Krooninen sairaus

tiivistelmä

galektiini-4 (Gal-4) on jäsen galektiini perheen glykaanin sitovia proteiineja, jotka on esitetty huomattavasti suurempi ekspressio kystisessä kasvainten ihmisen haiman ja haiman adenokarsinoomat verrattuna normaaliin haiman . Kuitenkin otaksuttu toiminto Gal-4 kasvaimen etenemisessä haimasyövän edelleen puutteellisesti. Tässä tutkimuksessa roolia Gal-4 syövän etenemiseen tutkittiin käyttäen joukko määritellyn haimasyövän solulinjoissa, Pa-Tu-8988S (PATU-S) ja Pa-Tu-8988T (PATU-T), mallina . Nämä kaksi solulinjaa ovat peräisin samasta maksan etäpesäkkeiden ihmisen ensisijainen haiman adenokarsinooma, mutta ne eroavat niiden kasvuominaisuudet ja metastaattinen kapasiteetti. Olemme osoittaneet, että Gal-4 ilme on korkea Patu-S, joka osoittaa huonoa muuttavien ominaisuuksia, kun taas paljon pienempi Gal-4 tasot havaitaan erittäin metastaattinen solulinja PATU-T. Patu-S, Gal-4 havaitaan sytoplasmassa, mutta se on myös erittyy, ja kerääntyy kalvon paikoissa kosketuksissa viereisten solujen. Lisäksi osoitamme, että Gal-4 estää etäpesäkkeiden muodostumista hidastamalla migraatio haimasyöpäsoluissa

in vitro

käyttäen naarmu määritystä, ja

in vivo

käyttäen zebrafish (

Danio rerio

) kuten kokeellisessa mallissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että Gal-4 voi toimia solun pinnan Patu-S: adheesiomolekyyli vapautumisen estämiseksi kasvainsolujen, mutta on lisäksi sytosolin toiminto estävä vaikutus kautta vielä tunneta mekanismia.

Citation: Belo AI, van der Sar AM, Tefsen B, van Die I (2013) galektiini-4 Vähentää Migration and Metastasis muodostuminen haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (6): e65957. doi: 10,1371 /journal.pone.0065957

Editor: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 14 helmikuu 2013; Hyväksytty: 29 huhtikuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Belo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitti Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Lissabon, Portugali, kautta tutkimusmäärärahat SFRH /BD /44820/2008 myönnetty AIB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi johtavista kuolinsyistä syöpä länsimaissa. Kliinisesti tehokas strategioita varhaista havaitsemista taudin ei ole vielä saatavilla. Ilmaantuvuus haimasyövän ja kuolleisuutta potilailla, joilla tämäntyyppinen syöpä on tuskin vähentynyt viimeisten 50 vuoden ajan [1], [2], [3], [4]. Siksi edelleen ymmärtäminen mekanismeihin puhkeamista, etenemisen ja etäpesäkkeiden haimasyövän on perusteltua.

Galectins ovat proteiineja, jotka voidaan poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​syöpä ja ovat sekaantuneet syövän etenemisessä [5], [6]. Ne koostuvat perheen galaktosidi sitovan liukoinen lektiinejä, jotka on luokiteltu kolmeen alaryhmään perustuen niiden rakenne ja määrä hiilihydraatteja tunnistavien alueiden: prototyyppi (galectins-1, -2, -5, -7, -10, -11 , -13, ja -14), chimera tyyppi (galektiini-3), ja tandem-toisto tyyppi (galectins-4, -6, -8, -9, ja -12) [tarkistetaan [7]]. Ne toimivat monenlaisia ​​biologisia prosesseja sekä sisäisen ja solun. Galektiini-glykoproteiini ristikoita pelata merkittävä rooli säätelyssä solujen toimintaa, kuten solu-soluadheesion, soluväliaineen (ECM) vuorovaikutuksia, solujen kasvuun [8], järjestäminen membraanidomeeneja vuonna lipidilautan muodostumiseen [9], [10] , [11], valkosolut muuttoliike [tarkastelleet [12]] ja sääntelyn solunsisäinen signalointi [13], [14], [15].

ilmentymistä galectins moduloidaan kehittämisen aikana yksittäisten solujen ja voidaan muuttaa eri fysiologinen tai patologisia tiloja. Galectins usein yli-ilmennetään syöpäsoluja ja syöpään liittyvän stroomasolujen, erityisesti ne solutyypit, jotka tavallisesti eivät ilmennä erityistä galektiini [16]. Syövän etenemisen, galectins osallistuvat erilaistumiseen, tarttuvuus, muuttoliike, angiogeneesi, pahanlaatuisiksi, apoptoosin ja syöpälääkkeen vastus [tarkistetaan [5], [17], [18], [19], [20], [21] , [22]]. Lisäksi on olemassa useita raportteja, jotka ovat yhdistäneet nämä proteiinit ja metastaasit useissa syöpien [16], [23], [24], [25], [26], [27], [28].

tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet roolista galektiini-4 (Gal-4) in etäpesäke haimasyövän soluja. Etäpesäkkeiden muodostumista on monivaiheinen prosessi, jossa primaarisen kasvaimen solut tunkeutuvat viereisen kudosten, kulkeutua verisuonistosta lopulta ekstravasoitumaan osaksi verisuonia kudosten ja lisääntymään uusio- kasvaimia. Gal-4 on 323-aminohapon (36 kDa), proteiinin, joka ilmentyy pääasiassa luminaalisessa epiteeli maha-suolikanavan, mistä kielen paksusuoleen. Gal-4: n ekspression ei havaittu terveillä haimassa, mutta on merkittävästi parannettu kystinen kasvainten ihmisen haiman ja haiman adenokarsinoomista verrattuna normaaliin kudokseen näytteitä, kun taas sen ilmentyminen on alhainen haiman neuroendocrine kasvaimissa [26], [27], [29 ], [30], [31]. Toiminto Gal-4 kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden haimasyövän kuitenkin edelleen epäselvä. Tässä tutkimuksessa otaksuttu rooli Gal-4 syövän etenemiseen tutkittiin käyttäen joukko määritellyn haiman solulinjoissa. Tulokset osoittavat, että Gal-4 on suurempi ilmaistaan ​​eriytettyä haiman kasvainsolujen verrattuna haiman soluja osoittaa metastaattisen ominaisuuksia. Lisäksi Gal-4 vaikuttaa etäpesäkkeiden muodostumista hidastamalla muuttoliike ja etäpesäke haimasyövän soluja

in vitro

on naarmu määrityksessä ja

in vivo

vuonna seeprakala alkioiden kokeellisessa mallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Roy

– /-; nacre

– /- casper

Danio rerio

(seeprakala) käsiteltiin noudattaen paikallisten eläinten hyvinvointia koskevien säännösten ja ylläpidetään standardimenetelmien mukaisesti (zfin.org). Kasvatuksen aikuisen kalan hyväksyi paikallinen eläinten hyvinvoinnin komitea (Animal Experimental lisensointi komitea, DEC) VU University Medical Center. Kaikki protokollat ​​tarttunut kansainvälisten ohjeiden määritelty EU: n eläinten suojelua koskevan direktiivin 86/609 /ETY, jonka avulla seeprakala alkioiden käyttää enintään hetkellä vapaana elävät (noin 5-7 päivän kuluttua hedelmöityksestä). Koska alkioita käytettiin tässä tutkimuksessa täyttänyt nämä kriteerit, ei joulukuu tarvitaan lupa tälle tutkimukselle.

Vasta-aineet, reagenssit ja puskurit

vuohen anti-ihmisen galektiini-4 (BD Biosciences, Belgia) oli havaitsemiseen käytetty Gal-4 ja hiiren anti-tubuliini (Cedarlane, Kanada) käytettiin endogeenista ohjaus. Toissijainen vasta-aineet (Ab) käytettiin Odyssey IRDye 680 aasin anti-vuohi (0,5 mg); IRDye 800CW Vuohen anti-kani IgG (LI-COR Biosciences, USA); kanin anti-vuohi Alexa Fluor 488; kanin anti-vuohi Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, USA). TO-PRO®-3 Iodide kanssa pitkälle punaisen fluoresenssin Live Technologies (Invitrogen, USA) käytettiin kuolleiden solujen indikaattorina.

Yhdistelmä hGal-4-proteiini hankittiin BD Biosciences; Licor estopuskuria hankittiin LI-COR biotieteiden, USA; laktoosi saatiin Sigma (USA) ja punainen fluoresoiva solujen värjäytymisen CM-Dil päässä Vybrant, Invitrogen (USA). Ohjaus siRNA (ryntäily A) ja GAL4 siRNA (10 uM) ostettiin Santa Cruz Biotecknology (USA). Äänenvaimennin ennalta suunniteltu siRNA vastaan ​​Gal-4 (20 uM) ja Ambion®

Silencer®

Negative Control # 1 siRNA (20 uM) hankittiin Ambion (USA). Lipofectamine RNAiMax ja Opti-MEM transfektioreagensseilla saatiin Invitrogen (USA).

Solut ja viljelyolosuhteet

Haimasyöpä solulinjoissa Pa-Tu-8988S (PATU-S) ja Pa-Tu -8988T (PATU-T) ostettiin DSMZ (Saksa). Muut haiman solulinjoja ystävällinen lahja Dr. Richardson (Leidenin yliopisto, Alankomaat) [32]. Solulinjat AsPC1, BxPC3, MiaPaca ja Panc01 viljeltiin RPMI (GIBCO, Invitrogen), jossa oli 10% FCS: ää (Lanza, Belgia) ja 1:100 Pen /Strep (GIBCO, Invitrogen) 37 ° C: ssa + 5% CO

2. Solulinjat Capan-I ja Capan-II viljeltiin 15% FCS. Patu-S, Patu-T ja PaTu8902 viljeltiin DMEM korkea glukoosi (Gibco, Invitrogen), jossa oli 10% FCS: ää ja 1:100 Pen /Strep: 37 ° C + 5% CO

2.

cDNA synteesi ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA eristettiin kaikista solulinjoista käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. mRNA tämän jälkeen cDNA: ksi käyttäen Reverse Transcription System Kit (Promega, USA), kuten aiemmin on kuvattu [33]. cDNA ihmisen normaalista haimatiehyeeseen epiteelityyppinen hTERT-HPNE solulinjassa [34] oli ystävällinen lahjoitus tri E. Giovannetti (Dept. of Medical Oncology, VUmc Cancer Center Amsterdam, Alankomaat). RT- (real time) PCR-reaktiot suoritettiin SYBR Green menetelmä ABI 7900HT sekvenssin havaitsemisen järjestelmää (Applied Biosystems, USA), kuten aiemmin on kuvattu [35]. Kaikki oligonukleotidit suunniteltiin käyttäen Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, USA) tietokoneohjelmistot, ja syntetisoitiin Invitrogen Life Technology (USA). Reaktiot suoritettiin seuraavasti: 2 min 50 ° C: ssa, mitä seurasi 10 minuuttia 95 ° C: ssa, ja 40 sykliä, joissa 15 sekuntia 95 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C: ssa. Tiedot ilmaistaan ​​suhteellisena mRNA runsaus saatu CT arvot kohde verrattuna endogeenisen viitegeenin

GAPDH

.

rakentaminen PATU-T soluja, jotka ilmentävät Gal-4

jotta rakennettaisiin Patù-T-solut, jotka ilmentävät rekombinantti-Gal-4, ihmisen galektiini-4 (hGal-4) geeni kloonattiin insertoimalla cDNA hGal-4-geenin vektorin pRRL-cPPT–CMV-X2-PRE-Sincom IRES-eGFP (ystävällinen lahjoitus tri A. Horrevoets, VU Medical Center, Amsterdam, Alankomaat). Koko hGal-4: n avoimen lukukehyksen (ORF) saatiin RT-PCR-monistuksella, käyttöön Nsil /EcoRI-restriktiokohdat ja COSAC järjestyksessä ennen ORF (Vl: catatgcatcaccATGGCCTATGTCCCCGC, Rev: gaattcgatTTAGATCTGGACATAGGACAAGG). HGal-4-insertti kloonattiin käyttäen EcoRI-vektorin, jolloin sijoittamalla hGal-4-geenin konstitutiivinen CMV-promoottori. Saatu lenti-viruksen konstrukti kasvatettiin

Escherichia coli

BL21 (DE3) ja puhdistettiin spin-pylväs plasmidin eristäminen (Qiagen, Saksa). Lenti-viruksen tuotanto ja tartunnan Patu-T-solujen kanssa viruksen konstrukti, jolloin solulinja PATU-T /Gal-4, suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [36]. Kontrolli solulinjaa (PATU-T /mock) rakennettiin käyttöön tyhjän vektorin.

Gal-4 Knock Down (KD) Patu-S Cells

RNA-välitteisen häiriön oli hyödynnetään vähentää Gal-4 ilmentymisen Patu-S soluissa. Optimaalisen transfektion tehokkuus Patu-S-solut, sekä Gal-4 tavoite siRNA (40 nM lopullinen konsentraatio) Santa Cruz Biotechnology ja äänenvaimennin esisuunnitellun siRNA (10 nM lopullinen konsentraatio) lisättiin samanaikaisesti käyttää estämään Gal-4 lauseke (PaTu- S /Gal-4-KD). Negatiivinen kontrolli (ryntäily A yhdessä negatiivisen kontrollin siRNA # 1) sisällytettiin kokeissa (PATU-S /mock-KD). Transfektiot suoritettiin Invitrogen suuntaviivat kääntää transfektion 24-kuoppaiseen levyyn 1 ui Lipofectamine RNAiMax ja 100 ui Opti-MEM-väliainetta. Vähentämiseksi Gal-4: n ekspression Patù-S-solut, siRNA otettiin käyttöön kahdesti 4 päivän välein, ja solut istutetaan seeprakala alkion 24 h kuluttua toisen transfektion. Gal-4-mRNA: n tasot mitattiin useissa aikapisteissä aikana kokeet, joissa käytetään määrällisiä RT-PCR: llä.

Länsi-pyyhkinyt

Solut hajotettiin 0 ° C: ssa TEA lyysipuskuria (Triton X- 100, NaCl, MgCl, CaCl

2, TEA pH8.2), joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit. Proteiinipitoisuus määritettiin A280 mittaukset ja BCA määritys käyttäen Protein Assay Kit Pierce (USA). Proteiinit solulysaateista (75 ug) ja viljelyväliaineessa (25 ui) erotettiin SDS-PAGE: lla 12,5% polyakryyliamidigeelillä epäjatkuvan puskurin järjestelmää ja proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Whatman Protran, Sigma). Yön yli esto 01:01 Licor estopuskurissa PBST /1% BSA: ta (PBS, jossa 0,05% TWEEN 20, 1% BSA), blotteja inkuboitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa vuohen anti-hGal-4 (0,1 ug /ml ). Hiiren anti-tubuliinia (1:2000 laimennus) käytettiin latauskontrollina (solulysaateista) ja solujen roskia tunnistus (viljelyalusta). Toissijainen ABs IRDye 680 anti-vuohen ja IRDye 800CW anti-kani IgG: tä käytettiin 1:15000 laimennoksia (0,07 ug /ml), PBST /1% BSA: ta 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT) pimeässä. Western-blotting-analyysi suoritettiin käyttämällä LI-COR Odyssey järjestelmät skanneri ja ohjelmistot.

proliferaatiomääritystä

Solut ympättiin 96-kuoppaiseen levyyn noin 1 x 10

4 ja 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja inkuboitiin yön yli solujen tarttumisen levyyn. [

3H] tymidiiniä (1 uCi /kuoppa; Amersham Biosciences, USA) lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 24 tuntia 37 ° C: ssa + 5% CO

2. Solut kerättiin ja [

3H] tymidiinin arvioitiin käyttäen nestetuikelaskuria MicroBeta

2 Plate Counter 2450 (Perkin Elmer, USA).

Immunofluoresenssimikroskopia

Patù-S , Patu-T /mock ja Patu-T /Gal-4-soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille 24 h pestiin 3 kertaa PBS: llä, kiinteä 30 minuuttia 4% paraformaldehydissä ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 /PBS: ssä 5 min. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin jäähdyttämällä 10 minuutin ajan PBS /glysiiniä (0,15 M), jota seurasi 30 min PBS /gelatiinia 0,2% /BSA 0,5% (PBSG). Soluja inkuboitiin polyklonaalisella vuohen anti-hGal-4 PBSG (laimennus 0,2 ug /ml) 1 tunti ja sen jälkeen pestiin PBS: llä. Havaitseminen suoritettiin 1 h inkuboinnin RT: ssä 5 ug /ml toissijaisen Abs (anti-vuohi-Alexa Fluor 488 tai anti-vuohi-Alexa Fluor 647). Tumat värjättiin HOECHST (1 ug /ml PBS: ssä) aikana inkubaatiovaiheen johdetun Ab. Aktiini havaittiin phalloidin värjäytymistä (1:5000 PBS: ssä, 15 min). Jälkeen lopullinen pesuvaihe PBS ja upottaminen käyttämällä Mowiol (Kuraray POVAL, Saksa) useita soluja jokaisen kunnon visualisoitiin käyttämällä Leica M6000 B mikroskooppi objektiivilinssin HCX PL APO 40,0 × 0,85 kuiva. Kuvat otettiin kanssa DFC350FXR2-095903305 Kamera ja analysoitiin käyttämällä LASAF ohjelmisto (Leica Microsystems, Saksa).

virtaussytometria

havaitsemiseksi endogeenisen Gal-4, solut ensin kiinnitettiin 4% paraformaldehydissä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen solu läpäiseväksi in PBA /0,5% saponiinia 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitoutumisen havaitsemiseksi ihmisen rekombinantti Gal-4 (rec hGal-4) solun pintaan, suoritettiin, mukaan Patnaik,

et ai

[37]. Lyhyesti, solut kerättiin, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen kylmään Hankin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS, Sigma, USA), jossa 500 mM laktoosia. Tämän jälkeen soluja kerättiin ja niitä inkuboitiin kylmässä HBSS 2% BSA: ssa 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa varovasti sekoittaen. Tämän jälkeen solut pestiin kerran HBSS: llä /BSA: ta, 2 mM β-merkaptoetanolia (Gibco, Invitrogen), ja sen jälkeen inkuboitiin tunnin ajan 4 ° C: ssa HBSS /BSA /1 mM β-merkaptoetanolia puuttuessa tai läsnä rec hGal-4 (5 ug /ml) havaitsemiseksi endogeenisen pintaan sitoutuneen Gal-4 tai pinta-sitoutuneen rec hGal-4, vastaavasti. Sen arvioimiseksi, onko Gal-4: n sitoutumista on hiilihydraatti riippuvainen, sitovat määritykset suoritettiin, kun läsnä oli 500 mM: laktoosi. Sekä pinta ja sytosolin analyysiä varten solut värjättiin anti-Gal-4 Ab (2 ug /ml) PBS: ssä, jossa oli 0,5% BSA: ta ja 0,02% atsidi (PBA), joka sisälsi 10% FCS: ää (Sigma, USA), 30 min 4 ° C: ssa. Sekundaariseen värjäys, Alexa488 tai Alexa647 leimattua Abs käytettiin (5 ug /ml ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa). Kuolleiden solujen ilmaisin TO-PRO®-3 jodidia (1 nM) lisättiin juuri aiemmin virrata cytrometry mittauksiin. Virtaussytometria suoritettiin käyttäen FACScan tai FACSCalibur -virtaussytometrillä ja Summit-ohjelmisto. Kuolleet solut määriteltiin korkea TO-PRO®-3 värjäys jätettiin analyysin ulkopuolelle.

In vitro

migraatiokokeessa ( ”scratch” -assay) B

scratch-määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu, jonka Liang et ai. [38]. Solut kasvatettiin konfluenssiin 24-kuoppaiseen levyyn. Yksisolukerros raaputettiin suorassa linjassa, jossa on 200-ul pipetin kärki (Sarstedt, Saksa). Valokuvia tyhjästä otettiin alle inverttisokeri Leica DMI mikroskoopilla 0 h, 12 h, 24 h ja 48 h PATU-T /Gal-4 ja PATU-T /mock-solut. Valokuvia kunakin ajankohtana otettiin Leica DFC420 kameralla. Gap leveys 0 h oli asetettu 100%. Aukon leveys analyysi suoritettiin PhotoshopCS4 käyttäen analyyttistä hallitsija työkalu. Mittaukset tehtiin useita määritelty sivustoja ( 5) pitkin tyhjästä. Jokainen naarmu annettiin Kaikkien suoritettujen mittausten keskiarvon. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

In vivo

Metastasis Pitoisuus

Roy

– /-, helmiäinen

– /- casper Danio rerio

(seeprakala) käsiteltiin noudattaa paikallisia eläinten hoitoon asetusten ja vakioprotokollia Alankomaiden. Kala pidettiin 28 ° C: akvaarioissa kanssa päivä /yö valoa jaksoissa (10 h pimeä versus 14 h valo aikoja). Kehittyvä alkiot pidettiin muna vedessä (60 ug /ml instant meri nähdä suolat) 28 ° C: ssa ennen elinsiirtoa ja 35 ° C: ssa kuluttua siirrosta.

Syöpä solujen siirto suoritettiin Marques

et al

[39]. Pohjimmiltaan, solut kasvatettiin konfluenssiin, trypsinoitiin (GIBCO, Invitrogen), ja sentrifugoitiin 5 min, 1500 rpm. Sitten solut värjättiin PBS: ssä, joka sisälsi CM-Dil lopullisessa pitoisuudessa 4 ng /ul, 4 min 37 ° C: ssa ja 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Tämän jälkeen solut kerättiin ja solujen pelletit suspendoitiin uudelleen 100% FCS: ää 5 min ajan talteenotto ja pestiin kahdesti PBS: llä. Lopuksi solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään siirrettäväksi zebrafish alkioiden 2 päivää lähettää lannoitus (DPF). Alkiot dechorionated ja nukutettiin tricaine (MS-222, Sigma-Aldrich, USA). Manuaalisella injektori (Eppendorf, Saksa; Injectman Ni2), solususpensio laitettiin injektio kapillaari (15 um sisäisesti ja 18 pm ulkoisen-halkaisija). Seuraavaksi noin 100 punaisia ​​fluoresoivia soluja injektoitiin keltuaispussiin on dechorionated alkioita. Injektion jälkeen alkioiden annettiin toipua elinsiirtoon 1 tunnin ajan RT: ssä. Tämän ajanjakson jälkeen (2 h transplantaation jälkeen (HPT)), alkiot tutkittiin läsnäolon fluoresoivien solujen. Alkiot sisältävät fluoresoivat solut ulkopuolella elinsiirrot alue 2 hpt katsottiin olevan vuotavat ja jätetty tarkempaa analyysiä. Alkioiden määrää hengissä tässä vaiheessa oli asetettu 100% jokaista kunnossa itsenäisesti. Kaikki muut alkiot inkuboitiin 35 ° C: ssa 3 seuraavina päivinä.

Imaging, valinta ja sijoittaminen Transplanted Seeprakala Alkioiden

1, 2 ja 3 päivää siirron jälkeen (DPT), The alkiot nukutettiin tricaine ja sivusuunnassa 3% metyyliselluloosaa. Alkiot seulottiin alla stereo DSR fluoresenssi Leica MZ16FA mikroskoopilla. Fluoresoiva syöpäsolut ulkopuolella implantaatio laskettiin jokaisessa alkio. Alkiot esitetään yli 5 syöpäsoluja ulkopuolella keltuainen katsottiin olevan positiivisia metastaasin ja asetettiin syrjään erotettu muusta siirretyn alkioiden. Prosenttiosuus etäpesäke asetettiin alkioiden määrää, jotka sisältävät yli 5 solua ulkopuolella keltuainen päivässä suhteessa päivä nollaan. Yhteensä etäpesäke prosenttiosuus asetetaan kokonaismäärä alkioiden metastasiaa 3 päivän kuluttua suhteessa päivä nolla.

Tilastot

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM. Tilastollinen analyysi sovelletaan määrällisiin RT-PCR-tulokset olivat yksisuuntainen ANOVA käyttämällä Dunnettin t-testillä. Kaikkien muiden tietojen tilastollinen analyysi käytettiin yksisuuntaista ANOVA: n Tukey t-testejä.

In vivo

etäpesäkkeiden määritykset analysoitiin tilastollisesti käyttämällä pariksi näytteen T-testejä. Tiedot pidettiin merkittävinä, jos

p

≤0.05.

Tulokset

mRNA Expression of Gal-4 in haima Adenokarsinooma Solulinjat

tutkimiseksi ero ilmentymisen Gal-4 mRNA-tasot määritettiin yhdeksän eri ihmisen haimasyövän solulinjoissa käyttämällä Real Time (RT) PCR: llä (kuvio 1). Kontrollina ilmentymisen normaalissa haiman kanava kudosta, Gal-4-mRNA-tasot määritettiin immortalisoitu solulinja on peräisin normaalista ihmisen epiteelin haiman kanava (hTERT-HPNE). Tulokset osoittivat, että Gal-4-mRNA: n tasoihin normaalilla haiman kanava solulinja eivät olleet havaittavissa. Gal-4 mRNA-tasot osoittivat suhteellisen alhainen runsautta kahdeksan yhdeksästä syövän solulinjoissa käyttämällä

GAPDH

kuin kotitalouksien viite geeni. Yksi solulinja, Pa-Tu-8988S (PATU-S), kuitenkin, oli enemmän kuin 10 kertaa kohonnut ilmentyminen verrattuna muita solulinjoja.

Gal-4-mRNA: n ilmentyminen normaalissa ihmisen haiman kanava epithelial- kuten solulinja (hTERT-HPNE) ja 9 eri ihmisen haimasyövän solulinjoissa analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja kuvattu suhteellisen määrän Gal-4-transkriptien (± SEM) verrattuna ilmentymisen endogeenisen viitegeenin

GAPDH

. (*** P≤0.001 verrattuna kaikki muut solulinjat, käyttäen yksisuuntainen ANOVA post Dunnettin kaksipuolinen t-testit).

Mielenkiintoista, Patu-S peräisin samasta maksan etäpesäkkeiden ihmisen ensisijainen haiman adenokarsinooma yksi alhaisen Gal-4 ilmentävien solulinjojen, Pa-Tu-8988T (PATU-T) [40]. Nämä kaksi solulinjaa on kuvattu sisältämään vastakkaiseen muuttavien ja metastaattinen kapasiteetti. Patu-S ja PATU-T näyttää erittäin matala ja korkea metastaattinen kapasiteetti vastaavasti molemmat

in vitro

ja

in vivo

käyttäen zebrafish mallina järjestelmän [39]. Lisäksi on aiemmin osoitettu, että suurin osa solulinjojen kuviossa 1 niillä on lisääntynyt

in vitro

maahanmuuton kapasiteettia verrattuna Patu-S [32], [41]. Nämä tiedot johtivat meidät pohtimaan mahdollisuutta, että ilmentyminen Gal-4 voi rajoittaa muuttavien ja /tai metastaattinen kapasiteetti näiden haiman syöpäsoluja. Koska niiden yhteinen alkuperä, matalan muuttavien Patu-S solulinjan ja metastaattisen PATU-T-solulinjan edustaa erittäin houkutteleva malli järjestelmä tutkia otaksuttu rooli Gal-4 etäpesäkkeitä.

lokalisaatio Gal- 4 Patu-S ja PATU-T Cells

ilmaisu ja lokalisaation Gal-4-proteiinin Patu-S ja PATU-T-solujen määritettiin käyttämällä virtaussytometria, Immunosytokemia (ICC) ja western blotting (WB) (kuviot 2-4). Määrittää endogeeninen Gal-4 Patu-S ja PATU-T-soluja, solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin sen jälkeen virtaussytometrialla käyttäen anti-Gal-4-vasta-aineita (Ab: t), ja fluoresoiva toissijainen Abs. Tulokset osoittavat selvästi eroa Gal-4 Ab sitoutumisen välillä Patu-S ja PATU-T. Patu-S-solut osoittavat voimakasta värjäytymistä anti-Gal-4 Abs, kun taas Gal-4 värjäytymisen Patu-T-soluissa on tuskin havaittavissa (kuvio 2A). Arvioida läsnä glykaanin ligandeja ulomman solun pinnan, joka voi tunnistaa Gal-4, solut ensin tiukasti pestiin 500 mM laktoosia poistaa endogeenisen pintaan sidottu galectins. Myöhemmin eksogeeninen rec. hGal-4-proteiinia (5 ug /ml) lisättiin soluihin ja Gal-4 sitoutuminen määritettiin virtaussytometrialla käyttäen anti-Gal-4 Abs. Tulokset osoittavat, että on edelleen merkittävä määrä Gal-4-värjäys havaittiin pinnalla Patu-S-soluissa, mutta ei PATU-T-solujen, pesun jälkeen laktoosin kanssa (kuvio 2B), mikä osoittaa, että läsnä on vahvasti sitoutuneen endogeenisen Gal-4 pinnalla Patu-S soluissa. Kun oli lisätty rec hGal-4 soluja, solun pinnan Gal-4-värjäys kasvanut voimakkaasti, mikä osoittaa, että Patu-S-solut voivat sitoa suuria määriä Gal-4 niiden pinnalle. Sitä vastoin paljon alhaisempi rec hGal-4 sitoutuu solun pinnalla PATU-T-soluja. Sen tutkimiseksi, onko rec hGal-4 sitoutuu soluihin hiilihydraatti-riippuvaisella tavalla, Patu-T ja Patu-S-soluja inkuboitiin rec hGal-4: n läsnä ollessa laktoosia. Kun läsnä on 500 mM laktoosia sitoutumisen hGal-4 molemmissa solulinjoissa estyi, mikä osoittaa, että Gal-4: n sitoutumista solun pintaan on glykaania-riippuvainen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että korkean Gal-4 tasot ovat läsnä Patu-S-soluissa, kun taas Gal-4 on tuskin havaittavissa Patù-T-solut. Lisäksi Patu-S-solut voivat sitoa paljon korkeampia Gal-4 ulkopinnan yli PATU-T-soluja, mikä osoittaa, että ne ilmentävät enemmän Gal-4-sitoutumisen hiilihydraatti ligandien.

Detection endogeenisen Gal- 4, ja Gal-4-ligandeja, Patù-S ja PATU-T-solujen virtaussytometrialla. Histogrammi on yksi edustaja koe on kuvattu kunkin tilan ainakin kahden itsenäisen kokeen. A) Dot tontteja Gal-4 värjäys läpäiseviksi Patu-S ja PATU-T-solut. Gal-4 havaittiin 4 ° C: ssa anti-hGal-4 Abs kiinteän läpäiseviksi soluissa. Toissijainen Abs värjäys ilman anti-hGal-4 Abs käytettiin tausta autofluoresenssia ohjaus. B) läsnäolo endogeenisen sitoutuneen Gal-4 pintaan Patu-S ja PATU-T pesun jälkeen solut 500 mM laktoosia ennen Gal-4-värjäys. Läsnäolo Gal-4 määritettiin FACS-analyysillä käyttämällä anti-hGal-4 Abs 4 ° C: ssa. Endogeeninen Gal-4 sitoutunut pintaan on esitetty mustalla viivalla. C) läsnäolo Gal-4 sitoutumiskohtia Patu-S ja PATU-T-solujen määritettiin pesun jälkeen solut 500 mM laktoosin ennen Gal-4 värjäystä. Sitoutuminen ulkoisesti lisätty rekombinantti (rec) hGal-4 (5 ug /ml, musta viiva) tutkittiin. Sitoutuminen rec hGal-4 pintaan voitiin estää lisäämällä laktoosia (tumma kenttä). Taustaa värjäys toissijainen Abs on kuvattu vaaleanharmaa kentät B ja C.

Valokuvia edustaja ICC analyysi solun lokalisaatio Gal-4 Patu-S soluissa. Gal-4 havaittiin käyttämällä Alexa-leimattu anti-Gal-4 Abs (vihreä), Actin värjättiin käyttäen falloidiinia (punainen) ja tuma värjäys saatiin käyttämällä HOESCHS (sininen); kolmas paneeli esittää yhdistäminen eri värjäykset. Bar = 25 pm.

A) Proteiinit koko solun uutteiden (75 ug kokonaisproteiinia) ja viljelyväliaineessa (4 päivää kulttuuri, 25 ui) Patu-S (PS), Patu-T (PT), PATU-T /Gal-4 (PT /Gal-4) ja PATU-T /mock (PT /M) erotettiin SDS-PAGE: lla. Siirtämisen jälkeen proteiinit nitroselluloosamembraanille, blotit värjättiin vuohen anti-hGal-4 havaitsemiseksi Gal-4, ja hiiren anti-tubuliinin kontrollina läsnäolo solunsisäistä proteiinia. B) Valokuvia edustaja ICC analyysi solun lokalisaatio Gal-4 Patu-T /Gal-4 ja PATU-T /mock-solut. Gal-4 havaittiin käyttämällä Alexa-leimattu anti-Gal-4 Abs (vihreä), Actin värjättiin käyttäen falloidiinia (punainen) ja tuma värjäys saatiin käyttämällä HOESCHS (sininen); kolmas paneeli esittää yhdistäminen eri värjäykset. Bar = 25 pm.

sijainti solun Gal-4 tutkittiin edelleen käyttäen ICC. Tulokset osoittavat korkean fluoresenssi-intensiteetin koko sytoplasmassa Patu-S-soluja (kuvio 3), mikä osoittaa, että useimmat Gal-4 on lokalisoitu sytosoliin. Korkean fluoresenssi havaittiin solukalvon yksittäisissä soluissa ja solujen välillä, erityisesti kosketuksessa sivustoja vierekkäisten solujen (solu-solu-kontaktien), kun taas tuskin lainkaan fluoresenssia havaittiin tuman. Gal-4 ei ole homogeenisesti jakautunut sytoplasmassa, osoittaa joitakin alueita enemmän fluoresenssitasoja kuin toiset, vaikka ei ole olemassa selviä merkkejä tiettyjen soluelimiin mukana kertyminen Gal-4. Patu-T-soluja, ei Gal-4 voitiin havaita tällä menetelmällä, perustamisesta virtaussytometrillä dataa, joka ilmoittaa, että Gal-4 tasoa Patù-T-solut ovat hyvin alhaiset.

yli-ilmentyminen Gal-4 Patu -T solut

arvioimiseksi oletetun osallistumista Gal-4 siirtymätesteissä, Gal-4 yliekspressoitiin Patù-T-solujen käyttöön sisältävä virusvektori hGal-4-geenin CMV: n promoottori (Patù -T /Gal-4). Kontrollina, virus- vektori ilman inserttiä transdusoitu PATU-T (PATU-T /mock). Proteiinin ilmentymisen ja lokalisaation Gal-4 hoitamattomien Patu-T ja Patu-S-solut, PATU-T /Gal-4 ja PATU-T /mock analysoitiin western blot (WB), ICC ja virtaussytometria.

tason määrittämiseksi Gal-4 ilmentyminen solulinjoissa, solut ja keskisuurten kerättiin 4 päivän kuluttua viljelyn. Proteiineja solu-uutteissa ja keskisuurten erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Värjäyksen jälkeen blotit käyttäen vuohen anti-Gal-4 Abs, nauhat 36 kDa vastaava näennäinen massa Gal-4 havaittiin Patu-T /Gal-4 solu-uutetta ja väliaineessa yhtä paljon kuin havaittu Patu-S solu-uutetta ja keskisuurten, vastaavasti (kuvio 4A). Kuten odotettua, PATU-T /mock eivät osoittaneet havaittavaa bändejä 36 kD. Nämä tulokset osoittavat, että Gal-4 ilmentyy Patu-T /Gal-4 samalla tasolla kuin Patu-S-soluja. Lisäksi saman verran Gal-4 erittävät Patu-S ja PATU-T /Gal-4-soluja.

Käyttäen ICC, osoitimme, että solunsisäistä jakelua Gal-4 sisällä PaTuT /Gal-4 solut on samanlainen jakautuminen Patù-S-soluissa, kun taas mitään Gal-4 havaittiin PaTuT /mock-solut (kuvio 4B). Jakelu Gal-4 näiden solujen sytosolissa on samanlainen jakauma Patù-S-soluja. Gal-4 on läsnä koko solun, lukuun ottamatta ytimen, joka on samanlainen kuin havaittiin Patù-S. Kuitenkin, kun taas Gal-4 on läsnä solukalvon Patu-S-solut, tuskin Gal-4 havaitaan kalvon läpäiseviksi PATU-T /Gal-4-soluja. Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että PATU-T /Gal-4 ilmaisee ja erittää Gal-4 samankaltaisissa määriä Patu-S soluissa.

Lisäksi päätimme siitä endogeenisiä, ja /tai lisättyä rekombinanttia Gal- 4 on sitoutunut solun pintaan Patu-T /Gal-4 virtaussytometrialla käyttäen anti-Gal-4 Abs. Sitovat anti-Gal-4 Abs solun pinnalla ei ollut eroa PATU-T /Gal-4 ja PATU-T /Mock (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen kapasiteetti PATU-T /Gal-4-solut sitomaan Gal-4 solun ulkopuolelle ei muutu verrattuna käsittelemättömiin PATU-T-solulinjan.

yli-ilmentyminen Gal-4 Vähentää Migration kapasiteetti Patu-T solut

tutkia Gal-4 vaikuttaa muuttokäyttäytymistä käyttäytymistä PATU-T-solujen, naarmu analyysi suoritettiin käyttäen PATU-T ja PATU-T /Gal-4-soluja (kuvio 5A-B).

tyhjästä (haavan paranemiseen) määritys suoritettiin PATU-T, Patu-T /Gal-4 ja PATU-T /mock-solut. Patu-T /mock ja Patu-T /Gal-4-solut ympättiin 24-kuoppalevylle ja naarmuuntunut pinnalla, jossa on 200-ul pipetin kärki. Suhteelliset arvot asetettiin 100%: n raon leveys aikaan tyhjästä.