Krooninen sairaus

tiivistelmä

Forkhead laatikko M1 (FOXM1) on leviämisen liittyvä transkriptiotekijä välttämätön solusyklin etenemisen. Lukuisat tutkimukset ovat dokumentoitu, että FOXM1 on useita toimintoja kasvainten synnyssä ja sen kohonnut usein liittyy syövän etenemiseen. Täällä me tunnettu rooli ERK /FOXM1 signalointi välittämisessä metastaattisen potentiaalin munasarjasyöpäsoluja. Immunohistokemiallinen (IHC), immunoblottauksen ja semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysit todettiin, että sekä fosfo-ERK ja FOXM1 olivat usein yläreguloituja munasarjasyöpiä. Kiehtovan, yli-ilmennetty fosfo-ERK (

p

0,001) ja FOXM1 (

p

0,001) olivat merkittävästi korreloi korkealaatuista munasarjojen kasvaimista aggressiivinen käyttäytyminen kuten metastasized imusolmuke (5 out of 6). Lisäksi ilmaisuja fosfo-ERK ja FOXM1 oli merkittävästi positiivinen korrelaatio (

p

0,001). Toiminnallisesti ektooppinen ilmentyminen FOXM1B huomattavasti parannettu solumigraatio /invaasio, kun taas FOXM1C paitsi kasvanutta solujen vaan myös edistänyt solumigraation /hyökkäystä. Kääntäen, esto FOXM1 ilmentymisen joko tiostreptonille tai U0126 voisi merkittävästi heikentää FOXM1 välittämän onkogeenisia kapasiteettia. Kuitenkin alas-säätely FOXM1 joko tiostreptonille tai U0126 vaaditaan läsnäoloa p53 munasarjasyöpäsoluja. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen FOXM1 saattavat aiheutua konstitutiivisesti aktiivista ERK joka sisältä metastaattinen valmiudet munasarjasyöpäsoluja. Arvonalentuminen metastaattisen potentiaalin syöpäsolujen FOXM1 inhibiittorit korostaa sen terapeuttista arvoa Pitkälle edennyttä munasarjasyöpää kasvaimia.

Citation: Lok GTM, Chan DW, Liu VWS, Hui WWY, Leung THY, Yao KM, et al. (2011) Poikkeava aktivointi ERK /FOXM1 Signaling Cascade Laukaisee Cell Migration /Invasion munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 6 (8): e23790. doi: 10,1371 /journal.pone.0023790

Editor: Maria G. Castro, University of Michigan, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2010 Hyväksytty: 26 heinäkuu 2011; Julkaistu: 17 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Lok et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Wong Cheuk Hän hyväntekeväisyysyhdistykseksi. Tämä tuki on yksityisistä lahjoituksista, eikä rahoittaja verkkosivuilla on saatavilla. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yksi kaikkein vaarallisin gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti. Koska epäspesifisiä oireita, useimmat munasarjojen syöpätapauksista esittelyyn pitkälle sairaus ja yhdistää korkea kuolleisuus [1]. Kehittyneiden munasarjasyöpä, kasvaimen solut ovat erittäin invasiivinen, ja sen jälkeen syövän etäpesäkkeiden johtaa kuolemaan [2]. Sekä solumigraation ja invaasion edistää metastaattista kykyä kasvaimen soluihin ja geneettisen mekanismin, joka säätelee etäpesäke vielä tunneta laajalti. Siksi on ensiarvoisen tärkeää tunnistaa molekyylitasolla välittäjäaineita joka antaa metastaattista potentiaalia munasarjasyöpäsoluja jotka voidaan käyttää kasvainmarkkereiden ennustaa munasarjasyövän riskiä etenemisen.

Forkhead Box M1 (FOXM1) on tyypillinen transkription tekijä, joka kuuluu Forkhead Box perhe [3]. FOXM1 on tunnettu sen keskeinen rooli solusyklin etenemisen säätelemällä G1 /S ja G2 /M vaiheissa solusyklin siirtyminen ja varmistaa asianmukaisen toteuttamisen mitoosissa [3], [4], [5]. Kuitenkin yhä enemmän todisteita tukee yhteyden poikkeavasta ilmaus FOXM1 ja ihmisen karsinoomien kuten haimasyöpä, tyvisolusyöpien, glioblastoomat ja kohdunkaulan syövän [6], [7], [8], [9]. Vielä tärkeämpää on, lisääntyneen ekspression FOXM1 on merkittävä korrelaatio asteittain lukuisten ihmisen syöpien [6], [9], [10], [11], [12]. Näin ollen FOXM1 paitsi edistää kasvainten synnyssä by kartuttaa proliferatiivista kapasiteettia ja johtaa hallitsemattomaan solunjakautumisen varhaisessa ajan syövän kehitystä, mutta myös parantaa muita tuumorigeenisia käyttäytymistä muissa vaiheissa syövän kehittymisen [12], [13], [14]. Tähän mennessä useita rivejä todisteita ovat osoittaneet, että FOXM1 voisivat tehostaa angiogeneesiä glioomasoluihin [15], ankkurointi riippumattoman kasvun kyky kohdunkaulan syöpäsolut [6], kasvaimen kasvua kyky glioomasoluihin [7] ja etäpesäkkeiden maksasolukarsinoomat solujen nude-hiirissä [16], joka merkitsee moninaiset roolit FOXM1 kasvainten synnyssä. Äskettäin Cancer Genome Atlas Research Network on käyttänyt probabilistic graafinen malli (paradigma) todistaa, että FOXM1 signalointi kriittisesti liittyy vakavien munasarjasyöpä patofysiologiassa [17]. Ilmaisulla asema ja toiminnalliset roolit FOXM1 munasarjasyövän, varsinkin solumigraatio /invaasio ovat pitkälti spekulatiivisia. Tämä korostaa pikaisesti rajata molekyylimekanismin taustalla syövän etenemisessä siten lisäämään eloonjäämisaste munasarjasyöpäpotilaalle.

konstitutiivisen aktivaation ERK signalointi yleensä liittyy neoplastisten transformaatio kuten kontrolloimaton solukasvu stimuloimalla solujen elossapysymisreitin ja lisäämällä solun liikkuvuus [18], [19], [20], [21]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että ERK toimii ylävirtaan FOXM1 ja fosforylaation FOXM1 mukaan ERK tarvitaan tumaan translokaatio ja myöhemmät transaktivaation [22]. Lisäksi, FOXM1: n on osoitettu olevan yksi ERK efektorien ihmisen maksasyövän ja rintasyövän [23], [24]. Kuitenkin toiminta ERK /FOXM1 signalointiryöpyn säätelyssä solujen vaeltamiseen /invasions ei ole vielä selvästi selvitetty.

Tässä tutkimuksessa olemme ensinnäkin analysoineet ilmentymistilanne ja kliinis korrelaatio FOXM1 munasarjasyövän. Useita tuumorigeenistä testit suoritettiin munasarjasyöpäsolu malleja käyttämällä vahvistus- ja keskeytys- toiminto FOXM1 kautta täytäntöön ilmaus FOXM1 tai estämällä endogeenisen FOXM1 mukaan tiostreptonille tai U0126. Olemme myös antoi tiedot, jotka osoittavat p53: käytön FOXM1 estäjiä. Lisäksi olemme mikäli ensimmäinen

in vitro

näyttöä ERK /FOXM1 signalointiryöpyn edistämisessä solumigraatio /invaasion munasarjasyöpäsoluja. Tämä antaa rohkaiseva tavoite torjunnassa kehittyneen munasarjasyövän.

Tulokset

FOXM1 on yli-ilmentynyt ja korreloi Perk ilme ja korkea-asteen alatyypin munasarjasyövän

Tutkia merkityksen FOXM1 ilmentymisen munasarjasyövän kehittämiseen, IHC analyysi kaupallisin kudokseen joukko 97 munasarjojen kudosnäytteiden, mukaan lukien 2 normaali, 2 hyvänlaatuinen, 1 rajatapaus cystademoma ja 96 pahanlaatuinen kasvain näytteissä suoritettiin. Korkea FOXM1 ilmentyminen korreloi merkitsevästi korkealaatuista kasvaimet (aste 3) (

P

0,001), jossa 73.33% Asteen 3 kasvainten tapauksissa näytteillä yli-ilmentyminen FOXM1 taas 68% asteet 1 ja 2 kasvaimia tapaukset osoittivat alhainen ilmentyminen FOXM1 (taulukko 1). Mitä tulee kasvain alatyypin ilmentyminen FOXM1 korreloi voimakkaasti endometriod adenokarsinooma (

P

0,05), jossa 74,07% tapauksista osoitettu yli-ilmentyminen FOXM1 (taulukko 1). Lisäksi 5 tapauksessa 6 kanssa imusolmuke etäpesäke osoitti yli-ilmentyminen FOXM1 (tuloksia ei esitetty). Huolimatta rajallinen otoskoko, se voisi olla viittaus yhdistyksen välillä FOXM1 ja etäinen etäpesäke. Lisäksi merkittävä korrelaatio havaittiin välillä säätely ylöspäin Sekä FOXM1 ja Perk (

P

0,001) (taulukko 1). Samanlainen FOXM1, merkittävä korrelaatio havaittiin välillä ilmaus Perk ja korkea-asteen kasvaimet (

P

0,001), jossa 66,67% Asteen 3 kasvaimia osoitti korkean ilmentymisen Perk (taulukko 2). Lihavien heikko vahva värjäytyminen Perk ja FOXM1 havaittiin myös koholla cystademoma palkkaluokkaan 3 kasvain, syyllistämättä tärkeyttä kahden proteiinin kasvainprogression munasarjasyövän (Fig. 1A).

(A) edustaja IHC osoitti immuunivaikutukset FOXM1 ja Perk rajatapauksissa, Grade 1, Grade 2 ja 3. asteen kasvain on munasarjasyöpä kudoksen array (OVC1021) (x20). Lisääntyvä värjäys molempien FOXM1 ja Perk havaittiin yhdessä etenemistä syöpä syytöksiä niiden mahdolliset roolit kasvainten synnyssä. (B) VVestern-blottaus osoitti ilmauksia Perk, ERK ja FOXM1 letkuihin ja munasarjasyövän solulinjoissa. (C) Reaaliaikainen QPCR analyysi paljasti ilmentymiä FOXM1 isomuotojen;

FOXM1B

ja

FOXM1C

letkuissa ja munasarjasyövän solulinjoissa.

FOXM1A

oli laiminlyöty tässä kokeessa, koska se oli ilmoitettu olevan kopiointia aktiivinen.

solulinjojen tutkimuksessa ilmauksia Perk ja FOXM1 myös osoittanut hyvä korrelaatio paneelissa munasarjasyöpään ja letkujen solulinjoissa. Molemmat proteiinit olivat erittäin ilmaistaan ​​syöpä solulinjoissa, erityisesti OVCAR3, SKOV3, OVCA429 ja A2780cp, vaikka ne osoittivat alhaisempia ilmaisuja LETKU solulinjoissa (Fig. 1 B). Samoin reaaliaikainen QPCR analyysi käyttämällä spesifisiä alukkeita mukaan edellisen raportin [12] osoitti, että molemmat

FOXM1B

(27-250-kertaisesti) ja

FOXM1C

(25-172-kertainen) kasvoi -regulated munasarjasyövän solulinjoissa verrattuna LETKU solulinjoilla (1C). Tämä tulos oli yhdenmukainen sen havaintojen western blot-analyysi ja osoitti myös, että ei ollut eroa ilmaisun kuvioita kahden isomuotojen munasarjasyöpäsoluja. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että sekä ERK toimintaa ja FOXM1 ilmaisu ovat säädelty ja korreloivat positiivisesti munasarjan syövät, etenkin aggressiivisia korkealaatuista kasvaimet, joka implicates jakaminen yhteisen väylän munasarjasyövän etenemiseen.

FOXM1 edistää solujen lisääntymistä ja solumigraatio /invaasio

Koska korkealaatuisesta kasvaimet olivat erittäin proliferatiivisia ja metastaattinen, päättelimme, että FOXM1 soittaa tietty rooli säätelyssä solun liikkuvuus ja invaasiota. Koetin kasvaimia synnyttävän roolit FOXM1 munasarjasyövän, arvioimme toiminnalliset vaikutukset kaksi aktiivista FOXM1 isoformia, FOXM1B ja FOXM1C puolesta A2780cp ja OVCA433 soluja (Fig. 2A). Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [14], [25], FOXM1C voisi lisätä solujen lisääntymistä kapasiteetti A2780cp (

P

0,005) ja OVCA433 (

P

= 0,006) munasarjasyöpäsoluja, vaikka FOXM1B vain aavistuksen verran kasvattanut (Fig. 2A). Toisaalta, ektooppinen ilmentyminen FOXM1B ja FOXM1C voisi edistää nopeampaa haavan sisään A2780cp ja OVCA433 munasarjasyövän solujen haavan paranemista määrityksellä (Fig. 2B). By siirtokuoppaan muuttoliike /invaasio määrityksiä, käyttöönottoa FOXM1B ja FOXM1C osoitti myös merkittävästi lisätä solujen vaeltamiseen (

P

0,05 vuonna A2780cp ja

P

0,005 OVCA433) (Fig. 2C ) ja solujen invaasiota (

P

0,05 vuonna A2780cp ja

P

0,01 OVCA433) (Fig. 2D) kykyjä A2780cp ja OVCA433 soluja verrattuna vektorin valvontaa. Mielenkiintoista, FOXM1B oli suhteellisesti suurempi vaikutus edistämisessä solumigraatioon ja invaasiota verrattuna FOXM1C. Yhdessä nämä tiedot annetaan joka FOXM1 isoformit voivat differentiaalisesti edistävät solujen lisääntymisen, migraation /invaasion munasarjasyöpäsoluja.

(A) XTT soluproleferaatiomäärityksessä osoittaneet FOXM1C voisi merkittävästi lisätä solujen lisääntymistä in A2780cp (*

P

0,005) ja OVCA433 (**

P

= 0,006) munasarjasyöpäsoluja, kun taas FOXM1B vain oli hieman vaikuttaa. Western blotting osoitti ilmentymiä FOXM1B (1B) ja FOXM1C (1C) in A2780cp ja OVCA433 solut käyttämällä anti-FOXM1 (K19). Tyhjän vektorin käytettiin negatiivisena kontrollina (V). (B) Haavan paranemista testi osoitti nopeammin haavan nopeudella FOXM1B tai FOXM1C kohdunulkoisen ilmentävät A2780cp (*

P

0,05) ja OVCA433 (**

P

0,01) soluja verrattuna vektorisäätö (*

P

0,05). (C) TranswellTM migraatiokokeessa ja pylväsdiagrammi osoittivat korkeampia vaeltavia korko FOXM1B ja FOXM1C kohdunulkoinen ilmentävien solujen A2780cp (*

P

0,05) ja OVCA433 (*

P

0,005 ) verrattuna niiden vektorin valvonta (V). (D) TranswellTM solujen invaasiomääritys ja pylväsdiagrammi osoittivat korkeampia hyökkäyksen n läpi Matrigel-pinnoitettu kalvo FOXM1B ja FOXM1C kohdunulkoinen ilmentävien solujen A2780cp (*

P

0,05) ja OVCA433 (*

P

0,01) verrattuna niiden vektorin valvonta (V). Edellä mainitut kokeet suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti ja tulos esitettiin graafisesti.

tehokas inhibitio FOXM1 ekspression tiostreptonia edellyttää p53

tiatsoli antibiootti tiostreptonia voi spesifisesti estää ilmentymisen FOXM1 geeni- promoottori taso rintasyövän solulinjoissa [26], ja siksi sitä käytettiin heikentävistä ilmentymistä FOXM1 vuonna munasarjasyöpäsoluja. Kun tiostreptonille hoito, havaitsimme erilaisia ​​vasteita FOXM1 munasarjasyövän solulinjoissa kuljettaa eri p53 genotyypin statukset: OVCA433 (p53 villityypin), A2780cp (p53 mutantti) ja SKOV3 (p53 poistetaan). OVCA433 ja A2780cp solut osoittivat voimakas lasku FOXM1 ilmentymistä aika- ja annos- riippuvaisella tavalla, sekä lisääntynyt p53 suurempi annos (20 uM) tiostreptonia (Fig. 3A). Toisaalta, SKOV3 oli resistentti tiostreptonia ja FOXM1-ilmentyminen kesti 10, 30 ja 50 uM. Nämä havainnot viittaavat siihen, että p53 voisi olla mukana tiostreptonille toimiva mekanismi. Ottaen huomioon juuri päinvastaisia ​​rooleja p53 ja FOXM1 solusyklin sääntelyn ja kielteisiä vaikutuksia p53 FOXM1 ilmaisun esitetty edellisessä mikro-array tulos [5], [27], [28], [29], [30], me arvioinut ilmaus FOXM1 muuttaessaan p53 ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja. Ohimenevä transfektio p53 vähensi huomattavasti FOXM1 paitsi proteiinia tasolla (Fig. 3B), mutta myös mRNA tasolla (Kuva. 3C) in OVCA433, A2780cp ja SKOV3. Nämä tulokset osoittavat, että p53 säätelee negatiivisesti sekä mRNA ja proteiini tasoilla FOXM1 ja p53 on välttämätöntä tiostreptonille käyttämään estyminen FOXM1 ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja.

(A) Western blotting paljasti alas-säätely FOXM1 ja ylössäätöä p53 munasarjasyövän solulinjoissa; OVCA433 ja A2780cp, mutta ei SKOV3 käsittelemällä tiostreptonia erilaisissa annoksina ja aikavälein. (B) Western blottaus osoitti, että ohimenevän transfektion kanssa p53 voisi tukahduttaa FOXM1 ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja (OVCA433, A2780cp ja SKOV3). (C) Reaaliaikainen PCR osoitti alas-säätely

FOXM1

selostukset kun ohimenevän transfektion p53.

Down-regulation of FOXM1 heikentää solumigraation /invaasion

Oletimme, että tiostreptonille voi tukahduttaa munasarjasyövän solumigraation /invaasion estämällä ilmaus FOXM1. Koska tiostreptonia voivat aiheuttaa apoptoottista vaikutusta syöpäsoluihin [26], XTT määritykset suoritettiin kolmasti jättää tekijä vähentää solujen elinkelpoisuus, jotka voivat vaikuttaa tarkkuuteen käyttäen haavan aikaa solujen vaeltamiseen arviointia. Todellakin, solujen elinkelpoisuuden edellä solulinjojen ei todettu merkittäviä muutoksia, kun käsittely annosvälillä 0-10 uM tiostreptonia (Fig. S1). Käsittelemällä tiostreptonille, OVCA433 solut osoittivat selvää tukahduttaminen solujen vaeltamiseen, jossa -50% laskua haavan nopeudella verrattuna käsittelemättömään kontrolliin haavan paranemista mitattuna (

P

0,05) (Fig. 4A ). Vastaavia estävä vaikutus solujen vaeltamiseen havaittiin A2780cp soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin hoito on SKOV3 ei ollut merkittävää vaikutusta solun vaeltavia esto (Fig. S2). Lisäksi hoito 10pM tiostreptonille on OVCA433 myös vähentänyt dramaattisesti noin 37% solujen vaeltamiseen (

P

0,05), ja 75% solujen invaasiota (

P

0,05) kykyjä verrattuna olevilla säätimillä Matrigel määrityksessä (Fig. 4B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että FOXM1 merkittävästi säätelee solujen lisääntymistä ja solumigraatio /invaasion munasarjasyöpäsoluja.

(A) Haavan paranemista määritys osoitti pienempi haavansulkemiseen nopeus tiostreptonia käsiteltyjen OVCA433 soluissa verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (*

P

0,05). (B) TranswellTM migraatiokokeessa ja pylväsdiagrammi osoittivat huomattavasti pienempi määrä vaeltavia solujen kautta Matrigel-pinnoitettu kalvo FOXM1-köyhdytettyä OVCA433 soluja kuin kontrolli (*

P

0,05) (

ylempi

). TranswellTM solu invaasiomääritys ja pylväsdiagrammi osoitti pienempi hyökkäys kurssi FOXM1-köyhdytettyä OVCA433 soluissa tiostreptonille hoidon verrattuna kontrolliin (*

P

0,05) (

pienempi

). (C) Western blotting paljasti alas-säätely FOXM1 munasarjasyövän solulinjoissa (OVCA433 ja OV2008) käsittelemällä U0126 eri aikavälein. (D) Haavan paranemista määrityksessä osoitti pienempi haavansulkemiseen nopeudella U0126-käsiteltyjen OVCA433 soluissa verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (*

P

0,05). Kolme riippumatonta koetta, ja sen tulos piirrettiin.

ERK toimintaa säätelee solujen vaeltamiseen välittämän FOXM1 vuonna munasarjasyöpäsoluja

Kuten edellä tutkimuksessa hiljaista uskottavaa yhdistyksen ERK toiminnan ja FOXM1 ilmentymistä (Fig. 1A ja 1B), on mielenkiintoista tutkia taustalla molekyylitason mekanismia. OVCA433 ja OV2008-soluja käsiteltiin MEK inhibiittorin U0126 ja tasot Perk ja FOXM1 arvioitiin eri aikapisteissä Western blot -analyysillä. Merkittävä lasku Perk tasolla havaittiin molemmissa solulinjoissa jo 30 minuuttia ja oli samanaikainen vähentäminen FOXM1 ilmaisun (Fig. 4C). Lisäksi esto FOXM1-ilmentyminen kesti niin kauan kuin ERK aktiivisuus pysyi tukahdutetaan (Fig. 4C). Koska ERK sijaitsee up-virran FOXM1 [23], [24], päättelimme, että esto ERK aktiivisuuden tulisi kumota solujen migraatio munasarjasyöpäsoluja läpi alaspäin säätäminen FOXM1. Todellakin, käyttäen haavan määritystä OVCA433 soluja käsiteltiin U0126 osoitti merkittävää kasvua haavan aika (2-kertaisesti enemmän) verrattuna kontrolliin (

P

0,05) (Fig. 4D). Toisaalta, ei ollut vähentäminen FOXM1 ilmaisun ja soluliikkuvuus in SKOV3- soluissa (p53 poistetaan), kun hoito U0126 (Fig. S3), mikä osoittaa, että läsnäolo p53 vaaditaan U0126 tai tiostreptonille välittämän FOXM1 eston. Yhdessä nämä havainnot tukevat olennainen rooli FOXM1 välittämisessä vaikutus ERK on soluvaelluksen munasarjasyöpäsoluja.

MMP-9 ja uPAR ovat FOXM1 loppupään tavoitteita säädellään solumigraation /invaasion

Solunulkoisilla proteaasit kuten metalloproteaasi-9 (MMP-9) ja urokinaasireseptorin (uPAR) ovat markkereita hankintaan metastaattisen valmiudet [2]. Siksi tutkimme tasot

MMP-9

ja

uPAR

vahvistaa vaikutusta FOXM1 solun liikkuvuuteen ja invaasiota. Tukahduttamalla FOXM1 ilmaisutapoja 5 ja 10 uM tiostreptonille vuonna OVCA433 tasot sekä

MMP-9

ja

uPAR

vähenivät noin 20- 30% (Fig. 5). Toisaalta, ohimenevä yli-ilmentyminen FOXM1 lisääntynyt

MMP-9

ja

uPAR

tasoilla -1,7-kertaiseksi ja ~2.4-kertaiseksi (Fig. 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että FOXM1 säätelee solumigraation /invaasion kautta kopiointia ajan säätelemällä ilmentymiä

MMP-9

ja

uPAR

.

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoitti että esto FOXM1 ilmentymisen tiostreptonille (5 ja 10 uM) in OVCA433 aiheutti laskua

MMP-9

ja

uPAR

ilmauksia (

jäljellä

), kun taas ohimenevästi transfek- jossa FOXM1 ekspressioplasmidin (1 ja 2 ug) in OVCA433 lisääntyi

MMP-9

ja

uPAR

lauseke (

oikea

). Lukuarvo alla paneeli tarkoitetun mRNA ilmentymistason suhteessa kontrolliin.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että FOXM1 oli poikkeavasti säädellään ylöspäin munasarjasyöpä erityisesti korkea-asteen alatyyppi. Samoin lisääntynyt fosfori-ERK samanaikaisen kanssa FOXM1 oli merkitsevästi yhteydessä korkealaatuisesta munasarjasyöpä. Meillä on siis ehdotti, että FOXM1 yliekspressio saattavat aiheutua konstitutiivisesti aktivoitua ERK signalointi, joka edistää metastaattista kykyä syöpäsoluissa. Tutkimuksemme osoittaa, että ERK /FOXM1 signalointiryöpyn voi olla lupaava kohde terapeuttiselle interventiolle munasarjasyöpä.

ja muut ryhmät ovat aikaisemmin raportoitu, että FOXM1 usein vapautettiin erilaisissa ihmisen syövissä [31]. Tärkeää on, että lisääntynyt FOXM1 ilmentyminen liittyy kasvaimen etenemistä ihmisen syövistä [6], [9], [10], [11], [12]. Kuitenkin toiminnalliset roolit FOXM1 munasarjasyövän jäävät paljolti hyödyntämättä. Täällä osoitti, että sekä mRNA ja proteiini tasoilla FOXM1 oli säädellään ylöspäin munasarjasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. FOXM1 yliekspressio korreloi merkitsevästi korkealaatuista munasarjakasvainten, mikä osoittaa, että FOXM1 voi pelata onkogeenisessä rooli munasarjasyövän, varsinkin korkea-asteen alatyyppiä. Siksi tutkitaan vaikutus FOXM1 in solumigraation /invaasio joka on yleinen tuumorigeenisia skenaario havaittiin aggressiivista korkealaatuisesta kasvaimet.

Molemmat kopioinnin suhteen aktiivisia silmukoitumisvarianttia FOXM1;

FOXM1B

ja

FOXM1C

osoitetaan olevan koholla lukuisissa ihmisen syövissä. Erityisesti, FOXM1B osoitettiin edistää angiogeneesiä, kasvaimen kasvua glioomasoluissa ja etäpesäke HCC puuttuessa Arf kun FOXM1C on havaittu parantavan solujen kasvua ja kiinnittymisestä riippumaton kyky kohdunkaulan syövän soluihin [6], [7], [15 ], [16]. Täällä täytäntöön ilmaus joko FOXM1B tai FOXM1C voisi edistää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion in munasarjasyöpäsoluja. Vaikka Tulosten mukaan FOXM1C mieluiten lisääntynyt solujen lisääntymistä samalla FOXM1B edistänyt solumigraatio /invaasio, vähentämiseen samanaikaisesti molempien FOXM1 isoformeja käyttämällä tiostreptonille johtanut vastaaviin vaikutuksia sekä solujen lisääntymisen sekä solumigraation /hyökkäystä. Vaikutus FOXM1 vahvistettiin lisäksi tutkimalla ilmauksia tunnettuja markkereita solumigraatio /invaasio,

MMP-9

ja

uPAR

, jotka ovat sopusoinnussa metastaattisen roolia FOXM1 raportoitu muut ihmisen syövissä [9], [16], [32], [33]. Olipa FOXM1 suoraan säännellä näitä ilmaisimia tai muita loppupään efektorien vaatii lisätutkimuksia. Kuitenkin kaikki nämä havainnot viittaavat siihen, että poikkeava säätely ylöspäin FOXM1 attribuutteja kasvaimia ominaisuudet korkealaatuisesta munasarjasyöpään.

ERK on yksi ratkaiseva välittäjänä Raf /ERK /MAPK signalointi akseli ylläpitää monipuolista cellular toiminto myös solujen jakautumista, apoptoosia sekä muuttoliike [34]. Aiemmin ERK on osoitettu olevan konstitutiivisesti aktiivisia munasarjasyövän ja meidän tunnistaminen korkean ekspressiotason Perk histologisissa korkealaatuisesta munasarjasyövän ja solulinjoissa osoittaa sen ratkaiseva rooli aiheuttaa aggressiivinen kasvainten synnyssä [35]. Kiehtovan, huomasimme, että Perk ja FOXM1 tasot tiiviisti korreloivat aikana syövän etenemisen, erityisesti korkea-asteen munasarjasyöpä. Me arveltu, että kohonnut FOXM1 ilmentyminen laukaisee konstitutiivisen aktivaation ERK, mikä johtaa parannetun solun liikkuvuus munasarjasyövän. Kuten odotettua, niiden suhde vahvistettiin manipuloimalla aktiivisuutta ERK, mikä johti rinnakkain muutoksia FOXM1 ilmaisun. Toisessa tutkimuksessa, kuviot muistuttavat ERK kohdesekvenssi on löydetty FOXM1 ja aktivointi ERK aktiivisuus osoitettiin indusoivan transaktivoivan kyky FOXM1C [22]. Siten tukahduttaa ERK aktiivisuuden U0126 vähentäisi FOXM1 fosforylaatioon joka lopulta johtaa inhibitioon FOXM1 ilmentymisen häiritsemällä omaa positiivista palautetta silmukka [36]. Vaikka se antoi meille vihjeen, että transaktivaatiota FOXM1 riippuu fosforylaation ERK klo transkription jälkeisellä tasolla on puute raportteja koskien toiminnallisiin ominaisuuksiin aktivoitua ERK /FOXM1 signalointi akselin munasarjasyöpä. Haavan paranemista tutkimus, itse asiassa, lasku haavan hinnan vuoksi esti ERK toimintaa ja vähentää FOXM1 ilmaisun yhteydessä U0126 hoitoon viittaa vahvasti siihen, että FOXM on yksi tärkeimmistä alavirran efektorit ERK-signalointia. Lisäksi tiostreptonia ja U0126 tukahdutetaan solujen siirtymistä samassa määrin (40% verrattuna 50%). Yhdessä uskomme, että säädelty ERK toiminnan ja sen seurauksena lisääntynyt FOXM1 ilmaisun osallistumaan edelleen induktion onkogeenisten käyttäytymistä, joka tukee että ERK /FOXM1 signalointi akseli helpottaa soluvaelluksen munasarjasyöpä.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet lupaava vaikutus tiostreptonia vuonna heikentäen kasvaimia käyttäytymistä välittämä FOXM1 [26], [37], [38]. Koska erilaiseen herkkyyteen FOXM1 alas-sääntelyn tiostreptonille hoito solulinjoissa eri asemaan p53, on houkuttelevaa spekuloida, että on tärkeää p53 Toimenpiteen tiostreptonia. Perustuu siihen, että menetys p53-toiminto on yleinen tapahtuma kasvaimia ja FOXM1 säätelee negatiivisesti p53, me arveltu, että menettää p53 ilmentyminen voi aiheuttaa vapauttaminen FOXM1 ja siten aiheuttaa solujen katastrofin ja jopa syöpää. Tässä p53 poistetut solulinja SKOV3 osoittanut mitään vastetta FOXM1 eri annoksia tiostreptonia sekä MEK estäjä, U0126, kun taas FOXM1 voitaisiin helposti vaimentaa useilla annoksilla OVCA433 ja A2780cp jotka kuljettavat villityypin ja p53-geenien vastaavasti. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tiostreptonille voivat saada aikaan apoptoottista vaikutusta syöpäsolujen vakauttaa p53 ilmaisun [39] ja säätely ylöspäin p53 suuremmilla annostus voi lisäksi avustaa tukahduttamista FOXM1. Mielenkiintoista, tiostreptonille tai U0126 ei ollut vaikutusta SKOV3 kuljettaa poistetut p53-geenin, kun taas ektooppinen p53 poisti ilmentymisen FOXM1 sekä RNA ja proteiini tasolla johdonmukainen muiden tutkimusten [28], [30]. Tämä paljastaa tarvittava rooli p53 välittämisessä estävä vaikutus tiostreptonia on FOXM1 ilme. Sen lisäksi, huonontamalla solumigraation /invaasion kyky, toinen ryhmä osoitti myös, että käyttö tiostreptonia voisi myös lisätä apoptoosia ja proliferatiivinen pidätys ihmisen syöpäsoluja joka korostaa entisestään terapeuttinen arvo tiostreptonia [26], [37], [38], [39], [40]. Yhdessä Tutkimuksemme tukee tätä tiostreptonille toimintoja tukahduttamalla FOXM1 ilmaisun kautta p53 myöhemmin lievittää tuumorigeenisyyteen ja ylös säätelevä p53 aiheuttaa solukuoleman.

Yhteenvetona tutkimuksemme osoitti yhteyden ERK /FOXM1 signalointi akselin ja metastaattista käyttäytymistä munasarjasyöpäsoluja. Lisäksi olemme paljastui kriittinen rooli p53 välittämisessä toimintaa tiostreptonia. Siten molemmat U0126 ja tiostreptonille edustavat lupaavia lähtökohdat perustaa syövän hoitoon munasarjasyövän kautta tukahduttamisesta FOXM1.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

Viisi ikuisti ihmisen munasarjan pintaan epiteelisolujen käytettiin: HOSE10-2, HOSE11-12, HOSE17-1, HOSE20-3 ja HOSE21-3 (professori George Tsao, The University of Hong Kong). Yhdeksän munasarjasyövän solulinjoissa käytettiin: A2780s A2780cp, OV2008, C13 * (professori Benjamin Tsang, University of Ottawa), OV420, OV429, OV433, OVCAR3 ja SKOV3 (American Type Culture Collection, Rockville). Kaikkia solulinjoja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 joko vähintään essential medium tai Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa (Gibco-BRL, Gaithersburg), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Gibco) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä ( Gibco).

plasmidit ja transfektio

Lentivirusvektorit pCDH-FOXM1B ja pCDH-FOXM1C plasmidit tuottamat subklonaamalla FOXM1B ja FOXM1C cDNA pcDNA3-FOXM1B ja pcDNA3-FOXM1C plasmidit pCDH-MSCV- MCS-EF1-GFP-Puro lentiviraalinen plasmidi (SBI, Mountain View, CA) vastaavasti. PRcCMV-p53 plasmidi oli prof Randy YC Poon (osasto Biokemian ja solubiologian, Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong). LipofectAMINEa ™ 2000 transfektioreagenssi (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) käytettiin solujen transfektioon mukaan valmistajan ohjeen. PCDH-MSCV-MCS-EF 1-GFP-Puro ja pcDNA3.0 tyhjät vektoreita käytettiin negatiivisina kontrolleina. Perustaa FOXM1B ja FOXM1C stabiilisti ilmentäviä soluja, lentivirus- infektoidut solut valitaan 2 ug /ml puromysiinille (Sigma) 2 viikkoa ja varmistettiin Western blot -analyysillä.

Semikvantitatiivisilla (SQ-PCR) ja määrälliset ( QPCR) käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktion

Kokonais-RNA eristettiin TRIzol (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Komplementaarinen DNA syntetisoitiin käyttämällä käänteisen transkription reagenssipakkauksen (Applied Biosystems, Foster City). Sen jälkeen cDNA: ta käytettiin suorittamaan PCR käyttäen spesifisiä geenejä alukkeita

FOXM1B

(eteenpäin, 5′-TTGCCCCCAAGGTGCTGCTA-3 ’ja reverse, 5’GGAGATTGGGACGAATCCTC-3’),

FOXM1C

( eteenpäin, 5′-CACCCATCACCAGCTTGTTT3 ”ja kääntää, 5′-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3 ’),

MMP-9

(eteenpäin, 5′- CATCGTCATCCAGTTTGGTG ja kääntää, 5′-GCCTTGGAAGATGAATGGAA-3′) ja

uPAR

(eteenpäin, 5′-GCCTTACCGAGGTTGTGTGT-3 ’ja reverse, 5’GGCAGATTTTCAAGCTCCAG -3’) olosuhteissa, joissa oli 94 ° C (5 min), jota seurasi 30-35 sykliä 95 ° C (30 s), 57 ° C (30 sek) ja 72 ° C (30 sek), lopuksi 72 ° C: ssa (10 min) ja 4 ° C: ssa. Suhteellinen määrä geenin normalisoitui vastaan ​​GAPDH-mRNA: n.

Q-PCR suoritettiin TaqMan® Gene Expression määritykset ja SYBR Green Gene Expression Assay. Validoida ilmentymisen

FOXM1

isoformeja, spesifisiä alukkeita kohdistaminen vastaan ​​

FOXM1B

ja

FOXM1C

suunniteltiin mukaan Kalin

et al

[11] ja hankkia Applied Biosystems. Tutkia p53 erityisiä TaqMan-koettimia (Applied Biosystems), joka sisältyy PCR-seosta tehtiin PCR olosuhteissa, 95 ° C: ssa 2 minuutin ajan, 40 ° C: ssa sykliä 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Suhteellinen määrä RNA kussakin näytteessä määritettiin vertailevaa CT-menetelmää ja 7500 System SDS-ohjelmiston (versio 1.3.1), josta kertainen ero verrattiin sisäisen valvonnan

18S

ja

TBP

ja suhteellinen kertainen ero oli sitten normalisoitu kalibraattorin. Suhteellinen ilmentymistaso kohdegeenin tulkittiin kertainen ero endogeeniseen valvontaa.

Western blotting ja immunohistokemiallinen (IHC) analysoi

Yhteensä proteiini valmistettiin lisäämällä sopiva määrä 1 x hajotuspuskuria solupellettiin.