Krooninen sairaus

tiivistelmä

Signaalin muuntimet ja Activator of Transcription-3 (STAT3) konstitutiivisesti aktivoitu monissa syövissä, joissa se edistää kasvua, tulehdus, angiogeneesi ja estää apoptoosin. Olemme osoittaneet, että STAT3 konstitutiivisesti aktivoitu ihmisen mahasyövän, ja että krooninen IL-11-driven STAT3 transkriptionaalista aktiivisuutta indusoi mahan tuumorigeneesiä in gp130

757FF hiirimallissa mahalaukun syövän kehittymisen. Tässä osoitamme, että hoitoon ihmisen AGS mahasyövän solujen kanssa Janus-kinaasi (JAK) estäjä WP1066 annoksesta, ja aikariippuvainen estää STAT3 fosforylaatiota, yhdessä alentunut JAK2 fosforylaatio, vähentää proliferaatiota ja lisääntynyttä apoptoosia. Lisäksi, sovellettaessa vatsaonteloon WP1066 varten 2 viikkoa, vähentää mahakasvaimen tilavuutta 50% gp130

757FF hiiren yhtenevä vähentää JAK2 ja STAT3 aktivaatio verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen, pesuetoverissa valvontaa. Mahalaukun kasvainten WP1066- käsitellyistä hiiristä oli vähentänyt polymorfonukleaaristen tulehdusta, yhtenevä inhibitio useiden proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL-11, IL-6 ja IL-1β, sekä kasvutekijät REG1 ja amfireguliini. Nämä tulokset osoittavat, että WP1066 voi estää proliferaatiota, vähentää tulehdusta ja aiheuttaa apoptoosin mahakasvaimen soluissa inhiboimalla STAT3 fosforylaation, ja että monet sytokiinit ja kasvutekijät, jotka edistävät mahan kasvaimen kasvua säätelevät STAT3-riippuvainen mekanismeja. WP1066 voivat muodostaa perustan tulevalle terapeuttisten vastaan ​​mahasyövässä.

Citation: Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, KALANTZIS A, et al. (2014) esto JAK2 /STAT3 Pathway Vähentää mahasyövän kasvu

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10,1371 /journal.pone.0095993

Editor: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2014; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2014; Julkaistu: 7. 2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat varoja; NHMRC Australia (www.nhmrc.gov.au) kohdeapuraha # 509165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanooma SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) aivojen SPORE 2 P50 CA127001-06. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Waldemar Priebe patentteja ja on taloudellinen intressi kehittämiseen yhdistettä WP1066 seuraavasti ; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki yhdisteet hoitoon solun proliferatiivisten sairauksien. Yhdistää patentti WO /2005/058829 12.01.2004. Huomaa myös, että kirjoittajat ovat antaneet muutetun laskelman kilpailevia intressejä koskevat patentin WP1066 hallussa W. Priebe. Kirjoittajat myös ilmoittaa, että ”tämä ei muuta meidän noudattamista PLoS One politiikkaa tietojen jakamiseen ja materiaaleja”.

Johdanto

Seitsemästä Signal muuntimet ja Activator of Transcription (STAT) perheenjäsenet , STAT3 on eniten johdonmukaisesti osallisena useita yleisimmistä syövistä ihmisellä, mukaan lukien; keuhko-, rinta-, munasarja-, eturauhas- ja paksusuolen [1], [2], [3], [4]. Tämä on totta myös ihmisen mahasyövän [5], [6], [7], jossa STAT3 aktivoitumisen krooninen fosforylaation tyrosiini (Y) oleskella 705 on yhdistetty lisääntyneeseen kasvuun, angiogeneesi, invaasio ja etäpesäkkeiden ensisijaisen syöpä [ ,,,0],6], [7], [8]. Siten esto STST3 transkriptionaalista aktiivisuutta ihmisen mahasyövän voivat tarjota mahdollisia keinoja vähentää korkea sairastuvuus ja pidentää elämää keskuudessa mahasyöpäpotilaista maailmanlaajuisesti.

Koska toiminnallisten mutaatioiden STAT3 geenin poikkeava STAT3 aktiivisuus indusoi pysyviä aktiivisuutta alkupään tyrosiinikinaaseja, ja /tai unscheduled- tai yli-ilmentyminen stimuloiva ligandien [9], [10], [11]. Tämä on selvästi esimerkkinä gp130

757F /F hiirimallissa mahasyövän kehitystä, jossa Phe Tyr substituutio 757 kanta solunsisäinen varren IL-6 perheen signalointi reseptorin gp130 samanaikaisesti estää SHP2 ja SOCS3 sitova , ja estää siten ras /MAP-kinaasin signaalin siirtoon, ja hyperactivation of STAT3 konstitutiivisen fosforylaatio [23], [24], [26]. Viime aikoina olemme ja muut ovat osoittaneet, että mahalaukun kasvaimet, merkittävä nousu transkriptio samaan aikaan voimistunutta ilmentymistä gp130 ligandin IL-11 ihmisen mahasyövän ja hiiri malleja tämän taudin [5], [12], [13]. Jälkimmäisessä IL-6 on tarpeeton, mutta IL-11 vaaditaan ehdottomasti tuumorigeneesiä [12], [13]. Lisäksi, IL-11 /STAT3 on osoitettu olevan tärkeä tekijä ja atrofinen gastriitti, ensimmäinen precancerous vaurio mahan jälkeen, krooninen infektio bakteerin

Helicobacter pylori

[14].

Tähän mennessä useat kinaasien on raportoitu aiheuttavan STST3 seuranneesta ligandin /reseptorin sitoutumisen, mutta vain JAK1 ja JAK2 osuus STST3 fosforylaatio kun telakointi IL-11 /gp 130-reseptori kompleksi [15] ja näiden IL-11 /gp130 sitoutuu ensisijaisesti JAK2 [16]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että JAK2 ja STAT3 läsnä lupaavia kohteita suunniteltaessa terapeuttisia antagonistien tukahduttaa IL-11 /STAT3 signalointi ihmisen mahasyövän.

Äskettäin kofeiinihappoa johdannainen WP1066, rakenteellisesti alhaisen teho tyrosiinikinaasiestäjä AG490 , on osoitettu olevan erittäin voimakas estäjä JAK2 /STAT3-reaktiotien transformoitu aivojen gliooma [17] ja munuaiskarsinooma [18] solulinjoja, jotka johtavat kasvuun inhibitio ja induktio klassisen pro-apoptoottisia reittejä. Lisäksi WP1066 on tehokas

in vivo

vastaan ​​erittäin pahanlaatuisten ihosyövän ja leukemiat, jotka ovat positiivisia JAK2-V617F + mutaatio, joka edistää konstitutiivisen JAK2 kinaasiaktivaatiota [19], [20], [21], [22 ]. Julkaisemattomia tutkimukset osoittavat, että WP1066 ei ole ATP-kilpaileva estäjä, ja se voi estää ilmentymisen fosforyloidun JAK2 ja STAT3; Lisäksi p-STAT3-Y705 voidaan estää riippumatta JAK2 tila. Siten WP1066 esittelee ainutlaatuisen mahdollisuuden estää sekä p-JAK ja p-STAT3, ja sen jälkeen voimakkaasti estää JAK2 /STST3 signalointireitin ja STST3 transkriptioaktiviteettia.

Voit testata ajatusta kahden saarto JAK2 ja STAT3 aktivointi vatsassa ja myöhemmin mahasyövän kehitys, olemme käyttäneet sekä

in vitro

ja

in vivo

lähestymistapoja arvioida, WP1066 voi hidastaa tai estää mahakasvaimen kasvua estämällä JAK2 /STAT3 toimintaa, ja muut läheisesti liittyviä kasvaimia synnyttävän signalointireitteihin. Tässä osoitamme, että WP1066 estää tehokkaasti STAT3 fosforylaatiota, ja indusoi apoptoosin mahasyövän solulinja, ja että se voi estää mahalaukun kasvaimen kasvua

in vivo

estämällä induktion keskeisten STAT3 geenien.

Materiaalit ja menetelmät

valmistelu ja varastointi estäjät

Inhibitor WP1066 kehitettiin ja syntetisoitiin Waldemar Priebe ja työtovereiden yliopistossa Texas MD Anderson Cancer Center, ja nykyinen kalusto toimitettiin kohteliaisuus Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Varastot suspendoitiin uudelleen Hybri-Max DMSO: hon ja säilytetään -20 ° C: ssa. Varastot olivat vain kertakäyttöön, eikä pakastaa uudelleen sulattamisen.

In vitro Culture

AGS soluja (ATCC, Manassas VA, USA) soluja pidettiin täydellisessä väliaineessa, joka sisälsi RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 50 IU penisilliiniä 37 ° C: ssa 5% CO

2-95% ilmaa.

Western blotting

proteiini uutteet valmistettiin joko TRIzol reagenssilla (Life Technologies, Vic, Australia) mukaan valmistajan ohjeiden ja proteiini suspendoitiin uudestaan ​​1% natriumdodekyylisulfaattia, joka sisältää 2 mmol /l Na

3Vo

4 tai RIPA puskuri. Alikvootit (30 ug) altistettiin natriumdodekyylisulfaatti /polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Membraanit blokattiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli kuorittu maito seuraavilla vasta-aineilla; STAT3, pY (705) STAT3, ERK1 /2, pT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, pS (473) AKT, JAK2, pY (1007), Y (1008) JAK2 (Soluviestintä, # 9132, # 9134S, # 9131, # 9102 # 4377, # 9272, # 4058, # 3752, # 3751, # 3229, # 3771), GAPDH (Abcam # 9485). Membraanit inkuboitiin peroksidi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Dako, polyklonaaliset sian anti kani, HRP konjugoituna, # P0399) ja visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Amersham, Buckinghamshire, UK). Analyysiä kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Biorad) ja fosforyloitu proteiinit ilmaistiin osuutena GAPDH peräisin kaksoiskappale kalvo. Vähintään n = 8 näytettä arvioitiin joko hoidon.

Cell Counting tekijänä Haemocytometry

Solut ympättiin 5 x 10

4 solua /ml 24-kuoppaisille muodossa täyteen kasvatusliuokseen ja annettiin kasvaa häiritsemättä 24 tuntia. Soluja käsiteltiin sopivan pitoisuuden WP1066 tai DMSO: ta kontrollina 0-360 min. Käsittelyn jälkeen solut irrotetaan käsittelemällä trypsiini-EDTA: ta 0,25% (Sigma), värjättiin trypan-sinisellä 0,4% (Sigma), jonka 1:01 laimennus 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja laskettiin hemosytometrillä.

karboksifluoreseiini diasetaatti sukkinimidyyliesteriä (CFSE) Värjäys

merkitä AGS solut CFSE, solut irrotetaan käsittelemällä trypsiini-EDTA: ta 0,25% (Sigma), ja suspensoitiin uudelleen esilämmitettyä PBS /0,1% BSA: ta, jonka tiheys 1 x 10

6 solua /ml. 10 mM CFSE väriainetta (Invitrogen) valmistettiin valmistajan protokollan mukaisesti, sen jälkeen 5 ul /ml, lisättiin ja sekoitettiin perusteellisesti inversion varmistaa homogeeninen merkintöjä soluja. Näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 10 minuuttia, reaktio pysäytettiin lisäämällä 5 tilavuutta jääkylmää media ja inkuboitiin 5 minuuttia jäällä. Näytteitä pestiin sitten 5 kertaa median ja levytettiin 2 x 10

5 solua /kuoppa (6-kuopan astioihin). Näyte soluja otettiin pinnoituksen jälkeen ja leimattiin 100 ug /ml propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin virtaussytometrialla yhtenäisyyden ja intensiteetti merkintöjä. Sitten soluja kasvatettiin täydellisessä median 48 tuntia, minkä jälkeen ne käsiteltiin kanssa tai ilman asianmukaista WP1066 (5 uM) 37 ° C: ssa, 5% CO

2 95% ilmaa, 18 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin, kuten edellä ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen median, jotka on merkitty 100 ug /ml PI, ja analysoitiin virtaussytometrialla 488 nM. Tiedot tallennettiin käyttäen BD FACS diiva (BD Biosiences) ohjelmisto ja analysoitiin Modfit LT ohjelmistopaketti (VSH).

anneksiini V Värjäys

AGS soluja kasvatettiin täydellisessä mediaa 2 × 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä DMSO: n kanssa (kantaja-kontrolli), tai WP1066 (5 uM), tai etoposidi (200 uM; positiivinen kontrolli) 37 ° C: ssa, 5% CO

2 95% air rauhassa 24 tuntia. Soluja käsiteltiin sitten seuraavasti; pestiin jääkylmällä PBS: llä, trypsinoitiin kuten edellä, ja solutiheys määritettiin haemocytometry ennen suspendoimalla uudelleen anneksiini sitomispuskuria 1 x 10

6 solua /ml. 100 ui tätä valmistetta otettiin, ja inkuboitiin 5 ui Komponentti A (anneksiini Fluor 488 anneksiini V komponentin, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% naudan seerumin albumiinia) ja 1 ug /ml PI 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Näytteet sekoitettiin sitten 400 ul: aan anneksiini sidospuskuria ja analysoitiin virtaussytometrialla. Sopivat tarkastukset +/- reaktion komponentit olivat valmiita säätää bias gating. Tiedot tallennettiin käyttäen BD FACS diiva (BD Biosiences) ohjelmistopaketti.

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Australian Code hoitoon ja eläinten käyttöä tieteellisiin tarkoituksiin (7

painos), ja sen jälkeen hyväksynnän Murdoch Lasten tutkimuslaitoksen Animal Ethics Committee (sovellus # A583). Kaikki pyrittiin minimoimaan epämukavuus näissä minimaalisesti invasiivisia toimenpiteitä.

In vivo

Kokeet

gp130

757F /F hiiriä on kuvattu aiemmin [23]. Lyhyesti, diskreetti antral kasvaimet kehittävät 4 viikon iässä ja kasvaa nopeasti, kunnes noin 12 viikkoa. He toistavat kehitykselliset ominaisuudet suoliston-tyyppinen mahalaukun adenokarsinoomaa, mukaan lukien submukoosinen invaasio, mutta eivät metastaaseja [24]. Eläimiä pidettiin SPF laitokseen Murdoch Lasten tutkimuslaitoksen ja vahvistettu olevan vapaa

Helicobacter pylori

. Kolme ryhmää hiiriä arvioitiin kasvaimen kehittymisen: 1) 8 viikkoa vanha gp130

757F /F hiirillä, jotka eivät saaneet mitään hoitoa (n = 10); 2) gp130

757F /F hiirillä, jotka saivat WP1066 8-10 viikkoa ikäisiä (n = 10); ja 3) gp130

757F /F hiirillä, jotka saivat DMSO ajoneuvo 8-10 viikkoa ikäiset (n = 8). Ennen koetta kaikki eläimet arvioitiin hyvinvoinnin, punnitaan ja hoito tilavuudet lasketaan sen mukaan. Kontrollieläimet saivat yhtä tilavuutta DMSO ajoneuvon WP1066 hoidettujen eläinten. Hiiret saivat 2 alkuperäisen vatsaonteloon injektioita WP1066 10 mg /kg joka 48 tunnin tasaantua ne hoidon vaikutuksia, sitten sai 5 injektiota WP1066 20 mg /kg joka 48. tunti loppuun 2 viikkoa hoito. Vatsaonteloon pistoskohdan vuorottelevat läpi neljä neljännestä vatsan hiirillä. Päätteeksi kokeen, hiiret lopetettiin, ja vatsat toistoleikattiin valokuvaukseen ja kudoksen keräys.

MAKROSKOOPPINEN ja histologinen arviointi

mahat irrotettiin nopeasti pitkin pienempi kaarevuus, puristuksiin ulos, valokuvataan ja kiinnitettiin 4% puskuroidussa paraformaldehydillä ennen käsittelyä. Parafiinileikkeet (4 um) värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Kvantifiointi

immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin vasta-aineilla, Ki-67 (Pharmingen # 550609) ja aktivoitu kaspaasi 3 (Cell Signalling Technology # 9961). Antigeeni haku suoritettiin keittämällä osat 30 minuuttia 10 mM sitruunahappo (pH 6,0). Värjäys saatiin päätökseen sopivilla lajikohtaisia ​​biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita (DAKO, Tanska), avidiini ja biotinyloidun piparjuuriperoksidaasi makromolekyylikompleksi (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3′-diaminobentsidiiniä (Sigma, St. Louis, MI) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä. Ki-67 kvantifiointiin, pidennetyn tarkkailija laskettu määrä värjättyä solua rauhanen useita leikettä eläintä kohti käyttäen ImageJ kuin ennen. Data ilmaistiin määrän Ki-67-positiivisia soluja per rauhanen. Aktivoiduille kaspaasi 3 kvantifiointiin, pidennetyn tarkkailija laskettu määrä värjättyä solua alueen limakalvon 4 satunnaisessa alueilla hyvin suuntautunut antrum eläintä kohden käyttäen ImageJ kuin ennen. Tiedot ilmaistiin määrä aktivoitu kaspaasi 3 positiivista solua alueen limakalvon.

Semikvantitatiivisilla morfometrinen analyysi Tulehdus

Tulehdus arvioitiin käyttämällä mikroskopian sokkona H E-värjätty kohdat. Antral kasvain kudosta analysoitiin ja vähintään 3 nauhojen eläintä kohden (n = 7) annettiin puolikvantitatiivinen pisteet asteen mukaisesti tulehdussolujen minimistä = 0 maksimi = 3 Lymphoplasmocytic ja polymorfonukleaarisiin tunkeutuminen sisään arvioitiin erikseen. Keskiarvot verrattiin tilastollista analyysia.

Real-Time (Q) -PCR Analysis

RNA uutettiin TRIzol reagenssilla (Life Technologies, Vic, Australia) mukaan valmistajan ohjeiden. Kokonais-RNA (3 ug), tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI), pohjustetaan 0,3 ug oligo (dT). Q-PCR-alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Express (Applied Biosystems) (taulukko 1). SYBR vihreän kemian (Applied Biosystems) käytettiin L32 kuin normalisoija. PCR-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 15 s; reaktiot ajettiin Applied Biosystems AB7500 RT-PCR kone. Tulokset analysoitiin sekvenssin ilmaisinta ohjelmistoa, ja suhteellinen kertainen erot määritettiin käyttämällä ΔΔCt menetelmällä, kuten on kuvattu valmistajan.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Arvoja kvantitatiivinen analyysi geenin ilmentymisen tai numero värjäytyneiden solujen verrattiin näytteiden välillä ANOVA, ja joissa tilastollisesti merkittävä ero havaittiin yksittäisiä ryhmiä, analysoitiin edelleen sopivalla parametrinen tai ei-parametrinen tilastollinen käyttäen Sigmastat tilastollista pakettia. Tilastollinen merkittävyys määritettiin p≤0.05.

Tulokset

WP1066 Nopeasti vaimentaa Fosfory- Y (705) STST3 ja indusoi fosforylaatio ERK1 /2 AGS Solut

JAK- STAT polku ja ERK1 /2-reitin ovat kaksi signaalitransduktioreaktioteihin alavirtaan gp130. Nämä kaksi väyliä on vastavuoroinen ja käänteinen sääntelyn vaikutukset toisiinsa, parhaiten osoittaa negatiiviseen säätelyyn pSTAT3 jälkeen ERK1 /2 aktivointi [47].

WP1066 annos-vaste-kokeet suoritetaan käsittelemällä AGS soluja 0 , 1, 2 tai 5 uM WP1066 60 min ja mittaamalla fosforylaation JAK2, STAT3, ERK1 /2 ja SHP-2. Kuten odotettua, pJAK2 voimakkaasti inhiboi WP1066 kaikilla testatuilla pitoisuuksilla ja 80% 5 uM. 5 uM WP1066 antoi myös enintään inhibition pSTAT3 ja vastavuoroisesti aktivaation pERK1 /2 (Fig. 1A), johtaen yhteensä STAT3 5 uM tai suuremmat pitoisuudet (tuloksia ei ole esitetty). Yhtäpitävä kasvu lisäansiot, pSHP2 aktivointi oli annoksesta riippuen parannettu jälkeen WP1066 annon (Fig. 1A).

. Annos-vaste: AGS solut käsiteltiin WP1066 0, 1, 2 ja 5 uM 60 minuuttia ja uutteet immunoblotattu spesifisten vasta-aineiden (i) pJAK2 ja JAK2; (Ii) pSTAT3 ja STAT3; (Iii) pERK1 /2 ja ERK1 /2; (Iv) pSHP2 ja SHP2. Tiedot myös ilmaistiin suhde fosforyloituu kokonaisproteiinin tuotteen kussakin tapauksessa. Tuloksia 3 kokeen näytetään keskimääräisenä OD suhde ± keskivirhe (SE). Tilastollinen merkitys kunkin hoitoon verrattuna 0 uM WP1066 näkyy jos p 0,05. B. Aika-kurssi: AGS solut käsiteltiin kuten kuvassa. 1A, mutta 5 uM WP1066 0, 15, 30, 60, ja 180 min. Tiedot käsiteltiin kuten Fig. 1A.

aika-kurssi tutkimukset, AGS soluja käsiteltiin 0-360 min 5 uM WP1066 ja fosforylaatiota JAK2, STAT3, ERK1 /2 ja SHP-2 analysoitiin Western blottauksella ( kuva 1B). WP1066 hoito johti nopeaan esto pJAK2, jossa on 75%: n lasku 30 minuuttia ja enintään 90%: n lasku 60 min. Tämän jälkeen solut otetaan talteen ja palautetaan pohjapinta JAK2 fosforylaatiota 360 min. Rakenteessa laski STAT3 aktivaation peilattu että JAK2 fosforylaatio. Sen sijaan, ERK1 /2 fosforylaatio lisääntyi merkittävästi vastauksena WP1066 hoitoon, jossa 250%: n nousu 15 min, ja maksimaalinen 460%: n nousu 60 minuuttia, ennen kuin palaa pohjapinta tasolle 360 ​​min. SHP2 aktivointi seurannut muutoksia ERK ilmaisutapoja maksimaalinen induktio 60 min.

WP1066 Estää AGS Kasvua tukahduttaminen leviämisen ja induktio Apoptoosin

Aktivoidut STST3 on vakiintunut kuljettaja ihmisen mahalaukun syöpäsolu kasvua ja lisääntymistä [5], ja pitkittynyt aktivaatio ERK1 /2 indusoi apoptoosia mahalaukun epiteelisolujen [25]. On osoittanut, että WP1066 säätelee STAT3 ja ERK1 /2 signalointi vastavuoroisesti tavalla, testasimme onko se voi myös häiritä solujen kasvua ja indusoivat apoptoosia AGS soluja.

hoito AGS solujen 5 uM WP1066 (Fig. 2A ) johti huomattavaan vähenemiseen solujen määrä suhteessa DMSO valvonnan (DMSO; 100% ± 3,14 vs. WP1066; 36.02% ± 3,18, p 0,05). Voit selvittää tämän vähennys solujen määrä johtui muuttunut soluproliferaation tai apoptoosin, tai molempia, CFSE ja anneksiini V värjäys suoritettiin käsitellyissä soluissa. AGS solut käsiteltiin WP1066 oli intensiivisemmin leimattiin CFSE: llä kuin käsitelty DMSO, näyttöä pienempi määrä solunjakautumisten ja siksi lisääntymistä (Fig. 2B). Lisäksi, suurempi osa AGS käsiteltyjen solujen WP1066 leimattiin anneksiini V (kuvio 2C) verrattuna soluihin, käsitellään DMSO: lla, mikä osoittaa, että WP1066 indusoi myös apoptoosin AGS soluissa (WP1066; 1,3-kertainen lisäys, p = 0,049).

leviämisen: A. AGS solut käsiteltiin WP1066 5 uM 18 tuntia, värjättiin trypaanisinisellä ja elinkelpoisten solujen laskettiin. Tiedot on ilmaistu prosentteina elävien solujen verrattuna pelkkää vehikkeliä. N = 3, keskiarvo ± SE. B. CFSE seuranta käytettiin mittaamaan muutoksia AGS soluproliferaatiota hoidon jälkeen WP 1066. Raaka fluoresenssi kerätyt tiedot on esitetty verrattuna DMSO ohjaimet edustavassa kokeessa. Apoptosis: C. AGS soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan DMSO: n kanssa (menetelmä kontrolli), WP1066 (5 uM) tai etoposidi (200 uM; positiivinen kontrolli) ja kiinnittyneet solut värjättiin anneksiini V laskettiin sitten manuaalisesti. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna DMSO ajoneuvon edustavasta kokeesta. * P = 0,047.

WP1066 Blocks Mahalaukun Kasvaimen kasvu gp130

757FF hiirissä Suppression Kasvainten Cell Proliferation ja Enhancement Apoptoosin

gp130

757FF hiiret kehittävät distaalinen vatsan kasvaimia ominaista kohonnut mahalaukun IL-11 ohjaa STAT3 aktivointi [12], [13]. Koska pJAK2 ja p-STAT3 estyvät WP1066

in vitro

testasimme WP1066 myös estää mahakasvaimen kehitys

in vivo

. Hoito gp130

757FF hiirillä 3 kertaa viikossa 2 viikon ajan 10-20 mg /kg WP1066 vähensi mahakasvaimen kasvua 47% vuodesta 42,11 ± 3,21 mm

2-22,36 ± 3,64 mm

2 ( p 0,05) (Fig. 3A-D). DMSO käsitelty kasvaimet eivät eronneet kasvaimia havaittiin 8 viikon ikäisillä hiirillä, ikä, jossa WP1066 hoito aloitettu, jossa vahvistetaan, että mahakasvaimen kasvu on suhteellisen vakaa 8-10 viikkoa [27], ja että WP1066 hoito todella aiheuttaa kasvainten sijaan pysähtymiseen (Fig. 3A-D).

gp130

757FF hiiret (8 viikkoa vanhoja) käsiteltiin ip 10 mg /kg WP1066 tai DMSO kahdesti rako yhden päivän annosten välillä, minkä jälkeen annokset 20 mg /kg joka 2 päivä 2 viikkoa. Antral kasvaimia 8 viikkoa käsittelemätöntä hiirtä (A) ja 10 viikkoa DMSO-käsiteltyjen vehikkelikontrollit (B) eivät eronneet keskimääräisissä alueella, mutta WP1066 hoito johti -50% pienempi kasvaimet (C). Tämä vahvistettiin määrällinen morfometria (D) missä antral kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä WP1066 hiirissä verrattuna 10 w.o. DMSO valvonta ja 8 w.o. käsittelemättömät hiiret (n = 7-10; p 0,05). Vaikutus WP1066 soluproliferaatioon arvioitiin värjäämällä jaksoon, joissa vasta-ainetta Ki-67. Oli merkittävä väheneminen Ki-67-positiivisia soluja kohti rauhanen WP1066 käsitellyissä hiirissä (F) verrattuna kontrolleihin (E) ja määrällisesti graafisesti (G). Määrä apoptoottisten solujen määrällisesti jälkeen kaspaasi 3 värjäyksen antraalivaurioiden osioita DMSO-kontrollin (H) ja WP1066 (I) hiiri, ja kvantifioitiin laskemalla värjäytyneiden solujen /mm

2 mahan limakalvon (J).

Voit selvittää leviämisen muutettiin mahalaukun kasvaimet, Ki-67-positiivisia soluja /rauhanen määrä määritettiin käsitellyn kohortissa. WP1066 hoito vähensi merkittävästi mahalaukun epiteelisolujen proliferaatiota (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 värjätään solua /rauhanen, p 0,05; Fig. 3E-G) osoittavat, että WP1066 voi estää kasvaimen kasvua estämällä solujen lisääntymisen. Vaikutusten arvioimiseksi on WP1066 kasvainsolujen apoptoosiin, osissa alkaen WP1066 tai DMSO saaneilla ikäluokat värjättiin vasta-ainetta pilkotun kaspaasi 3, merkkiaine apoptoottisen solukuoleman (Fig. 3H, I). Oli huomattavasti enemmän apoptoottisia profiileja WP1066 saaneilla kasvaimia kuin valvontaa, mikä osoittaa selvästi pro-apoptoottinen vaikutus WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs. DMSO 2,65 ± 0,76 värjättyä solua /mm

2 limakalvo, p 0,05; Fig. 3J ).

WP1066 kohdistuu erityisesti JAK2 ja STAT3 fosforylaatiomääritys ohitettavat Mahalaukun tuumorigeneesiä in gp130

757FF hiiret

Koska gp130-

757FF hiiret kehittävät kasvaimia vastauksena konstitutiivisen gp130 aktivointi [20] testasimme ovatko WP1066 tukahdutetaan alavirran signalointireitteihin

in vivo.

WP1066 hoito 2 viikkoa johti 25% laskuun suhteellisen määrän koko STAT3 että antral limakalvon verrattuna DMSO testiryhmään (Fig. 4A) . Kokonaisvahingoista JAK2, AKT ja ERK1 /2 ei ole muuttanut WP1066 hoitoa. Tämä viittaa siihen, että krooninen hoito gp130

757FF-hiirten WP1066 estää ilmentymisen STAT3.

gp130

757FF hiiret (8 viikkoa vanhoja) käsiteltiin kuten kuviossa. 3 ja antral otteet määrällisesti Western blottauksella täydellistä JAK2, STAT3, ERK1 /2 ja AKT (A) ja pJAK2, pSTAT3, pERK1 /2 ja Pakt (B). Kalvot samanaikaisesti hybridisoitiin GAPDH-vasta-aineen latauskontrollina. Intensiteetti signaali kvantifioitiin densitometrialla ja ilmaistaan ​​prosentteina signaalin kontrolleihin verrattuna standardoitu intensiteetti GAPDH-signaalin. n = 6-10; * Merkittävästi (p 0,05).

immunoblot-analyysi aktivaatiota osoitti vähentää merkittävästi pJAK2 (80,12% ± 5,70 ja DMSO-ohjattu), pY705 STAT3 (26,84% ± 7,2: aan DMSO valvonta; Kuvio . 4B) ja pERK1 /2 (72.66% ± 5.23.of DMSO-kontrollin, Fig. 4B). AKT fosforylaatio ei muuttanut WP1066 hoitoa. Vähentynyt aktivointi JAK2 ja STAT3 on sopusoinnussa

in vitro

tietojen ja tunnetuista vaikutuksista WP1066.

WP1066 tukahdutti tulehdusreaktio on Antral Mucosa gp130

757FF Hiiret

Koska krooninen tulehduksellinen vaste vatsa on ratkaisevan tärkeää tuumorin kehitykseen [27], testasimme onko osa toimintatavan WP1066 on tukahduttaa STAT3-välitteisen tulehdusreaktion, joka normaalisti edistää kasvaimen etenemiseen. Histologinen analyysi osoitti, että polymorfonukleaaristen tunkeutuminen antrumin WP1066 käsiteltyjen hiirten oli merkittävästi pienempi kuin kontrollihiirissä (Fig. 5A; DMSO 2,45 ± 0,24 vs. WP1066 1,46 ± 0,22, p 0,05), kun taas lymphoplasmocytic infiltraatti ei ollut eroa näiden kahden ryhmiä (kuvio. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs. WP1066 1,32 ± 0,20, p 0,05).

gp130

757FF hiiriä (8 viikon ikäisiä) käsitellään kuten Fig. 3, oli antral vatsa kudos otetaan histologiaa ja proinflammatoristen geeniekspressiota Q-PCR jälkeen mRNA uuttamalla. Hoito gp130

757FF hiiriä WP1066 aiheutti merkittävä väheneminen (p 0,05) polymorfonukleaarisista infiltraatiota (A) antral vatsassa, mutta lymphoplaysmocytic infiltraatti oli muuttumaton (B). Geenien ilmentyminen suhteessa taloudenhoitaja GAPDH IL-6 (C), IL-11 (D), IL-1 α (E), IL-1β (F) ja COX-2 (G), kvantifioitiin ΔΔCT menetelmällä . Kaikki n = 8; * P 0,05 verrattuna DMSO valvontaa.

Koska mahalaukun tulehdus tyypillisesti välittyy pieni joukko keskeisiä proinflammatoristen sytokiinien ja entsyymejä, mittasimme ilmaus valitse ryhmä nämä mukaan Q- PCR DMSO ja WP1066-käsiteltyjen mahojen. Expression kaikki pro-inflammatoristen välittäjien, lukuun ottamatta IFNy, TNFa: n ja iNOS n vaikutuksesta inhiboitui merkittävästi WP1066 tavalla seuraavasti; IL-6 (kuvio. 5C; 6,0 ± 2,6-kertaisesti), IL-11 (Fig. 5D; 8,7 ± 3,4-kertaisesti), IL-1α (Fig. 5E; 10,9 ± 4,3) kertaa), IL-1β (Fig. 5F ; 3 ± 0,9-kertainen) ja COX2 (Fig. 5G; 2,94 ± 1,05). Siksi WP1066 estäminen STAT3 aktiivisuus ja kasvaimen etenemiseen johtui osittain vähentyneestä polymophonuclear soluttautuminen ja vähentää STAT3-riippuvaisen transkription tulehdusta IL-6, IL-11, IL-1α, IL-1β ja COX2 geenejä.

WP1066 esti ilmentäminen amfireguliini vuonna Antral Mucosa gp130

757FF Hiiret

vaikutus WP1066 hoidon ilmaus kasvutekijän ligandien tiedetään olevan rooli kasvua ja erilaistumista mahalaukun ja kehittämisessä gp130

757FF kasvaimia arvioitiin myös. WP1066 esti ilmentymisen amfireguliini (1,85 ± 0,60-kertaiseksi, p 0,05), mutta ei HB-EGF: ää (Fig. 6) antrumin limakalvossa käsiteltyjen hiirten. Lisäksi, vatsa proliferatiivinen ligandin ja STAT3 säädelty geeni REG1 oli voimakas estävä trendi jälkeen WP1066 hoidon verrattuna DMSO-kontrollin antrum (Fig. 6; p = 0,069).

gp130

757FF hiiriä ( 8 viikkoa vanhoja) käsiteltiin kuten kuviossa. 5. mRNA REG1, amfireguliini ja HB-EGF analysoitiin Q-PCR-analyysi ja kvantifioitava ΔΔCT menetelmällä. EGFR ligandit säädellään eri tavalla siten, että amfireguliini mRNA oli merkittävästi vähentynyt WP1066 käsitellyissä hiirissä verrattuna kontrolleihin (p 0,05), kun taas HB-EGF pysyi ennallaan. Ei-EGFR ligandi Regi osoitti vahva trendi kohti laski lauseke (p = 0,069). Kaikki n = 8; * Tilastollisesti erilainen (p≤0.05).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että WP1066 annosriippuvaisesti estää JAK2 /STST3 signalointireitin ihmisen mahasyövän (AGS) solut , minkä seurauksena 60%: n vähennys solujen proliferaatiota, ja pienempi apoptoosin lisääntyminen. Mekanismi tähän on todennäköisesti johtuu dual esto fosforyloidun muotojen JAK2 ja STAT3 vähentää siten STAT3 transkriptioaktiivisuutta, kuten on osoitettu useita syövän solulinjojen gliooma [17], [28], [29], myelooinen leukemia [ ,,,0],30], ja melanooma [20]. Toisaalta, WP1066 sovellus johti vastavuoroisesti kasvuun ERK1 /2 aktivointi yhtenevä lisääntynyt pSHP2, fosfataasi vastuussa aktivoimiseksi ras /MAP-kinaasin signalointireitille. Samanlainen havainto suhteen ERK aktivointi on tehty muu syöpä johdetut solulinjat munuaissyöpä [18], ja gliooma [28]. Siksi rajat sääntely STAT3 ja ERK-välitteinen signalointi myötävirtaan IL-6-perheen sytokiinien näyttää esiintyvän yleisesti on valikoimia kudoksissa ja solulinjoissa [31].

WP1066 oli myös tehokas, kun annetaan

in vivo

, missä se estää STAT3 aktivointi (75%) in gp130

757FF hiiri antral kasvaimia, ja myös vähensi yhteensä STAT3 proteiinia, mikä viittaa siihen, että se saattaa vähentää ilmentymä

Stat3

-geenin vatsat käsiteltyjen hiirten. Tätä tukee se, että yksimielisyys sivustoja aktivoitu STAT3 sitoo

Stat3

promoottori, jossa aktivointi

Stat3

geeni osoitettuna käyttäen mutantti

Stat3

promoottori-reportteri konstruktit ja EMSA [48], tai ChIP-kohdat [49], ja ehdottaa, että WP1066 voi estää autokriinisen aktivointi STAT3 jälkeen inhibitio JAK2 /STAT3: n fosforylaation.

Kuten odotettua, pJAK2 tasot vähensi myös läsnä ollessa

H.