Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma on ratkaisematon terveysongelma lähes 75% potilaista diagnosoitu edennyt sairaus ja yleinen 5 vuoden pysyvyys lähellä 5%. Huolimatta vahva yhteys kuolleisuuteen ja maligniteetti, taustalla olevia mekanismeja haimasyövän levittämistä ja etäpesäkkeiden huonosti. Vastaavaa patologinen ja soluviljelmässä analysoi ehdottaa kemokiinireseptori CXCR4 näyttelee biologinen rooli haimasyövän etenemiseen.

In vivo

roolit CXCR4 ligandin CXCL12 haimasyövän maligniteetti tutkittiin. CXCR4 ja CXCR7 olivat johdonmukaisesti ilmaistaan ​​normaalissa ja syöpä- haimatiehyen epiteelin, pysyvien solulinjojen, ja potilaasta peräisin ensisijainen syöpäsoluja. Suhteessa terve eksokriinisessä kanaviin, CXCL12 ilmentymistä patologisesti tukahdutettu haimasyövän kudosnäytteet ja potilaan solulinjat. Voit testata toiminnalliset seuraukset CXCL12 hiljentämisen, haimasyövän solulinjoissa vakaasti expressingthe kemokiinin muokattiin. Yhdenmukainen rooli CXCL12 tuumorisuppressorina, jotka tuottavat kemokiinin wereincreasingly kiinnittyvä ja siirtolaisuutta puutteellinen

in vitro

ja huonosti metastasoituneen

in vivo

verrattuna hallita soluihin. Edelleen, CXCL12 uudelleen vähensi merkitsevästi kasvaimen kasvu

in vitro,

merkittävästi pienempiä kasvaimia

in vivo

, mikä lausutaan selviytymisen etu prekliinisessä mallissa. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, toiminnallinen tuumoria tukahduttavan rooli normaalin ilmentymisen CXCL12 haiman kanavat, säätämiseen sekä kasvaimen kasvua andcellulardissemination ja metastaasien.

Citation: Roy I, Zimmerman NP, Mackinnon AC, Tsai S, Evans DB, Dwinell MB (2014) CXCL12 Kemokiini Expression vaimentaa Ihmisen haimasyövän kasvua ja Metastasis. PLoS ONE 9 (3): e90400. doi: 10,1371 /journal.pone.0090400

Toimittaja: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 marraskuu 2013; Hyväksytty: 29 tammikuu 2014; Julkaistu: 04 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Roy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta terveempi Wisconsinin ja MCW Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Meillä on seuraavat edut. Tohtori Dwinell on vastaanottaja patentin (# 8404640) käyttöön CXCL12 on pahanlaatuisten syöpien ja on co-perustaja Protein Foundry, LLC. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille. Otsikko patentti on: ”Method of diagnosointiin ja hoitoon Colon Cancer”.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on anunrelenting muodossa ihmisen syövän, ilman tehokas tekniikka varhaisen diagnoosin tai hoito, ja esiintyvyys lähes yhtä suuri kuolleisuus [1], [2]. Useimmat potilaat, aikaan diagnoosi, on jo paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä, jolloin kirurginen resektio primaarikasvaimen rajallisten terapeuttinen arvo [3] .Current lääke- hoitojen PDAC ovat riittämättömiä, koska valtaosa haimasyövän potilaat kuolevat mikro – tai makro-etäpesäkkeitä [4]. Parannettu ymmärtäminen biologinen mekanismeista aggressiivisuus PDAC tarvitaan. Vaikka viimeaikaiset tutkimukset ovat määritetty molekyylitason tekijöitä etenemistä PDAC [5] – [7], tiedetään vain vähän biologista säätelevän mekanismin solun liikkuvuus ja puolestaan ​​etäpesäkkeitä. Kemotaktinen sytokiinit tai kemokiinit, pelata keyroles solujen maahanmuutto, ja pystyvät koordinoimaan useiden näkökohtien solumigraation koneita. Aktivoimalla niiden reseptorien, chemokinesregulate useita puolia normaalin fysiologian, kuten leukosyyttiliikenteen, epiteelisolujen maahanmuuton tarpeen haavan sulkemiseen, kudoksen verisuonten muodostumista, ja urut kehittäminen alkionkehityksen aikana [8] – [10]. Aiemmin meidän lab revealedthe merkitys kahden ilmentymisen kemokiinin CXCL12 ja sen vastaavan reseptorin CXCR4 suoliston muuttoliike, haavan paranemista, ja angiogeneesi [11] – [16].

Useat tutkimukset ovat sekaantuneet rooli kemokiinin reseptoreihin, erityisesti CXCR4 ja CCR7, syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [9], [17] – [22]. CXCR4 ilme on yhteydessä pahanlaatuisuuden yli 20different syöpien [17], [23]. Olemme aiemmin osoittaneet, että CXCL12 ilmentyy normaaleissa epiteelisoluissa suolistossa ja rintarauhasiin, mutta on epigeneettiseltä hiljennetty ihmisen rinta- ja peräsuolen syöpä [24], [25] .Tämä malli CXCL12 geenin repressionresults kasvainsoluissa jonka kemo- – reseptorin profilesmirror että erittäin liikkuvien leukosyyttien, jotka ilmentävät reseptoreita CXCR4 ja CXCR7 muttei ligandia. Osoitimme, että uudelleen ilmentyminen CXCL12 vähentynyt kyky rinta- ja peräsuolen syövän soluja etäispesäkkeitä [24] – [26] .Several tutkimukset haveextended ne uraauurtava havainnot osoittaa suotuisia vaikutuksia autocrine CXCL12 rintasyövän, keuhkosyövän, mahalaukun sekä pään ja kaulasyöpiä [27] – [30]. Menetys CXCL12expression vuonna osteosarkooman ja rintasyövän potilaiden kasvain specimenswas korreloi huonompi ennuste [31] – [34]. Haimasyövän, ristiriitaisia ​​ja epätäydellisiä raportit viittaavat siihen, että joko CXCL12 ilmentyminen on kohonnut tai CXCL12 ei ilmenny valtaosa potilaista [35], [36]. Niinpä vaikka yhä useammat todisteet osoittavat kasvaimeen tukahduttava rooli CXCL12 ihmisen syövän maligniteetti, sen mekanistinen roolit PDAC yhä puutteellisia.

vallitsevana mallina syövän etäpesäkkeiden on, että pahanlaatuinen kasvain levinnyt kaukaisiin kudoksiin kautta yli-ilmentyminen CXCR4 [22], [37], [38], mikä herkistävät pahanlaatuisten solujen leviäminen vasteena kaukana kaltevuudet CXCL12 tuottaman metastaattinen kohde-elimet. Tämä malli on myös käytetty selittämään PDAC etäpesäke, koska useita raportteja dokumentoida ilmaus CXCR4 haiman sinoomasolulinjoja ja ihmisen kudosta [39] – [42]. Kuitenkin mikään näistä tutkimuksista ovat tiukasti tutkittiin rinnakkain ilmentämisen CXCL12 tai CXCR7 yhteydessä CXCR4 tai määritellyn ilmentymisen tahansa kolmesta komponentista tämän kemokiinin akselin normaalin haiman epithelium.The tavoitteet Tutkimuksemme oli ekspression määrittämiseksi profiilin ja toiminnallista roolia CXCL12-CXCR4-CXCR7 akseli sekä terveillä normaalin ja pahanlaatuisen haima. Tässä meidän tulokset osoittavat, että vaikka reseptorin ilmentyminen lisääntyy, CXCL12 ilmentyminen on merkittävästi vähentynyt resektoidun PDAC kudosten ja akun ofpancreatic syöpäsolun linjat verrattuna normaaliin haimasta. CXCL12 ilmentyminen lyhytaikaisesti palauttaa käyttämällä estäjiä epigeneettiset repression.Stable uudelleen CXCL12 vuonna PDAC soluissa esti suunnattu solujen vaeltamiseen ja maksan etäpesäkkeiden ja hidasti kasvaimen kasvua

in vitro

ja

in vivo

, mikä lisää selviytyminen prekliinisissä malleissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Vapautettu, de-tunnistettu normaali haimoissa PDAC kudosnäytteet, ja ainutlaatuinen potilaasta johdettujen PDAC solut hankittiin Surgical Oncology Biorepository käyttäen Medical College of Wisconsin (MCW) InstitutionalReview hallituksen # 4 hyväksytty protokolla. Kudosten ja solujen sisällä biopankissa saatiin potilailta seuraava allekirjoitettu kirjallinen lupa ja koodataan ja de-tunnistettu, henkilökohtaisia ​​tunnistetietoja ei jaeta tutkimukseen tutkijat. Prekliiniset hiiren ksenografti tutkimukset suoritetaan käyttäen protokollia ja menettelyjä dokumentoitu vakiintunut Animal Käytä Application (AUA076) hyväksymä MCW Institutional Animal Care ja Käyttö komitean ja noudattaen vahvistamien suuntaviivojen toimisto Laboratory Animal Welfare ja ohjeen varten Care ja käyttö on LaboratoryAnimals. Kaikki hiiret sijoitettiin häkkeihin patogeenivapaissa olosuhteissa, saivat ruokaa ja vettä mielin määrin, ja ylläpidetään 10 tuntia: 14 tunnin valo /pimeä sykli on lämpötilaohjattu huoneen (25 ± 2 ° C) .Animals lopetettiin klo loppuun tutkimuksen tai seuraavia merkkejä kärsimystä tai huono kehon kunnossa arvioimana koulutettu laboratorion henkilökunta ja vahvistettu MCW Biomedical Resource Center henkilökunta eläinlääkärit lievittävät kipua ja ahdistusta liittyvät kasvaimen muodostumisen.

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa

Panc1 (CRL-1469), MiaPaCa2 (CRL-1420), Capan2 (HTB-80), ja HPAFII (CRL-1997) solulinjat hankittiin ATCC: ltä. Panc1 ja MiaPaCa2 solulinjoja pidettiin yllä DMEM 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS). Capan2and HPAFII solulinjoja pidettiin yllä 10% (v /v) FBS McCoyn 5Aor MEM, vastaavasti. Joissakin kokeissa soluja kasvatettiin normaalissa väliaineessa hoidettiin päivittäin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa) tai trikostatiini-A (EMD Biosciences). MiaPaCa2 solulinjat transfektoitiin Firefly-lusiferaasia zeosiinivalinnalla. Saatu lusiferaasi-ilmentäviä MiaPaCa2 jälkeen soluja transfektoitiin plasmideilla, jotka koodaavat joko eGFP tai ihmisen CXCL12, ja klooneja kasvatettiin neomysiini selektio-olosuhteissa [26]. Solulinjoja de-tunnistettiin kaikista tunnistusparametreja yksittäisistä suostuu potilaiden haimasyöpä ja vahvistettiin olevan PDAC alkuperää seuraavat DNA karyotyyppi ja proteiinin ilmentymisen analyysi.

Human haiman tissuespecimens

Normal kanavat ja Panin vauriot eristettiin yksinomaan viereiseen normaaliin kudokseen poisheittäminen elinsiirron tai haiman toiminta ei liity PDAC tai muita exocrine syöpäsairauksia. Tautitilanne näiden normaalin ja kasvaimen tissueswas vahvistettu board-sertifioitu pathologist.A yhteensä 25 kudosten 21 eri potilasta käytettiin normaalia analyyseihin. Kaikkiaan 82 kudosten 29 eri potilasta käytettiin kasvaimen analyyseihin. Ja 29 potilasta antamalla PDAC kudosta, 11 potilasta oli saanut neo-adjuvanttihoitona.

RT-PCR

RNA eristettiin soluista ja kudosnäytteiden käyttäen RNAeasy (Qiagen) ja käsiteltiin DNaasia (Ambion), muunnetaan cDNA, ja CXCL12, CXCR4, CXCR7, ja GAPDH transkripti ilmentyminen analysoitiin kuten on määritelty ja aiemmin optimoitu tehokkuuden lineaarisella alueella [24], [43] .A alueen 5′-transloimattoman alueen mannoosi sitova lektiini-geeni monistettiin havaitsemaan genomista DNA: ta epäpuhtaudet [12].

Immunoanalyses

värjäämätön kalvot muodostettiin haimakasvaimesta näytteet ja CXCL12 immunovärjättiin käyttämällä vasta-ainetta R ab72100), ja Ki-67 (ab15580) havaittiin käyttämällä vasta-aineita Abcam.Visualization tehtiin käyttämällä piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja 3,3′-diaminobenzidinePeroxidase Substrate Kit (Vector Labs). Välttämiseksi tausta häiriöiden Levyjä ei vastavärjät-. Proteiinin ekspressiotasoja pisteytettiin tavallisella 4 pisteen asteikolla [0 = poissa, 1 = heikko, 2 = sekoitettu, ja 3 = voimakas värjäytymisintensiteettiä] [44]. Analyysit itsenäisesti päätökseen tutkijan sokaissut tautitilanne ja immunovärjäys protokollaa. Erittyy CXCL12-proteiinin supernatantista haimasyövän soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa havaittiin ourpreviously perustettu sandwich-ELISA-menetelmällä käyttäen vasta-aineita, R Fig. 2A). CXCL12 kemokiini ilmentyminen erityisesti rajoitettu duktaalinen osastoon ja poissa acinar ja endokriiniset solut, jotka molemmat värjättiin kemokiinireseptoreihin CXCR4 ja CXCR7 (tietoja ei ole esitetty). Inkubointi rinnakkaisleikkeitä isotyyppikontrolli vasta confirmedspecificity (Fig. 2A). Olemme ensi tutkinut ilmentymistä premaligneja haiman vaurioita, tunnetaan Haiman intraepiteelisiin kasvaimet (PanINs) [48] – [51]. Kuten on esitetty kuviossa 2C-D, CK19 + PanINsexpressed sekä CXCR4: ää ja CXCR7. Vertailun, CXCL12 värjäys wasmore muuttuja, jossa on sekoitettu tomarkedly vähentynyt ilmentyminen PanINs verrattuna normaaliin haiman kanavat (kuvio 2C-D). Rajoitetussa analyysissä, mitään merkittäviä eroja CXCL12 ilmentymistä voitaisiin havaita välillä PanIN1, PanIN2, ja PanIN3 vaurioita.

Serial osat normaaleissa ja sairaissa haimakudoksessa värjättiin CXCL12, CXCR4, CXCR7, ja CK19. CXCL12 värjäytyminen ilmeinen normaalissa exocrine kanaviin väheni vuonna PDAC kudoksessa. CXCR4 värjäytyminen lisääntyi Panin ja PDAC suhteessa normaaliin duktaalisia epiteelin. CXCR7 ilmentyminen oli vaihteleva normaaliepiteelissä, Panin vaurioita, ja PDAC. (A) Normaali kudos yhdestä potilaan terve haima edustaa havaintoja 25 eri normaaleista kudoksista 21 yksittäisiä potilaita. (B) PDAC kudosta yhdestä potilaasta edustaa havaintoja 82 eri kudoksista 29 eri potilasta. 1000-kertainen suurennus edustaa upotettavat laatikko 200 x. (C) Värjäys kvantitoitiin sokaissut pisteytystä leikesarjojen suhteessa CK19 värjäystä. (***) Tarkoittaa

P

≤0.001.

edustaja 200 × kuvaa samasta (A) normaali tai (B) haiman adenokarsinooma (PDAC) kudoksiin on esitetty 1000 kertainen suurennus kuviossa 1. Edustavia sarja osassa kuvia haiman suoliston kasvain (Panin) leesion (C) 200 x tai (D) 1000 x suurennus. Serial kudosleikkeet immunovärjättiin vasta CK19, CXCL12, CXCR4 ja CXCR7 tai isotyyppikontrolleja. n = 25 erilaista normaaleissa kudoksissa 21 yksittäisten potilaiden, 82 eri kudosten 29 eri PDAC potilasta, tai 19 patologisesti vahvistettu Panin vaurioita.

analyysi PDAC kasvainkudoksen revealeda edelleen, ja selvempi, sukupuuttoon CXCL12 CK-19 + kasvainsoluja (kuvio 1 B, 2B). Heterogeenisissä tuumorikudos sisältää sekä pahanlaatuiset ja normaali rauhaset, CXCL12-värjäys väheni pahanlaatuisten solujen, butpreserved viereisissä normaalin tiehyen soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Analyysi sarja kudoksen sectionsrevealed että pahanlaatuinen kudos heikosti CXCL12had vastavuoroinen kasvu CXCR4 sekä CXCR7, värjäystä (kuvio. 1 B, Fig. 2B). Kvantifiointi CXCL12, CXCR4 ja CXCR7 immunovärjäämällä intensiteetti vahvisti vähentynyt merkittävästi CXCL12 ilmaisun aikana progressionfrom normaalia esiaste Panin pahanlaatuisen haiman kudosta (Fig. 1 C). Sen sijaan, CXCR4 ilmentymistä koholla PanINsand PDAC verrattuna normaaliin kanaviin (1C). Pisteytys CXCR7 ilmaisun paljasti kaksivaiheinen kuvio alemman ilme esiintyvät Panin vaiheessa ja korkeamman ilmaisun toistuu PDAC (1C) .Kun potilaat jaettiin edelleen ryhmiin riippuen ovatko he saaneet neo-adjuvanttihoito potilailla, jotka saavat standardi-of-care hoito gemsitabiinin tai FOLFIRINOX hoito [52] – [54] oli merkittävästi (

P

≤0.05) korkeammat pistemäärät CXCL12 ilmaisun (0,82 ± 0,18) verrattuna potilaisiin, jotka eivät saa neoadjuvant hoitoa (0,43 ± 0,09).

CXCL12 ilmaisun ja epigeneettiset sääntelyn haimasyövän solulinjoissa

edelleen karakterisoimiseksi kemo- – reseptorin ilmentymisen ja tunnistaa sopiva malli tutkittaessa toimintaa CXCL12 vuonna PDAC, ensisijainen potilaaseen johdettu ja vakiintunut haimasyövän solulinjoissa analysoitiin läpi RT-PCR käyttämällä aikaisemmin optimoituja alukesarjoista varten CXCL12, CXCR4, ja CXCR7 [24], [43]. RT-PCR osoitti johdonmukaisesti puute CXCL12 nauhoituksen potilaasta peräisin ensisijainen sekä Panc1, MiaPaCa2, Capan2, ja HPAFII solulinjoja (3A-B). Suostumuksella immunohistokemiallinen analyysit, CXCR4 mRNA säilytettiin 7of 8 PDAC solulinjoissa, kun taas CXCR7 ilme oli vaihteleva (3A-B). Virtaussytometria vahvisti solun pinnalla paikantaminen CXCR4 ja CXCR7 edustavilla solulinjoilla (kuvio 3C). Sen varmistamiseksi, ovatko puute CXCL12 ilmaisun heijastuu epigeneettisiä vaiennettu, soluja käsiteltiin titrattiin annoksilla DNA metyylitransferaasi-inhibiittorin 5-atsa. Inhibiittori pelastettiin CXCL12mRNA ilmentyminen edustaja solulinjoissa (Fig.3D). Hoito histonideasetylaasi estäjä Trichostatin-Aalso palautettu ilmaus CXCL12 vuonna Capan2 soluissa (Kuva. 3E). Pohjautuu Ennakkotutkimukset analysoimaan niitä mekanismeja CXCL12 promoottorin hypermetylaatio peräsuolen ja rintasyöpiä [24], [25], nämä tiedot viittaavat siihen, että CXCL12 ilmentymistä säädellään epigeneettiset mekanismit haimasyövän kuin well.Cumulatively, thesedata osoittavat CXCL12 geeni tukahduttaminen ihmisen tissueand akku uusien ja vakiintuneiden PDAC solu lines.The MiaPaCa2 solulinjaa todettiin ihannemalli, koska sen CXCL12-CXCR4-CXCR7 ekspressiokuviota jäljittelee havaittu pahanlaatuinen ihmisen PDAC kudosta.

RT PCR-analyysi osoitti, että (A) potilaasta peräisin haimasyövän solulinjoissa (# 1, # 2, # 3, # 4) tai (B) vakiintuneet solulinjat puuttui ilmentymisen CXCL12 ja ylläpidetään ilmentymisen CXCR4. CXCR7 mRNA oli läsnä 3 8 PDAC lines.Flow sytometrinen tunnistus (C) pinta-CXCR4 tai CXCR7 proteiinin ilmentymisen. Solulinjoja treatedseven päivää, jonka pitoisuus käyrä (D) 5-atsa-2-deoksisytidiini (5-atsa) palautettu ekspression CXCL12.Linestreated 4 päivää, jonka pitoisuus käyrä (E) Trichostatin-A (TSA) palautettu CXCL12 mRNA: n ekspression in Capan2 soluissa.

CXCL12 uudelleen ilmentymistä ihmisen PDAC soluissa disruptedchemotaxis, lisääntynyt liima potentiaali, ja vähentynyt maksan etäpesäkkeiden

tavanomainen paradigman kemokiinin välittämän etäpesäke syöpäsolujen on tätä ilmaisua CXCR4 on pro-metastasoitunut. Tämä malli perustuu kykyyn eksogeenisten CXCL12 edistää maahanmuuttoa syöpäsolujen

vitro [13], [45], [55]. Kuten odotettua, mittaus natiivi muuttopotentiaalia useiden CXCL12-puutosta haiman solulinjoissa ilmeni, että CXCR4-ilmentäviä PDAC solujen vaeltavat kohti akuutti CXCL12 stimulaatiota (Fig. 4A). Tärkeää on, Panc1 ja MiaPaCa2 solujen siirtyneet tekemään CXCL12 in kaksivaiheisesti-pitoisuuden riippuvaisella tavalla yhdenmukainen nykyisen ymmärrystä kemotaksista muuttoliike [55], [56]. HPAFII solulinjaa, joka puuttui pinta ilmentymistä joko CXCR4 tai CXCR7 voinut siirtyä vastauksena CXCL12 hoitoon (Fig. 4A). Panc1 cellsalso tunkeutuneet soluväliaineen vasteena akuutin eksogeenisen CXCL12 stimulaation (Fig. 4B).

(A) Panc1 ja MiaPaCa2 vaeltaneet solut kohti eksogeenisen kaltevuudet CXCL12, joka on alueella 1 nM 1000 nM alle serum- vapaa olosuhteissa (*), (**), ja (***) tarkoittavat

P

≤0.05,

P

≤0.01, ja

P

≤0.001, vastaavasti , verrattuna stimuloimattomiin soluihin (NS). Receptor-null HPAFII solut eivät muuttaneet vastauksena CXCL12. (B) CXCL12 ohjaa Panc1 solun chemoinvasion osaksi kolmiulotteinen matrigeeliä pistoke. Positiivinen kontrolli (+) oli 10% seerumia sisältävässä väliaineessa. (*), (**), Ja (***) tarkoittavat

P

≤0.05,

P

≤0.01, ja

P

≤0.001, vastaavasti, verrattuna stimuloimaton soluihin (NS).

Uskomme, että pro-metastasoitunut vaste PDAC solujen johtuu vaiennettaisi ilmaus CXCL12. Tämän testaamiseksi otettiin käyttöön otetut ilmentymä kemokiinin käyttäen doublestable plasmidia, integraatiota MiaPaCa2 soluihin. Solut transfektoidaan ensin stabiilisti tulikärpäsen lusiferaasi ja transfektoidaan sitten ylimääräiset geenit käyttäen toista valintaa reagent.Several CXCL12-ilmentäviä klooneja yhdessä ohjaus klooni transfektoitiin eGFP, joilla kummallakin ekvivalenttia tasot lusiferaasiaktiivisuuden (Kuvio 5A-B ). Tärkeää on, ettei kemokiinin tuotanto oli confirmedby ELISA Panc1, MiaPaCa2, Capan2, ja HPAFII solulinjoissa (kuvio. 5C). Toiminnallinen kemokiini tuotanto CXCL12-ilmentävien kloonien verrattuna GFP-proteiinia ekspressoivien kloonien ja MiaPaCa2-soluissa oli validoitu ELISA andtranswell migraatiota U937-soluissa (5C-D) .MiaPaCa2 erittävät solut CXCL12demonstrated vähentää merkittävästi muuttavien vasteena TGF-βor CXCL12 , sekä tunnettuja kuljettajat

in vitro

PDAC solujen vaeltamiseen (6A-D). Kun otetaan huomioon liiman potentiaalia metastaattisen kyvyt syövän solut, solujen adheesio vieressä mitattiin. CXCL12 positiiviset solut olivat merkitsevästi kiinnikkeiset kudosviljelmän plasticcompared on kemokiini null soluihin (kuvio. 6E). Nämä

in vitro

tiedot osoittavat, että yleinen pahanlaatuinen potentiaalia haimasyöpäsoluissa sekä kykyä näiden solujen siirtyä ja kiertää alustaan ​​tarttumista, vähenee seuraavan uudelleenkäyttöönoton CXCL12 litteraattisi PDAC soluihin.

Lusiferaasin tasoa ohjaus GFP tai kolme eri (31, # 2, # 3) CXCL12-ilmentävien MiaPaCa2 kloonien mitattuna spektrofotometrillä (A) tai IVIS-100 biophotonic Imager (B). Tasot CXCL12 mitattiin ELISA (C) perustettiin PDAC solulinjoissa sekä GFP- ja CXCL12-ilmentävien MiaPaCa2-lusiferaasi klooneja. (D) CXCL12-erittämä transfektoitujen MiaPaCa2-lusiferaasi kloonien # 1 ja # 2 stimuloitiin U937 kemotaksista. Solut, jotka käsitelty neutraloivilla vasta CXCL12 (αL12) vahvisti spesifisyys U937 kemotaksista. Arvot A, C, ja D ovat keskiarvo ± SEM, n = 2-3.

(A) TranswellTM muuttoliike määritykset paljastivat vähensi uttamaa CXCL12-ilmentävien kloonien (# 1 ja # 2) verrattuna ligandiin nolla (GFP) soluja. Houkutusaineet olivat seerumittomassa alustassa (-), 10% seerumia (+), tai 10 nM CXCL12 (L12) seerumittomassa media. Merkitään

P

≤0.01 ja

P

≤0.001, vastaavasti, verrattuna 10 nM CXCL12-stimuloitujen GFP-soluja, n = 5. (B) CXCL12 uudelleen ilmentyminen väheni TGF-β (5 ng /ml) indusoimaa kemotaksista suhteessa CXCL12-null-soluissa. (##) Tarkoittaa

P

≤0.01 verrattuna TGF-β-stimuloitujen GFP-soluja, n = 4. (C) (D) Kuvat ovat kokeiden (A) ja (B) vastaavasti. (E) CXCL12-ilmentäviä soluja oli huomattavasti enemmän kiinnittynyt kudosviljelymuoviin verrattuna CXCL12-null-soluissa. Käsittelemättömät solut = (-), neutraloiva vasta-aine CXCL12 aktiivisuus = (αL12), ja positiivinen kontrolli = 1 ng /ml EGF: ää (+). (##) Tarkoittaa

P

≤0.01 verrattuna 10% seerumia-stimuloitujen kontrollisolujen. (*), (**), Ja (***) tarkoittavat

P

≤0.05,

P

≤0.01 ja

P

≤0.001 vastaavasti verrattuna stimuloimattomat GFP-soluja, n = 7.

vieressä pyrittiin määrittämään, onko samanaikaisesti kasvanut liiman ja laski migratoryphenotypes in PDAC solut suppressmetastatic levinnyt

in vivo

usinga heterotooppisen ksenografti hiirimallissa. CXCL12-ilmentävät ja CXCL12-null-solut ruiskutettiin pernaan SCID-hiirillä. Yli 28 päivän

in vivo

seuranta solujen osoitti, että verrattuna ohjaus soluihin, oli merkittävä muutos kyky CXCL12 ilmentävien MiaPaCa2 solujen levittää päässä alkuperäisestä inokulaatiopaikalla (7A -B).

Ex vivo

analyysi osoitti, että luminesenssi paikalla pernan inokulaation pysyi muuttumattomana, kun taas hiiret injektoitiin PDAC jotka tuottavat CXCL12had huomattavasti pienempi maksan tuumorimassa kuin hiirissä, joihin injektoitiin GFP-kontrollisoluja (Fig.7C-E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CXCL12 nimenomaan muuttaa kykyä haimasyöpäsoluissa kotiin maksaan, elin korkea ilmaus CXCL12 ja yhteinen metastasoitunut määränpää PDAC potilaista.

(A) edustaja bioluminenssin kuvia hiirten ksenosiirrettyjä kanssa GFP- tai CXCL12-ilmentävien solujen istutusta (päivä 0) tai tutkimuksen päättyessä (päivä 28). (B) Koko kehon

in vivo

radianssin aikaan GFP- ja CXCL12-hiirillä. (C)

Ex vivo

säteilyn leikattiin perna (C), mikä kasvainsolut injektiokohtaan tai metastaattinen kohde (D), mikä laski maksan etäpesäke CXCL12 ilmentävien solujen suhteen GFP-soluja . (**) Tarkoittaa

P

≤0.01, n = 4-5. (E) edustaja H & E-kuvat osoittavat lausutaan syöpäkasvain maksassa valvonnan (GFP), suhteessa kokeellinen (CXCL12) ksenosiirrettyjä hiirillä.

samanaikainen CXCL12, CXCR4 ja CXCR7 ilmaisun laski kasvainsoluproliferaation ja etäpesäke ja pidentynyt eloonjääminen on prekliinisissä PDAC malli

Aiemmin olimme havaittu, että uudelleen ilmentäminen CXCL12 kolorektaalisyövässä soluissa johtaa lisääntyneeseen anoikis, irtoaminen perustuva apoptoosin [24], [43]. Testasimme onko uudelleen aloittamisen CXCL12 osaksi PDAC soluihin muuttaisivat apoptoottisen tai proliferatiivinen potentiaaleja. Seerumittomassa olosuhteissa, apoptoosin lisääntyminen havaittiin kiinnittynyt CXCL12-ilmentäviä haima- syöpäsoluja verrattuna GFP-proteiinia ekspressoivien valvontaa, vaikka tämä vaste on vaimentaa lisäämällä seerumia (Fig. 8A-B). Käyttäen vakiintunutta malli tutkimalla irtoaminen: n indusoiman apoptoosin, soluja viljeltiin Poly-HEMA [43]. Kuten kiinnittyneet solut, apoptoosi lisääntyi tarttumattomat CXCL12-positiivisten PDAC solujen kontrolleihin verrattuna, mutta jälleen lisäämällä seerumin kanssa ei muuttanut apoptoosin (Fig.8C-D). Solujen määrä pysyi ennallaan välillä tarttumattomat CXCL12-positiiviset ja negatiiviset solupopulaatioiden (kuvio. 8C-D).

Apoptosis GFP ja CXCL12-ilmentäviä MiaPaCa2 solut arvioitiin käyttäen kaspaasi 3/7 Glo assay.Cells nälkiinnytettiin 24 tuntia ja viljeltiin 0% seerumia (A, C) tai 1% seerumia (B, D), joka sisälsi väliaineen. (A-B) Apoptosis in kiinnittynyt CXCL12-ilmentävien solujen kohonnut verrattuna joko GFP-proteiinia ekspressoivien kloonien seerumittomassa olosuhteissa, jossa ei ole muutosta nähdään 1% seerumia. GFP-solujen werestimulated 100 uM gemsitabiinin kontrollina. (C-D) mittaamiseksi solujen määrä ja irtoaminen perustuva apoptoosin soluja suspensiossa, MiaPaCa2-lusiferaasi soluja viljeltiin poly-HEMA. Käyttämällä Viacount reagenssin ja virtaussytometria solujen laskenta, ei ollut eroa elävien solujen lukumäärän havaittiin tarttumattomat CXCL12-null (GFP) tai ekspressoivat solut, kun viljeltiin joko 0% (C) tai 1% seerumia (D). Apoptoosin poly-HEMA viljellyissä soluissa paljasti in lisäys aktiivinen kaspaasi-3/7 rajoitettu viljeltyjen solujen seerumittomissa olosuhteissa vain (C), joilla ei ole havaittu muutosta 1% seerumia (D). Gemsitabiini (GEM) käytettiin kontrollina vähentynyt solujen määrän ja lisääntynyttä apoptoosia. (*), (**), Ja (***) tarkoittavat

P

≤0.05,

P

≤0.01, ja

P

≤0.001 vastaavasti verrattuna ohjata soluja (GFP). Arvot ovat keskiarvo ± SEM, n = 4-5.

Koska vähäinen muutos anoikis-herkkyys CXCL12 ilmentäviä PDAC solujen seerumia sisältävässä olosuhteissa Seuraavaksi testasimme niiden kasvupotentiaalia. Aivan toisin kuin meidän tietoja paksu- tai rintasyövän hoitoon [24] – [26], [43], väestönkasvu CXCL12 ilmentävien PDAC väheni huomattavasti verrattuna kemokiini vajaiden solujen (Kuva9).