1688. Tulokset edustavat ensimmäinen raportti, joka EVO voi merkittävästi estää elinkelpoisuutta sekä H446 ja H1688 solujen annoksesta ja ajasta riippuva käytöstapoja. EVO indusoiman solusyklin pysähtymisen G2 /M-vaiheessa, indusoi apoptoosin jopa-ekspressiota sääteleviä kaspaasi-12 ja sytokromi C-proteiini, ja indusoi ilmentymistä Bax mRNA ja alas-säätely ilmentymisen Bcl-2: n mRNA sekä H446 ja H1688-soluissa. Kuitenkin, ei ollut vaikutusta proteiinin ilmentymiseen kaspaasi-8. Yhdessä estovaikutukset EVO kasvuun H446 ja H1688 solut saattavat johtua G2 /M pidätys ja myöhemmät apoptoosin kautta mitokondrioiden riippuvaisia ​​ja Endoplasmakalvosto stressin aiheuttama väyliä (luontainen kaspaasiriippuvaisen reittejä), mutta ei läpi kuoleman reseptori aiheuttama reitin (ulkoisten kaspaasiriippuvaisen reitti). Tulosten perusteella näyttää, että EVO on lupaava uusi ja voimakas kasvainten vastainen lääke ehdokas SCLC. Lisäksi solusyklin, mitokondriot ja ER stressi reitit ovat järkevä tulevaisuuden tavoitteiden kehittämistä EVO jakelujärjestelmän hoitoon SCLC.

Citation: Fang C, Zhang J, Qi D, Tuuletin X, Luo J, Liu L, et ai. (2014) evodiaminiyhdisteet indusoi G2 /M pysähtymiseen ja apoptoosiin kautta Mitokondrioiden ja Endoplasmakalvosto Pathways in H446 ja H1688 ihmisen pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 9 (12): e115204. doi: 10,1371 /journal.pone.0115204

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. 2014; Hyväksytty: 19 marraskuu 2014; Julkaistu 15 joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Fang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksen CSTC2012JJB10027 Chongqing Science and Technology komitea, Chongqing, Kiina. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä, jonka osuus 12,5% kaikista vuosittain vasta diagnosoitu syöpä tapauksissa maailmanlaajuisesti. Sen lisäksi hyvin yleisiä, keuhkosyöpä on korkein kuolleisuus kaikkien syöpätyyppien [1]. Keuhkosyöpä voidaan luokitella pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka perustuu histopatologisia piirteitä taudin. Noin 10%: sta 15% kaikista keuhkosyövässä ovat SCLC [2]. Kliinisesti SCLC eroaa NSCLC nopea kasvaimen kasvua ja laajaa etäpesäkkeiden. Suuntaviivojen mukaan American Cancer Society [2], kemoterapia tärkein hoito SCLC, ja sisplatiini, etoposidi, karboplatiini ja irinotekaani ovat yleisimmin käytetty huumeita. Kuitenkin nämä lääkkeet ovat vain vähän tehoa ja aiheuttaa vakavia sivuvaikutuksia, [3]. Itse asiassa, viiden vuoden eloonjäämisaste SCLC on melko alhainen (3~8%) verrattuna viiden vuoden pysyvyys kaikenlaista keuhkosyöpä ( 15%) [4]. Uusia ja tehokkaita syöpälääkkeiden, joilla on vähemmän ja lievempiä sivuvaikutuksia tarvitaan kiireellisesti parantaa kliinisiä tuloksia.

evodiaminiyhdisteet (EVO), joka on merkittävä quinazolinecarboline alkaloidi

Evodia rutaecarpa

, on sytotoksisia vaikutuksia erilaisia ​​ihmisen syöpäsoluja, kuten glioblastoma-soluissa [5], mahasyöpä soluihin [6], rintasyövän solut [7], virtsarakon syöpä solut [8] ja keuhkosyövän soluja. Erityisesti EVO esillä sytotoksisia vaikutuksia eri NSCLC solulinjoissa, mukaan lukien A549 keuhkoadenokarsinooma soluihin [9], H1299-solujen [10], CL1 soluihin [11] ja H460 suuri-keuhkosyövän soluja [12], [13]. Toisin sytotoksisia vaikutuksia EVO eri syöpäsoluissa [14], EVO on vain vähäinen vaikutus normaaleihin ihmisen perifeerisen veren soluja tai kehon painon kasvaimen kantavien hiirten sen tehokas annos [15].

Toisaalta, jotkut lääkkeet, joilla on sytotoksisia vaikutuksia NSCLC on myös selvää vaikutusta SCLC, kuten wentilactone A, joka on sytotoksinen sekä H460 ja H446 [16], ja glukosamiini, joka on sytotoksinen A549 ja H446-soluja [17 ]. Näin ollen, vaikka ei ole raportin vaikutuksen EVO on SCLC mennessä, EVO voi olla potentiaalinen uusi lääke-ehdokas hoitoon SCLC.

Tässä tutkimuksessa vaikutuksia EVO solujen elinkelpoisuuden solusyklin ja apoptoosin ihmisen SCLC solulinjoja NCI-H446 ja NCI-H1688 tutkittiin, ja taustalla olevien mekanismien tutkittiin edelleen. Tuloksemme osoittivat, että inhiboivia vaikutuksia EVO kasvuun H446 ja H1688-soluja johtuu G2 /M-pysähtymisen ja myöhemmin apoptoosin kautta mitokondrioiden riippuvaisia ​​ja solulimakalvostoon (ER) stressin aiheuttama kaspaasi aktivaatioreaktioteissä (luontainen kaspaasiriippuvaisen reittien ), mutta ei kuoleman kautta reseptorin aiheuttaman kaspaasi aktivaatioreitin (ulkoisten kaspaasiriippuvaisen reitti). Tähän mennessä ei ole lääke on raportoitu indusoivan apoptoosia SCLC-solujen kautta ER stressin kautta. Tuloksemme ovat ensimmäinen raportti että EVO indusoi apoptoosin H446 ja H1688 SCLC solulinjat kautta ER stressin kautta. Lisäksi ei ole edellisen raportin huume, joka samanaikaisesti saa aikaan solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin SCLC soluihin mitokondrioita välittämän ja ER stressiä polkuja. Me raportoimme ensimmäistä kertaa, että EVO indusoi G2 /M pysähtymiseen ja apoptoosiin kautta sekä mitokondrioiden välittämää ja ER stressin pääsyväylistä H446 ja H1688 SCLC solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 yhdiste

evodiaminiyhdisteet (EVO) ostettiin Yuancheng Technology Development Co, Ltd (Wuhan, Kiina), puhtaus 99,13%. EVO liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) valmistamiseksi 40 mM kantaliuosta, joka laimennettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS ) ennen jokaista koetta. Lopullinen DMSO-pitoisuus oli enintään 0,025% tässä tutkimuksessa.

2.2 Cell Culture

Ihmisen NCI-H446 ja NCI-H1688 SCLC solulinjoja ostettiin Kiinan Academy of Medical Sciences (Peking, Kiina) ja Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina), tässä järjestyksessä. H446 ja H1688-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco Co., Grand Island, NY, USA). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

2,3 elinkykyyn määritykset

H446 tai H1688-soluja siirrostettiin tiheydellä 2 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyt (Corning Incorporated, NY, USA). Soluja kasvatettiin 12 tuntia, ja kasvualusta korvattiin RPMI 1640 väliaineessa, joka sisältää erilaisia ​​pitoisuuksia EVO (1,25, 2,5, 5, 10 ja 20 uM). Päättymisen jälkeen määritetyn itämisaika (24 h, 48 h ja 72 h), väliaine vaihdettiin tuoreeseen väliaineeseen, joka sisälsi 20 ui 5 mg /ml metyyli-tiatsolyyli tetratsolium (MTT) liuosta (Sigma). Kun oli inkuboitu 4 tuntia, MTT-liuos poistettiin ja korvattiin 150 ul: aan DMSO: ta, ja mikrolevyjä ravisteltiin 5 min. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä, jossa on Multiskan GO Microplate Spektrofotometri (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Solun elinkelpoisuus laskettiin seuraavasti: Solujen elävyys (%) = OD

testiryhmä /OD

kontrolliryhmän × 100%, jossa OD

testiryhmä oli optinen tiheys (OD) EVO tai DMSO hoitoryhmässä ja OD

kontrolliryhmässä oli optinen tiheys negatiivisen kontrolliryhmän. Hoitamaton H446 tai H1688-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina ryhmä. IC

50-arvo viittaa lääkkeen konsentraatio, joka vaaditaan tappamaan 50% soluista [18]. Solun elinkykyä eri EVO pitoisuudet analysoitiin OriginPro 7 ohjelmisto (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA), ja sitten IC

50-arvot saatiin. Morfologiat H446 soluja inkuboitiin EVO 24 tunnin visualisoitiin alla käänteinen fluoresenssi mikroskooppi (ECLIPSE Ti-S, Nikon Instruments Inc., Tokio, Japani).

2.4 Cell Cycle ja apoptoosi Analyysit

H446 tai H1688-soluja viljeltiin 25 cm

2-pulloihin, ja sitä käsiteltiin 10 uM EVO 24 tuntia. Solut kerättiin trypsinzation ja sentrifugoimalla, ja kiinnitettiin sitten 70% etanolilla 4 ° C: ssa 12 tuntia. Huuhtelun jälkeen kahdesti fosfaattipuskuroidulla liuoksella (PBS), solut suspendoitiin uudelleen DNA-värjäys, joka sisälsi 40 ug /ml propidiumjodidilla (PI) ja 0,1 mg /ml RNase 25 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. Solut analysoitiin FACSVantage virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) on varustettu CellQuest-ohjelmaa [18]. Sitten solusyklin jakautumisen määritettiin ja analysoitiin.

Apoptotic solujen kvantifiointi määritettiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI apoptoosin havaitseminen kit (Beyotime Biotekniikan instituutti, Shanghai, Kiina). Apoptoosin induktion havaittiin H446 tai H1688-soluissa 24 tunnin kuluttua hoidon 10 uM EVO mukaan anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen menetelmällä. H446-solujen havaittiin alle Nikon Eclipse Ti käänteinen fluoresenssi mikroskooppi.

2.5 reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), solunsisäisen vapaan kalsiumin (Ca

2 +), ja mitokondrion kalvon Potential (ψ

m ) B

ROS, Ca

2+ ja ψ

m tasot määritettiin kanssa FACSVantage virtaussytometrillä käyttämällä seuraavia kolmea fluorokromeja: 2 ’, 7’-dichlorofluorescin diasetaatti (DCF-DA) (Beyotime Biotekniikan instituutti, Haimen, Jiangshu, Kiina), Fluo-3 /AM (Beyotime Biotekniikan instituutti, Shanghai, Kiina), ja JC-1 (Beyotime Biotekniikan instituutti, Jiangshu, Kiina), vastaavasti [19]. Lyhyesti, H446 tai H1688-soluja ympättiin tiheydellä 1 x 10

6 solua /kuoppa 6-kuoppaisille levyille (Corning Incorporation, NY, USA) käsiteltiin 10 uM EVO 24 tuntia. Solut kerättiin, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen värjäystä, joka sisälsi 10 uM DCF-DA (5 uM Fluo-3 /AM tai 5 ug /ml JC-1) 37 ° C: ssa 30 min (45 min tai 20 min) ja sitten analysoitiin käyttämällä FACSVantage virtaussytometria.

2,6 Caspase-3, -8, ja -9 Activity Assay

kaspaasi-3, -8 ja -9 aktiivisuus mitattiin käyttämällä aktiivisuusanalyysiä sarjat (Beyotime Biotekniikan instituutti, Haimen, Jiangsu, Kiina). Lyhyesti, H446 tai H1688 solut otettiin talteen sen jälkeen, kun hoidetaan 10pM EVO 24 h (48 h tai 72 h). Sitten solut pestiin kylmässä PBS: ssä, suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (100 ui per 2 x 10

6 solua), jätettiin jäille 15 minuutin ajan ja sitten sentrifugoitiin 18000 x

g

at 4 ° C: ssa 10 min. Kokeet suoritettiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä inkuboimalla seosta, joka koostuu 10 ui solu- lysaattia, 80 ui reaktiopuskuria ja 10 ui kaspaasi-3 (-8 tai -9) substraattia (Ac-DEVD-pNA) 37 ° C: ssa 4 tuntia. Kaspaasi-3 (-8 tai -9) aktiivisuus näytteissä kvantitoitiin käyttäen Multiskan GO mikrolevyspektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) absorbanssilla 405 nm.

2.7 Western Blot-analyysi

sytokromi C (Cyt C), kaspaasi-12, -8, -9 ja -3, tekijä liittyy itsemurha (Fas) ja tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (Trail) mitattiin proteiini taso Western-blottauksella. H446 soluja käsiteltiin 10 uM EVO 48 tuntia kerättiin ja inkuboitiin radioimmunosaostuskoe (RIPA) lyysipuskuria (Beyotime Biotekniikan instituutti, Haimen, Jiangshu, Kiina) 60 minuutin ajan jäillä. Solulysaatit sentrifugoitiin 13000 g: ssä 15 minuutin ajan, ja proteiini pitoisuudet lysaatit määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä Dye (Bradford) reagenssia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Yhtä suuret määrät proteiineja erotettiin sulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja blotattiin Immobilon-P siirto kalvoja (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA).

Membraanit blokattiin 5% rasvaton maito TBST-puskurissa (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween 20). Cyt C, kaspaasi 12, -8, -9 ja -3, Fas ja Trail havaittiin käyttämällä ensisijaista vasta-aineita (kaniinin anti-Cyt C, kaspaasi 12, -8, -9 ja -3, Fas ja Trail) ja toisen vasta-aineet (vuohen anti-kani-IgG (H + L), piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun). Kaikki vasta-aineet hankittiin Beijing Biosynthesis Biotechnology Co, LTD., Peking, Kiina ja ne laimennettiin 1:200 5% rasvaton maito TBST (Sigma) ennen käyttöä. Lopullinen pitoisuus vasta-aineita oli 20 ug /ml. Vastaavasti, Cyt C ja kaspaasi-12 ja -8 mitattiin H1688: lla käsiteltyjen solujen EVO 48 tuntia Western-blottauksella.

2,8 RT-PCR (RT-PCR) B

Yhteensä RNA vasta eristetystä H446-solut eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). CDNA syntetisoitiin käyttäen käänteistranskriptaasia (Genecopoeia Inc., Rockville, MD, USA). Erityinen geeni-tuote monistettiin PCR: llä Taq-DNA-polymeraasia (Fermentas, Waltham, MA, USA). Alukesarjat PCR olivat seuraavat:

Bax juosteen: 5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3 ’;

Bax antisense-juoste: 5′-CCAGCCTTGAGCACCAGTTT-3′.

Bcl-2 sense-juoste: 5′-ACTTCGCCGAGATGTCCAGC-3 ’;

Bcl-2 antisense-juoste: 5′-GCACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3′;

2,9 tilastollinen analyysi

kukin koe tässä tutkimuksessa toistettiin 3 kertaa. Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ± keskihajonta (SD), ellei toisin mainita. Analyysit suoritettiin käyttäen Statistical Package for Social Sciences (versio 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Studentin t-testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi on eroja koeryhmien. Tilastollinen merkitsevyys perustettiin

P

0,05.

Tulokset

3.1 estovaikutus evodiaminiyhdisteet annetun Cell Growth

inhiboivat vaikutukset EVO on ihmisen SCLC H446 ja H1688 solujen kasvaimet arvioitiin käyttäen MTT sytotoksisuusmäärityksiä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, EVO esti ihmisen SCLC H446 kasvua annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Elinkelpoisuus määrä H446 soluja käsiteltiin 10 uM EVO 24 h (~66%) laski -16% verrattuna, että solut, joita käsiteltiin 1,25 uM EVO (~82%). Elinkelpoisuus määrä H446 soluja käsiteltiin 10 uM EVO 72 tuntia (~35%) laski ~22% verrattuna, että solut, joita käsiteltiin 1,25 uM EVO (~57%). IC

50-arvot EVO-käsiteltyjen H446-soluja 24 h, 48 h ja 72 h olivat 20 uM, 18,07 uM ja 1,80 uM vastaavasti.

solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä . Solut valokuvattiin käyttäen mikroskooppia. Kukin koe toistettiin 3 kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 3). *

P

0,05 osoittivat merkitsevää eroa kahden ryhmän. Hoitamaton H446 tai H1688-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina ryhmä. 0 uM EVO ryhmä sisälsi 0,025% DMSO. 0,025% DMSO käytettiin valmistettaessa 20 uM EVO (suurin pitoisuus EVO ratkaisu tutkimuksessa). *

P

0,05 verrattuna vastaaviin EVO käsitellyssä ryhmässä 24 tuntia.

#

P

0,05 verrattuna vastaaviin EVO käsitellystä ryhmästä 48 h.

EVO esti ihmisen SCLC H1688 solujen kasvua hieman eri tavalla (Fig. 1 B ): (1) EVO esti ihmisen SCLC H1688 solun kasvun annoksesta riippuvalla tavalla 72 h. Elinkelpoisuus hinnat H1688-solujen käsiteltiin 10 uM EVO (~49% 24 h, ~ 33% 48 h ja -30% 72 h, vastaavasti) laski ~19%, 19% ja 21% verrattuna käsitellyn 1,25 uM EVO (~68% 24 h, ~52% 48 h ja ~51% 72 h, vastaavasti). (2) EVO esti H1688 kasvu ajasta riippuvalla tavalla, konsentraatioilla alueella 1,25 uM 10 uM 48 tuntia ja jonka pitoisuus on 20 uM 72 tuntia. (3) inhibiitionopeudet hoidon jälkeen 48 h olivat lähes samat kuin 72 tunnin kuluttua hoidon EVO konsentraatioilla alueella 1,25 uM 10 uM. (4) IC

50-arvot EVO H1688-soluissa laski 8,14 uM (24 h) 2,08 uM (48 h) tai 1,37 uM (72 h).

käsittelyn jälkeen 10 uM EVO, elinkelpoisuus hinnat H446 tai H1688-soluja ~66% tai ~49% (24 h), ~56% tai ~ 33% (48 h), ja 35%: n tai -30% (72 h), vastaavasti . Koska ilmeinen estävä vaikutus 10 uM EVO on H446 tai H1688-soluja, väli- annos EVO (eli 10 uM) valittiin voidaan käyttää kaikissa seuraavista kokeista, ellei toisin mainita.

Fig. 1C osoitti, että morfologiat H446: lla käsiteltyjen solujen eri pitoisuuksia EVO 24 h olivat olennaisesti muuteta. Kun EVO pitoisuus kasvoi, enemmän H446 soluja tuli pyöreä ja irrotettiin viljelylevyssä niiden valejalka vähitellen vedettynä. EVO inhiboi H446 solun kasvun annoksesta riippuvalla tavalla, paitsi, että H446: lla käsiteltyjen solujen EVO 5 uM, 10 uM tai 20 uM 24 h oli samanlaisia ​​sytotoksisuuden vaikutuksia.

Yhdessä nämä luonnollisia kasviperäisiä osatekijän EVO estivät merkittävästi elinkykyä H446 ja H1688 SCLC solujen annoksesta ja ajasta riippuvia käytöstapoja.

3.2 vaikutukset evodiaminiyhdisteet solusyklin ja apoptoosi

tutkia häiriöiden solusyklin oli vastuussa EVO välittämiä solun kasvun estäminen, tutkimme solusyklin jakeluun. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja 2B, EVO selektiivisesti pidätettiin solusyklin G2 /M-vaiheessa (so pre-mitoosi /mitoosi vaihe). Hoidon jälkeen 10 uM EVO 24 tuntia, määrä EVO käsitellyn H446 tai H1688-soluja G2 /M (~63%: n tai -50%) oli noin 5-kertaisesti tai 2,5-kertainen verrattuna käsittelemättömien solujen (sokeakoe , ~13% tai 20%). Samaan aikaan, numerot (~31%: n tai ~29%) EVO-käsiteltyjen H446 tai H1688-soluja S-vaiheessa (synteesin, jonka aikana kromosomit replikoituvat) olivat lähes samat kuin käsittelemättömistä soluista (-30%: n tai ~29%).

Cell cycle havaittiin PI-määrityksellä. Apoptoosi havaita käyttäen anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäys määrityksessä. H446 solut värjättiin anneksiini V /PI havaittu alle käännetyn fluoresenssimikroskoopilla. Kukin koe toistettiin 3 kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 3). *

P

0,05 verrattuna vastaaviin kontrolliryhmään. Hoitamaton H446 tai H1688-soluja käytettiin negatiivisena kontrolli- ryhmä.

Apoptoosi on myös nimitystä solujen itsemurhan tai ohjelmoidun solukuoleman. Sen määrittämiseksi, ovatko EVO indusoi apoptoosin SCLC H446 ja H1688 solujen apoptoosin hinnat havaittiin anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäystä. Hoidon jälkeen EVO 24 tuntia, kuten kuviossa. 2C ja 2D, apoptoosin määrä EVO-käsiteltyjen H446 (-15%) tai H1688 (~11%) soluja, oli paljon suurempi kuin käsittelemättömien solujen (sokeakoe, -5% tai ~ 4%); kuten on esitetty kuviossa. 2E, tyypillisiä piirteitä apoptoosin, kuten kromatiinin tiivistymistä ja syrjäytyminen, ydin- segmentointi ja apoptoottisten ruumiin muodostumista, havaittiin EVO-käsiteltyjen H446-soluissa. Lyhyesti, EVO merkittävästi indusoi apoptoosia sekä H446 ja H1688-soluissa. On huomattava, että alustavissa kokeissa arvioimme apoptoottisen vaikutusten pienempiä annoksia EVO (kuten 1,25 uM ja 2,5 uM). Apoptoosin hinnat SCLC H446: lla käsiteltyjen solujen 1,25 uM EVO tai 2,5 uM EVO olivat lähes samat kuin vastaavien tyhjä kontrolleihin (tuloksia ei ole esitetty).

3,3 vaikutukset evodiaminiyhdisteet on ROS, Ca

2+ ja ψ

m Levels

ROS, Ca

2+ ja ψ

m tasot olivat kriittisiä tekijöitä mahdollista aktivointia apoptoosin polkuja. Useimmat ROS ovat vapaita radikaaleja, jotka aiheuttavat DNA: ta, proteiinia ja biomembrane vahinkoa [18]. Solunsisäisen kalsiumin on tärkeä solunsisäinen signalointi tekijä. Ψ

m on keskeinen osoitus solun terveydelle, koska se liittyy ATP tuotantokapasiteetin soluja. Tässä tutkimuksessa ROS, Ca

2+ ja ψ

m mitattiin loiste koettimilla käyttäen FACSVantage virtaussytometriä [18]. Hoidon jälkeen EVO 24 tuntia, verrattuna kontrolliryhmiin, (1) ROS tasoilla EVO-käsiteltyjen SCLC H446-solujen määrä nousi yli neljänneksen (noin 28%) ja H1688 soluissa, ROS tasoilla yli kaksinkertaistui (~104%) (Fig. 3A ja 3B); (2) solunsisäistä Ca

2+ tasoilla sekä H446 ja H1688-solut kasvoivat puoli (~51%: n tai ~48%) (Fig. 3C ja 3D); (3) ψ

m pienenivät lähes kolmanneksen (~32%) ja yksi seitsemäsosa (~ 14%) on H446 ja H1688 soluja, tässä järjestyksessä (Kuva. 3E ja 3F). Tulokset viittaavat siihen, että EVO lisäsi ROS tasoilla SCLC soluissa. Ylimääräinen ROS ei ainoastaan ​​vaurioitunut DNA, mutta se myös vaurioitua mitokondrion kalvon ja lisääntynyt mitokondrion kalvon läpäisevyyttä. Enemmän kalsiumia vapautui mitokondrioita ja tuli sytoplasmaan. Solunsisäisen kalsiumpitoisuuden nousu, ja mitokondrion kalvon potentiaali osittain depolarisoituneiden. EVO indusoi apoptoosia sekä SCLC H446 ja H1688 solujen kautta ROS-välitteisen mitokondrioiden reitin.

ROS, Ca

2+ ja ψ

m ovat erikseen havaita DCF-DA, Fluo-3 /AM ja JC-1 määrityksissä. Kukin koe toistettiin 3 kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 3). Hoitamaton H446 tai H1688-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina ryhmä. *

P

0,05 verrattuna vastaaviin kontrolliryhmään.

3.4 Vaikutukset evodiaminiyhdisteet on kaspaasi-8, -9 ja -3 Activity Assay

Kaspaasit ovat proteolyyttisiä entsyymejä, jotka ovat kriittisiä välittäjiä apoptoosin. Toiminta kaspaasin 8, -9 ja -3 määritettiin spektrofotometrisesti. Verrattuna vastaavaan kontrolliryhmiin, merkittävä nousu toimintaan kaspaasi-8, -9 ja -3 havaittiin H446: lla käsiteltyjen solujen 10 uM EVO 24 h, 48 h ja 72 h, lukuun ottamatta kasvu kaspaasi -8 aktiivisuus EVO-käsitellyissä soluissa 24 tunnin kuluttua, mikä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Korkeimman kaspaasi-8 (~213%, Fig. 4A) ja kaspaasi-9 -aktiivisuuden (~240%, Fig. 4B) havaittiin hoidon jälkeen EVO 48 tuntia, kun taas korkein taso kaspaasi-3: n aktiivisuuden ( ~564%) havaittiin 24 h (Fig. 4C). Kuitenkin korkein kaspaasin 8 ja -9 toiminta oli edelleen pienempi kuin kaspaasi-3: n aktiivisuuden (~278%) EVO-käsitellyissä soluissa 48 tuntia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että EVO indusoi apoptoosia kaspaasiriippuvaisen reittejä.

Solulysaatit analysoitiin kolorimetrisellä määrityksellä Ac-DEVD-pNA. Kukin koe toistettiin 3 kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 3). Caspase toiminta annettiin mielivaltaisesti yksikköä (AU) milligrammaa proteiinia. Käsittelemättömiä H446-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina ryhmä. *

P

0,05 verrattuna vastaavaan kontrolliryhmään.

#

P

0,05 verrattuna vastaaviin EVO hoidetussa ryhmässä 24 tuntia.

P

0,05 verrattuna vastaaviin EVO käsitellystä ryhmästä 48 h.

3.5 Vaikutukset evodiaminiyhdisteet on Protein Expression of Cyt C, Caspase-12, – 8, -9 ja -3, Fas ja Trail

Cyt C on mitokondrion proteiini osallistuu aloittamisesta mitokondrioiden-välitteisen apoptoosin. Kaspaasit ovat kysteiini-asparagiinihappo proteaaseja, jotka ovat välttämättömiä apoptoosin. Kaspaasi-12 on lokalisoitu ER ja mukana ER-välitteistä apoptoosia. Kaspaasi-8 välittää signaalitransduktion alavirtaan syöttämällä reseptorien (DR), joka sijaitsee solukalvon ja on siten osallisena DR-välitteistä apoptoosia. Vuorovaikutus DR sen luonnon ligandien (esim FasL ja Trail) indusoi kaspaasi-8. Kaspaasi-9 on asparagiinihappo-proteaasilla. Kaspaasi 3 on henkivartijan kaspaasi vastuussa kromatiinin tiivistyminen ja DNA: n fragmentoituminen apoptoosin. Cyt C ja kaspaasi-12 ja -8 laukaista kaspaasi 9 (initiaattori kaspaasi) ja kaspaasi-3 (efektori kaspaasi) ennen kuin ne lopulta aiheuttamaa apoptoosia.

EVO-käsiteltyjen H446 tai H1688 soluja verrattuna niiden vastaavat kontrolliryhmää (taso asetettiin 100% kussakin kontrollit), (1) proteiinin ekspressiotasot Cyt C kasvatti merkittävästi ~220% ja ~367% (ks. 5A ja 5B), vastaavasti , (2) proteiinin ilmentymistä kaspaasi-12 kasvatti merkittävästi ~248% ja ~190% (ks. 5C ja 5D), vastaavasti, ja (3) proteiinin ilmentymistä kaspaasi-8 oli lähes ennallaan ( ~94% ja ~112%, vastaavasti) (katso kuvio. 5E ja 5F). Lisätutkimukset H446 käsiteltyjen solujen EVO paljasti, että merkittävä nousu tason Cyt C lisännyt kaspaasi-9 ja -3 ilmentyminen ~275% ja 204%, tässä järjestyksessä (ks. 5G ja 5H). Lisäksi FasL ja Trail, jotka ovat kaspaasi-8 aktivaattorit, eivät muutu (~102% ja ~105%, vastaavasti) (katso kuvio. 5I ja 5J). Western blot tulokset viittaavat siihen, EVO lisäsi Cyt C ja kaspaasi 12 tasoa sekä H446 ja H1688 SCLC-solujen, mikä EVO indusoi apoptoosia sekä mitochondria- ja ER-välitteisen reittejä. Lisäksi kohonnut proteiinin ilmentymistä kaspaasin 9 ja -3 osoitti, että EVO aiheuttaman apoptoosin kautta kaspaasi-3-riippuvaisen reitin. Päinvastoin, EVO ei ollut vaikutusta proteiinin ilmentymisen kaspaasin 8 joko H446 tai H1688 SCLC-soluja, mikä viittaa siihen, että se ei indusoi apoptoosia kautta DR-välitteisen reitin.

Solulysaatit analysoitiin Western blot . Kukin koe toistettiin 3 kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 3). Hoitamaton H446 tai H1688-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina ryhmä. *

P

0,05 verrattuna vastaaviin kontrolliryhmään. Fas: tekijä liittyy itsemurha; Trail: tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi; Cyt C: sytokromi C.

3,6 vaikutukset evodiaminiyhdisteet mRNA: n ilmentäminen Bax ja Bcl-2

BAX tunnetaan myös Bcl-2: n kaltaisen proteiinin 4 tai Bcl- 2-liittyvä X; Bcl-2 tarkoittaa B-solulymfooman 2. Bax edistää apoptoosia vastavaikuttamalla Bcl-2, joka on erityisesti pidetään tärkeänä anti-apoptoottisen proteiinin. Samalla, BAX: n ja Bcl-2 ovat erikseen koodaa BAX: n ja Bcl-2-geenien. Tässä ilmauksen tasot Bax ja Bcl-2-geenien määritettiin RT-PCR: llä. Verrattuna niiden vastaavaan valvontaa, (1) mRNA: n ekspression tasojen Bax on H446 tai H1688-soluja käsiteltiin EVO kasvatti merkittävästi ~215% tai ~135% (24 h), ~397% tai ~172% (48 h) ja ~514% tai ~185% (72 h), vastaavasti (Fig. 6A ja 6B). (2) Sen sijaan, mRNA ekspressiotasot Bcl-2 EVO-käsitelty H446 tai H1688-solut vähenivät merkittävästi -10%: n tai ~11% (24 h), -60%: n tai noin 28% (48 h), ja ~66% tai ~53% (72 h), vastaavasti (Fig. 6C ja 6D). Yhdessä EVO lisäsi suhde Bax /Bcl-2: n transkription tasolla, minkä odotetaan edelleen kasvavan suhde Bax /Bcl-2 proteiinitasolla ja lopulta edistää apoptoosia.

Solulysaatit analysoitiin RT-PCR: llä. Kukin koe toistettiin 3 kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 3). Hoitamaton H446 tai H1688-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina ryhmä. *

P

0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

#

P

0,05 verrattuna vastaaviin EVO hoidetussa ryhmässä 24 tuntia.

P

0,05 verrattuna vastaaviin EVO käsitellystä ryhmästä 48 h.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa että EVO estää merkittävästi elinkelpoisuutta SCLC-solujen. IC

50-arvot EVO H446-soluissa laski 20 uM (24 h) 18,07 uM (48 h) tai 1,80 uM (72 h); ja H1688 soluissa, IC

50 laski 8,14 uM (24 h) 2,08 uM (48 h) tai 1,37 uM (72 h). EVO aiheutti estävät vaikutukset H446 ja H1688 solujen pitoisuudesta ja ajasta riippuva käytöstapoja. Se on dokumentoitu, että IC

50-arvot EVO ihmisen NSCLC-soluja 12 uM (48 h, H460-solut) [13], 13,2 uM (72 h, (R) -EVO, H460-solut) [12] , 2,6 uM (72 h, (S) -EVO, H460-solut) [12], ja 100 uM (72 h, A549-solut) [9]. Lyhyesti, EVO näytteillä antituumorivaikutus in SCLC lisäksi NSCLC soluihin. Lisäksi useimmissa tapauksissa, EVO esti kasvua H446 SCLC-solujen tehokkaammin kuin H460- ja A549-NSCLC-soluja.

tutkimus solusyklin jakautumisen osoittivat, että häiriöt solusyklin oli vastuussa evoluution välitteistä solujen kasvun esto. Määrä H446 ja H1688-soluja S-vaiheessa oli lähes ennallaan sen jälkeen, kun EVO hoidon kontrolliin verrattuna. Kuitenkin EVO laukaisi pidätys G2 /M vaiheessa, so EVO saaneista H446 ja H1688 solujen kertynyt G2 /M vaiheessa. Pidätys solujen G2 /M vaiheessa vastauksena genotoksinen stressiin (esim oksidatiivisen stressin ja DNA interkalaatioaineita) saattavat aiheuttaa DNA-vaurioita sekä p53-riippuvaista (via ROS) [20] ja p53-riippumattomalla tavalla [21].

Se on dokumentoitu, että EVO indusoi apoptoosin erilaisissa ihmisen syöpäsoluja kautta eri reittejä. Esimerkiksi NSCLC H1299 soluissa apoptoosia indusoitiin läpi tukahduttaminen tumatekijä (NF) -κB tien aktivaation kautta [10]; ja haiman SW1990-soluissa, apoptoosin aiheutettiin kautta sääntely PI3 K /Akt-reitin [22], vuonna 253J ja T24 virtsarakon syövän solut, apoptoosia indusoitiin läpi mTOR /S6K1 välittämää downregulation Mcl-1 [8]. Apoptoosin induktion EVO H446 tai H1688 SCLC-solujen leimasi anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäys, ja morfologisia muutoksia näkyivät H446-soluissa. Lisäksi tulokset toteamme, että G2 /M vaiheessa solusyklin pysähtymiseen pysähtyi H446 ja H1688 solujen kasvua ja lopulta johti solukuolema kahden luontainen kaspaasiriippuvaisen reittejä, mutta ei läpi ulkoisten kaspaasiriippuvaisen reitin (kuvio . 7):

Apoptoosi indusoitiin läpi mitokondrioiden välittämää n vapautumisen kautta. Tulokset osoittivat, että EVO laukaisi mitokondrioiden apoptoosin mukana kertyminen ROS. Tässä tutkimuksessa, muutos Mitokondrioiden kalvon läpäisevyyden aiheuttamaa ROS johti aktivaatioon solunsisäisen kalsiumin vapautumisen menetys mitokondrion kalvon potentiaalia, ja vastaavasti vapauttaa Cyt C. Koska apoptoosin tekijä, Cyt C edelleen laukaisi aktivointi kaspaasi 9 (initiaattori kaspaasi), jota seuraa kaspaasi-3 (efektori kaspaasi), induktion PARP lohkominen ja lopullinen apoptoosin induktion [23]. Xu et ai.