PLoS ONE: Merkel Cell Polyomavirus Pieni T antigeeni aiheuttaa syöpää, ja Alkion Merkelin soluproliferaatiota siirtogeenisen hiiren Model
tiivistelmä
Merkelin solu polyomavirus (MCV) aiheuttaa suurimman osan ihmisen Merkelin solukarsinoomat (MCC) ja koodaa pieni T (sT) antigeeni, joka muuntaa kuolemattomaksi jyrsijän fibroblastien
in vitro
. Kehitetään hiirimallissa MCV sT aiheuttama Karsinogeneesin tuottamaamme siirtogeenisiä hiiriä flox-stop-flox MCV sT järjestyksessä homologisesti yhdisteltävissä
ROSA
lokuksen (
ROSA
sT
), jolloin Cre-välitteisen, ehdollinen MCV sT ilme. Standard tamoksifeenia (TMX) anto aikuisille
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiiriä, jossa
Cre
ilmentyy kaikkialla, johti MCV sT ilmentyminen useissa elimissä, jotka oli tasaisen tappava 5 päivän kuluessa. Sitä vastoin useimmat aikuinen
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiiret selvisivät pieniannoksista tamoksifeenin antoa, mutta kehittyneissä korvan koru ihon hyperkeratoosi ja hypergranulosis. Samanaikainen MCV sT ilmaisun ja ehdollinen homotsygoottinen p53 poistetaan syntyy multifokaalinen, huonosti erilaistunut, erittäin anaplastinen kasvaimia pernassa ja maksa hiirillä 60 päivän TMX hoidon. Hiiren alkion fibroblasteja näistä hiiristä indusoida ilmentämään MCV sT näytteillä ankkurista riippumaton solujen kasvua. Tutkia Merkelin solu patologia, MCV sT ilmentyminen indusoi myös keskipäivän alkionkehityksen Merkel soluissa
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
hiiriä, jotka johtavat huomattavasti Merkelin solujen määrä yhteyttä kupolit myöhään alkion ikäisten normalisoitui vaikutukset. Tamoksifeenin antoa aikuinen
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
ja
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
;
p53f
lox /flox
hiirillä ei vaikuttanut Merkelin solujen määrä ja ei indusoinut kasvaimen muodostumisen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että MCV sT stimuloi kantaisä Merkelin solujen lisääntymistä alkion hiirillä ja on bona fide virus onkoproteiinia joka indusoi täyden syöpäsolun muunnos
p53
-null ympäristössä.
Citation : Shuda M, Guastafierro A, Geng X, Shuda Y, Ostrowski SM, Lukianov S, et ai. (2015) Merkel Cell Polyomavirus Pieni T antigeeni aiheuttaa syöpää, ja Alkion Merkelin soluproliferaatiota siirtogeenisen hiiren malli. PLoS ONE 10 (11): e0142329. doi: 10,1371 /journal.pone.0142329
Editor: Suzie Chen, Rutgers University, Yhdysvallat |
vastaanotettu: 24 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 19 lokakuu 2015; Julkaistu: 06 marraskuu 2015
Copyright: © 2015 Shuda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään
Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.
Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH NCI R01CA136806, CA136363, CA170354, ja American Cancer Society professuurit PSM ja YC. MS tukivat osittain University of Pittsburgh Skin Cancer SPORE CA12197305. SMM tukivat NIH NIAMS R01AR05114, Richard kuningas Mellon Institute for Pediatric Research. SMO tukivat Dermatology Foundation ja NIH NIAMS T32-AR007569. Tämä projekti käytti University of Pittsburgh Cancer Institute core tilat, jotka tukevat osittain palkinnon P30CA047904.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Merkel cell polyomavirus (MCV) on kloonaamalla integroitu ~ 80% Merkelin solukarsinoomat (MCC) ja on tällä hetkellä ainoa ihmisen polyomavirus tiedetään onkogeeniset [1, 2]. Tämä virus oli ensimmäinen ihmisen taudinaiheuttaja löysi nondirected RNAseq menetelmä sanottu digitaalinen transcriptome vähennyslaskua [3], lähestymistapa, joka on nyt yleisesti käytetään löytää ja luonnehtia ihmisen viruksia [4]. MCV T-antigeenin lokus koodaa kaksi suurta päällekkäistä selostukset suurten T (LT) ja pienet T (ST) antigeeni onkoproteiineja [5, 6]. Kaikki MCV-MCC kasvaimet tutkittiin tähän mennessä ei vain tehdä kloonaamalla-integroitu virus, mutta myös olla klonaalisia kasvainspesifisiä LT mutaatioita, jotka katkaista C-päässä ja häiritä helikaasia toiminnot LT proteiini [5, 7, 8]. p53 kohdistaminen kautta bi-partite vuorovaikutus verkkotunnus LT antigeenin läheistä sukua Simian vakuoleja 40 (SV40) virus on olennaista SV40 LT: n muuntamiseen. Kuitenkaan mitään analogisia p53 kohdistaminen verkkotunnus on todettu joko MCV LT tai sT onkoproteiineja [9-11].
MCV sT on siveetön E3-ligaasi estäjä [12, 13] ja yksinään riittävä muuntamaan jyrsijöiden fibroblastien solulinjat [14]. MCV sT jyrsijäsolu transformaatio ei edellytä aktiivista proteiinia 2A (PP2A) sitovan kohdan toimintaa [14]. Sen sijaan, alue nimeltään suuri T vakauttaminen domain (LSD) sitoutuu ja estää monipuolinen E3-ligaasi tunnustamista proteiineja kuten Fbw7, cdc20 ja cdh1 [12, 13]. Jälkimmäiset kaksi proteiinia ovat tunnustusta alayksiköitä varten anafaasia edistää kompleksi /cyclosome (APC /C) ja St ilmaisun edistää mitoosi prometaphase pidätys [13]. Tämä puolestaan lisää CDK1 ohjaama fosforylaation 4E-BP1 ja aktivointi mitoosia liittyvän cap-riippuvaisten käännös (MACT) [14]. Mutaatioita MCV sT LSD eliminoida MCV sT aiheuttama muutos, ja knockdown joko LT tai sT käynnistää solukuoleman tai solusyklin pysähtymisen MCV-positiivisten MCC soluihin [15, 16].
Äskettäin Spurgeon et ai osoittivat, että siirtogeenisiä, keratiini 14 promoottori-ajettu MCC-johdettu genominen T-antigeenin ilmentymistä hiiren ihon indusoi papillomatosis [17]. Samoin Verhaegen ym osoittivat, että siirtogeenisiä MCV sT ilmentymistä hiirissä käyttäen eläinkuidut 5 (K5) promoottori indusoi hyperproliferatiivisia vaurioita, jotka jäljittelevät ihmisen okasolusyöpä
in situ
[18]. Tämä liikakasvu on riippuvaista ehjästä MCV sT LSD alueella. Tähän mennessä ei kuitenkaan hiiri malleja ovat osoittaneet, että siirtogeenisiä MCV T antigeeniekspressiota indusoi täyden neoplasia.
tuotetaan siirtogeenisiä hiiriä, jotka ehdollisesti ilmentävät MCV sT päässä
ROSA26
lokuksen mitata onkogeeninen tämän viruksen proteiinia. Vahvistamme, että MCV sT ilmaisu indusoi hyperplastic vasteen ihon kudoksia kuten aikaisemmin on kuvattu. Me osoittavat lisäksi, että vain pitkäaikainen MCV sT ilmentymistä p53-null yhteydessä tuottaa erittäin anaplastic, huonosti eriytetty pahanlaatuisia kasvaimia sisäelimissä. Tämä vaatimus useille onkogeenisten maksujen täysi muutos on samanlainen kuin C-Myc, Wnt-1 ja SV40 LT [19-21]. Olemme myös havainneet, että MCV sT induktio Merkel soluissa alkion hiirten johti ohimenevään nousua Merkel solujen numeroita, mutta ei riittänyt aiheuttamaan leviämiseen tai kasvaimen kehittymisen aikuisilla Merkel solupopulaatioiden riippumatta p53 asemasta.
Tulokset
Generation MCV sT siirtogeenisten Mouse
siirtogeeninen hiirimallissa indusoituvan MCV sT ilme,
ROSA
sT
, tuotettiin C57BL /6 geneettinen tausta. Ehdollisesti ilmentävät MCV sT proteiinia, kodonioptimoidun MCV sT (sTco) cDNA vektoriin kloonattu alavirtaan
loxP-
reunustaa neomysiinifosfotransferaasi-cDNA-sekvenssi, jossa on 5′-sekvenssi, joka on homologinen hiiren
ROSA26
lokus tuottaa
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
(kuvio 1A).
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
toimitettiin homologisella rekombinaatiolla ROSA26 lokukseen hiiren alkion kantasoluja (ES-solut) (katso yksityiskohdat materiaalit ja menetelmät).
(A) Suunnittelu
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
, joka on ROSA26 knock-in, joka koodaa kodonioptimoiduista MCV sT rinnakkaistoimenpiteistä loxP-STOP-Neo-loxP (LNL) sekvenssi, rekombinoitua ROSA26 genomisen lokuksen.
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
risteyttää
Ubc
CreERT2
tai
Atoh1
CreERT2
hiiret mahdollistaa TMX aiheuttama Cre rekombinaasia leikkaamisella loxP-STOP-Neo-loxP sekvenssi, joka johtaa MCV sT ilmaisun alle CAG-promoottorin. (B) MCV sT ilme on tappava
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
siirtogeenisiä hiiriä. Kaplan-Meier-käyrä suuren annoksen (0,2 mg /g) ja matalan annoksen (0,02 mg /g) TMX injektoidaan hiiriin. Korkea annos TMX injektion aiheuttama nopea laihtuminen ja hiirillä saavutti eutanasia kriteeri (20% painon menetys) 5 päivän sisällä injektion (n = 4, kiinteä oranssi). Survival of the ohjaus
Ubc
CreERT2
hiiriä (n = 7, pilkullinen oranssi) ei vaikuttanut TMX injektiona.
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
hiiriin ruiskutettiin pienempi annos TMX eläintutkimuksissa merkitsevästi pidentynyt eloonjääminen verrattuna korkean annoksen TMX (n = 18, kiinteä punainen) ja valvonta hiiret pysyivät muuttumattomina (n = 10, pilkullinen punainen) (C) Multi-kudos MCV sT proteiinin ilmentymistä
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
hiiriä, jotka kuolivat heti suuren annoksen TMX injektio (alle 5 päivää). Pienempi annos TMX injektio indusoi vähemmän MCV sT-proteiinin ilmentymisen hiiri, joka kuoli päivänä 7-injektion jälkeen, kuten havaittiin immunoblottauksella käyttämällä vasta-ainetta vastaan, MCV sT, CM8E6 [22]. MCV sT vektori tai tyhjän vektorin transfektoidut HEK293-soluja käytettiin positiivisena ja negatiivisena kontrollina vastaavasti. Yhtä suuret määrät sT-transfektoitujen HEK293 solujen lysaatit ladattiin normalisoinnin eri blotteja. Hsp70 /Hsc70 detektoitiin proteiini laadunvalvontaa. (D) MCV sT -proteiiniekspressio ylläpidettiin kudoksissa
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
hiiriä, jotka selvisivät yli 70 päivän kuluttua pienen annoksen TMX injektio. Immunoblotit suoritettiin, kuten (C). Tissue lysaatit
ROSA
sT
käytettiin negatiivisena kontrollina.
korkean tason ilmentäminen MCV sT kudoksissa on tappava Hiiret
ehdollisesti aiheuttaa cre-loxP rekombinaatio ja sT ilmentymistä monissa elimissä,
ROSA
sT
hiiret pariutuneet
Ubc
CreERT2
hiirillä, jotka koodaavat ihmisen ubikitiinipromoottori C promoottoriajetun Cre-rekombinaasin, joka on fuusioitunut kolminkertainen mutantti muoto ihmisen estrogeenireseptorin aktivoitavissa tamoksifeeni (TMX). Tutkimme sT ilmaisun kahdella eri TMX annostelu: suuren annoksen TMX aktivointi edistää laaja-levinnyt sT ilmaisun, ja pieniannoksisen TMX aktivointi jossa stokastinen osa soluista useimmissa kudoksissa tehtäisiin rekombinaatio ja sT ilme.
korkea-annoksen CreERT2 aktivaatio yhdellä vatsaonteloon (ip) TMX injektio (0,2 mg per gramma hiiren ruumiinpainoa) aikuisten
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiiret aiheuttama nopea painonpudotus kaikkien hiirten testattu (n = 4). Nämä hiiret tuli kuivattu, vähemmän aktiivisia päivänä 3 kuluttua ja saavutti 20% laihtuminen eutanasia päätepiste 5 päivän kuluessa. Yksikään kontrollihiiristä negatiivinen
Ubc
CreERT2
siirtogeenin osoittivat huomattavaa painonlasku TMX injektion (kuvio 1 B).
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
hiiret eivät näytä laihtuminen ilman TMX injektio, ja niiden selviytyminen oli verrattavissa
Ubc
CreERT2
ja
ROSA
sT
ohjaus hiirillä.
Pieniannoksinen TMX, 10% suuresta annoksesta (0,02 mg /g), pieneni huomattavasti kuolleisuutta, 72% (13/18) hiirten elossa 10 päivää tai enemmän (n = 18) (kuviot 1B ja 2B) huolimatta vakaa laihtuminen aikana kokeen. Yksi tällainen hiiri selviytyi 144 päivää lähettää TMX injektion ennen 20% laihtuminen eutanasiaa kriteeri ja tämä oli sitten pidetään päätepisteen tutkimuksen aikana.
(A) Hyperplastista fenotyypin korvan ihon
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
hiirillä. Korva ihokudosten
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
hiiret altistettiin H ROSA
sT
hiirillä. H ROSA
sT
ja
ROSA
sT
hiiret satunnaistettiin ja arvioidaan sokaissut tavalla kaksi patologit for liikasarveistuminen /hypergranulosis vuonna orvaskeden lisääntynyt solukkoisuus /lisäke poikkeavuuksia. N /A: ei saatavilla vuodesta korvan kudosten olivat normaalit ja ei korjattu. NT: ei testattu.
Riippumatta TMX annoksen, kudoksen immunoblottauksen
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiirillä paljasti laajoja MCV sT ilme lihasten, perna, keuhkot, maksa, munuaiset, suoli, sydän ja aivot kudosten hiiriä, jotka kuolivat 10 päivän kuluessa TMX injektion kun taas pieni annos TMX aiheuttama s vähemmän proteiinia kudosekspressiotutkimuksen (kuvio 1C ja S1A kuvassa). Ei sT ekspressiota havaittiin
ROSA
sT
poikueesta ohjaus hiirillä. Hiiriä pistetään pieniannoksiseen TMX ja elossa 10 päivää, mutta MCV sT proteiinin ilmentymistä erilaisissa kudoksissa väheni verrattuna elossa 10 päivässä sT proteiinia havaittiin vain korvaan, iho, lihakset ja aivot kudosten immunoblottauksella (kuvio 1 D). MCV sT ilme ei ollut havaittavissa paitsi lihaksen
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiiret lopetettiin päivänä 144 post pieniannoksisen TMX injektio. Lisääntynyt määrä TUNEL positiiviset epiteelisolujen havaittu suolistossa
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiirtä sai usean suuren annoksen TMX (kerran päivässä 3 päivän ajan), verrattuna
ROSA
sT
kontrollihiiret (S1 kuvio). Muut elimet mukaan lukien perna, keuhkot ja munuainen osoittivat samanlaisia tuloksia (tuloksia ei ole esitetty).
Low Dose MCV sT Expression Aiheuttaa ihon ja epidermaalisen hyperplasian Ear Kudokset
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiiriä, jotka selvisivät yli 42 vuorokautta TMX injektion (n = 12), brutto ulkoinen tarkastus osoitti silmiinpistävää kahden- ja hajanainen paksuuntumista korvakkeet. MCV sT proteiini havaittiin immunoblottauksella korvan kudosten 77,8% hiiristä (7/9, kolme korva kudokset eivät korjattu), ja sT induktio liittyi liikakasvuun verinahan ja orvaskeden mikroskopian 61,1% (11/18) on
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiirillä (kuvio 2A). MCV sT proteiinin ekspressiotasot kuitenkaan ei liittynyt tähän fenotyypin. Kaksi hiirtä elossa yli 117 päivää (9F ja 9M) osoitti hyperplastic korva fenotyyppi huolimatta puute havaittavaa sT proteiinin ilmentymistä korvissa. Kumpikaan
ROSA
sT
eikä
Ubc
CreERT2
ohjaus hiirillä osoittivat tämän korvaan fenotyypin. Hematoksyliinillä eosiini (H
ROSA
sT
ja
ROSA
sT
alkioita.
In vitro
käsittely 500 nM 4-hydroksi tamoksifeenia (4-OHTMX) aiheuttama MCV sT ilmaisun
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
MEF (n = 8 alkioita), mutta ei
ROSA
sT
MEF (n = 2 alkiot) (kuvio 3A). Jotkut MEF osoittivat vuotavan MCV sT ilmentymisen jopa ilman 4-OHTMX hoito (S2A kuvio). c-Myc ilmaisua, joka on osoitettu stabiloida MCV sT [12], kasvattivat myös MCV sT ilmaisu (kuvio 3 ja S2B kuvassa). WST-1 soluproleferaatiomäärityksessä osoittivat, että nopeutettu kasvu ilmeni
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
mutta ei
ROSA
sT
MEF (kuvio 3 ja S2B kuvassa).
(A) induktio MCV sT useita hiiren alkion fibroblasti (MEF) solujen pesuetove- 4-OHTMX. MEF uutettu
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
ja
ROSA
sT
alkioita viljeltiin läsnä ollessa tai poissa ollessa 500 nM 4-OHTMX varten 7 päivää. MCV sT ja c-Myc-proteiinin ilmentymistä havaittiin immunoblottauksella. Hsp /Hsc70-proteiinin ekspressio havaittiin latauskontrollina. (B) MCV sT ilmaisu kiihdyttää solujen proliferaatiota MEF-soluissa. Leviämisen MEF käsiteltyjen solujen tai ilman 4-OHTMX arvioitiin Wst1 määrityksiä.
MCV sT Expression p53 nollahiiriä Tuottaa Anaplastic, Huonosti erilaistunut neoplasiaa ilmaiseminen Mixed Lineage merkkiaineet vuonna pernassa ja maksassa
kiertää kuolleisuutta tuottama MCV sT ilmaisu johon myös voima- TUNEL indeksit kudoksissa ja nopea kuolema laihtuminen kokeellisen hiiriä, ylitimme
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiiriä
p53
flox /flox
hiirten tuottamiseksi
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiirillä. Näissä hiirissä, TMX hallinto samanaikaisesti aiheuttama MCV sT ilmaisun ja
p53
geenin poisto. Kuitenkin, kun suuri annos (0,2 mg /g) TMX annettiin ip, MCV sT ekspressiota havaittiin useita kudoksia, ja kaikki hiiret kuolivat 5 päivän kuluessa (n = 9), mikä viittaa siihen, että
p53
poisto ei pelastaa kuolleisuutta aiheuttama korkea sT ilmaisun (S3A kuvio). Kuten p53 villityypin hiiriä, lyhytaikaiset eloonjäämisasteesta
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiiret olivat suurempia matalan annoksen verrattuna korkean annoksen TMX käsiteltyihin hiiriin (S3A kuvio) ja 42,3% (11/26) hiiret kuolivat 10 päivää alhaisen annoksen TMX injektio. Laajalle levinnyt MCV sT proteiinin ilmentymistä havaittiin myös useita kudoksissa näistä hiiristä, jotka kuolivat 10 päivän kuluessa pieniannoksisen TMX injektio (S3B kuvio).
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiiriä esiintyivät myös liikasarveistuminen /hypergranulosis korva ihon fenotyyppi nähdään p53 villityypin, sT ilmentäviä hiiriä (S4 kuvio).
Noin 19% on
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiiriä (5/26) selvisi 60 päivää tai enemmän post-pieniannoksisen TMX käsittely (kuvio 4A). Neljä näistä viidestä (80%) hiirille kehittyi korkealaatuisesta kasvaimet sisäelimissä näkyvissä ruumiinavauksessa; kolme hiirillä oli kasvaimia sekä pernassa ja maksassa, ja yhdellä oli törkeästi havaittavissa kasvain kyhmyt pernassa yksinään (kuvio 4B). Valomikroskoopilla, kasvainsolut oli erittäin pleomorphic ytimiä, jotka vaihtelivat dramaattisesti koko ja muoto useita nucleoli ja hyperchromatism. Mitoosien oli useita ja solut oli epäselvä sytoplasmista rajoja. Immunoblottauksella tutkimus kudoksissa (kuvio 4C ja S5 kuvassa) osoittivat, että sT voimakkaasti ilmaistu näissä kasvaimissa taas sT ilmaisua ei yleensä havaittavissa pernassa ja maksa peräisin pitkäikäinen
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
hiiriä tai kasvaimeen negatiivinen
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiiri (kuvio 1D ja S5 kuvassa). sT proteiinin ilmentyminen pernan kasvaimissa oli havaittavissa 75% (3/4) kasvaimen omaavien hiirten (S5 kuvio). sT ekspressiota havaittiin myös immunoblottauksella edustavan maksan kyhmy otettu on saatu sairastuneesta hiirestä (p53.7F, kuvio 4C). Joillekin näistä hiiristä (2/5), MCV sT myös ilmaistu munuaiskudokset ja histopatologinen tutkimus osoitti merkitty proliferatiivisia muutoksia putkimainen epiteeli vaihtelevat
in situ
vaurioita täysin pahanlaatuinen vaurioita hyökkäyksen kautta tyvikalvoista. Huolimatta mikroskooppinen näyttöä munuaisten neoplasia, diskreetti munuaisten kasvaimet eivät olleet havaittavissa brutto tutkimus ruumiinavauksessa. Immunohistokemia osoitti voimakasta ekspressiota MCV sT paikallistamisen että pahanlaatuisia leesioita maksan ja pernan ja hyperproliferatiivisissa ja pahanlaatuisten epiteelin vauriot munuaisen (kuvio 4D). Nämä tulokset on toistettu 1/2 pienellä annoksella TMX (0,01 mg /g) injektio. Hiiren eloonjääminen kääntäen verrannollinen TMX annostelua 0.01, 0.02, ja 0,2 mg /g (S3 kuvassa). 87,5% (7/8) on
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
; p53
flox /flox
hiirissä, jotka selvisivät yli 60 päivää, jossa oli 0,01 mg /g TMX myös kehittäneet korkealaatuista kasvaimia pernassa ja /tai maksan kudoksissa (tuloksia ei ole esitetty). Emme havainneet tumorigeneesin p53-geenin poisto yksin
Ubc
CreERT2
; p53
flox /flox
hiirillä jopa 140 päivää sen jälkeen 0,02 mg /g TMX hoitoon (kuvio 4A). Vaikka ituradan poistetaan p53 tässä hiirimallissa edistää kasvaimen muodostumisen niinkin aikaisin kuin 50 päivää, on osoitettu, että synnytyksen jälkeinen p53-geenin deleetio johtaa kasvaimen esiintymistiheys oli vain 3%, vaikka 600 päivää sen jälkeen, kun Cre-rekombinaasin transduktion, joka osoittaa, että ajoitus p53 menetys on kriittinen tekijä kasvainten esiintyvyys [23, 24].
(A) p53 ablaatio ei pelasta hiiriä MCV sT aiheuttamaa kuolleisuutta. Kaplan-Meier käyrä pienellä annoksella (0,02 mg /g) TMX ruiskutetaan
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
; p53
flox /flox
hiiriä (Solid sininen viiva, n = 26) ja
Ubc
CreERT2
; p53
flox /flox
hiiriä (pilkullinen sininen viiva, n = 10). Pink viivat osoittavat selviytymisen
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
(yhtenäinen viiva) B ja
Ubc
CreERT2
(pisteviiva) hiiret villityyppisen p53 kuten kuvassa 1B verrattuna p53 pudotuspelit tausta (siniset viivat). (B) MCV sT lauseke tuottaa kasvaimia
in vivo
in
p53
null ympäristössä. 80% (4/5) hiirten, jotka selvisivät yli 60 päivää sen jälkeen, kun TMX injektion kehittää paljain silmin kasvain pernassa ja maksassa. Edustavia pernan ja maksan kudoksiin kasvaimen kyhmyjä alkaen p53.7F näytetään vastaavassa normaalissa kudosten peräisin C57BL /6 ohjaus hiiri. (C) Immunoblottaus MCV sT-proteiinin ekspression maksan ja pernan kudoksissa hiiren p53.7F) makroskooppisen kasvaimia. Perna, lihas- ja korva kudoksissa johdonmukaisesti katsonut sT ilme yli 60 päivän kuluttua TMX injektion. sT ilmentyminen oli havaittavissa maksakudoksissa immunoblottauksella ainoastaan maksassa näkyvissä kyhmyjä (hiiri p53.7F). MCV sT-proteiini havaittiin käyttäen CM8E6 vasta-ainetta, ja Hsp /Hsc70 ilmaisua käytettiin latauskontrollina. (D) Ylempi kenttä esittää anaplastinen neoplasia pernassa ja maksassa. Valikoima proliferatiivisia muutoksia havaittiin munuaisissa, jossa distaalisen putkimainen epithelia on vaikuttanut eniten, mutta glomerulusten (musta nuolenkärki), proksimaalisten tubulusten epiteeli (*), ja interstitiaalinen kudoksia suhteellisen säästynyt proliferatiivisia muutoksia. Keskimmäinen paneeli esittää edustavan immunohistokemiallisella värjäyksellä sT proteiinin ilmentymisen maksakasvaimien, pernassa kasvain ja munuaisten kudoksia
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
; p53
flox /flox
hiirillä. Kudosnäytteet immunovärjättiin MCV sT (CM5E1) vasta-aine. (E) Yläpaneeli esittää sT aiheuttama maksakasvain kanssa immunoreaktiivisuus a-sileän lihaksen aktiini (Asma) ja pohja paneeli esittää K14 positiivisuus haja kasvainsoluissa.
määrittämiseksi histogeneettisesti sT indusoimaan neoplasia, kasvaimia
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiiret immunovärjättiin markkereita eri suvusta: CD45 (pan-lymfosyyttien), CD68 (makrofagi), α-sileän lihaksen aktiini (ASMA-sileän lihaksen ), sytokeratiini 14 (epiteelin), sytokeratiini 8 (epiteelin), hermo adheesiomolekyyli (NCAM). Kasvainsolut olivat kauttaaltaan ASMA positiivisia. Yksittäisiä kasvaimen solut osoittivat positiivisuutta ja CK14 ja NCAM (kuvio 4E). Näimme mitään värjäytymistä muiden markkereiden kuten CD68 ja CD45 (S6 kuvio).
p53 Ablaatio tarvitaan koko transformaatio MEF mukaan MCV sT
Koska MCV sT on muuttamassa onkoproteiinia vuonna p53-null hiiret, suoritimme transformaatio joissa käytetään eristetty MEF iältään
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
,
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
,
Ubc
CreERT2
;
p53
flox /flox
ja
ROSA
sT
hiirillä. Kun 4-OHTMX hoidon klooneja MEF eristetty kahdesta itsenäisestä
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiiret muodostivat pesäkkeitä 4 viikon kuluttua yhden solun kylvö pehmeässä agar (kuvio 5A-5C). Kumpikaan MCV sT ilmaisu yksinään (
Ubc
CreERT2
;
ROSA
sT
) eikä p53 Knockout yksin (
UBC
CreERT2
;
p53
flox /flox
) aiheuttama pesäkkeiden muodostumisen (kuvio 6B). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia meidän
in vivo
kasvainten synnyssä tuloksia.
(A) MCV sT aiheuttaa pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen puuttuessa p53 MEF-soluissa. MEF-solut eristettiin muodossa
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
,
ROSA
sT
,
Ubc
CreERT2
; p53
flox /flox
ja kaksi
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
; p53
flox /flox
alkioiden poikueesta käsiteltiin 500 nM 4OHTMX yli 7 päivää, ja solut altistettiin pehmeän agarin pesäkemuodostusta. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä
p 0
.
05
. (B) Pehmeä agar pesäkkeet aiheuttama p53 ablaatio. p53 ablaatio ei yksinään johda pesäkkeen muodostumiseen. (C) Expression MCV sT sisään MEF alkaen
Ubc
CreERT2
; ROSA
sT
; p53
flox /flox
.
Wholemount, K8-immuno- iho osoittaa touch kuvut kontrollista pesuetove- (A, C, F, H, K),
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
(B, D, G, I) ja
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
(L) hiirille annettiin TMX at P28 (A-D) tai E14.5 (F-I, K, L). Ikä kudos sato on esitetty kunkin parin paneelit. (E, J, M) Kuvaajat osoittavat Merkelin solumäärä per touch kupoli varten mukana paneelien. * P 0,05, *** p 0,001. Mitta-asteikko: 10 um.
MCV sT ilmentyminen lisää Alkion Merkel Cell esiasteet Proliferation mutta ei vaikuta Adult Merkelin solujen määrä tai Syy kasvaimien synnyn
MCC ilmaisee fenotyyppisiä markkereita eniten kaltaisia ilmaisemat normaali, asukas ihon Merkelin soluja. Vaikutuksen tutkimiseksi sT tässä erityisessä solutyypissä suunnattiin sT Merkelin soluja kasvattamalla
ROSA
sT
hiiriltä
Atoh1
CreERT2 /+
hiirissä [25]. Atoh1 on Atonaalista ryhmä Proneuraaliset perus helix-loop-helix transkriptiotekijä anti-onkogeenisiä toiminto [26], että on ratkaiseva merkitys Merkelin solujen kehittämiseen [27].
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
hiiret ja ohjaus
ROSA
sT
littermates annettiin yksi annos tamoksifeenin (0,25 mg /g ) suun kautta letkuruokinnalla syntymän jälkeisenä päivänä 28 (P28) aktivoimiseksi sT ilmaisun nimenomaan Merkel soluissa [28]. Takaisin iho kerättiin 7 päivää tai 12 kuukauden kuluttua ja immunovärjättiin Merkelin solumarkkerille eläinkuidut 8 (K8). Molemmissa ajankohtina, määrä Merkelin solujen kohti kosketuksen kupoli oli pienempi
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
hiirissä verrattuna
Atoh1
+ /+
;
ROSA
sT
ohjaus hiirillä, joka on aiemmin ilmoitettujen vaikutusten Heterotsygoottisuuden klo
Atoh1
lokus [28] (Kuva 6A-6E). Ei missään vaiheessa löydämme kosketuksen kupolit poikkeuksellisen korkealla Merkelin solujen määrä, kohdunulkoisen Merkelin soluja tai kasvaimen muodostumisen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että sT ilmaisu yksin aikuisten Merkel soluissa ei indusoi solun jakautumista tai syövän syntymistä.
Mitoottista
Atoh1
+ esisolujen tuottavat kypsät Merkelin soluja aikana myöhään alkionkehityksen [28]. Vaikutusten tutkimiseksi sT ilmaisun tässä potilasryhmässä, me annetaan tamoksifeenin raskaana oleville patojen E14.5 ja korjattu alkioiden E18.5 tai 5 kuukauden iässä. Huomasimme, että E18.5
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
hiirillä oli ~ 50% enemmän Merkelin soluja kuin pesuetove- valvontaa, ja 5 kuukauden ikäinen
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
hiirillä oli ~ 30% vähemmän Merkelin soluja kuin niiden pesuetove- ohjaimet (kuvio 6F-6J). Ei kasvaimia löytyy joko iässä. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia sT ilme edistää mitoosia aktiivisesti jakamalla solupopulaatioiden, ja osoittaa, että kosketus kupoli Merkelin solujen määrä säätelee vaikka edessä Tämä lisääntynyt jako. Kuten aikuisilla eläimillä, MCV sT ilmaisu ei muuta näitä soluja.
Voit selvittää yhdistetyn sT ilmaisun ja menetys p53 edistäisi Merkelin solujen lisääntymistä, meidän annettiin TMX on E14.5
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
sT
;
p53
flox /flox
hiirillä ja korjattu ihon P28. Emme löytäneet lisäykset Merkelin solujen numerot ja mitään näyttöä kasvaimen (Kuva 6K-6M). Toisin kuin sT aiheuttama maksan ja pernan neoplasia, nämä tiedot viittaavat siihen, että sT ilme yhdistettynä
p53
poisto ei riitä pitää yllä Merkelin solun jakautumista tai kasvaimen kehittymisen.
Keskustelu
MCV sT siirtyminen muuttaisi kuolemattomaksi jyrsijöiden fibroblastien kuten RAT1 ja NIH3T3 [14] ja viruksen sT ilmaisua tarvitaan kasvuun MCV-positiivisten MCC syöpäsolulinjoilla [15, 16]. Nykyinen tietojen mukaan MCV ilmaisun yhteydessä p53 menetys edistää täysin uudisvaurioiden hiirillä. Huomaamme, että MCV sT indusoi alkion Merkel soluproliferaatiota vaan ei riitä täysin kerrata Merkel cell carcinoma riippumatta p53 asemasta.
Äskettäin Verhaegen ym osoittivat, että epiteelin erityisiä sT ilmentymisen käyttäen K5 promoottorin C57BL /6 hiiret aiheuttama solunjakautumisen vilkastuminen vauriot muistuttavat okasolusyöpä
in situ
[18]. Tämä proliferatiivinen vaikutus välittyy MCV sT LSD domeenin, joka on havaittu kohdistaa E3-ligaasi-tuumorisuppressorigeenin proteiinit [12, 13]. Sen sijaan havaitsimme, että kaikkialla postnataalista induktio MCV sT ilmaisun oli tasaisen tappava hiirille annokset ovat suuria TMX injektio. Meidän siirtogeenisen hiiren mallia käytetään kodonioptimoitu MCV sT cDNA, joka johtaa suurempaan proteiinin ilmentymisen kuin luonnollinen sT-cDNA-sekvenssin (tuloksia ei ole esitetty), ja sytotoksiset vaikutukset kohonneeseen MCV sT ilmentyminen voi selittää tämän eron. Korva, iho, lihakset ja aivot kudoksissa ylläpidetään sT ilmaisu kauan sen jälkeen pienellä annoksella TMX injektio, mikä viittaa siihen, että hiiret sietävät kimeerisiä ilmentymä MCV sT.
Spurgeon et al. kertoi myös, että silloin, kun kasvaimeen johdettu genominen T-antigeenin (sekä sT ja MCC-johdetut katkaistu LT) ilmentyy konstitutiivisen K14 promoottorin FVB /N tausta-hiiriä (
K14-MCPyV168
), kaksi kolmasosaa hiirillä ovat kannattavia, kun taas loput hiiret kuolivat tai lopetettiin klo varhaisessa iässä takia aliravitsemus [17].