Krooninen sairaus

tiivistelmä

Neuroblastooma (NB) synnyssä on raportoitu olla tiiviisti mukana lukuisia geneettisiä muutoksia. Kuitenkin taustalla DNA metylaation ei ole laajasti tutkittu tässä kehityshäiriöitä maligniteetti. Täällä syntyy microarray-pohjainen DNA metylaatio profiilit ensisijaisen varhaishermosolusäi- kasvaimia. Tiukat valvottu ero metylaatio analyysien antoi meille mahdollisuuden tunnistaa epigeneettiset muutokset ominaista NB kasvainten sekä kliinisiä ja biologisia alatyyppejä NB. Havaitsimme, että geenispesifiseen menetys DNA: n metylaatio on yleisempää kuin promoottori hypermetylaation. Merkillistä, kuten hypometylaatio vaikuttaa syöpään liittyvien biologisten toimintojen ja geenien merkitystä NB synnyssä kuten

CCND1

,

SPRR3

,

BTC

,

EGF

ja

FGF6

. Erityisesti ero metylaation

CCND1

vaikuttaa lähinnä evoluution säilyneitä toiminnallisesti asiaankuuluvat 3’alueella, mikä viittaa siihen, että hypometylaatio ulkopuolella promoottorialueille voi olla rooli NB synnyssä. Hypermetylaation kohdennettuja geenien solujen kehitystä ja lisääntymistä, kuten

RASSF1A

,

POU2F2

tai

HOXD3

, mm. Tulokset johdetut tutkimuksen antaa uuden ehdokkaan epigeneettisellä biomarkkereita liittyvät NB sekä oivalluksia molekyylitasolla patogeneesin tämän kasvain, johon liittyy selvästi geenispesifisiin hypometylaatio.

Citation: Mayol G, Martín-Subero JI , Ríos J, Queiros A, Kulis M, Sunol M, et al. (2012) DNA hypometylaatio Vaikuttaa syöpään liittyvien biologisten toimintojen ja Geenit merkitystä Neuroblastooma Patogeneesi. PLoS ONE 7 (11): e48401. doi: 10,1371 /journal.pone.0048401

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 07 elokuu 2012; Hyväksytty: 01 lokakuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Mayol et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Espanjan terveysministeriön (Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria, 2007 PI070286) ja espanjalainen yhteiskunta syöpää vastaan ​​(Asociación Española Contra el Cancer, 2007). G. M. tukee apurahan Hospital Sant Joan de Déu Barcelona (Grant BR201102), S. G. jota lahjoituksena NEN yhdistys ja J.I.M-S. tutkimuksia Epigenomics tukee Espanjan tiede- ja innovaatio (RYC sopimus ja SAF2009-08663).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Neuroblastooma (NB), yleisin ekstrakraniaalisen kasvain lapsuuden, on monimutkainen kehityshäiriöitä maligniteetti tyypillisiä monet biologisesti merkittäviä geneettisiä muutoksia, jotka liittyvät läheisesti kliiniseen tulokseen potilailla [1]. Lisäksi geneettisiä muutoksia, monimutkainen ja heterogeeninen kliinistä kehitystä NB riippuu suuresti potilaan ikä diagnoosin sekä kliinisessä vaiheessa ja histopatologisia piirteitä kasvaimen [1].

Altered DNA metylaation on laajalti raportoidaan olevan kriittinen tekijä syövän kehittymisen ja etenemisen. Erityisesti, alueelliset DNA hypermetylaation (hyperM) CpG-saarekkeiden promoottorin alueilla tuumorisuppressorigeeneille sekä globaalit hypometylaatio (hypoM), jotka vaikuttavat DNA toistot pidetään yleisin syöpään liittyvien epigeneettisiä muutoksia, [2], [3]. Toistaiseksi useimmat tutkimukset ovat keskittyneet huomionsa roolia ja mekanismeja promoottorin hyperM, koska menetys maailmanlaajuinen DNA: n metylaatio uskottiin vaikuttavan DNA toistot ja olla pääasiassa mukana rakenteellista-ydin- toimintoja, kuten kromosomi epävakaus [2].

Vaikka genomisen profiilia NB on hyvin tunnettu, DNA: n metylaatio muutoksia ei ole laajasti tutkittu näissä kasvaimissa. Useita geenejä, on raportoitu olevan metyloitu NB [4] – [9], kuitenkin genomin laajuinen DNA metylaatio NB on edelleen suuresti tuntematon. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli tutkia rakenteessa epigeneettiset muutokset NB genomin laajuisesti käyttämällä DNA metylaatiospesifistä mikrosiruja. Lisäksi tunnistamalla muutokset maailmanlaajuisesti liittyy NB, me tunnettu DNA metylaation liittyviä erillisiä kliinisiä ja biologisia taudin alalajeja. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että geenispesifiseen menetys DNA: n metylaatio on yleisempää kuin promoottori hyperM. Tällaiset hypoM vaikuttaa syöpään liittyvien biologisten toimintojen ja geenien merkitystä NB synnyssä kuten

CCND1

[10].

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

yhteensä 25 ensisijaisen varhaishermosolusäi- kasvaimia (NT), mukaan lukien 22 NB, 2 ganglioneuromas (GN) ja 1 ganglioneuroblastoma (GNB) käytettiin genomin laajuinen metylointianalyysi. Lisäksi itsenäinen kohortin 13 NB ja 2 GN käytettiin bisulfiitti pyrosekvensointi mRNA geenien ilmentyminen ja DNA kopioluvun vaihtelu analyysit (taulukko 1 ja taulukko S1A). GN ja GNB sekä normaalin ihmisen sikiön aivojen (FB) ja lisämunuaisen (AG) kudoksiin käytettiin viitteenä näytteitä. NB riskinarviointi määriteltiin Kansainvälisen Neuroblastooma Välivarastointi System (INSS) [11]. Kasvainnäytteestä arvioitiin patologi (MS), vain kasvaimista 70% elinkelpoisia kasvainsolun sisältö otettiin mukaan tutkimukseen. DNA eristettiin snap-jäädytetty näytteitä Cell Lysis Solution (Promega, USA) ja proteinaasi K (Sigma, USA) seuraavat valmistajien protokollia.

Ethics lausunto: Tutkimuksen hyväksyi Institutional Research eettisen komitean (Comité Ético de Investigación Clínica, Fundación Sant Joan de Déu – CEIC-FSJD). Potilaat /vanhemmat /huoltajat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen ennen näytteenottoa.

Genominlaajuiset DNA: n metylaatio profilointi

DNA: n metylaatio profilointi tehtiin käyttäen Infinium HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, USA). Perimän DNA bisulfiittikonversion ja hybridisoimalla alustan suoritettiin Human genotyypin yksikön Espanjan National Cancer Center (CEGEN-CNIO, Madrid, Espanja), kuten aiemmin on kuvattu. Tiedot analysoitiin käyttämällä BeadStudio (versio 3, Illumina Inc, USA) [12], [13]. Kunkin CpG laskimme beeta-arvo (βvalue), joka on kvantitatiivinen mitta DNA: n metylaatio, jotka vaihtelivat 0 täysin metyloimattoman 1 varten täysin metyloidut sytosiinit. Mahdollisia lähteitä biologisten ja teknisten harhojen, jotka voivat vaikuttaa tuloksiin, kuten sukupuoleen liittyviä ja heikkolaatuisia CpG: t jätettiin pois tutkimuksesta [14] – [16]. Metylointi microarray data on talletettu Gene Expression Omnibus tietovarasto (GSE39626).

Differential DNA metylointianalyysi

Koska ei ole yksimielisyyttä strategia ero metylointianalyysi, käytimme kolmea eri lähestymistapaa. Ensinnäkin, CpG sivustot luokiteltiin hyperM kun βvalues ​​olivat 0,25 vertailu- näytteiden ja 0,75 vähintään 10% NB näytteistä, ja hypoM kun βvalues ​​olivat 0,75 vertailu- näytteiden ja 0,25 vähintään 10% NB näytteistä. Toinen ero metylaatio oli määritelty keskimääräinen βvalues ​​välillä NB ja vertailunäytteet esittää absoluuttinen ero on suurempi kuin 0,25 [17]. Lopuksi, parittomalla t-testi suoritettiin käyttäen askel alaspäin Permutation (SDP) [18] ja False Discovery Rate (FDR) analyysit [19]. Venn kaavioita käytettiin vertaamaan luetteloita erilaisesti metyloituja CpG: t (https://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi) ja vain ne samanaikaisesti tunnistaa kaikki kolme luokitteluperusteita määriteltiin erilaisesti metyloituja.

hierarkkinen klusterointi ja Pääkomponenttianalyysin

Ohjaamaton ja valvottu agglomerative hierarkkinen klusterointi suoritettiin käyttäen Cluster Analysis työkalun Bead Studio (versio 3, Illumina Inc, USA). Principal Component Analysis (PCA) suoritettiin R (www.r-project.org) käyttäen FactoMineR paketti saatavilla kautta Bioconductor.

bisulfiittimodifiointi pyrosekvensointi

Validoida DNA: n metylaatio tiedot, bisulfiitti pyrosekvensointi ( BPS) analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, genominen DNA oli bisulfiitti muunnetaan EpiTect Plus Bisulfiittikonversio Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Myöhemmin PCR-monistus suoritettiin käyttäen biotinyloitua alukkeita (taulukko S1B). Pyrosekvensointi ja data-analyysi suoritettiin kanssa pyrosequencer analysaattorin PyroMark Q96 (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Geenien ilmentyminen analyysi

arvioimiseksi ekspressiotasojen differentiaalisesti metyloituneiden geenien, julkisesti käytettävissä ilmaisun microarray tietomääriä [21] – [23] kanssa edustajan NB kasvain spektrit analysoitiin. Raakadataa normalisoitiin z-arvoksi muutosta. Pariton t-testi analysointi säätää SDP ja FDR suoritettiin. Geenit, joilla on tilastollisesti merkitsevä ero lauseke (

p

0,01), z-pisteet 1 50% näytteistä, katsottiin ilmentyvät eri.

kandidaattigeenejä, yhteensä RNA: n eristys ja geenin ilmentyminen kvantifiointi suoritettiin 10 tapausta sisältyvät metylointi array ja riippumaton sarja 13 NB näytteitä kvantitatiivista reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR), kuten aikaisemmin on kuvattu [22] (taulukko S1B).

bioinformatiikka- merkinnästä erilaisesti metyloitua geenien

Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) v6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) käytettiin geenien merkintä rikastamiseen analyysi ja biologisen reitin kartoitus [24]. Todennäköisyys (Benjamini-Hochberg korjaus) pienempi kuin 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Differentially denaturoidulla geenien luokitellaan niiden kromosomi lokalisointi. Todennäköisyysjakauma analyysi tehtiin määrittämiseksi mahdollisten kromosomi rikastamiseen.

P

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Promoottori luokittelu erilaisesti metyloitua geenien promoottorit korkea (HCP), keskitason (ICP), matala (LCP) ja sekoitetaan CpG sisältöä, sekä tunnistamisen Polycomb- (PcG) kohdegeenien suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [14].

Hypergeometrisen todennäköisyysjakauman analyysi todennäköisyydellä cut-off 0,05, suoritettiin määrittämään hyperM tai hypoM kromosomi rikastamiseen ja määrittämään promoottori tyypin ja PCG-merkki rikastumisen erilaisesti metyloitua geenejä. Analyysit tehtiin SPSS versio 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Tulokset

DNA: n metylaation profilointi ja tunnistaminen erilaisesti metyloitua geenien NB

Jotta tutkia rakenteessa DNA: n metylaation NB, analysoimme 22 ensisijainen NB kasvaimia käyttämällä Infinium HumanMethylation27 BeadChip mikrosirun. Kaksi GN, 1 GNB, samoin kuin normaalin ihmisen FB ja AG kudoksia käytettiin vertailunäytteiden tunnistaa erilaisesti metyloidut geenien spesifinen Huom.

Alussa suorittaneet laadunvalvonta saatujen tietojen mikrosiruanalyysillä ja jätetty 3337 sukupuoleen liittyviä ja huonolaatuisia CpG: t. Lisäksi yksi NB näyte (NT18, taulukko S1A) sulkeminen johtui huonosta havaitseminen

p

-arvot.

valvomaton Principal Component Analysis (PCA) suoritetaan kaikkien näytteiden tutkimuksessa mukana, osoittivat, että NB näyttää selvästi erillistä DNA: n metylaatio profiilin verrattuna normaaliin vertailunäytteitä (FB ja AG) sekä kliinisesti vähemmän aggressiivisia GNB ja hyvänlaatuisia GN (kuvio 1A), joka näiden kahden yksikön välillä epigeneettiseltä undistinguishable normaalista vertailunäytteitä. Jotta voitaisiin tunnistaa eri tavoin metyloidut geenien NB, valvotuissa analyysit suoritettiin käyttäen itsenäisesti kolmea erilaista vertailunäytettä (FB, AG ja 2 GN 1 GNB). Vertaamalla geeni luetteloita syntyy näiden analyysien pystyimme tunnistamaan yhteiset 351 geenejä, on 23 hyperM ja 328 hypoM, NB (kuvio 1 B, taulukko S2A). Tämä joukko geenejä tullaan jatkossa ’NB-geenit. Sitten suoritetaan valvottu hierarkkinen klusteri ja PCA käyttämällä hyperM ja hypoM geeni asettaa erikseen. Merkillistä, DNA metylaatio hyperM geenien antanut meille mahdollisuuden erilaistua NB monipuolista

MYCN

vahvistusta tila. Mielenkiintoista, hypoM geenit erillisiä NB niiden ikä diagnoosin, kokosi ne, joilla on 5 tai enemmän vuoden erillään nuoremmilla potilailla (kuvio 1 C ja 1 D).

V: valvomaton Principal Component Analysis (PCA) array-pohjainen DNA metylaatio tiedot 21 varhaishermosolukasvaimesta (NB) (luokitellaan INSS Stage), 2 ganglioneuroma (GN), 1 ganglioneuroblastoma (GNB); ja normaali vertailunäytteet: sikiön aivojen (FB) ja lisämunuaisen (AG). B: Venn kaavio esittää strategiaa käytetään tunnistamaan NB-geenit. Hypermetyloitunut ja hypometyloidut geenien NB määritettiin käyttäen kolmea erilaista ohjattua analyysejä erottuva vertailunäytteitä (FB, AG ja GN /GNB). C: Valvottu hierarkkinen klusterin analyysi DNA: n metylaatio tietojen NB-geenit 21 NB näytteissä, 2 GN, 1 GNB; ja 2 normaali vertailunäytteet: FB ja AG. D: Valvottu Principal Component Analysis (PCA) 21 NB näytteissä, 2 GN, 1 GNB; ja normaali vertailunäytteet: FB ja AG: NB-geenit.

NB-geenit rankattiin mukaan prosenttiosuus näytteistä löytyi differentiaalisesti metyloidut ja taso βvalue muutoksia. Selkeimmin hyperM geenien meidän sarjassa olivat

EMP1

,

RASSF1A

,

ACTC

,

GNG12

,

HOXD3

,

PAMR1

,

IL17RC

,

CARD11

,

POU2F2

ja

P2RY6

(taulukko S2B). Näistä

RASSF1A

ja

POU2F2

on kuvattu aikaisemmin metyloitu NB kasvaimia ja solulinjat. Tässä molemmat geenit osoittivat selvästi lisääntynyt metylaatio tasoilla ≥80%: n NB näytteiden, joka on yhdenmukainen tunnetun raportit [5], [7], [25]. Sen lisäksi, että tietomme vain

HOXD3

on aiemmin kuvattu hyperM syövän, erityisesti eturauhassyöpä [26], [27].

Soveltamalla samaa strategiaa, 69 geenit olivat selvästi hypoM vuonna NB (taulukko S2B). Erityisesti näistä tunnistimme

CCND1

. Tämä geeni on raportoitu olevan erittäin ilmaistaan ​​merkittävä osa ( 75%) NB kasvaimia ja solulinjat [10], [28]. 17 CpG: t analysoitiin koko pituus

CCND1

locus paljasti monimutkainen epigeneettisiä kuvio NB tapauksissa ja kontrollinäytteitä (kuvio 2A). NB, havaitsimme väheneminen DNA: n metylaatio tasoilla 12 17 CpG sivustoja ja merkittävä hypometylaatio käyttäen tiukat kriteerit, vain kaksi CpG: t (Target tunnukset cg04717045 ja cg02723533). Yllättäen, DNA: n metylaatio menetystä havaittiin ulkopuolella 5′-alue

CCND1

, joka oli metyloimatonta NB tapauksissa ja kontrollinäytteitä. Hypometylaatio geenissä-elin ei pidetty merkittävästi johtuen epigeneettiset heterogeenisuus vertailunäytteen (kuvio 2A). 3 tulkitsemattoman alue (3′-UTR), sitä vastoin oli johdonmukaisesti metyloitavaa vertailunäytteitä ja hypometyloidut suuri osa NB. Kahdessa merkittävästi hypoM sivustoja, 17 21 NB menettää Metylointia verrattuna kaikkiin vertailunäytteet (βvalue 0,90), joka 11 heistä selvästi hypoM (kuvio 2A).

V: Graafinen näyttö DNA: n metylaatio tasoilla 17 CpG: t mitattiin poikki

CCND1

pituus. Heatmap näyttää tietoja 21 neuroblastooma (NB) ja vertailunäytteet (2 GN, 1 GNB, 1 FB ja 1 AG). Alla heatmap näytämme joitakin genomista ominaisuuksia

CCND1

lokuksen (UCSC Genome selain, dataa hg19 mukautettu hg18) lukien transkriptiotekijä sitoutumiskohtia (TFBS), evoluution konservoitunut DNAseI yliherkkä domain (DNAseI cluster) ja selkärankaisten Multiz aligment, PhastCons Conservation (Nisäkkäiden Conservation) ja miRNA kohdesivustot (TS). B: DNA metylaatiospesifistä pyrograms varten

CCND1

. Pyrogram Edellä vastaa neuroblastooma näyte taas pyrogram alla vastaa vertailunäytteen (FB). Harmaa varjostus näyttää prosentteina metylaation havaittiin CpG: t analysoitiin. C: Box-kuvaaja DNA: n metylaatio datan

CCND1

saadaan bisulfiitti pyrosekvensointi riippumattomalla kohortin 13 NB ja 2 GN näytteet ja vertailunäytteet. D: mRNA: n ilmentymisen tasot

CCND1

analysoitiin qRT-PCR kahdessa NB itsenäistä ikäryhmät.

DNA metylaatiomuutokset kliinisesti ja biologisesti relevantti NB alaryhmiin

valvottua lähestymistapaa käytettiin analysoimaan ero DNA metylaatio profiilien välillä kliinisen ja biologisesti relevantteja NB alaryhmiä.

korkean riskin (HR) NB: (n = 9), määritellään vaiheessa 4 ja

MYCN

monistettu (

MYCN

A) kasvaimet, verrattiin matalan riskin (LR) NB: (n = 8), johon sisältyy vaihe 1-3

MYCN

vahvistamattoman (

MYCN

NA) kasvaimia. Yhteensä 19 selvästi erilaisesti metyloitua geenejä tunnistettiin. Viisi geenit olivat hyperM HR suhteessa LR NB ja vertailunäytteet, kun taas mitään hypoM geeni havaittu tässä kliinisessä alaryhmässä. Sen sijaan hyperM ei havaittu LR NB taas 14 geenien näytteille

de novo

menetys metylaation tällä kliinisesti suotuisat alaryhmä (taulukko S2C).

vieressä verrattuna kahteen kliinisesti merkittäviä metastaattisen NB alaryhmiä, eli vaihe 4 (n = 6) ja vaihe 4S (n = 4) NB. Olemme tunnistaneet yhteensä 9 erilaisesti metyloitua geenejä. Näistä 2 geenit olivat hyperM vähintään 3 4 vaiheen 4S NB eikä hyperM havaittu vaiheessa 4 NB. Osalta hypoM, 5 ja 2-geenien havaittiin vaiheessa 4S ja 4 NB, vastaavasti (taulukko S2C).

vertailu

MYCN

A (n = 5) ja NA (n = 15 ) kasvaimet, tunnistimme 23 erilaisesti metyloituja geenejä (7 hyperM ja 16 hypoM) in

MYCN

monistetaan suhteen vahvistamattoman kasvaimia ja vertailunäytteet (taulukko S2C).

Lopuksi vertasimme NB perustuu potilaan ikä diagnoosin käyttäen kliinisesti vakiintunut 18 kuukautta ikä cut-off eli 18 kuukautta (n = 11) ja ≥18 kuukautta (n = 10). Mukaan meidän valintaperusteita, ei johdonmukaisesti erilaisesti metyloituja geenit tunnistettiin, todennäköisesti koska suuri heterogeenisyys molemmissa alaryhmissä. Perustuen valvottujen PCA-analyysi kuviossa 1D, havaitsimme, että potilailla, joilla on 5 tai enemmän vuotiaita erillään erillään nuoremmilla potilailla, mikä viittaa eri taustalla metylaation. Valvottu analyysi oli siis käyttää kahta ikä cut-off 18 kuukautta ja 5 vuotta (eli 0 18 kuukautta (n = 12), ≥18months 5 vuotta (n = 4), ≥5 vuotta (n = 5)). Erot metylaation kolmen iästä alaryhmää havaittiin. Kuitenkin metylaatio oli heterogeeninen potilailla alle 5 vuotta, mutta selvästi erillään vanhempi NB potilaat (taulukko S2C). Hakeminen vain 5 vuotta ikä cut-off ( 5 vuotta, n = 16 ja ≥5-vuotiaat, n = 5), tunnistimme selkeä DNA metylaatiokuvion ominaista joukko geenejä johdonmukaisesti menetys DNA: n metylaation potilailla alle 5-vuotiaat lapset verrattuna vanhempia potilaita, joista jälkimmäinen on samankaltainen vertailunäytteen (taulukko S2C).

Tekninen ja kliininen validointi ehdokas geenien pyrosekvensointi

DNA bisulfiitti pyrosekvensointi of 3 NB-erityisiä kandidaattigeenit (

EMP1

,

GNG12

ja

CCND1

) sekä

EPSTI1

, joka on differentiaalisesti metyloitu kliinisesti merkittäviä NB alaryhmiä, tehtiin vahvistaa DNA: n metylaatio array tietoja. Kaksi NB kasvaimia sisältyy microarray sekä itsenäisenä kohortin 13 NB ja 2 GN näytteitä käytettiin tähän tarkoitukseen. Ensinnäkin korrelaatioastetta microarray DNA: n metylaation ja BPS tietojen testattiin ja sen todettiin olevan merkittävästi korkea (r = 0,958,

p

0,001) (Kuva S1).

Yhdenmukainen array tulokset,

EMP1

ja

GNG12

NB-geenit osoittivat korkeaa metylaatiotasoilla verrattuna vertailunäytteiden kaikissa NB tapaukset validointi joukko (n = 13) (kuvio S2B ja S2C ).

CCND1

osoitti selvästi tappiolliseksi metylaation 10: 13 riippumatonta NB testattu, mikä on sopusoinnussa osuus hypoM tapauksista tunnistetaan metylointi array (kuvio 2A, 2B ja 2C, kuvio S2A).

EPSTI1

metylointianalyysi validoinnissa sarjassa vahvisti myös array data (kuva S2D).

Association between DNA metylaatio ja geenien ilmentymisen

Sen tutkimiseksi, ero DNA-metylaation NB liittyy geenien ilmentyminen, analysoimme julkaistu geenien ilmentyminen tietojen riippumattomien ja edustavien NB kasvaimen sarjaa [21] – [23]. Expression tietoja oli käytettävissä 13 23 hyperM ja 136 328 hypoM NB-geenit (taulukko S3A). Viisi kolmentoista (38,4%) hyperM geenit osoittivat alhaisempia ekspressiotasoja verrattuna vertailunäytteiden. Sen sijaan, 10 136-geenien (7,3%), joilla on alhaisempi metylaatiotasoilla olivat erittäin ilmaistaan ​​NB verrattuna vertailunäytteiden. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten raportointi, että vain murto-osa geenien kanssa promoottorin hypometylaatio kasvavat merkittävästi geenien ilmentyminen, on mahdollisesti ehdollistettu erityisiä aktivointi [29] – [30].

Validoida jos ero DNA: n metylaatio NB liittyy geeniekspression muutoksia, analysoimme 5 kandidaattigeenit by qRT-PCR 23 NB kanssa käytettävissä RNA (10 tapausta sisältyvät metylointi array ja riippumaton sarja 13 NB näytettä). Yleensä hyperM geenit osoittivat alhaisempia ekspressiotasot NB näytteissä verrattuna vertailunäytteiden. Samoin useimmat hypoM geenit osoittivat korkeampia ekspressiotasoja NB kasvainten suhteen vertailunäytteitä, vahvistaa microarray tietoja (dataa ei esitetty).

CCND1

todettiin olevan erittäin ilmentyy kaikissa NB näytteissä, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [10], [31] (kuvio 2D).

Bio- ja toiminnalliset ominaisuudet erilaisesti metyloitua geenien NB

Differentially denaturoidulla geenit toiminnallisesti tunnusomaista käyttämällä bioinformatiikan lähestymistapoja. Geeni ontologian (GO) analyysi geenien hypoM NB auttanut tuomaan esiin merkittävästi rikastettu (

p

0,05) toimintoja, kuten puolustus vastauksen, immuunivaste, immuunijärjestelmän prosessi, vastauksena ärsyke ja orvaskeden kehittäminen ( Taulukko S3B). Johtuen pienestä otoskoko, geeni asetetaan peräisin muista vertailuja ei aiheuttanut mitään merkittävästi rikastettu GO aikavälillä.

Useimmat tutkimukset aikuisilla kasvaimia on raportoitu, että hyperM geenit rikastettu promoottorit korkean CpG sisältöä (HCP) ja PRC2 kohdegeenien alkion kantasolujen (ESC) [17]. Yllättävää kyllä, meidän sarjassa, ryhmä hyperM geenien osoitti tappiota HCP promoottorit (21,7%

vs.

53,5% taustalla,

p

= 0,072) ja rikastamiseen ICP promoottorit (34.78%

vs.

11,68% taustalla,

p

= 0,012). Mitään merkittäviä rikastamiseen PRC2 tavoitteita havaittiin (13%

vs.

9,6% taustalla,

p

= 0,49). Sen sijaan hypoM geenit osoittivat aiemmin raportoitu malli [17], eli ne liittyivät lisääntyminen alhaisen CpG pitoisuus promoottorit (LCP) (68,3%

vs.

22,6% taustalla,

p

0,001) ja se laski PRC2 tavoitteiden (3,3%

vs.

9,6% taustalla,

p

0,001) (taulukko S3C).

Voit selvittää ero metylaation NB tapahtuu yhdenmukaisesti koko genomin, kromosomi jakaminen NB-geenejä analysoitiin. Koska pieni määrä hyperM geenejä ei ole merkittävää rikastumista tai ryhmitetty suuntaus havaittiin (taulukko S3D). Toisaalta, merkittävä osa hypoM geenien kartoittaa kromosomeihin 1 (48-geenien), 17 (25 geenit), 19 (58-geenien) ja 21 (9 geenejä) (

p

0,05 kaikki) ja osoittivat kromosomispesifisten lokalisointi. Nämä geenit kartoitettiin tiettyihin kromosomialueita 1p36 (20%) ja 1q21 (25%), kromosomi 17p13 ja 17q21 (molemmat 27%), kun taas suurin osa geenien tunnistettu kromosomissa 19 rajoittuivat 19p13 ( 70%, 43 58), ja kaikki kromosomi 21 hypoM geenit kartoitetaan 21q22 (9/9).

Dicussion

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet rakenteessa ero metylaation perusterveydenhuollossa NB näytteitä mikrosirujen -pohjainen DNA metyloituvuutta. Valvomatta PCA osoitti, että DNA: n metylaation profiileja NB ovat selvästi eroavat kliinisesti vähemmän aggressiivisia GNB ja hyvänlaatuisia GN ja normaali vertailunäytteet Tässä tutkimuksessa käytettiin (kuvio 1A). Differential DNA metyloituvuutta käyttäen tiukat kriteerit meille mahdollisuuden tunnistaa DNA metylaatiomuutokset ominaisuus NB kasvaimia. Mielenkiintoista on, että kuvio hyperM ja hypoM havaittiin liittyvän klinikalla-biologisesti merkityksellisten alaryhmien NB kasvaimia. Tarkemmin sanottuna DNA metylaatio hyperM geenien antanut meille mahdollisuuden erilaistua NB monipuolista

MYCN

vahvistusta tila. HypoM geenit erillisiä tapauksissa iän diagnoosin, kokosi ne, joilla on 5 tai enemmän vuoden erillään nuoremmilla potilailla (kuvio 1 D). Ohjattu DNA metyloituvuutta verrataan tunnettujen NB kliinisen alaryhmien varmistunut, että erilaisesti metyloitua geenien korkean ja matalan riskin kasvainten,

MYCN

A NA kasvaimia sekä vaihe 4 vaiheesta 4S NB. Aiemmat raportit analysoidaan erityisiä kandidaattigeenit ovat tunnistaneet hypermetyloitunut liittyviä geenejä

MYCN

vahvistus tilaansa NB solulinjoissa ja kasvaimia [4], mikä vahvistavia olemassaolo alaryhmä-spesifisen DNA metylaatiovyöhykkeiden NB. Kuitenkaan mitään johdonmukaista DNA metylaatioerojen tunnistettiin verrattaessa alaryhmiä käyttämällä kliinisesti vahvistettu ennustetekijöiden ikä cut-off 18 kuukautta. Sitä vastoin mukaisesti analyysi on esitetty kuviossa 1D, johdonmukainen menetys DNA: n metylaation potilailla havaittiin alle 5 vuotta verrattuna vanhemmilla potilailla ja vertailunäytteet (taulukko S2C). NB, ikä diagnoosin aikana on voimakas merkki kasvaimen käyttäytymisen ja on siten kriittinen ennustetekijöiden arvioinnissa Kehittämisprojektin pahanlaatuisen [32]. Perinteisesti potilaan ikä on analysoitu binary toiminto, jossa on rajakohta aluksi vahvistettu 12 kuukautta, ja viime aikoina asetettu optimaalisemmalla ennustetekijöiden ikä cut-off 18 kuukautta [32]. Kuitenkin kansainvälinen Neuroblastooma Pathology Classification (jäljempänä Shimada järjestelmä) arvioi ennustetekijöiden vaikutus histologiset piirteet kasvaimen harkitsee kahden ikäryhmän cut-off klo diagnoosi: 18 kuukautta ja 5 vuotta [33]. Mielenkiintoista, vaikka havaitsimme ikääntymiseen liittyvien DNA metylaation muistuttaa näistä kahdesta ikä cut-off, ne olivat yhdenmukaisia ​​käyttäen 5 vuotta cut-off.

Kaiken havaitsimme, että menetys DNA: n metylaatio on yleisempää kuin promoottori hyperM NB. Tämä on linjassa tunnettu globaali hypometylaatio syöpäsolujen DNA, yleensä uskotaan vaikuttavan toistuvat sekvenssit ja satelliitin DNA ja edistää sukupolven kromosomi epävakauden [2]. Näin ollen, geeni-spesifisten hypometylaatio ei ole tutkittu laajasti. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että hypoM vaikuttaa geenien merkitystä NB synnyssä kuten

CCND1

. Sykliini D1 on säädin alayksikkö sykliiniriippuvaisten kinaasien vaaditaan solusyklin G1 /S-siirtymä, joka on kuvattu ilmentyy suuresti eri kiinteitä kasvaimia sekä yli 75% NB. Syy

CCND1

yliekspressio näissä kasvaimissa on suuresti tuntematon. Korkean tason amplifikaatioita

CCND1

on raportoitu vain pieni osa (2%) NB kasvaimia [10]. Siksi muiden mekanismien kuin geenimonistuman näyttävät olevan vastuussa lisääntynyt

CCND1

ilmaisun [34]. Äskettäin

GATA3

, transkriptiotekijä yli-ilmennetään NB, on raportoitu olevan osallisena

CCND1

yliekspressio [35]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme menetys

CCND1

geenin metylaatio yli 70%: n NB kasvainten analysoitiin, liittyy korkea

CCND1

ekspressiotasot ja puuttuessa geenin monistamisen (tuloksia ei ole esitetty) . Differentiaalisesti metyloitu CpG: t eivät lokalisoitu promoottorialueen mutta 3′-alueen (kuvio 2A). Mielenkiintoista, tietojen perusteella saatavilla UCSC Genome Browser (GRCh37 /hg19), 3′-UTR

CCND1

on kehittyvä konservoitunut DNAseI yliherkkä verkkotunnuksen erittäin runsaasti microRNA kohdesivustot ja transkriptiotekijä sitoutumiskohtia, kuten

GATA3

,

MYC

,

FOXA1 /2

ja

JUND

mm. Kokeelliset tiedot tukevat toiminnallista roolia 3′-UTR alue ilmaus

CCND1

on raportoitu vaipan solulymfooma (MCL), jossa lisäksi fuusio

CCND1

geeni kromosomissa 11 olevan immunoglobuliinin raskaan ketjun tehostaja, menetys 3′-UTR on liitetty hyper-proliferatiivinen MCL [36]. Kuitenkin

CCND1

uudelleenjärjestelyjä mikä johtaa 3′-UTR on havaittu vain hyvin pieni osa NB [10]. Huomionarvoista, meidän sarjassa

CCND1

hypoM tapahtuu, kun läsnä on

RASSF1A

promoottori hyperM. Valikoiva epigeneettisellä vaiennettu

RASSF1A

on yleinen tapahtuma ihmisen syövässä, mukaan lukien NB jossa se on raportoitu hypermetyloitunut 75% kasvaimista [5], [25]. Ras yhdistys verkkotunnuksen perhe 1 isoformin A on tuumorisuppressorina joka säätelee negatiivisesti solujen lisääntymistä estämällä sykliini D1 proteiinien kertymistä kautta posttranskriptionaalisella mekanismien [37].

RASSF1A

hyperM on aiemmin käänteisesti yhteydessä sykliini D1 ilmentyminen ja kasvainsoluproliferaation [38]. On siis houkuttelevaa spekuloida, että menetys

CCND1

geenin metylaatio 3′-UTR säätelyalueen ja samanaikainen hypermetylaatiota

RASSF1A

voisi olla potentiaalinen mekanismi taustalla

CCND1

geeni yliekspressio Huom.

menetys metylaation vaikuttaa myös geenit syöpään liittyviin biologisiin toimintoihin eli

SPRR3

, aikaisemmin raportoitu hypometyloidut syövän, erityisesti maksasolukarsinoomassa [39]. Yliekspressio

SPRR3

on raportoitu edistää rintasyövän ja paksusuolen syövän leviämisen tehostamalla p53 hajoamisen kautta

AKT

ja

MAPK

reittejä [40], [41]. HypoM vaikuttaa myös geenit raportoitu stimuloivan solujen lisääntymistä, eli

BTC

,

EGF

ja

FGF6

. Beetaselluliini, jäsen EGF-perheen, on viime aikoina raportoitu aiheuttavan leviämisen hermoston kantasoluja ja estää spontaania erilaistumista soluviljelmässä kautta sekä EGF-reseptorin (

EGFR

) sijaitsee NSCs ja

ErbB4

on alkeisneuroblasteja [42]. Epidermikasvutekijän toimii myös kautta EGFR edistää solujen lisääntymistä ja neoplastisen transformaation.