Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

monimutkaisuus ihmisen plasman Proteome merkitsee huomattavaa haastetta biomarkkereiden löytö. Proteomiikan analyysi geneettisesti hiirimalleissa syövän ja eristetty syövän solujen ja solulinjojen tarjota vaihtoehtoisia menetelmiä määritettäessä mahdollisia syövän merkkiaineiden olisi havaittavissa ihmisen verestä käyttäen herkkiä määrityksiä. Tavoitteena Tämän työn on arvioida hyödyllisyyttä integroiva strategiaa käyttämällä näitä kahta lähestymistapoja biomarkkereiden löytö.

Menetelmät /Principal Havainnot

tutkineet strategiaa, jossa yhdistyivät määrällinen plasma proteomiikka of munasarjojen syöpä hiirimallissa analyysia proteiinien erittyy tai vuodattaa ihmisen munasarjasyöpä soluja. 106 plasman proteiineihin tunnistettu kohonneeseen kasvaimen kantavissa hiirissä, 58 olivat myös erittyy tai vapautuu munasarjasyöpäsoluja. Loppuosa koostui pääasiassa isännän vasteen proteiineja. 25 tunnistettujen proteiinien tutkimuksessa että analysoitiin, 8 enimmäkseen erittyy proteiineja yhteisiä hiiren plasma ja ihmisen syöpäsolut olivat merkittävästi yliaktiivista joukko plasmat peräisin munasarjasyöpä potilaille. Viisi kahdeksasta proteiinien vahvistettiin voimistuvan toisessa riippumaton joukko munasarjasyövän plasmat, kuten alkuvaiheen tauti.

Johtopäätökset /merkitys

Integrated proteomiikka analyysi syövän hiiren mallien ja ihmisen syöpäsolun populaatiot tarjoaa tehokkaan lähestymistavan tunnistamaan mahdolliset kiertävän proteiinin biomarkkereita.

Citation: Pitteri SJ, JeBailey L, Faça VM, Thorpe JD, Silva MA, Ireton RC, et al. (2009) Integrated proteomiikan analyysi ihmisen syöpäsoluja ja Plasma peräisin kasvain kantavien hiirten varten munasarjasyöpä biomarkkereiden Discovery. PLoS ONE 4 (11): e7916. doi: 10,1371 /journal.pone.0007916

Editor: Alfred Nordheim, Tübingenin yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2009; Hyväksytty: 26 lokakuu 2009; Julkaistu: 19 marraskuu 2009

Copyright: © 2009 Pitteri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat haluta tunnustaa NIH SPORE avustusta, # P50 CA83636 ja # P50 CA105009, National Cancer Institute Early Detection Research Network ja Kanarian Foundation. Daniela Dinulescu on V Foundationin Scholar ja tukee myös Burroughs Wellcome, Rivkin, Munasarjojen Cancer Research, ja Mary Kay Ash Foundations, Dana-Farber Cancer Institute Madeline Franchi ja Moorman palkinnot, ja NIH Mouse Models of Human Cancer Consortium myöntää # U01 CA084301. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

proteiinit havaittavissa seerumissa ja plasmassa ovat yleisesti vedotaan seurata munasarjojen, haiman, ja paksusuolensyöpä hoitovaste ja taudin uusiutumisen kautta mittaus CA125, CA19.9, ja CEA vastaavasti. Lisäksi seulonta ja seuranta eturauhassyövän nykyisin perustuu osittain mittaukset PSA veren [1] – [3]. Kehittää tehokkaita strategioita tunnistamiseksi verenkierrossa proteiinimarkkereita jotka täydentävät nykyinen markkereita olisi hyödyllistä [4]. Useat viimeaikaiset munasarjasyövän tutkimuksissa on käytetty proteomiikka tunnistamiseksi proteiineja munasarjasyövän solujen, kudosten ja nesteiden [5] – [9]. Tällaiset tutkimukset viittaavat siihen satoja potentiaalisia ehdokkaita huomioon yli-ilmentymisen, mutta eivät anna viitteitä siitä, kohonnut veren ehdokas proteiinit voivat esiintyä syöpäpotilailla. Tunnistaminen romaani kiertävän proteiinimarkkereita läpi plasma profiloinnin merkitsee huomattavaa haastetta. Vaikka plasma on yksi helpoimmin biologisten aineiden se sisältää valtavan kokoonpanot proteiinien ja komplekseja ja sillä huomattavaa heterogeenisyyttä välillä ja sisällä aiheista, jotka vaikeuttavat proteomiikka analyysi vähäisessä määrin proteiineihin [10]. Suunniteltu hiiri malleja syövän ominaista rajallinen heterogeenisyys ja suotuisan kasvain kehon massan suhde, ja eristetty kasvainsolupopulaatioissa joka voidaan profiloida toteuttaa huomattavia syvyys hetkellä vaihtoehtoisia strategioita määritettäessä mahdollisia syövän markkereita, erityisesti eritettyjä proteiineja, jotka voidaan suorittaa validointi ihmisen veressä herkillä määrityksiä.

Olemme kehittäneet useita hiiri malleja epiteelin munasarjasyöpä [11]. Nämä mallit on luotu käyttämällä intrabursal toimituksen Adeno-Cre (AdCre) adenovirus kautta infundibulum geenimuunnelluissa hiirillä. Tämä menetelmä aktivoi selektiivisesti onkogeenien ja inaktivoi tuumorisuppressoreita sisällä munasarjojen pinnan epiteeli (OSE), sivusto on peräisin monien ihmisten munasarjojen kasvaimia. Olemme aiemmin tukeutui

LSL-K-ras

G12D /+

ja

PTEN

loxP /loxP

ehdollinen hiiren kantoja (tässä kutsutaan K-ras /PTEN) kehittää hiirimallissa munasarjasyöpä [11] – [13]. Toinen malli kehitettiin rinnakkain meille ym perustuu yhteistyöhön Wnt ja PTEN väyliä (

APC

loxP /lox PTEN

loxP /lox

geneettinen yhdistelmä, jota tässä kutsutaan PTEN /APC) [14]. Molemmat mallit näytteille ominaisuuksia endomet- munasarjojen kasvaimia.

Olemme hiljattain sitoutuneet proteomic profilointi munasarjasyövän solupopulaatioiden lukien solulinjat ja raikas kasvainsolut rikastettu vatsaontelonesteestä, mikä johti tunnistamiseen useita tuhansia proteiineja ja selventänyt ohjelmistoon proteiinien ilmentyvät solun pinnalla ja proteiinit vapautuvat solunulkoiseen miljöö [15]. Proteomianalyysi on paljastanut irtoaminen ylimääräistä domeenit ja erittäin dynaamisia prosesseja proteiinia eritystä. Tässä olemme käyttäneet perusteellisen määrällisen proteomic lähestymistapa [16] – [18] analysointiin plasman proteiineihin muutokset liittyvät kasvainten kehittymistä K-ras /PTEN munasarjasyöpä hiirimallissa määrittää niiden osallistumista väyliä ja verkkojen ja niissä kirjeenvaihto proteiineihin ilmaistu tai vapautuu ihmisen munasarjasyöpä soluja. Sokaisi analyysi ihmisen näytteitä tehtiin mitkä analysoitiin proteiinit integroidun syöpäsolun ja hiiren plasma saadut tiedot tilastollisesti merkitsevää niiden tasojen munasarjasyöpää tapauksissa suhteessa kontrolleihin. Proteiini alaryhmä edustavat lähinnä eritetyt proteiinit yhdistetyistä hiiren plasma ja ihmisen syöpäsolu proteomic data saatu merkittäviä eroja tasojen plasmat munasarjojen syöpäpotilaiden ja plasmaa välillä verrokkien.

Tulokset

Quantitative Plasma proteiini havaitut muutokset munasarjasyöpäsolu Mouse Model

pooli plasmanäytteistä peräisin AdenoCre-tartunnan K-ras /PTEN hiiriä (n = 5) ja altaan adeno-tyhjä pistetään ohjaimet (n = 5) oli altistettiin kvantitatiivinen proteomiikka analyysi määrittää eroja plasman proteiineihin tasoilla. Erilliset plasmapoolin tapauksista ja valvonta tehtiin immunodepletion poistamiseksi runsaasti plasman proteiineihin, jonka jälkeen ero isotooppileimaukseen erottaa syöpätapausta kontrolleihin. Näytteet sekoitettiin ja sitten suoritettiin muuttumattoman proteiinin fraktiointi ioninvaihdolla, jota seuraa käänteisfaasi-kromatografialla. Proteiineja yksittäisten kerätyt fraktiot entsymaattisesti ja alistettiin verkossa LC-MS /MS-proteiinin tunnistaminen ja kvantifiointi (kuvio 1). Piirre IPAS alusta on, että laaja fraktiointi mahdollistaa de-kompleksoivan näytteiden yksittäisiksi jakeet tunnistusta ja pitoisuuden proteiinien läsnä plasmassa yli 6-7 kertaluokkia [16], [19]. Aiemmassa tutkimuksessa on käyttää tätä lähestymistapaa on osoittanut, että kvantitatiivinen analyysi proteiinin muutoksia voidaan luotettavasti määrittää [18]. Tässä tutkimuksessa noin 1.725.000 massaspektrit otettiin talteen ja analysoitiin. 1031 proteiineja tunnistettiin suuri luottamus (taulukko S1). 106 proteiinit voimistunut 1,5-kertainen tai suurempi (p-arvo 0,05) (taulukko S2). Enemmistö (57%) on voimistunut sisältämät proteiinit signaalipeptidin erittämistä varten, kun taas 17% käsitti heidän vastaa geenisekvenssiä trans-kalvo domain. 28%: n voimistunut proteiineja aikaisemmin tunnistettu Proteome profiloinnissa hiiren maksakudosta, merkittävä lähde plasman proteiineihin [20], [21]. 9% ei ollut ihmisen ortologisista määritetty perustuen Hiiri Genome Database [22]. Sen sijaan, 36-proteiineja vaimentua 1,5-kertainen tai suurempi (p-arvo 0,05) (taulukko S3), mukaan lukien eritettyjen proteiinien kanssa, 8, jotka edustavat proteiineja aikaisemmin tunnistettu hiiren maksakudosta.

Kaavio työnkulun käytetään Tämä tutkimus. Altaat valvonta- ja syövän plasman K-ras /PTEN hiirimallissa ensin immunodepleted poistamiseksi runsaasti proteiineja ja sitten merkitty D0- ja D3- akryyliamidia isotooppien erottaa syövän kontrollista. Altaat sekoitettiin ja suoritettiin laaja ehjä proteiini fraktioidaan anioninvaihto-, mitä seurasi käänteisfaasi-kromatografialla. Jälkeen tryptinen digestio, näytteet altistettiin korkean resoluution massaspektrometria ja haulikon LC-MS /MS-analyysi proteiinin tunnistamiseen ja kvantitointiin. Sen jälkeen tilastollinen analyysi ja tiedon louhinta, upregulated proteiinit hiiren plasmassa verrattiin ihmisen askites peräisin kasvainsolujen /tasyöpäsolulinja tiedot. Lisäksi polku analyysiä käytettiin määrittämään merkittäviä biologisia polkuja ja prosesseja. Ilmaisu asiaan ylössäädellään proteiinien edelleen validoitu hiiren ja ihmisen kasvaimissa ja plasman.

vertaileva analyysi kasvaimen omaavien Hiiren plasman ja ihmisen munasarjakasvain Cell proteomeja

Vertasimme hiiriplasmassa tietoja tietojen laaja proteomic tutkimus kolmen ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa (OVCAR3, Caov3, ja ES2) ja kasvainsolujen vesivatsanesteestä saatu munasarjasyöpä potilaalle [15]. Solulinjat koostui kahdesta huonosti eriytetty vakavien adenokarsinoomat (OVCAR3, CaOV3) ja yksi selkeä cell carcinoma (ES2). Askites johdettu kasvaimen solut kerättiin potilaalta, jolla on vakavien munasarjasyöpä. Solut isotooppileimatussa viljelmään käyttäen SILAC [23], jotta varmistamiseen, solun alkuperää proteiinien tunnistettu media. Vertaamalla ilmen- tymisen lisääntymisen hiiren plasman proteiinien luettelon proteiinien rikastettu pinnalla tai erittää solun osiin ihmisen munasarjan syöpäsolujen (taulukko S2), 55% (58/106) ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinien hiiren plasmassa havaittiin vapautetaan munasarjojen syöpäsolut kautta eritystä tai irtoaminen tai rikastettu munasarjasyövän solun pinnan lokero. Aiemmin kuvattu ehdokas merkkiaineita munasarjasyövän tunnistettu sekä hiiren plasma ja munasarjasyöpäsoluja (taulukko S4), sisältyvät WFDC2 (HE4), IGFBP2, ja LCN2. Tasapaino proteiinien ei tunnistettu munasarjasyöpäsolu analyysit olivat pääasiassa tulehdus- ja immuunivasteen liittyviä proteiineja. Mielenkiintoista, vaikka K-ras /PTEN mallissa on piirteitä endomet- munasarjasyöpä, aineistosta ilmeni, että ilmen- tymisen lisääntymisen erittyvien proteiinien tunnistettiin hiiren plasmassa kasvaimen kehitys olivat pitkälti samoja muiden munasarjasyövän histologinen alatyyppi, koska ihmisen solulinjoissa ja askites johdetut kasvainsolut johtui papillien adenokarsinooma, kirkas solu ja serous alatyyppiä vastaavasti [24], [25].

lisäksi määrällisten syövän hallittavaa suhteet proteiinien esittelyyn, useita proteiineja oli merkitty peptidien vasta havaittiin raskas muoto akryyliamidin, joka edustaa ”syöpä-only” peptidejä. Niistä 106 proteiinit säädelty hiiren plasmassa IPAS, 33 proteiinit oli ylimääräisiä syöpä vain peptidit tunnistettiin (taulukko S2), edelleen vahvistavia niiden sääteli tila. Lisäksi seitsemän proteiineja: Cacna1c, ci, Fcgbp, MMP19, Lyz2, Eef1a1, ja Gapdhs oli syöpä vain peptidit (taulukko S2). Vcl toimii yhdistää proteiinin polttovälin tarttuvuus ja on tutkittu puitteissa syövän [26]. MMP19, osa metalloproteinaasi perheen osallisena syövän, on raportoitu aiheuttavan epiteelisolujen muuttoliike, jolla on tärkeä rooli varhaisessa vaiheessa syöpä [27]. Jäsenet Eef1a perhe on raportoitu otaksuttu onkogeenien yli-ilmennetään munasarjasyöpä [28], [29].

biologiset toiminnot ja Networks keskuudessa yliaktiivista proteiinit Hiiren plasman

Pathway analyysi suoritettiin määritetään biologisista prosesseista, jotka edistävät muutoksia plasman proteomiin munasarjojen kasvainten kehittymiseen, ja tutkia väyliä proteiinien kiinnostaa ymmärtää prosesseja, jotka he osallistuvat. Meillä on tukeutunut kahteen koulutusjakson työkaluja tätä, kekseliäisyyttä ja GeneGo n MetaCore. Alustava polku analyysi luettelon 106 voimistunut proteiinien käyttäen laskennallisia geeniä verkon ennakointi työkalu, kekseliäisyyttä Pathways Analysis, luokiteltu proteiinien biologisiin toimintoihin. Kolmekymmentä proteiinit tulehdukseen (p = 1,30 x 10

-6). Syöpä todettiin merkittävä sairaus prosessi (p = 3,71 x 10

-5) suhteessa kaikkiin proteiineihin tunnistettu, esittäessä 52 asiaa proteiinit tästä luettelosta. Mielenkiintoista, geenejä 11 proteiinit liittyvät ryhmänä munasarjasyöpä (p = 1,41 x 10

-3) (CFH, CLU, IFI30, IGFBP2, IGFBP4, LCN2, MMP2, POSTN, TFF3, TNFRSF9, HE4 (WFDC2 ). HE4, tunnettu ehdokas merkkiaine munasarjasyöpä [30], [31] oli voimistunut (8,8-kertainen p 0,001) hiiren plasmassa keräämiseen. Jotkin proteiinit listalta on myös havaittu kasvain tutkimuksia kliinisistä tuloksista ennustavia (marraskuu, CLU TNC, POSTN, IGFBP2, LCN2) tai välittäjiä resistenssi kemoterapiaa (CLU, FBLN1, THBS, STIP1, PTGES3, IGFBP4, ATOX1) [32] – [45].

58 106 upregulated proteiinit hiiriplasmassa analyysissä havaittiin myös rikastettu pinnassa tai erittyy solukomponenttien osastoissa munasarjasyöpäsoluja. Pathway analyysi näistä 58 proteiinien tunnistettiin neljä merkittävää verkkoja käyttäen Ingenuity (kuva 2 ja kuva S1) ja viisi verkostoja MetaCore työnkulun (kuva S2). yleisin prosessit korostetaan kekseliäisyyttä verkoissa mukana kasvaimen kasvua, solujen lisääntymistä ja apoptoosia, sääntely kasvaimen microenvironment, angiogeneesi, solumigraatiota, invaasio ja metastaasi (taulukko S5). Ylimääräinen laatiminen MetaCore uraanin rikastamiseen työkalujen poikki GeneGo ontologioita ja Gene ontologia (Kuva S2, kuva S3, taulukko S6) vahvisti soluadheesiota, lisääntymistä, kehitys ja soluväliaineen remodeling merkittävinä edustettuina prosesseja. Top kaksi verkkoa tuottama Ingenuity korostettaisiin TGFp välittämän solujen jakautumisen, aineenvaihdunnan ja solun tukirangan remodeling (kuvio 2, taulukko S5), täydentää MetaCore rikastamiseen tulokset (kuva S3). Lisäksi TGFli, muita keskushermoston solmut (sekä kekseliäisyyttä ja MetaCore) sisältävät MMP2, p38MAPK, NFKB, ja RAS, kaikki tiedetään olevan tärkeitä munasarjasyöpä [46], [47]. Pathway analyysi 48 proteiineja, jotka havaittiin voimistuvan hiiren plasmassa kanssa kasvainten kehittymiseen, mutta ei tunnistettu erittyy tai pintakalvoproteiinit munasarjan syöpäsolujen tuotti kolme merkittävää verkostoja Ingenuity (kuva S4, taulukko S5). Tässä luettelossa otaksuttu tulehdusproteiineja kuten haptoglobiini (HP), S100A8, ja CCL8. Kategorisointi ilmen- tymisen lisääntymisen proteiineihin plasmapitoisuuden perustuu rikastumisen munasarjasyöpäsoluja alafraktiot hyvä keino arvioitaessa joka yliaktiivista proteiineihin plasmassa todennäköisesti peräisin syöpäsoluja, ja jotka proteiinit todennäköisesti liittyvät isäntä-vasteen.

Top kaksi verkkoa (A, B) määrittämä Ingenuity Pathway Analyysi ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinien hiiriplasmassa että myös rikastettu tasyöpäsolulinja tiedot. Keski solmuun kuuluu TGFli, PI3K, MMP-2, Ras ja MAPK. Proteiinit punaisina edustavat voimistunut proteiineja ja väritöntä proteiinit ne määrittämä Ingenuity tietokantoihin mahdollisesti oleville vuorovaikutusten perusteella Ingenuity tietokantaan. Kiinteät viivat osoittavat suoria suhteita (kaksi molekyyliä tehdä fyysistä kontaktia) ja pisteviivat merkitsevät epäsuorat suhteet (ei vaadi fyysistä kosketusta). Peli A) ja B) ovat 51 ja 24 vastaavasti.

immunoblottianalyysi Hiiren ja ihmisen näytteet

Joukko tunnistettujen proteiinien munasarjasyöpäsoluja ja todettu voimistuvan plasmassa kasvaimen kantavissa hiirissä, TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, CLU, ja FBLN2, valittiin immunoblot-analyysillä käyttäen kasvainkudoksen kerättiin hiiren mallia, väliaine ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa, ja primääri munasarjojen kasvaimia ihmisen aiheista. Lisääntynyt proteiinin tasot Timp1, Lcn2, IGFBP2, Pfn1, ja SPARC havaittiin munasarjojen tuumorikudoksissa eristettiin K-ras /PTEN (kuvio 3A) ja PTEN /Apc (kuvio 3B) munasarjasyöpä hiirimalleissa verrattuna kontrolliin kudokseen lysaatit. Samoin rikastus TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, CLU, ja FBLN2 havaittiin elatusaineessa (CM) kerätään munasarjasyövän solulinjoista peräisin vakavien adenokarsinoomat (OVCAR-3, SKOV3, CaOV3, OVCAR-5 , OVCAR-8), endomet- karsinooma (TOV112D), kirkas cell carcinoma (ES-2, IGROV1) verrattuna väliaine on johdettu ihmisen munasarjojen pinnan epiteeli (HOSE, kuvio 3C). Lisäksi ekspressiotasojen TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2, CLU, ja FBLN2 kohosivat munasarjakasvain lysaateissa verrattuna kontrolliin kudokseen juuri otettu potilailta, joille suoritetaan leikkaus (kuva 3D).

Protein tasot TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2 ja CLU määritettiin seuraavasti: (A) normaali munasarjakudoksen (N) ja munasarjojen kasvaimia (T) eristettiin K-ras /PTEN, tai (B) PTEN /APC hiirimallissa munasarjasyöpä, (C) elatusaineessa (CM) normaalista ihmisen pintaepiteelissä solulinjoja (HOSE) ja munasarjasyövän solulinjoissa ja (D) ihmisen ensisijainen kudokset (HPT): normaali munasarjakudoksen (N) ja munasarjojen kasvaimet (T). Hiiren valmisteet, kudoksen lysaatit valmistettiin normaalista munasarjat ja kasvaimia otettu samasta eläimestä (a-d) kanssa neljä-viisi kasvaimia erillisistä eläimistä (e-i). Ihmisen primaarisen kasvaimen (HPT) näytteet, kudoksen lysaatit valmistettiin 4 kasvainnäytteet pariksi niiden normaalia kudosta samalta potilaalta ja 3 yksinäinen kasvainnäytteet, jossa ei normaalissa näytteet olivat saatavilla. Potilas näytteet ovat seuraavat: potilaan # 14 oli itsenäinen kahdenvälinen vakavien rajatapaus kasvaimia vasemmalle (TL) ja oikea munasarja (TR), kasvaimet # 3, # 7, ja # 15 ovat papillien vakavien karsinoomat, kasvain # 12 on epiteelin rajatapaus kasvain MUllerin-tyyppinen, jossa endoservikaalisia mucinous ja vakavien erilaistumista, kasvain # 13 on selkeä cell carcinoma, ja kasvain # 16 on endomet- adenokarsinooma.

ELISA määritykset hiiren ja ihmisen plasmat

testattiin edelleen osajoukko proteiinien saapuvat massaspektrometrialla voimistuvan plasmassa kasvaimen kantavissa hiirissä, niiden tasot ihmisen ja hiiren plasmassa. Vertasimme myös suorituskykyä proteiinien havaittiin erittyvän munasarjasyövän soluissa, mutta ei joko havaittu hiiren plasmassa tai ei todettu olevan koholla plasmassa kasvaimen hiirille. 25 proteiinit valittiin saatavuuden ELISA-määritysten. Hiiren määritykset, arvioimme tasot Timp1 ja Lcn2 biologisissa nesteissä ja plasma tuumorin hiirille (vaihe I /II, n = 6; Stage III /IV, n = 5; valvontaa, n = 18). Timp1 tasot vaiheen I /II ja vaiheen III /IV-näytteet kasvoi 5,9-kertaisesti (p 0,0001) ja 9,5-kertainen (p 0,0001) verrattuna kontrolleihin, (kuvio 4A). Samanlaisia ​​havaintoja havaittiin Lcn2 (kuva 4B). Olemme edelleen tutki Timp1 ja Lcn2 rikastuneet nestettä uutetaan myöhään munasarjojen kasvaimia ja vatsakalvon askites koska läheisyys näiden nesteiden munasarjasyöpäsoluja ja erittyvän luonteesta proteiineja. Timp1 tasot olivat koholla yli 400-kertainen ja 250-kertaisesti munasarjakasvain nesteen ja vatsakalvon Askites verrattuna hiiren plasma, vastaavasti (kuvio 4C). Samoin Lcn2 oli samanlainen kuvio, jossa on 79- ja 19-kertainen tasojen munasarjakasvain nesteen ja vatsakalvon askites, vastaavasti (kuvio 4D), joka on hänen aktiivisen erityksen ympäröivään nesteitä syöpäsoluja.

TIMP1 ja LCN2 tasot hiiren plasmassa eri vaiheissa syövän etenemisen määritettiin ELISAlla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (A, B). Myös osoittaneet ovat TIMP1 (C) ja LCN2 (D) tasot hiiren munasarjakasvain nestettä ja vatsakalvon askites plasmaan verrattuna. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin t-testi * p 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,0001 kontrolleihin verrattuna.

25 proteiinit valittu määrityksissä ihmisen plasma olivat joko: 1) säädelty hiiren plasmassa, 2) ilmaisema munasarjasyöpäsoluja, tai 3) molemmat säädelty hiiren plasmassa ja ilmaisseet munasarjasyöpäsoluja. Alkuperäinen sarja ihmisen plasmaa, tästedes kutsutaan Set 1, koostui plasmanäytteet 13 naisten epiteelin munasarjasyöpä (n = 3 varhaisessa vaiheessa, n = 10 myöhäisessä vaiheessa) ja 56 tervettä naista. Kaikki näytteet Set 1 kerättiin klinikalla, ei-kirurgiset olosuhteissa (taulukko S7). Määritys tulokset Set 1 on koottu taulukkoon S2 yhdessä hiiren plasma ja solulinjaa käytetyt tiedot valita proteiinien testaukseen. Tasot 8 25 proteiinien, GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, TIMP1, PPBP, CD14, ja NRCAM, todettiin olevan tilastollisesti merkitsevästi (p 0,05) kohonneet vasta diagnosoidut potilaat munasarjasyöpä verrattuna kontrolleihin (taulukko 1, kuvio 5).

Set 1, proteiinin tasot syöpäpotilailla verrattiin tasolle terveillä verrokeilla, ja kaikki näytteet on kerätty klinikalla ei-kirurginen olosuhteissa. Set 2, proteiinin tasot syöpäpotilailla verrattiin kontrolleihin kaikkiin kerätyistä näytteistä leikkaussalissa kirurgisten olosuhteissa. Logistinen regressioanalyysi määrittämiseen käytettiin tilastollista merkitystä muutosten proteiinin tasojen tapauksessa ja kontrolliryhmiin. Set 2, p-arvot aikaisin ja loppuvaiheissa laskettiin, jos p-arvo oli merkittävä koko Set 2 (kaikissa tapauksissa). * P 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,0001 tapauksiin verrattuna kontrolleihin. Marker-tasot normalisoitiin antamaan terveisiin kontrolleihin keskiarvo on 0 ja keskihajonta 1. y-akselit ovat standardoitu markkerin.

Mielenkiintoista, 5 8 proteiinien löydetty jopa -regulated Aseta 1 (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, ja TIMP1) erittyi proteiineja risteyksessä hiiren plasmassa ja syöpäsolun tietoja. PPBP oli eritetty proteiini säädelty hiiriplasmassa, mutta ei löydetty munasarjasyövän solulinjoissa, kun taas CD14 ja NRCAM olivat solun pinnan proteiineja munasarjasyövän solulinjoissa, ja ei määrällisesti hiiren plasmassa.

8 proteiineja, jotka osoittivat tilastollisesti merkittävästi lisätä tasoja Set 1 määrityksissä testattiin edelleen ylimääräinen ihmisplasman näytteitä, tästedes kutsutaan Set 2. Aseta 2 koostui plasmanäytteistä 55 naisten epiteelin munasarjasyöpä (n = 31 varhaisessa vaiheessa, n = 23 myöhäisessä vaiheessa, ja n = 1 vaihe tuntematon) ja 39 tarkastukset tehdään leikkaus. Kaikki näytteet Set 2 kerättiin leikkaussalissa kirurgisten olosuhteissa (taulukko S7). Niistä 8 proteiineista löytyy merkittäviä Set 1, 5 proteiinit (GRN, IGFBP2, RARRES2, TIMP1, ja CD14) on vahvistettu olevan säädellään ylöspäin Set 2 (taulukko 1, kuva 5). Erityisesti kaikki 5 proteiinit tilastollisesti merkittävästi kohonnut alkuvaiheessa näytteet.

Niistä 25 proteiineja analysoitiin kymmenen oli yhtäpitävät havainnot hiiren plasmassa ja solulinja tiedot. Mielenkiintoista, viisi proteiineja, jotka olivat läsnä risteyksessä ehdokkaiden hiiren plasmasta ja solu- väestötietoja (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, ja TIMP1), todettiin merkittävästi yliaktiivista Set 1 ja neljä viidestä proteiinien vahvistettiin Set 2, jossa THBS1 kuin poikkeus.

Näytteenotto olosuhteet voivat vaikuttaa Veren proteiineja. Esimerkiksi potilailla, jotka ovat verta aikaan leikkaus voi ovat lisääntyneet tasot tiettyjen proteiinien seurauksena stressiin [48]. Käyttäen aiemmin kuvattua menetelmää [48], arvioimme onko proteiinin tasot vaihtelivat välillä tapaus ja kontrolliryhmien oikaisun jälkeen olosuhteissa verinäytteen. Näytteissä, joita käytetään määrityksissä, seitsemän munasarjasyöpä potilailla oli veren kiinnittää kaksi ajankohtina: ennen leikkausta, ja leikkauksen aikana. Proteiinin tasot molemmissa aikapisteissä kunkin potilaan on esitetty kuvassa S5. Regressio analyysit suoritettiin käyttäen Yleistynyt arvioiminen yhtälöitä (GEE) menetelmät [48] tilille korrelaation proteiinissa tasojen 7 naista kahdella verta kokoelmia, ja antaa p-arvoja, jotka ovat puolueeton tavalla monista veri vetää samasta naiset (Taulukko S8). Säätämisen jälkeen olosuhteet veren piirtää, viisi proteiinit aiemmin havaittu merkittäviä Set 1 ja Set 2 logistista regressioanalyysiä, havaittiin myös merkitsevä GEE mallin tapauksessa verrattuna terveisiin verrattuna. Toissijaisen GEE malli, kerroin verenotto olosuhteita vahvistettu ensimmäisestä GEE analyysin välttää bias alkaen asennusta. Toinen analyysi rajattiin näytteet kerätään leikkaus ja kaikki 5 proteiineista löytyy merkittäviä ensimmäisessä analyysissä olivat merkitseviä, kun kyseessä vs. muu tapaus, varhainen tapaus vs. muu tapauksessa ja myöhäinen tapauksessa vs. muu tapaus vertailua. Nämä tulokset tukevat havainnot logistinen regressio ja osoittavat, että IGFBP2, TIMP1, RARRES2, CD14, ja GRN ovat koholla kaikissa tapauksissa verrattuna valvoa ja tärkeintä alussa tapauksissa kontrolleihin verrattuna.

GRN on kuvailtu oletetun uusi kasvutekijä munasarjasyöpä, ja sen havaittiin olevan erittäin erittyy munasarjasyöpäsoluja [49]. Kohonneeseen GRN ja RARRES2 plasmassa munasarjasyöpää sairastavilla potilailla sekä varhaisen ja myöhäisen vaiheen tapaukset ovat uudenlainen havainnot tässä tutkimuksessa. CD14, ja IGFBP2 on aiemmin määritettiin seerumin munasarjasyöpää sairastavilla potilailla [37], [50], [51]. He olivat merkitsevästi koholla tässä tutkimuksessa hiiren plasmassa, ja rikastettu erittyvän proteiinin osa munasarjasyövän solulinjoissa. Toteaminen kiinnostusta tutkimus on esiintyminen kohonneeseen IGFBP2 ja CD14 varhaisessa vaiheessa sairaus. TIMP1 suoritetaan osoitti myös kohonneeseen niin varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa tapauksissa. Solulinja tiedot osoittivat, että TIMP1 vapautui munasarjasyöpäsoluja at nanogrammaa miljoonaa syöpäsoluja tunnissa [18], jonka osuus olisi kohonneeseen ihmisen munasarjasyöpä potilaiden näytteistä.

Keskustelu

on tällä hetkellä rajoitettu muutosten ymmärtäminen plasman proteiineihin, joita esiintyy kehittäminen munasarjojen kasvaimia ja useimmille kasvaintyyppien yleensä [52], [53]. Löytö uusia plasman markkereita on edustanut myös suuri haaste, erityisesti markkereita, jotka ovat sovellettavissa alkuvaiheessa tauti. Analyysi korkea-ulotteinen genomista, transcriptomic tai proteomic data sallii vaikuttaa polkuja, verkostoja ja signalointi solmujen tutkittava [53], [54]. Tämä tutkimus antaa näyttöä varten hyödyllisyys Yhdistämällä tietoja perusteellinen kvantitatiivinen proteomianalyysi hiiren malleja syövän tiedoilla ihmisen syöpäsoluja varten biomarkkereiden tunnistamiseen. Tässä käytimme hiirimallissa epiteelin munasarjasyövän yhdessä IPAS proteomic alustan avulla voimme luotettavasti arvioida ja kvantifioida muutokset kattavat vähäisessä määrin proteiineihin hiiren plasmassa kasvaimen kehitystä [53]. Integrointi tietoja ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa oli hyvä keino arvioida, mitkä voimistunut proteiinit ilmennettiin syöpäsoluissa. Lisäksi signalointi solmujen, jotka vaikuttivat ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinit plasmassa määritettiin. Tämän seurauksena, proteiineja, jotka todennäköisesti johtui tulehdus- ja immuunivasteen muutokset olivat erottaa proteiinit, jotka todennäköisesti seurausta erityksen kasvainsolujen tai tuumorigeenisiä prosesseja. Muutokset kasvaimen mikroympäristössä ja ECM liittyy autokriiniseen sääntelyä. ECM proteiinit on aiemmin tunnistettu munasarjasyövän etäpesäkkeiden allekirjoitus geenejä [55], [56]. Muutokset solun tukirangan havaittiin myös solun tukirangan välittämän muuttoliike, pito, ja hyökkäystä. Lopuksi soluproliferaation havaittiin muutoksia ja sisällytettiin solujen apoptoosin. Useat Keski signalointi solmujen tunnistettiin Tässä tutkimuksessa kuten TGF, MMP2 ja NFKB signalointi. TGFli, signalointi erityisesti on keskeinen monia prosesseja, kuten solujen lisääntymisen ja apoptoosin, ECM remodeling, solujen vaeltamiseen, tarttuvuus, invaasio ja metastaasi, angiogeneesi, ja tulehdusta ja immuunijärjestelmän valvonnan [57], [58]. TGFp perhe on aktiivinen kohde syövän ennaltaehkäisyyn ja hoitoon [57], [58]. Mielenkiintoista on, että TGFp on tunnetusti sekä tuumorisuppressorigeenin ja pro-oncongenic vaikutuksia erilaisten syöpien, mukaan lukien munasarjojen [59]. TGF myös tärkeä rooli epiteelin kantasolujen kapealla homeostaasin [60], ja poistaminen TGFp reseptorin indusoi erittäin proliferatiivisen ja invasiivisia ympäristöön [61]. Tumbar et ai. myös, että menetys TGFp reseptorien yhdistettynä onkogeenisella Ras parannettu kasvainten muodostumiseen. Tätä olettamusta tukee myös syntyvän verkot meidän koulutusjakson analyysi (kuvio 2B), jossa NFKB (oletettavasti valvonnassa TGFp) on osoitettu saavan aikaan Ras, PI3K, ja MAPK signalointi kohti aktiini-vasteita ajo solumigraatiota, EMT , invaasio, ja etäpesäkkeiden [59]. Tämä rooli TGFp signalointi muistuttaa sen vaikutuksista alkion kantasolujen pluripotenttisuus ja alkion kudosten kehitystä, kuten munasarja [62] – [64]. Tämän mukaisesti hypoteesin, ylimääräinen verkkoja havainnollistetaan koulutusjakson analyysi (kuva S1) varten myöhäisessä vaiheessa Proteome korosta Notch ja Dkk3, tunnettu kantasolujen effektorit [65], [66]. Siksi ei ole yllättävää, että tämä efek- on hallitseva plasmassa ja syöpäsolujen linja data, joka tukee nykyistä asemaa TGFp koska se saa aikaan erilaisia ​​vasteita syöpään liittyvää prosesseihin (leviäminen, apoptoosia, tulehdus, angiogeneesi, autorcrine-säätely kasvain microenvironment /ECM ja tarttuvuus, invaasio, ja etäpesäkkeiden).

Kun etsiä mahdollisia munasarjasyöpä biomarkkereita, suoritimme uusi integroiva analyysi vertaamalla hiiren plasma proteomiin tiedot ihmisen solulinjassa ja askitesta peräisin kasvainsolun tiedot.