Krooninen sairaus

tiivistelmä

Valmistuessa ihmisen genomin, Biolääketieteiden merkitty ”omiikka” aikakausi, lähinnä korkean suoritustehon genomiikka tekniikoita ja viimeaikainen soveltaminen massaspektrometriaa Proteomiikan analyysejä. On kuitenkin vielä viivettä näiden teknologisen kehityksen ja niiden soveltamista kliinisessä ympäristössä. Työmme on suunniteltu rakentaa siltoja korkean suorituskyvyn proteomiikan ja kliinistä rutiinia. Proteiini uutteet saatu tuore normaalin keuhkokudoksen ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä näytteitä. Me soveltanut Phosphopeptide rikastamiseen seurasi LC-MS /MS. Myöhemmät label-vapaa kvantifiointi ja bioinformatiikan analyysit tehtiin. Arvioimme proteiini kuvioita näistä näytteistä, jotka osoittavat kymmeniä ero merkkiaineiden välillä normaalin ja kasvainkudoksen. Gene ontologia ja interactome -analyyseissä signalointireitteihin muuttunut kasvaimen kudokseen. Olemme tunnistaneet kaksi proteiinia, PTRF /cavin-1 ja MIF, jotka ilmentyvät differentiaalisesti normaalin keuhkojen ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Nämä potentiaaliset biomarkkerit validoitiin käyttäen western blot ja immunohistokemia. Soveltaminen löytö perustuvan proteomiikan analyysit kliinisistä näytteistä antoi meille mahdollisuuden tunnistaa uusia potentiaalisia biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, Calvo E, Agulló-Ortuño MT, López-Vacas R, Díaz E, et ai. (2012) PTRF /Cavin-1 ja MIF Proteiinit tunnistetaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä biomarkkerit Label-Free proteomiikka. PLoS ONE 7 (3): e33752. doi: 10,1371 /journal.pone.0033752

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ”, Italia

vastaanotettu: 01 joulukuu 2011; Hyväksytty: 16 helmikuu 2012; Julkaistu: 26 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Gámez-Pozo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia FIS CP05 /00248, PS09 /01597, Red Temática de Investigación Cooperativa en syöpä (RTICC, RD06-0020-1022) Carlos III Institute of Health (Espanjan tiede- ja innovaatio, Espanja) ja tutkimusapurahoja jonka mutua Madrileña Foundation. ISN tukee Foundation for Biomedical Research La Paz yliopistollisessa sairaalassa. ED tukevat avustus CA10 /01447 Carlos III Institute of Health. Espanjan kansallinen keskus Sydäntutkimussäätiö tukee Espanjan tiede- ja innovaatio sekä ProCNIC Foundation. IdiPAZ Biopankkiverkosto tukee Carlos III Institute of Health, Espanjan terveysministeriön (retic RD09 /0076/00073) ja Farmaindustria kautta yhteistyö Program Clinical and translaatiotutkimuksen yhteisön Madridin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmassa. Yleinen eloonjääneitä 5 vuoden on 15% ja ei ole parantunut vuosikymmeniä. Kahdella kolmasosalla potilaista diagnosoidaan edennyt sairaus, jossa terapeuttiset vaihtoehdot ovat lievittävä, ja jopa 55%: lla potilaista, joilla rajoitettu sairaus lopulta relapsi radikaaleja [1].

geeniekspressioprofilointi on johtanut tunnistamiseen ryhmien potilailla, joilla on eri lopputulokseen, mikä kuvastaa epäyhtenäisyyttä tämän taudin [2]. Kuitenkin geeni tason analyysit eivät havaitse hienoisia muutoksia aiheuttamia translaation jälkeisiä modifikaatioita proteiinien [3]. Syvä ymmärrys prosessien syövän, kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden vaatii selvitystä sekä genomin ja proteomiin [4]. Proteomic teknologiat perustuvat massaspektrometriaa (MS) ovat nousseet parempana komponenttien strategian löytää diagnostisia, prognostisia ja terapeuttista proteiinia biomarkkerit [5]. Jatkuvat alan kehityksestä antavat tämän strategian valtava potentiaali tällaisista tutkimuksista [6], [7].

Viimeaikaiset kliiniset kokeet osoittavat hyvä vaste uusien lääkkeiden tietyillä potilasalaryhmissä korostavat tarvetta molekyylitestejä että täydennys klassinen histopatologisia menettelyt [8]. Tässä yhteydessä proteomic profilointi voi antaa arvokasta biomarkkereiden työkalut tehokkaaseen potilaan kerrostuminen ja hoidon valinta.

Vaikka on mahdollista analysoida proteiinien kudoksista käyttämällä massaspektrometriaa [3], [9], monimutkaisuus kliinisen näyte ja käytettävissä oleva proteiinin rajoittavia tekijöitä. Siksi näyte rikastus biologisesti relevantti analyyttien vaaditaan [5]. Useimmat eukaryoottisoluilla säätelee proteiinien fosforylaation, ja vapautuminen tämän avaimen translaation jälkeiset muutos on yleistä syöpää ja muita sairauksia. Tämä selittää, miksi proteiini kinaasien ovat nousseet tärkein luokan uuden lääkkeen tavoitteita onkologian ja muilla aloilla [10]. Tässä työssä olemme käyttäneet Phosphopeptide rikastamiseen yhdistettynä merkkivapaalla MS tekniikoita tunnistaa jo tunnettuja ja uusia mahdollisuuksia biomarkkereita ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kliininen kudoksia ja vahvistaa niitä käyttämällä western blot ja immunohistokemia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Institutional hyväksyntää eettisen komitean saatiin varten tutkimuksen tekeminen (Comité Ético de Investigación Clínica, sairaala Universitario La Paz). Tiedot analysoitiin anonyymisti. Potilaat toimitti kirjallisen suostumuksen, jotta niiden näytteiden ja kliinisiä tietoja voitaisiin käyttää tutkimustarkoituksiin.

Näytteiden valinta

Jäädytetyt näytteet potilailta diagnosoitu keuhkosyöpä haettiin patologian osaston of Hospital Universitario La Paz (Madrid, Espanja): 5 keuhkon adenokarsinooma (AC), 5 keuhkojen okasolusyöpä (SC) ja 5 normaali keuhko (NL) näytteet. Histopatologisen ominaisuuksia kunkin näytteen tarkistettiin kokenut keuhkojen patologi vahvistaa diagnoosin ja kasvaimen sisältöä. Vähintään 50% näytteestä oli tehtävä jopa syöpäsolujen jotta se olisi oikeutettu. Näytteitä potilasta ystävällisesti antamat IdiPAZ Biopankkiverkosto (RD09 /0076/00073) integroitu espanjalainen Hospital biopankeista Network (RetBioH; www.redbiobancos.es). Näytteitä on rekisteröity ja käsitellä seuraavat nykyiset menettelyt ja kiinteä /jäädytetty heti niiden vastaanottamisen jälkeen.

Yhteensä proteiiniuutto, liukenemisen ja ruoansulatus

Näytteet leikattiin Leica CM3050S, säädetty saaminen 10 osat 10 mikronia paksuus kussakin. Tissue käsittelyssä oli TRIzol reagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. MS-analyysit, proteiini suspendoitiin uudestaan ​​guanidiinihydrokloridia 6 M ja kuumennetaan 10 minuuttia 95 ° C: ssa sekoittaen. Sen jälkeen 950 ui 50 mM ammoniumbikarbonaattia (pH 7-9) per näyte lisättiin. Proteiini näytteen konsentraatio mitattiin MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific). Trypsiini MS Grade Gold (Promega) lisättiin kuhunkin näytteeseen on 01:50 suhteessa. Digestio suoritettiin yön yli 37 ° C: ssa. Poltettu näyte jaettiin kahteen erään.

Parallel IMAC (PIMAC) B

Phosphopeptide väkevöiminen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Lyhyesti, Fe (III) -pohjaisen IMAC suoritettiin yhtenä eränä pilkotun proteiinin käyttäen PHOS-Select Iron Affinity Gel (Sigma-Aldrich) noudattaen valmistajan ohjeita. Ga (III) -pohjaisen IMAC suoritettiin toinen alikvootti sulaneen proteiinin avulla Phosphopeptide Isolation Kit (Pierce-Thermo Scientific) seuraten valmistajan ohjeita. Eluaatit sekoitettiin, kuivattiin tyhjössä ja säilytettiin -20 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten MS-analyysiä.

LC-MS /MS-analyysit

Peptide seoksia altistettiin nano-nestekromatografia yhdistettynä MS proteiinin tunnistaminen. Peptidit injektoitiin C-18 käänteisfaasi (RP) nano-kolonniin (100 um ID ja 12 cm, Mediterranea meri, Teknokroma) ja analysoitiin jatkuvasti asetonitriilin gradientilla, joka koostuu 0-40% B 90 min, 50-90 % B 20 min (B = 95% asetonitriiliä, 0,5% etikkahappoa). Lopussa kaltevuus, kolonni pestiin 90% B ja tasapainotettiin 5% B 20 min. Virtausnopeutta 300 nl /min käytettiin eluoimiseksi peptidejä RP nano-sarakkeen päästöiltään nanospray neulaa reaaliaikaiseen ionisaatioon ja peptidifragmentaatiota koskevasta LTQ-Orbitrap XL massaspektrometri (Thermo Fisher). Parannettu FT-spektrin (resoluutio = 60000), jonka jälkeen MS /MS-spektri viidestä voimakkain emoionien analysoitiin pitkin kromatografisen ajon (130 min). Dynaaminen syrjäytyminen asetettiin 1 min. Proteiinien tunnistaminen pirstoutuminen spektrit etsittiin vastaan ​​msdb tietokannan (versio 091509) käyttäen Mascot 2,1 ohjelma (Matrixscience). Kaksi jäi katkeamiset annettiin, ja virhe kuin 10 ppm 0,8 Da asetettiin täysi MS tai MS /MS-spektri hakuja, vastaavasti. Kaikki tunnistuksiin suoritettiin Proteome Discoverer 1.0 ohjelmisto (Thermo Fisher). Decoy tietokanta etsiä väärien löytö korko analyysi asetettiin 0,05 soveltamalla vastaavat suodattimia. Raw tiedostoja käsiteltiin ja verrattiin SIEVE versio 1.2 (Thermo Fisher). Proteiini tunnistuksiin validoitiin käyttäen BLAST työkalu Blastp- suite (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Yksityiskohtaisia ​​peptidi massa sormenjälkien ja proteiinin tunnistamiseen, katso taulukko S4.

Inmunoblotting määrityksissä

inmunoblotting määrityksiä, proteiini pelletit resuspendoitiin 2% SDS ja kuumennetaan 10 minuuttia 95 ° C: ssa sekoittaen . Proteiini näytteen konsentraatio mitattiin MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific) .Western blotit suoritettiin käyttämällä WesternDot järjestelmä (Invitrogen) kanssa SNAP i.d. laite (Millipore). MIF-vasta 1: 250 laimennus (R 0,05 pidettiin merkittävänä. SIEVE ja tiheysmittaus verrattiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa.

Bioinformatics

Proteiini luetteloita käsiteltiin käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) versio 2.0 (http: //david. abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) [12], [13]. Tunnistaa ali- ja yliedustettuina toimintakategorioihin käytimme Protein analyysiin Evolutionary Ihmissuhteet (PANTHER) tietokanta v 6,1 (www.pantherdb.org) [14]. Tuumoriproteiinia lista verrattiin normaaliin keuhkojen listan avulla binomimallia testi [15] kullekin molekyyli- toiminnon, biologisen prosessin tai polku aikavälillä PANTHER. Proteiini-proteiini-vuorovaikutusten saatiin Search Tool haettaessa Vuorovaikutus Genes /Proteiinit (STRING) tietokanta v9.0 sisältää tunnettuja ja ennustettu fyysisen ja toiminnallisen proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia [16]. STRING proteiinia tilassa käytettiin, ja vain vuorovaikutukset perustuu kokeellisessa proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen ja kuraattorina databases- luotettavuusasteikolla yli 0.5- pidettiin.

Tulokset

Tässä tutkimuksessa arvioimme eroja proteiinitasolla välillä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja keuhkojen normaalin kudoksen käyttää Phosphopeptide rikastamiseen strategia ja tarra-vapaa lähestymistapa. Näytteet analysoitiin LTQ-Orbitrap XL jälkeen suoritettiin nestekromatografialla. Koska on tunnettua, että eri tekniikoita eristää erillisiä ja päällekkäisiä segmenttejä phosphoproteome [17], mukaan lukien Fe (III) ja Ga (III) IMAC [18], me sekoitetaan Fe (III) ja Ga (III) IMAC fraktioita kustakin näyte ja analysoidaan ne yhteen.

arvioitiin ainutkertaisten peptidien ja niiden vastaavien proteiinien sekä fosfopeptidejä ja niiden vastaavia fosfopro-, tunnistettu keuhkoadenokarsinooma (AC), keuhkojen okasolusyöpä (SC) ja normaali keuhko (NL) näytteet levittämällä houkutuslintuna tietokantahaku at vääriä löytö asti 0,05. Laaja analyysi suoritetaan NSCLC ja NL näytteitä LC-MS /MS antoi meille mahdollisuuden tunnistaa keskimäärin 381 ainutlaatuista peptidien näytettä kohti, joista keskimäärin 56 oli fosfopeptidit. Nämä peptidit vastasivat keskimäärin 138 proteiineja tunnistettiin näytettä, joista keskiarvo 39 fosforyloitiin. Osa fosfopeptidejä tunnistettu (lukumäärä fosforyloidun peptidien * 100 /tunnistettujen peptidien) oli 19,9%.

Gene ontologia analyysit suoritettiin käyttäen kaikkia yksilöityjä proteiineja. Kasvain proteiini lista verrattiin tavanomaiseen keuhkojen proteiinia luettelo kunkin molekyyli toimintoa (kuva S1), biologisen prosessin (kuva S2), tai polku (kuva 1) suhteen käyttäen PANTHER. Tämä lähestymistapa osoitti merkittäviä eroja normaalin keuhkojen ja kasvainten näytteitä (täydellisiä analyysejä on esitetty taulukossa S1). Erot molekyyli- toiminnot liittyvät pääasiassa vuorovaikutusta nukleiinihapot ja sääntelyn proteiinisynteesiä ja aktiivisuutta. Prosessit, jotka ohjaavat eksosytoosilla, immuunivaste, vastauksena ärsyke, reaktio stressiin ja liikenne olivat merkittävästi aliedustettuina kasvaimia, kun taas luokat liittyvät soluväliaineen tarttumisen vastauksena toksiinia yliedustettuna. Toisaalta, homeostaasin luokat olivat aliedustettuina, kun taas luokat liittyvät energiantuotantoon ja soluproliferaatiota olivat yliedustettuna kasvaimia. Huomattavia eroja koulutusjakson analyysi ilmestyi ryhmiin liittyvät signaalitransduktion ohjaus. Vaikka cytoskeletal sääntelyä Rho GTPaasi, tulehdusta välittävät kemokiinin ja sytokiinien signalointireitin integriinin signalointireittiä ja Wnt-signalointireitin olivat aliedustettuja Tuumorinäytteissä, EGF-reseptori-signalointireitin, Glykolyysi, p53-reitin ja PI3 kinaasireittiä olivat yliedustettuina.

vertailu useita proteiineja kullekin GO reitin luokka. Normaali kudosnäytteestä kategorioiden kuten kertamuutosta suhteessa tähän ryhmään. Tilastollinen merkitys testataan käyttämällä binomisen testi. Vain merkittävät luokat (p 0,05) on esitetty.

Differential ilmentymisanalyysiä välillä NSCLC vs. normaali keuhko suoritettiin käyttäen SIEVE 1.2 ohjelmistoa. Yhteensä 296 differentiaalisesti ilmaistuna m /z piikit havaittiin, 115, joka oli saatavilla MS2 spektri, mikä johtaa proteiinien tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmaistuna normaalin keuhkojen ja NSCLC näytteitä (taulukko 1). Kaikki saadut SIEVE analyysit, myös suhteellinen ilmaisu arvot, on esitetty taulukossa S2.

PTRF /cavin-1 ja MIF ulokkeellisille joukossa ilmentyvät eri biomarkkereita välillä NSCLC ja normaalin keuhkojen näytteiden merkkivapaalla analysoi kaikkein alassäädetty ja säädelty vastaavasti (kuva 2). PTRF /Cavin-1 osoitti menetyksen ilmaisun sekä adenokarsinooma ja okasolusyöpä näytteitä. Toisaalta, MIF osoitti voimistunutta ilmentymistä näissä näytteissä. Jotta vältettäisiin väärien positiivisten tunnistusten, yli kaksikymmentä MS2 spektrit kullekin MIF ja PTRF /cavin-1 peptidit arvioitiin manuaalisesti (kuviot S3 ja S4 ja taulukko S3). Muutokset PTRF /cavin-1 ja MIF ilmaisun NSCLC näytteet validoitu käyttämällä immunohistokemiallinen (IHC) ja western blot-analyysit. Sama käytetyt näytteet MS /MS-analyysit ja yhdeksän lisänäytteitä adenokarsinooma, okasolusyöpä ja normaali keuhkojen arvioitiin MIF ja PTRF käyttämällä western blot. Viisi lisänäytteitä adenokarsinooma, okasolusyöpä ja normaali keuhkojen arvioitiin MIF ja PTRF avulla IHC. Kaikki kasvaimet osoittavat positiivista värjäytymistä MIF ja negatiivinen värjäytyminen PTRF, vaikka kaikki normaalit kudokset olivat negatiivisia MIF ja positiivisia PTRF värjäystä. MIF yli-ilmentyminen kasvaimen kudoksissa varmistettiin sekä IHC ja western blot (kuviot 3 ja 4). Toisaalta, kasvain näytteet varmistuvat menetys PTRF /cavin-1 ilmentymisen verrattuna normaalin keuhkokudoksen (kuviot 3 ja 4) käyttäen sekä tekniikoita. Pearsonin korrelaatiota Sieve label-vapaan ilmaisun arvot ja western blot kvantifiointiin oli r = 0,723 ja r = 0,754 (p 0,005) ja MIF ja PTRF /cavin-1 vastaavasti.

Boxplots edustavat keskiarvoa ja kahdeskymmenesviides-seitsemäskymmenesviides prosenttipiste ; viikset edustaa minimi ja maksimi. Mittaukset saatiin viideltä eri näytettä kussakin kunnossa. Kruskall-Wallisin testi p-arvot näkyvät. AC: Adenokarsinooma; SC: Okasolusyöpä; NL: Normaali keuhko.

a) Western blot kokonaisproteiinia uutettu osoitettu näytteistä, käyttäen anti-MIF ja anti-PTRF /cavin-1 ensisijainen vasta-aineita. b) Densitomet- analyysit western blot. ImageJ 1.38e ohjelmisto käytettiin mittaamaan intensiteetti bändejä. Kaikki arvot mielivaltaisina yksikköinä. c) immunohistokemia on ilmoitettu näytteiden, käyttäen anti-MIF ja anti-PTRF /cavin-1 ensisijainen vasta-aineita. AC: Adenokarsinooma; SC: Okasolusyöpä; NL: Normaali keuhko.

Box-Plot kaavioita PTRF ja MIF western blot kvantifiointiin käytetään ImageJ 1.38e ohjelmistoa. Kaikki arvot mielivaltaisina yksikköinä. Jokainen laatikko sisältää arvot yhdeksästä eri näytteistä. Erot normaalin ja kasvaimen näytteet p 0,005 kummassakin tapauksessa (Kruskall-Wallisin testi).

etsitään STRING tietokantaan interactomic yhteyksiä MIF ja PTRF. Jotta minimoidaan määrä vääriä positiivisia, me eliminoitu kumppanit käyttävät tiukat, ja vain kokeellinen proteiini-proteiini vuorovaikutusten ja tapoja valmistaa kuratoituja tietokannoista otettiin huomioon. PTRF sisältyy RNA-transkription polku, ja fyysisesti vuorovaikutuksessa TTF1. Muut PTRF vuorovaikutukset sisältävät proteiineja, jotka liittyvät transkription säätelyyn ja EGFR (kuva 5). MIF liittyy fenyylialaniinin metaboliareittiin, ja on vuorovaikutuksessa p53: n kanssa ja proteiinien COP9 signalosomi monimutkainen, kompleksi osallistuu eri solu- ja kehitysprosesseja, mukaan lukien p53 fosforylaatio-välitteinen hajoaminen [19]. Muut yhteisvaikutukset käsittävät proteiineja, jotka liittyvät solukuolemaan sääntelyä ja tulehduksellinen prosessi (kuva 6).

Kuvaaja PTRF verkon rakennettu STRING v9.0 näkyy. Eri linja värejä edustavat erilaisia ​​todisteita varten yhdistys: vaaleanpunainen kokeisiin ja sininen tietokantoja.

Kuvaaja MIF verkon rakennettu STRING v9.0 näkyy. Eri linja värejä edustavat erilaisia ​​todisteita varten yhdistys: vaaleanpunainen kokeisiin ja sininen tietokantoja.

Keskustelu

Proteomiikka yleensä ja phosphoproteomics erityisesti ovat tulossa suosituin menetelmiä proteiinin löytö-analyysin perusteella. Käyttö merkkivapaalla, löytö lähestymistavat voivat auttaa löytämään odottamattomia biologisia yhteyksiä puuttumisen vuoksi aiempien tiedon puolueellisuudesta. Bioinformatiikka työkaluja, kuten geeni ontologian ja interactome analyysejä, sovelletaan kliinisistä näytteistä on loistavat mahdollisuudet tunnistaa polkuja ja molekyylien implisiittisesti terapeuttisen tason ja voivat tarjota vihjeitä Genesis sairauksista ja niiden taustalla molekyylitason muutoksia. Sekä teknologia itsessään ja tietojen analysointi työkaluja pitäisikin vielä tarkentaa ennen niiden tuloa klinikalle.

Phosphopeptide rikastuminen näytteitä ennen MS-analyysillä käyttäen PIMAC toimi kohtuullisen hyvin, sillä 20% mitatusta peptidien fosforyloitiin. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet rikastuminen fosfopeptidejä noin 50% käyttäen IMAC protokollaa sama kuin meidän trypsiinisoija Digest seosta useiden viite proteiinien [20]. Ottaen huomioon, että näytteet olivat hyvin monimutkaisia ​​ja että emme käytä mitään Fraktiointivaiheeseen, Phosphopeptide rikastus oli onnistunut ja verrattavissa saatu aiemmista teoksista [21], [22]. Kuitenkin suurin osa spektreissä osoittavat fosfaatti menetys esitetty huono pirstoutuminen, eikä peptidi tunnistaminen saatiin aikaan. Uusien pirstoutuminen tekniikoita, kuten korkeamman energian collisional dissosiaatio, parantaa pirstoutumisen spektrien [23], joiden avulla voidaan suorittaa laajamittaista phosphoproteome analyysi.

Gene ontologia analyysit biologisen prosessin ja reitit osoitti kasvua luokat liittyvät energiantuotantoon soluissa, kuten glykolyysiin ja sukupolven esiasteen aineenvaihduntatuotteiden ja energiaa. Nämä erot energia-aineenvaihdunnan normaalin ja kasvaimen solut tunnetaan Warburg vaikutus [24]. Vuodesta signalointipolkujen aliedustus NSCLC kudoksissa, chemokine- ja sytokiinivälitteisiä tulehdus on aiemmin osoitettu olevan aliedustettuina NSCLC [25]. On merkillistä liiallinen edustus proteiinien kuuluvat EGFR signalointireitin, tilanteessa, jossa kliininen käyttö EGFR: n estäjien on tullut paradigma yksilöllisiä hoidon NSCLC [26], [27], [28].

yli 10% havaittujen peptidien osoitti ero ilmaisun välillä normaalin ja kasvaimen näytteitä. Prosenttiosuus ero peptidejä oli alle 2% verrattaessa adenokarsinooma ja keuhkon okasolusyöpä näytteitä, mutta silti oli huomattavia eroja näiden kahden NSCLC histologinen alatyyppi, kuten olemme aiemmin osoittaneet [11].

Olimme kyettävä toteuttamaan vahvistus NSCLC mahdollisia biomarkkereita yksilöityjen haulikko proteomiikka-analyysit IHC ja western blot lähestymistapoja. MIF (makrofagien migraatiota estävä tekijä) syrji normaali keuhko ja NSCLC näytteitä. Tämä hyvin tunnettu tekijä on tulehdusta edistävä sytokiini, joka kykenee toimimaan liukoisen kasvutekijä, ilmentää ja erittää vasteena mitogeeneille ja integriini-välitteiset signaalit. MIF-proteiinin on mukana monissa maligniteettien, koska se edistää solujen transformaatio, estää sytolyyttisen immuunivasteen kasvainsoluja vastaan ​​ja edistää uudissuonittuminen [29]. Interactome analyysit paljastivat läheinen suhde solukuoleman sääntelyn ja MIF, ja se ei ole yllättävää, että MIF yli-ilmentyminen oli kuvattu monissa syöpätyyppien, kuten peräsuolen syöpä, rintasyöpä, eturauhas-, iho- ja keuhkosyöpä [30], [31], joilla on merkittävä rooli kehitettäessä kasvainten keskushermostossa [32]. Kasvaimet koekspressoivat MIF ja sen kalvo reseptori (CD74-proteiini) ovat kasvaneet vascularization [33]. Vaikka on olemassa useita molekyylejä, jotka estävät entsyymiaktiivisuutta MIF, sen korkea IC 50 on rajoittanut sen kliinisessä käytössä toistaiseksi [34], mutta uudet molekyylit ovat nykyisen kehityksen [35]. Tuloksemme osoittavat lisääntynyttä ilmentymistä MIF NSCLC näytteissä merkkivapaalla proteomiikka, vahvistivat sekä western blot ja immunohistokemia.

PTRF (Polimerase I ja Transcript Release Factor), joka tunnetaan myös cavin-1, on proteiini välttämättömiä RNA transkriptio [36] ja kaveoleja muodostumisen [37]. Nämä kohtiin, solun pinnan liittyvät prosessit vesicular liikenteen, kolesterolin homeostaasin, signaalitransduktion [38] ja lipolyysiä ohjaus [39]. Siksi ei ole yllättävää, että PTRF /cavin-1 mutaatioita, joilla on synnynnäinen yleistynyt lipodystrofiaan, tyyppi 4 ihmisillä [40]. PTRF /Cavin-1 colocalizes kanssa caveolin 1 (CAV1) sisällä kaveoleja [41], ja positiivisesti moduloi sen ilme [42]. Interactome analyysien mukaan PTRF satamat tuntematon toimintoja pidemmälle joitakin äskettäin kuvattu [43], [44], [45]. Menetys PTRF /cavin-1 ilmentymisen eturauhassyöpä on liittynyt etenemiseen [46], ja se on osoittanut, että sen ilmentyminen vähenee migraation PTRF /cavin-1-puutteellisten syöpäsolujen [47]. Menetys PTRF /cavin-1 ilmentymisen tuumorigeenisiä HBE-soluissa verrattuna normaaliin ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa on osoittautunut viime aikoina [48]. Bai ja kollegat ovat raportoineet äskettäin, että PTRF proteiini alassäädetty rintasyövän solulinjoissa ja rintojen kasvainkudoksen, ja että alas-säätely PTRF rintasyöpäsoluissa liittyi promoottorin metylaation [49]. PTRF /cavin-1 fosforyloitua lajeja on kuvattu soluihin, jotka yli-express EGFR, mikä viittaa siihen, funktio tässä signalointireitillä [50]. Meidän label-vapaa proteomiikan tulokset osoittavat, että PTRF ilmentyminen häviää NSCLC näytteissä. Nämä tulokset vahvistettiin käyttäen sekä western blot ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa PTRF /cavin-1 tappio ilmentymisen NSCLC kasvainkudoksen proteiinitasolla. Tämä menetys ilmaisun yhdessä PTRF-EGFR vuorovaikutus ja EGFR reitin sääntelyn purkamisen NSCLC näytteissä, viittaa rooli PTRF NSCLC kehittämiseen.

Työmme osoittaa, että on mahdollista tunnistaa mahdolliset biomarkkerit käyttämällä merkkivapaalla ero proteomiikka strategia todellisiin kliinisistä näytteistä. Olemme tunnistaneet useita ero markkereita, joista kaksi todensi vaihtoehtoisia klassisen proteomic menetelmiä. Lisäksi osoitamme, että geeni ontologian ja vuorovaikutus analyysit voivat tunnistaa reittejä ja prosesseja lippusi kasvainkudoksen, jotka voivat tarjota vihjeitä Taudin synty ja sen taustalla molekyylitason muutoksia, ja voi olla altis hoitointerventio. Tässä mielessä tämä työ osoittaa, että PTRF rooli NSCLC ja sen suhde EGFR polku ansaitsee syvemmin.

tukeminen Information

Kuva S1.

analyysi eroista GO Molecular Function välillä NSCLC ja normaali keuhko. Vertailu määrä proteiineja kullekin GO reitin luokka. Normaali kudosnäytteestä kategorioiden kuten kertamuutosta suhteessa tähän ryhmään. Tilastollinen merkitys testataan käyttämällä binomisen testi. Vain merkittävät luokat (p 0,05) on esitetty.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s001

(TIF) B Kuva S2.

analyysi eroista GO Biological Process välillä NSCLC ja normaali keuhko. Vertailu määrä proteiineja kullekin GO reitin luokka. Normaali kudosnäytteestä kategorioiden kuten kertamuutosta suhteessa tähän ryhmään. Tilastollinen merkitys testataan käyttämällä binomisen testi. Vain merkittävät luokat (p 0,05) on esitetty.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s002

(TIF) B Kuva S3.

Fragmentation spektriä PTRF SLKESEALPEK tryptisiin peptidi. Kaavio osoittaa fragmentti-ionit vastaavat main pirstoutuminen sarja (b-amino ja y-karboksi). * Tarkoittaa veden menetys; 2+, kaksinkertaisesti veloitetaan fragmentti. Vanhempien ioni on merkitty nuolella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s003

(TIF) B Kuva S4.

Fragmentation spektriä MIF PMFIVNTNVPR tryptisiin peptidi. Kaavio osoittaa fragmentti-ionit vastaavat main pirstoutuminen sarja (b-amino ja y-karboksi). * Tarkoittaa veden menetystä. Vanhempien ioni on merkitty nuolella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s004

(TIF) B Taulukko S1.

Gene ontologia analyysit suoritetaan PANTHER. Normaali keuhko proteiini lista käytettiin viiteluetteloon.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s005

(PDF) B Taulukko S2.

SIEVE label-vapaa kvantifiointiin. Saadut tiedot SIEVE analyysit, myös suhteellinen ilmaisu arvoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s006

(PDF) B Taulukko S3.

PTRF ja MIF MS2 spektrit.

doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s007

(PDF) B Taulukko S4.

Peptidi Massa Sormenjälkien ja Proteiinitunnistus asetukset.

doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s008

(DOC) B

Kiitokset

Haluamme erityisesti tunnustaa tutkimuspotilaat niiden osallistumisesta ja IdiPAZ Biopankkiverkosto integroitu Espanjan Hospital biopankeista Network (RetBioH; www.redbiobancos.es), antelias lahjoja kliinisistä näytteistä käytetään tässä työssä.