Krooninen sairaus

tiivistelmä

Prodigiosins (PG: t) ovat ryhmä luonnollinen punainen pigmenttejä syövän vastaista aktiivisuutta, ja yksi perheenjäsen on tullut kliinisen vaiheen II tutkimuksissa. Kuitenkin syövän vastaisen mekanismeja PG edelleen pääosin epäselvä. Tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan molekyyliperustan syövän vastaisen aktiivisuuden UP, johdannainen PG, vuonna P388 soluissa. Ottamalla käyttöön farmakologisia inhibiittoreita ja käyttämällä erilaisia ​​analyyttisiä lähestymistapoja, mukaan lukien Western blot, virtaussytometrialla ja konfokaali laser mikroskopian, olemme huomanneet, että UP esti leviämisen P388 kautta pidättää solut G2 /M-vaiheen ja edistävien solujen apoptoosin, mikä liittyi aktivointi P38, JNK sijaan ERK1 /2 signalointi. ROS uudistaminen ja happamoitumisen soluissa näyttävät ole mukana UP aiheuttamaa apoptoosia. Lisäksi hyödyntämällä massaspektrometria, sakkaroositiheysgradienttia fraktiointi ja Immunofluoresenssivärjäystä huomasimme, että UP ilmeisesti sijoitettu ribosomien. Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että ribosomin voi olla potentiaalinen kohde UP syöpäsoluissa, joka avasi uuden Avenuen rajattu syövänvastainen mekanismi PG: eiden.

Citation: Liu P, Wang YY, Qi X, Gu Q, Geng M, Li J (2013) Undecylprodigiosin aiheutti apoptoosia P388 Syöpäsolut liitetään sitä Sitoutuminen Ribosomi. PLoS ONE 8 (6): e65381. doi: 10,1371 /journal.pone.0065381

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Kanada

vastaanotettu: 5. marraskuuta 2012 Hyväksytty: 24 huhtikuu 2013; Julkaistu: 14 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National High-tech-T 99,5%. 4,6-diamino-2-phenyllindile (DAPI), propidiumjodidia (PI). Naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin GIBCO (Gaithersburg, MD). Parannettu kemiluminesenssin (ECL) pakki hankittiin PIERCE (Holmdel, NJ) .U0126, SP60012, SB203580, SRB, DCFH-DA, BCECF AM, AO olivat kaikki ostettu Beyotime Biotekniikan instituutti (Jiangsu, Kiina). PARP, Cyt C, Caspase-3, Caspse-8, Caspase-9, β-aktiini, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 ja P38-vasta-aine hankittiin Cell Signaling (Beverly, MA). Ribosomaalinen proteiini S3-vasta ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Solulinjat ja kulttuurin

Solulinjat hankittiin Institute Biokemian ja solubiologian (Shanghai, Kiina) ja huolletaan toimittajien ohjeita. Lyhyesti, P388-solut ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen minimum essential (DMEM); A459-soluja viljeltiin F12K väliaineessa. Molemmat media täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia. Soluja pidettiin 5% CO 2 37 ° C: ssa.

proliferaatiomääritystä

soluproliferaatiota mitattiin SRB-määrityksellä. P388-soluja viljeltiin 8 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille ja sitten käsiteltiin UP 72 tuntia. Joissakin kokeissa soluja esikäsiteltiin NAC, iminazole tai MAPK-inhibiittori 1 tunti. Soluja inkuboitiin 16% trikloorietikkahappoa (TCA) 4 ° C: ssa 1 h, minkä jälkeen levyt pestiin viisi kertaa kylmällä vedellä, ylimääräinen vesi valutettiin pois ja levyt jätettiin kuivumaan ilmassa. SRB-värjäys (100 ui, 0,4%, 1% etikkahappoa), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja jätetään kosketuksiin solujen kanssa 30 minuuttia, sitten solut pestiin 1% etikkahappoa viisi kertaa. Levyt kuivattiin ja 150 ui 10 mM Tris-emästä (pH 10,5) lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi väriaine 30 min. Absorbanssi (OD) kunkin luettiin Microplate Reader (Tecan, Itävalta) 490 nm: n aallonpituudella. Että% solun elinkykyisyyden = (OD käsiteltyjen solujen /OD kontrollisolujen) x 100%.

DNA Content Analysis

P388-solut maljattiin 100 mm viljelymaljalla 2 x 10

5 solua /malja, 24 tuntia myöhemmin, solut käsiteltiin UP 24 tuntia. Tämän jälkeen solut otettiin talteen, kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla 4 ° C: ssa 12 h, inkuboitiin RNaasi A: lla (30 ug /ml) 30 min ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten värjättiin propidiumjodidilla (50 ug /ml ) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Solujen DNA analysoitiin virtaussytometrialla (Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA).

Western blot -analyysi

Kun UP (0,05 uM) hoitoa 1 h tai 24 h, 1 x 10

6-solut pestiin PBS: llä ja sitten lyysattiin RIPA (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS) 30 minuutin ajan jäissä. Solulysaatti ladataan elektroforeesi 10% SDS-PAGE. Erotetut proteiinit elektroforeettisesti blotattiin NC (Millipore, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa laimennettiin TBS-T 2 tuntia huoneenlämpötilassa, sitten niitä inkuboitiin yön yli vasta-aineiden PARP, Cyt C, kaspaasi-8, 9, 3, s-AKT, AKT, p- ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 ja P38. Vuohen anti-kani-IgG: llä konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (1:3000 laimennos) inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Jokaisen inkubointivaiheen välissä, membraanit pestiin 3 x 5 min TBS-T: llä. Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin parannettu kemiluminesenssin reagenssilla.

lokalisaatio UP soluissa,

P388-soluja kasvatettiin peitinlaseilla käsiteltiin UP (0,05 uM) freeness’iin 37 ° C: ssa 1 h. Kolmen pesun jälkeen PBS: lla, soluja inkuboitiin sitten DAPI. Peitinlasit tutkittiin laserilla skannaus -konfokaalimikroskoopilla (LSM510-Meta, Zeiss, saksa) [10].

AO Värjäys

Elävä viljellyt solut värjättiin akridiinioranssilla kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],11], [12]. Lyhyesti, P388 solut kammion dia altistettiin UP 1 h. Sitten soluja inkuboitiin 5 ug /ml akridiinioranssia 30 min ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Kammion objektilasit pestiin Hanksin liuoksella ja sitten tutkittiin konfokaali laser mikroskoopilla.

havaitseminen Solunsisäiset pH (pHi) B

P388 solut altistettiin 0,05 uM UP 1 h. Viljellyt solut pestiin PBS: llä, sentrifugoitiin ja ladattu 10 uM 29, 79-bis- (karboksietyyli) -5 (69) -Carboxyfluorescein asetoksimetyyliesteri (BCECF-AM) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan PBS: ssä. Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään ja analysoitiin virtaussytometrialla [4].

havaitseminen Solunsisäiset reaktiivisten hapen lajien (ROS) B

Solunsisäinen oksidatiivinen stressi arvioitiin mittaamalla solunsisäinen hapettamalla 2 ’, 7’-dichlorofluorescin (DCFH). Substraatti on DCFH-DA, joka helposti leviää solusta ja seuraavaksi deasetyloitiin solujen esteraasien on enemmän hydrofiilinen, fluoresoimaton DCFH. ROS sukupolvi solussa hapettaa DCFH fluoresoivaan 2 ’, 7’-dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCF). P388-soluja ympättiin ja inkuboitiin UP (0,05 uM) 1 tunti, sitten talteen solut, pestiin, ja ladattu DCFH (10 uM) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten solut otettiin talteen, pestiin ja ladattu DCFH (10 uM) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Lopuksi solut pestiin PBS: llä, ja solujen fluoresenssi mitattiin käyttäen virtaussytometriaa, jossa eksitaatio 488 nm: ssä ja emissio 530 nm: ssä [13], [14].

Native-PAGE ja massaspektrometrianalyysissä

inkuboinnin jälkeen UP (0,05 uM) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, P388 solut kerättiin ja lyysattiin lyysipuskurilla (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100) ja 30 min jäällä, sentrifugoitiin 12000 g: ssä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Yhtä suuri tilavuus latauspuskuria (50 mM trisbase, 30% glyserolia, 0,01% bromifenolisinistä) lisättiin supernatanttiin. Näytteet erotettiin 8% Native-PAGE, ja nauha leikattiin mukaan värin UP. Proteiinit sitova UP analysoitiin LC-ESI-LTQ (Thermo Finnigan LTQ) vastaan ​​NCBI hiiriproteiinipitoisia tietokantaan [15].

sakkaroositiheysgradienttia fraktiointi

Valmistele sytoplasminen uute ribosomin fraktiointiin , P388-soluja käsiteltiin 0,05 uM UP 1 h, pestiin sitten jääkylmällä PBS: llä kaksi kertaa ja hajotettiin jääkylmässä RIPA 30 minuuttia, sitten sentrifugoitiin 10,000 x g 15 minuuttia tyhjentää tuloksena supernatantin ytimet, mitokondrioita ja roskia. Lysaattia proteiinin liuos kerrostettiin 9 ml lineaarista sakkaroosigradienttia liuosta (10-50%), kun 11,5 ml Sorvall sentrifugiputkeen ja sentrifugoitiin 35000 x g 3 tunnin ajan 4 ° C: ssa ultrasentrifugissa (Beckman Optima tm L-100 XP). Vain UP ilman lysaattia päälle lineaarista sakkaroosigradienttia liuosta käytettiin kontrollina. [16]

Immunofluoresenssivärjäys

P388-soluja ympättiin kuuden kuoppalevylle ja niitä viljeltiin yön yli. Solut altistettiin UP (0,05 uM) 1 tunti. Solut huuhdottiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 10 minuutin ajan 4% formaldehydiä. Seuraavaksi solut pestiin kahdesti PBS: llä ja sitten läpäiseviksi 10 minuutin ajan 0,1% Triton X-100, soluja esi-inkuboitiin PBS: llä, joka sisälsi 1% BSA: ta 20-30 minuuttia ja värjättiin ribosomaalinen proteiini S3-vasta-ainetta yli yön 4 ° C, jonka jälkeen inkuboitiin anti-hiiri-IgG-FITC: llä 30 minuuttia. Sitten solut pestiin PBS: llä ja tutkittiin konfokaali laser-skannaus mikroskoopit [17].

Tulokset

UP estää niiden kasvun P388 Cells

määrittämiseksi sytotoksinen vaikutus UP on P388-solujen, SRB määritystä käytettiin arvioimaan solujen lisääntymistä 72 tunnin jälkeen hoidon. Vuonna pitoisuusalue +0,0048-15

μ

Μ, UP hoito johti konsentraatiosta riippuvaisen eston solukasvun P388 soluja. IC

20 ja IC

50 P388-soluja 0,0049

μ

Μ ja 0,042

μ

Μ vastaavasti (Fig. 2).

Soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden UP ja PG: ssa 72 tuntia. Esitetty aineisto edustaa prosenttiosuudet solujen elinkelpoisuuden kolmen erillisen kokeen kolmella määrityksiä kussakin. **,

p

0,01 ja ***, p 0,001 vs. kontrolli.

UP indusoi G2 /M-vaiheen pysähtymiseen ja apoptoosiin in P388 solut

tukahduttaminen syöpäsolujen kasvu on ollut tiedossa olevan välittyy pääasiassa apoptoosin ja solusyklin pysähtymiseen. Me seuraavaksi sovellettu virtaussytometrialla analysoida solusyklin vaihe jakelu ja apoptoosin kun UP hoitoa. P388-solut, joita käsiteltiin UP (0,05 uM) 24 tunnin ajan osoitti kertymistä G2 /M (40,73%), jossa on samanaikainen lasku G0 /G1 vaiheen soluja, mikä viittaa solusyklin pysähtymisen G2 /M-vaiheessa. UP indusoi myös suurempi prosenttiosuus sub G0 /G1 väestö, ohjeellinen apoptoosin esiintymiseen. Noin 8,23% soluista oli apoptoottisia hoidetuilla UP 24 h (Fig. 3A) toisin kuin 1% apoptoottisia soluja hoitamattomaan verrokkiryhmään. Lisäksi tutkimme UP indusoitu poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkominen, tunnusmerkki apoptoosin, joka osoittaa kaspaasien aktivaatio. Tulokset osoittivat, että hydrolyysi 116 KD poly (ADP-riboosi) polymeraasin proteiinin 85 KD havaittiin UP käsitellyissä soluissa sen jälkeen, kun 24-tunnin altistuksen 0,05 uM. Sen tutkimiseksi, onko caspases olivat mukana UP aiheuttaman apoptoosin, western blot-analyysi suoritettiin edelleen vahvistaa osallistumista kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9. Cleavaged vyöhykkeet prokaspaasi-3, prokaspaasi-8 ja prokaspaasi-9 havaittiin hoidon jälkeen UP 24 tuntia, joka osoittaa kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9.

. DNA histogrammit P388-soluja viljeltiin pelkässä alustassa, tai DMSO: ssa (1:1000) tai kun läsnä oli 0,05 uM PG ja UP 24 tuntia. B. ilmentyminen apoptoosin liittyvät proteiinit määritettiin immunoblottauksella spesifisten vasta-aineiden altistuksen jälkeen UP 24 tunnin ajan. Ilmaisu kvantifioitiin automatisoidussa kuva-analyysin järjestelmän ImageQuant. Kukin pylväs edustaa niitä skannataan kahtena kolmesta kaivojen ilmaistaan ​​prosenttiosuutena ohjaus ± keskihajonta. *,

P

0,05, UP vs. Blank. C. Edustavia virtaussytometria profiileja rodamiini 123 värjäyksellä, sen jälkeen kun soluja inkuboitiin 0,05 uM UP 24 tuntia. a, DMSO; b, 0,05 uM PG; c, 0,05 μΜ UP.

vieressä tutki mitokondriaalisen vapauttamaan Cyt C, ylävirran polku kaspaasin 9. Kun 24-tunnin hoidon UP, vapauttamaan Cyt C solusooli huomattavasti lisääntynyt, kun taas Cyt C mitokondrioissa laski selvästi (Kuva. 3B). Se on ollut tietää, että vapautuminen intermembrane proteiinien kuten Cyt C tapahtuu sen jälkeen eheyden mitokondrion kalvon oli heikentynyt, mikä johtaa häiriöitä sisemmän transmembraanisen potentiaali (ΔΨm). Vaikutus UP mitokondrion kalvon läpäisevä potentiaali (ΔΨm) tutkittiin lisäksi käyttäen rodamiini 123, tietyn fluoresoiva koetin. Fluoresoiva intensiteetti oli merkittävästi vähentynyt UP käsitellyissä soluissa, verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 3C). Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että luontainen mitokondrioiden apoptoottisen reitin, johon kaspaasi-9 ja -3, on sekaantunut UP aiheuttaman apoptoosin P388 soluissa.

UP Pääosin paikantuu Solulima

UP lähettää punaista fluoresenssi 488 nm: n virityksellä, joka voidaan visualisoida elävissä soluissa. P388 solut värjättiin DNA: ta sitovan väriaine DAPI 1 h altistuksen 0,05 uM UP tutkia solukomponenttien lokalisoinnin UP. Solut kuvattiin alle konfokaali laser mikroskoopilla. Kuten on esitetty kuviossa. 4, UP on pääasiassa lokalisoitu sytoplasmassa, mutta ei kalvo tai tumassa.

Sininen edustaa tuman värjäys ja punainen edustaa UP.

UP Aktivoi MAPK muttei AKT Signaling

Voit selvittää mahdolliset osallistumista proteiinikinaasin koulutusjaksojen G2 /M pidättämisestä ja indusoiman apoptoosin UP, me tutkittiin fosforylaatiota tila neljä suurta proteiinikinaasien jotka liittyvät soluproliferaation P388 soluissa jälkeen altistuvat UP 1 h. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, UP ilmeisesti nostivat fosfo-ERK1 /2, fosfo-p38MAPK, ja fosfori-JNK1 /2, kun taas AKT fosforylaatio asema oli tuskin vaikuttaa. Proteiinin kokonaismäärästä vastaavan proteiinikinaasien ei ole muutettu.

. Altistumisen vaikutuksia P388 solut 0,05 uM UP 1 h fosforylaatioon tilasta ja ekspressiotaso proteiinikinaasien. Ilmaisu kvantifioitiin automatisoidussa kuva-analyysin järjestelmän ImageQuant. Kukin pylväs edustaa niitä skannataan kahtena kolmesta kaivojen ilmaistaan ​​prosenttiosuutena ohjaus ± keskihajonta. ***,

P

0,001, UP vs. valvonta. B. Vaikutukset MAPK estäjien UP-indusoitua P388 kasvun inhibitiota, solut esikäsiteltiin U0126 (10 uM), SP60012 (20 uM) tai SB203580 (20 uM) 1 tunti, sitten co-käsitelty UP: ssa 72 tuntia. U0126, ERK estäjä; SP60012 (SP), JNK estäjä; SB203580 (SB), P38 estäjä. **, P 0,01, PG vs. (PG + estäjä), UP vs. (UP + estäjä).

Edelleen kysyisi ERK1 /2, JNK1 /2 tai P38 oli mukana UP -inhibited solujen kasvuun, soluja inkuboitiin kanssa tai ilman inhibiittoria ERK1 /2, JNK1 /2 ja P38 vastaavasti ja sitten cotreated 0,05 uM UP: ssa 72 tuntia. Solut lisääntymistä arvioitiin SRB menetelmällä. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, mikään näistä inhibiittorit vaikuttivat solujen lisääntymistä sinänsä. SP ja SB, mutta ei U0126 ilmeisesti päinvastaiseksi estävää vaikutusta UP proliferaatioon P388-solujen, mikä osoittaa, että JNK1 /2 ja P38 aktivointi oli mukana UP: n indusoiman apoptoosin. Vain P38 aktivaatio havaittiin liittyvän PG: n indusoiman apoptoosin, joka oli samaa mieltä kirjallisuudessa raportit [18].

NAC epäonnistuu pelastamaan UP aiheuttaman soluproliferaation inhibointi

On raportoitu että PG saattavat antaa ROS tuotanto soluissa [19]. Tutkimaan mahdollista osallistumista ROS UP aiheuttaman apoptoosin ja G2 /M vaiheessa pidätyksen P388 soluissa, me ensin mitattuna ROS sukupolvi soluissa. Tulokset osoittivat, että ROS: n syntyminen on korotettu jo 1 tunnin kuluttua UP hoidon (Fig. 6A). Paljastaa, onko ROS sukupolvi aiheuttaa jopa indusoiman apoptoosin, ROS puhdistusainetta NAC käytettiin ennen UP hoitoa. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, NAC epäonnistui pelastamaan kasvun estäminen indusoi UP ja PG, jossa toisin H

2O

2 tukahdutetaan solujen proliferaatiota selvästi päinvastaiseksi NAC hoitoa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ROS sukupolvi ei todennäköisesti ole osallisena UP aiheuttaman apoptoosin.

. P388-soluja käsiteltiin 0,05 uM UP 1 h, ja värjättiin DCFH (10 uM). Fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla. a, DMSO + DCFH; b, 0,05 uM PG; c, 0,05 uM PG + DCFH; d, 0,05 uM UP; e, 0,05 uM UP + DCFH. B. P388-solut olivat esikäsittely kanssa tai ilman NAC (0,5 mM) 1 tunnin ajan, sitten soluja yhteisrahoitettuja inkuboitiin PG (0,05 uM), UP (0,05 uM) ja H

2O

2 (0,4 mM) 72 h. *, P 0,05, H

2O

2 vs (H

2O

2 + NAC).

happamoituminen ei osallistu UP aiheuttamat kasvunestomenetelmää

akridiinioranssin on ”happo- tropiikissa” heikko emäs, joka on tarttunut elävien solujen ja kerääntyy hapatettu osastoissa kuten lysosomeihin [17], [20]. Fluoresenssi akridiinioranssin on vihreä pieninä pitoisuuksina, kun taas suurilla pitoisuuksilla fluoresenssia muuttuu oranssiksi [17]. Havaitsimme ilmeinen katoaminen oranssi rakeet soluissa jälkeen lyhyt hoito (1 h) 0,05 uM PG ja UP (Fig. 7A). Muutoksia pHi analysoitiin myös virtaussytometrialla BCECF-AM, kalvo läpäisevää fluoresoivaa indikaattoria mittaukseen sytoplasmisen pH. Huomasimme, että pHi vähentynyt huomattavasti PG tai UP-käsitellyt solut (Fig. 7B) verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

. Akridiinioranssivärjäyksellä P388-solujen, PG ja MP oli 0,05 uM, AO oli 5 ug /ml. Orange rakeita happamaksi osastoja. B. Edustavat tiedot flow-Sytometrisen pHi-analyysillä käyttäen 10 uM BCECF-AM värjäyksen jälkeen soluja inkuboitiin 0,05 uM PG tai UP 24 tuntia tai ilman imidatsolia (0,5 mM) esikäsittelyn 1 tunti. a, valvonta; b, PG; c, PG + imidatsoli; d, UP; e, UP + imidatsoli C. vaikutus happamoitumiseen estäjän UP-indusoitua P388 kasvun inhibitiota, solut esikäsiteltiin imidatsolia (0,5 mM) 1 h, sitten co-käsiteltiin PG (0,05 uM) ja UP (0,05 uM) 72 h.

Sen sijaan solun läpäisevä emäkset imidatsoli hoito selvästi esti lasku phi. Sitten testataan onko UP-aiheutti kasvun estäminen voisi pelastaa imidatsoli. Samanaikainen YLÖS altistumista, emme pystyneet tunnistamaan mitään merkittäviä eroja verrattuna käsiteltyjä soluja, noin vain 3% talteen (kuvio. 7C), mikä viittaa siihen, että happamoituminen sytoplasman ei pitäisi olla tärkein syy indusoiman apoptoosin UP. PG todettiin olevan samanlaisia ​​tuloksia UP.

UP sitoutuu ribosomin P388 Solut

eteni tunnistamaan molekyylitason kohteet UP P388 soluja tunnistamalla UP sitovia proteiineja käyttämällä massaspektrometriaa analyysi. UP muuttoliike voidaan helposti havaita kanssa paljain silmin kuin bändi oranssi väri natiivi PAGE (Fig. 8A). Geeli bändi leikattiin ja alistettiin massaspektrometria analyysiä. Yhteensä 951 proteiineja havaittiin, joista 171 proteiineja, yllätykseksemme olivat ribosomaalinen proteiineja, joilla on korkeampi CoverPercent (taulukko 1), mikä viittaa siihen, että UP voi ensisijaisesti sitoutua ribosomin.

. Liuska UP in Native-PAGE. B. sakkaroositiheysgradienttia jakotislaamalla UP-käsiteltyjen P388 soluja ja yksin. C ja D. solunosasijaintia Rps3 ja UP P388-solut (C) ja A549-soluja (D) havaitaan konfokaalisella. UP fluoresenssi näkyy punaisena, Rps3 fluoresenssia vihreänä ja rinnakkaispaikantumisen (sulautuvat) keltaisella.

lisävalidointia, P388 soluja inkuboitiin UP 0,05 uM 1 tunti ja ribosomien eristettiin sakkaroositiheysgradienttia fraktiointi. Verrattaessa kontrolliryhmää jossa YLÖS rikastettiin ylhäällä sakkaroosin tiheys ratkaisu, ilmeinen kerroksellinen väri-nauhat löytyivät UP käsitellyissä soluissa (Kuva. 8B), joka tukee käsitystä, että UP sitoutuu ribosomin. Olemme myös havainneet rinnakkaispaikantumisen välillä UP ja ribosomin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla molemmissa P388 soluissa (Kuva. 8C) ja A549-solut (Fig. 8D). Immunofluoresenssivärjäyksen osoitti, että UP colocalized ribosomin tunnistettavissa endogeenisten Rps3 kahdessa solulinjoissa.

Keskustelu

Tähän mennessä syövänvastainen mekanismi PG vieläkään ole selvitetty yksityiskohtaisesti. Esimerkiksi Francisco R raportoitu PG vaikutti mitokondrioita, aiheutti irrotus vaikutus sähköisen ketjun solun tuma säilynyt prodigiosin yhteys [17]. Kuitenkin havainnot Montanerin B osoitti, että indusoiman apoptoosin PG oli kupari -välitteisen pilkkomisen DNA [21]. Jing Zhang et ai. kertoi myös, että PG lisääntynyt solujen välistä ROS, joka johti sytotoksisia vaikutuksia [19]. Molekyyli tavoitteet PG: t raportoitu johdonmukaisesti myös JAK3, mTOR ja NAG-1 [7], [8], [22]. Tutkimuksessamme olemme sitä mieltä, että UP indusoi apoptoosia P388 soluissa liittyy UP-ribosomin sitova.

Huomasimme, että UP esti solujen lisääntymistä, pidätettiin solusyklin G2 /M vaiheessa johti aktivointi kaspaasi 3, 8, 9, muutokset mitokondrion kalvon potentiaalia, vapautumista Cyt C ja pilkkominen PARP. Nämä tulokset osoittavat, että UP on sytotoksisuus P388 ja indusoi P388-solujen apoptoosin joihin mitokondrioita apoptoottisen reitin ainakin. Selventämiseksi mekanismin taustalla indusoiman apoptoosin UP, ensin arvioidaan solun jakautuminen UP sen auto-fluoresenssi, tulos osoitti, että UP jaetaan sytoplasmassa, mutta ei kalvo tai tumassa, mikä viittaa siihen, meille, että UP voivat olla vuorovaikutuksessa molekyylien solulima apoptoosin.

PI3K /Akt-reitin säätelee olennainen solun toimintoja, kuten solun kasvua, selviytymistä, ja liike. Liioiteltu aktivoituminen PI3K /Akt-reitillä on raportoitu liittyvän syövän kehittymiseen. Akt voi myös suoraan säädellä apoptoottinen koneet fosforyloimalla ja inaktivoimalla proapoptoottisiin proteiineja, kuten BAD lisäksi, Akt-aktiivisuutta tarvitaan G2 /M faasimuutos ja AKT esto aiheuttaa usein G2-M pidätys [23]. Kuitenkin meidän kokeita, UP ei todettu vaikuttavan AKT aktivoinnin P388.

MAP-kinaasien koostuvat seriini /treoniiniproteiinikinaasit, mukaan lukien ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasien (ERK), p38 MAPK, c-Jun-NH2-terminaalista kinaasien (JNK), ja MAP-kinaasien signalointireitteihin säädellä olennaisesti kaikilla pahanlaatuisten solujen käyttäytymistä, lisääntymistä, eloonjääntiä, muuttoliike ja invaasio [24]. Tuloksemme osoittivat, että UP aktivoi P38, ERK ja JNK huomattavasti. Selektiivinen estäjiä P38 ja JNK sijaan ERK estäjä, esti P388 syöpäsolujen sytotoksisuuden aiheuttama UP. Nämä tulokset osoittavat, että indusoiman apoptoosin UP liittyy aktivointi P38 ja JNK, joka on eri kuin PG joista vain fosforylaatio p38 liittyy sen toimintaan.

ROS syntyy solun sivutuotteina normaalin aerobisen aineenvaihdunnan tai toisiolähetteinä eri signaalitransduktioreitteihin tai vastauksena ympäristökuormituksesta [25], [26]. Erityisinä toinen sanansaattajia signa- osallistuvat solujen lisääntyminen ja erilaistuminen, ROS on ollut mukana säätelyyn erilaisia ​​solujen toimintoja, kuten solunsisäinen signalointi transkription aktivaation, proliferaation ja apoptoosin [27]. Viime vuosina monet tutkimus keskittyy suhdetta ROS ja mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi-MA

PK

signalointireittejä. Ling Liu et ai raportoi, että NG-aiheuttaman apoptoosin HepG2 soluista oli ominaista solunsisäisten ROS sukupolvi. Samanaikaisesti NG hoito saattaa johtaa aktivoinnin fosforylaation JNK ja p38 muttei ERK1 /2. Tuloksemme osoittivat, että UP aiheuttama solunsisäinen ROS tuotantoa P388 soluissa. Kuitenkin ROS raadonsyöjä NAC ei kumonnut lisäkasvun estäminen aiheuttaman UP, vaikka se ilmeisesti antagonisoi ROS tuotanto H

2O

2. Nämä tulokset osoittavat, että sukupolven ROS ei osallinen indusoiman apoptoosin UP.

Phi sisällä happamia organelles ovat vastuussa monenlaisia ​​tärkeitä solun toimintoja, kuten endosytoosin, eksosytoosilla ja solunsisäistä kuljetusta, sekä solujen erilaistumista, solujen kasvuun ja solukuolemaa. PHI transformoiduissa tai syöpäsoluissa yleensä pysyy neutraalina tai jopa hieman enemmän emäksinen kuin normaalit solut [28], säätelee erilaisia ​​pH ^ homeostaattisia mekanismeja, mukaan lukien Na

+ /H

+, Na

+ – riippuvainen ja riippumaton CI

– /HCO

3

– lämmönvaihtimet, vakuolaarisen tyyppi H

+ – ATPaasi (V-ATPaasi) ja muut. Daigo Ya mamoto raportoitu, että solunsisäinen happamoituminen KPL-1 cPrG.HCl indusoi apoptoosin ja sykli pidätys, joka oli voimakkaasti tukahdutti imidatsoli, solu-läpäisevä pohja. On osoitettu, että bafilomysiini A1, voimakas, selektiivinen estäjä vakuolaarisen H

+ – ATPaasi [29] indusoi myös laskua solunsisäisessä pH: n ja estää niiden kasvun eri syöpäsolujen linjat [30]. Olemme myös havainneet, että UP saattaa vähentää solunsisäistä pH ^ havaita konfokaali ja virtaussytometria vastaavasti. Kuitenkin imidatsoli, estäjä happamoituminen epäonnistui pelastamaan kasvun estäminen UP. Nämä tulokset sulje pois mahdollisuutta happamoitumisen indusoiman apoptoosin UP.

Hyödyntämällä sen autofluorisaatiota ominaisuus, huomasimme, että UP jaetaan pääasiassa solulimassa. Olemme edelleen eristetty proteiinien sitoutumisen UP in natiivi-PAGE-geelillä ja toimitetaan massaspektrometria analyysiä. 171 proteiineja 951 havaittavia proteiineja ribosomien liittyviä, mikä viittaa siihen, että UP voivat todennäköisesti sitoutua ribosomien. Olemme edelleen vahvistanut hypoteesin sakkaroositiheysgradienttia fraktiointi menetelmä, tavanomainen lähestymistapa eristää ja tutkia ribosomin ja immunofluoresenssivärjäyksen tarkkailla rinnakkaispaikantumisen UP ja ribosomin P388 soluissa ja A549-soluja. Ribosomaalinen proteiinit pelata useita rooleja koordinoinnissa proteiinibiosynteesin ylläpitää solujen homeostaasin ja selviytymistä. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että useat ribosomaalisen proteiinien toissijaiset toiminnot riippumatta niiden osallistumista proteiinien biosynteesiä. Nämä proteiinit toimivat solujen lisääntymistä sääntelyviranomaisten ja joissakin tapauksissa indusoijina solukuoleman [31], [32]. Johnson CR havaittu, että häiriö 28S-rRNA BCS aloitettu apoptoosin REH soluihin rekrytointi SAPK-JNK signalointi [33]. Bae HK raportoitu, että SG nimenomaan vuorovaikutuksessa 40S ja 60S ribosomaalisen alayksiköiden jo 5 min RAW 264.7 soluja ja indusoi fosforylaatiota p38 ja JNK [16]. Ottaen huomioon, että UP voivat aiheuttaa P388-solujen apoptoosin joihin aktivointi P38 ja JNK edellisessä tutkimuksessa olemme spekuloida, että apoptoosin aiheuttama UP voivat liittyä UP-ribosomin sitova, mikä puolestaan ​​vaikuttaa toimintaan joidenkin ribosomien proteiinien ja johtaa apoptoosin. Oli myös syytä mainita, että vain kaksi mitokondrioita proteiinit havaittiin massa- spektrometrinen coverprecent proteiinia 10%, mikä estää pitkälti mahdollisuus suoraan kohdistamista mitokondrioiden proteiinien UP.

Yhteenvetona tuloksemme esitellään tässä tutkimuksessa sulje pois osallistumista ROS ja happamoitumisen UP aiheuttaman apoptoosin, huolimatta valtava kirjallisuus. Tuloksemme sen sijaan osoittaa, että UP sitoutuu ribosomin, joka voi ainakin osittain, laukaisevat P38, JNK signalointi ja mitokondrioiden reitin apoptoosin, joka lopulta johtaa esto solu- proliferation.The kohdennettujen ribosomaalisen molekyylejä on vielä tutkittu. Kuitenkin ribosomien voisi avata uuden keinon tutkia syövän vastaisen mekanismi PG tulevaisuudessa.