Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Glykosylaatiota on tärkeä ja universaali translaation jälkeisen modifikaation monille proteiineille, ja säätelee proteiinien toimintoja. Kuitenkin yksinkertainen ja nopea menetelmiä analysoida glykaanien yksittäisten proteiineihin ei ole ollut saatavilla vasta äskettäin.

Methods /Principal Havainnot

Uusi tekniikka analysoida glykopeptideitä on erittäin herkkä tavalla matriisi-avusteinen laserdesorptio /ionisaatio massaspektrometrian (MALDI-MS) käyttäen nestematriisissa 3AQ /CHCA on kehitetty äskettäin, ja optimoitu tätä tekniikkaa analysoida pieni määrä transmembraaniproteiinin erotettiin SDS-PAGE: lla. Käytimme MALDI-MS menetelmän arvioimiseksi glykosylaation asemaan kalvo-tyypin 1 matriksimetalloproteinaasi (MT1-MMP).

O

-glycosylation of MT1-MMP raportoidaan muuntamaan sen proteaasin aktiivisuutta ja näin vaikuttamaan syöpäsoluinvaasiota. MT1-MMP ilmaistuna ihmisen fibrosarcoma HT1080-solut immunosaostettiin ja SDS-PAGE. Sen jälkeen kun in-geeli tryptinen ruoansulatusta proteiinin, yksi pisara hajotettu levitettiin suoraan nestematriisissa on MALDI tähyslevyä. Pitoisuus hydrofiilisten glykopeptidien sisällä keskialueella johtunut vähitellen haihtumisen näyteliuoksen, kun taas Glykosyloimaton hydrofobisia peptidejä pysyi periferiassa. Tämä erityinen erottaminen ja pitoisuus glykopeptidien mahdollisti kattavan analyysin MT1-MMP

O

-glycosylation.

Johtopäätökset /merkitys

Me osoittaa, ensimmäistä kertaa, heterogeeninen

O

-glycosylation profiilin proteiinin koko proteiinin analyysi käyttäen MALDI-MS: llä. Koska syöpäsolut on raportoitu olevan muuttunut proteiinien glykosylaatio, tämä helppo käyttää menetelmää glykopeptideihin analyysi avaa mahdollisuuden tunnistaa tiettyjä glykosyloitumismalleja proteiineja, joita voidaan käyttää uusina biomarkkereita pahanlaatuisia kasvaimia.

Citation: Shuo T, Koshikawa N, Hoshino D, Minegishi T, Ao-Kondo H, Oyama M, et al. (2012) havaitseminen heterogeeninen

O

-Glycosylation Kavereita MT1-MMP ilmoitettuna Syöpäsolut yksinkertaisella MALDI-MS Method. PLoS ONE 7 (8): e43751. doi: 10,1371 /journal.pone.0043751

Toimittaja: Nikos K. Karamanoun, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 05 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 27 heinäkuu 2012; Julkaistu: 22 elokuu 2012

Copyright: © Shuo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B) [22700375] (TS), joka on Grant-in-tuki Scientific Research (S) [22220014] (MS) ja Global COE Program ”keskus opetus- ja tutkimus Advanced Genome – Based Medicine – for henkilökohtaisen lääketieteen ja valvonta maailmanlaajuisesti tartuntatautien ”(TS ja MS) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia (MEXT) Japanissa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: SS, SI, ja KT ovat työntekijöitä Shimadzu Corporation. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Glykosylaatiota on yleinen ja erittäin monipuolinen yhteistyö ja translaation jälkeinen proteiinin muutos [1 ]. Kertyvät todisteet osoittavat, että lisäämällä tai muuttamalla yhden tai useamman sokeriosaa voi olla erilaisia ​​vaikutuksia proteiinien toimintaa ja tällaisia ​​muutoksia ovat sekaantuneet eri tautitilojen [2]. Erityisesti erityisiä muutoksia proteiinien

O

-glycosylation on raportoitu pahanlaatuisten kasvainten [3], [4], [5].

O

-glycosylation aloitetaan lisäämällä

N

-acetylgalactosamine (GalNAc) ja hydroksyyliryhmä on seriinin tai treoniinin tähteen, jota seuraa myöhemmin lisäämällä galaktoosia tai

N

-acetylglucosamine (GlcNAc), joka muodostaa ytimen rakenne glykaanin ketjun [6]. Core

O

glykaanien voidaan edelleen laajentaa muiden hiilihydraattiosien, kuten fukoosin ja /tai siaalihappoa. On raportoitu, että ydin rakenteet

O

glykaanien ovat mukana metastaattisen kapasiteetin syöpäsoluja. Esimerkiksi Iwai

et al

. osoittivat, että pakko ilmentymistä β1,3-

N

-acetylglucosaminyltransferase 6, joka lisää β1,3 sidottu GlcNAc GalNAc pelkistävässä terminuksessa, ihmisen fibrosarcoma FP-10-solut (erittäin invasiivinen variantti HT1080-solujen ) johti merkittävään vähenemiseen

in vitro

muuttoliikkeen kyky ja muodostumista keuhkojen etäpesäkkeiden

in vivo

hiirillä [7].

MT1-MMP on tyypin I transmembraanisen proteinaasi että on ratkaiseva rooli tuumorisolun invaasio, koska sen kyky katkaista laaja kirjo soluväliaineen makromolekyylien kuten kollageenien ja laminiineja, ja aktivoimaan proMMP-2 [8]. MT1-MMP on multi-domain rakenne, jossa katalyyttinen domeeni (Thr

112-Gly

285), joka on sarana domain (Glu

286-Ile

318), joka on Hemopeksiini kaltainen domeeni ( Cys

319-Cys

508) ja varsi verkkotunnuksen (Pro

509-Ala

541) on solunulkoinen alue [9]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että MT1-MMP on posttranslationaalisesti modifioitu

O

glykaani useisiin paikkoihin sisällä sarana verkkotunnus. Tämä muutos on ollut mukana substraattitunnistus [10], proteiini vakaus [11], ja vaihtuvuus entsyymin [12]. Esimerkiksi Wu

et al

. osoittivat, että MT1-MMP

O

-glycosylation vaikuttaa proMMP-2 aktivointi solun pinnalla [10]. Mahdolliset glykosylaatiokohdat on MT1-MMP ehdotettiin aminohapposekvenssin analyysi ja kohdennettua mutageneesiä [10], [13] ja glykaanin ryhmät analysoitiin lektiinit ja glykosidaaseja [10], [11]. MT1-MMP ilmaistaan ​​yleensä alhaisella tasolla (1-2 x 10

5 molekyyliä /solu) jopa syöpäsoluja [14]. Siksi nämä biokemialliset menetelmät eivät sovellu analysoida heterogeeninen glykosylaation aseman MT1-MMP, erityisesti kliinisissä näytteissä.

MALDI-MS [15], [16] on välttämätön analyyttinen väline selvittämiseksi sekä peptidi ja glykaanirakenteessa ryhmiä glykopeptidien [17]. Kuitenkin, glykopeptidit ovat yleensä tehottomasti ionisoidun kuin Glykosyloimaton peptidit, ja lisäksi, määrä glykopeptidi syntyy pilkkomalla proteaasilla proteiinin näyte on yleensä melko pieni verrattuna Glykosyloimaton peptidin. Näin ollen, ennen erottamista glykosyloidun ja Glykosyloimaton peptidejä on väistämättä tarvitaan MS-analyysiä varten [18]. Hiljattain kehitetty MALDI-tekniikalla käyttäen nestematriisissa 3AQ /CHCA, joka koostuu 3-aminokinoliini ja α-syano-4-hydroksikanelihappo, käytössä kohde-erotus glykosyloidun ja Glykosyloimaton perustuvien peptidien eroja niiden hydrofiilisyyden jälkeen pisara proteaasi sulatella levitettiin nestematriisissa on MALDI tähyslevyä [19]. Tämä on kohde-erottelu menetelmää käytettiin analysoimaan

N

-glycosylation ribonukleaasi B, jota käytetään mallina glykoproteiini. Täällä sovellettu ja optimoitu uuden MALDI-MS menetelmän analysoida

O

-glycosylation profiilia MT1-MMP ilmaistu syöpäsoluissa alhaisella tasolla ja yrittivät tunnistaa heterogeeninen muutos tila.

tulokset

on-tavoite peptidien erotteluun on Liquid Matrix 3AQ /CHCA

peptidit eri hydrofiilisyyttä voidaan erottaa sen nestematriisissa 3AQ /CHCA täpläksi MALDI tähyslevyä [19] . 3AQ /CHCA matriisi muodostaa keltaisen värinen viskoosi paikalla, kun sitä sovelletaan tähtäinlevy kuten kuvassa. 1A. Yksi pisara proteolyyttisten digestio proteiinia sisältävän näytteen sekä glykosyloituneen ja Glykosyloimaton peptidit sitten laikullinen pinnalle nestemäisen matriisin. Näyte leviää tasaisesti nesteeseen matriisi ja näyteliuoksen vähitellen haihtuu noin 12 min (Kuva. 1 B). Aikana haihtuminen, hydrofiilisiä ainesosia kuten glykopeptidien keskittyvät sisällä keskialueella. Sitä vastoin hydrofobiset peptidit ovat yleensä jätettävä haihduttamalla liuos ja jätetään kehällä nesteen matriisin.

(A) Kaavamainen esitys on kohde-erotus menetelmä on kuvattu tässä tutkimuksessa. 3AQ /CHCA ensin täpliksi MALDI tähyslevyä ja sitten proteolyyttinen koko proteiini Näyteliuokset sisältää sekä glykosyloituneen ja Glykosyloimaton peptidit levitetään yläpinnalle nesteen matriisin. (B) ajan funktiona seuranta näytteen pisara nestettä matriisi. Haihduttamalla näyteliuoksen mahdollistaa pisaran kutistua niin, että hydrofiiliset aineosat ovat vähitellen keskittyneet keskittynyt pisaran.

Detection glykosyloidun peptidien Endogeenisen MT1-MMP

MT1-MMP on kiinteä kalvo proteinaasi ilmaistuna pinnalla aggressiivinen syöpäsoluja. Ensin yrittäneet havaita MS spektri tuotetaan glykopeptidien of MT1-MMP ilmaistu syöpäsoluissa. Endogeeninen MT1-MMP immunosaostettiin kalvo lysaateista ihmisen fibrosarkooman HT1080-soluihin käyttäen monoklonaalisia anti-MT1-MMP-vasta valmistettu laboratoriossamme kuvatulla

Materiaalit ja menetelmät

. Siaalihappoa, joka vastustaa ionisaation MS-analyysi [20], poistettiin käyttäen sialidaasi. Näytteet erotettiin sitten SDS-PAGE: lla (Fig. 2A). Laimennokset naudan seerumin albumiinia (BSA) käytettiin myös geelin arvioida proteiinin määrää (tietoja ei esitetty). Geeli värjättiin Coomassie Blue ja noin 150 ng MT1-MMP-proteiini leikattiin (Fig. 2A, bändi on hakasuluissa). Eristetty geeli fragmentille suoritettiin geelissä trypsiinillä hajotusta ja yhden kuudeskymmenesosaa digestio vietiin suoraan 3AQ /CHCA matriisi MALDI kohdelevyä.

(A) Endogeenisen MT1-MMP immunosaostettiin anti-MT1-MMP-vasta-aine-konjugoitua hartsi kalvon solulysaateista villityypin HT1080-solujen, ja edelleen erotettiin SDS-PAGE: lla ja värjäämällä Coomassie Blue. Sialidaasia, joka sisältää BSA: ta kantajaproteiini, ladattiin valossa kaistaa (merkitty tähdellä). Numerot vasemmalla paneelin edustaa molekyyli- massat kilodaltonia (kDa). (B) polypeptidi vastaava vyöhyke MT1-MMP leikattiin, digestoitiin geelissä trypsiinin kanssa. Osajaetta tryptinen MT1-MMP digest peräisin HT1080 soluista levitettiin suoraan nestematriisissa 3AQ /CHCA annetun MALDI tähyslevyn. MS-spektri saatiin sisällä keskeisellä alueella nestematriisissa (avoin ympyrä [○]). Stereoskooppinen mikroskooppi kuva näytteestä paikalla näkyy vasempaan olkavarteen insertin. Numero edustaa kumulatiivista intensiteetti alkuun piikin (mielivaltaisina yksikköinä).

tryptiselle MT1-MMP sulattaa levitetään nestematriisissa on MALDI tähyslevyä annettiin haihtua ja keskiosa näytteestä kuormatila säteilytettiin lasersäteellä (Fig. 2B, lisätty kuva). MS-spektri tuotti käsittää useita huippuja (

m /z

2,042.5, 2,245.1, 2,406.9, 2,609.7, 2,771.6, 2,974.0 ja 3,135.8) väliset etäisyydet huippujen vastasi tarkasti massojen tyypillinen monosakkarideja: 162 ja 203 Da for heksoosi (Hex) ja

N

-acetylhexosamine (HexNAc: ia), tässä järjestyksessä (Kuva. 2B). Siksi nämä piikit arveltiin olevan peräisin yhdestä peptidi glykosyloitu eri tavoin.

Analyysi glykosyloidun peptidit

Jotta voitaisiin edelleen tutkia glykopeptidien huiput johdettu MT1-MMP by toinen ja kolmas vaihe MS analyysit (MS

2 ja MS

3), käytimme FLAG-merkittyä MT1-MMP (MT1-FLAG) ilmaistuna HT1080 soluissa, koska siitä syystä, että suuri määrä FLAG-merkittyä proteiini voidaan puhdistaa helposti ja tehokkaasti. Toistamaan natiivin glykosylaatiomallin MT1-MMP soluissa, MT1-FLAG ilmentyi stabiilisti tasolle verrattavissa endogeenisen proteiinin villityypin soluista. Ilmaisimme MT1-FLAG käytettäessä HT1080 johdannainen, jonka endogeenistä MT1-MMP pudotettiin käyttäen shRNA. Tasot MT1-MMP ilmentymistä soluissa vahvistettiin Western blot -analyysillä (kuvio. S1A). MT1-FLAG puhdistettiin kalvon lysaateista revertantti soluihin käyttämällä anti-FLAG-vasta-ainetta. Noin 400 ng MT1-FLAG proteiini SDS-PAGE (kuvio. S1B) ja sitten analysoitiin paikan kohde erotusmenetelmä kautta MALDI-MS.

Saatu MS spektri MT1-FLAG oli lähes identtinen endogeenisen MT1-MMP (Fig. 3 versus Fig. 2B), paitsi hydrofiilisen FLAG-tag (DYKDDDDK) sisältävä peptidi piikin

m /z

1,786.9 in MT1-FLAG. Törmäyksen aiheuttama dissosiaatio suuria protonoitu ioni [M + H]

+ huiput (

m /z

2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 ja 3,134.2) kautta MS

2 ilmoitettu että fragmentti-ionit vastaavat sarjan tappiot monosakkaridien glykosyloidusta peptidi

299TTSRPSVPDKPK

310 (Fig. 4). Glykomuotoja Tämän peptidin sisälsi 2-5 Hex ja HexNAc: ia. Fragmentti-ioni-spektrit saatiin myös toisesta glykopeptidien

278GIQQLYGGESGFPTK

292 kuin sodiated-ioni [M + Na]

+ piikin kohdassa

m /z

1,968.7 (Fig. S2A). MS

2 tuoteioniparien osoitteessa

m /z

1,024.0 osoitettiin olevan Hex-HexNac: ia sisältävä peptidi

287SGFPTK

292 MS

3 pirstoutuminen (Kuva. S2B). Yhteenveto tunnistetuista glykopeptidien on merkitty kaavamaisesti rakenteesta MT1-MMP (Fig. 5). Näin ollen, olemme pystyneet havaitsemaan glykosyloituneen peptidejä MT1-MMP MS-analyysi koko proteiinin ote geeli. Kuten glykopeptidien piikkejä ei saatu, kun sama näyte analysoitiin käyttämällä tavanomaista kiinteän matriisin DHB [21], kuten on esitetty kuviossa. S3. Nämä tulokset osoittavat selvästi paremmuuden uuden menetelmän avulla nestematriisissa 3AQ /CHCA.

Osajaetta tryptinen MT1-FLAG digestio levitettiin suoraan nestematriisissa 3AQ /CHCA. MS-spektri on saatu aikaan keskiosassa nesteen matriisin. Glykaanirakenteeseen osat ja aminohapposekvenssit peptidien, mukaan lukien glykosylaatiokohtien näiden glykopeptidien jaettiin MS

2 ja MS

3. Numero edustaa kumulatiivista intensiteetti alkuun piikin (mielivaltaisina yksikköinä).

ionipiikkien peräisin MS-spektri tryptisten MT1-FLAG liuottamaa osoitteessa

m /z

2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 ja 3,134.2 (Fig. 3), tehtiin MS

2 analyysiä. Nämä fragmentti-ionit jaettiin menetys yhden monosakkarideja (162 ja 203 Da Hex ja HexNac: ia, vastaavasti) samasta peptidi-ioni (

299TTSRPSVPD

307).

MT1- MMP on tyypin I trans- proteinaasi, ja on erityisesti multidomain rakenne, jossa on katalyyttinen domeeni, joka on sarana-domeeni, Hemopeksiini kaltainen domeeni ja varren toimialue solunulkoinen alue. Aaltoalleviivaus glykopeptidien tunnistettu tässä tutkimuksessa.

heterogeeninen glykosyloitumisprofiilin of MT1-MMP

valmistelemiseksi standardin proteiininäytteestä perustaa määritysolosuhteissa glykopeptideihin analyysi, valmistimme liukoinen MT1-MMP, josta puuttuu transmembraanidomeeni, joka on ilmaistu Madin-Darby koiran munuaissolut (MDCK) soluja. Tuloksena MS-analyysi liukoisen MT1-MMP on esitetty kuviossa. S4. Vain yksi suuri glykopeptideihin huippu havaittiin, että peptidin

299TTSRPSVPDKPK

310. Toisaalta, useita glykopeptidien piikit havaittiin samasta peptidistä MT1-FLAG ilmaistuna HT1080-solut (Fig. 3). Siksi glykosylaatiomallissa MT1-FLAG saatu HT1080 soluista edustaa heterogeenistä glykosylaatioprofiili peptidin ja se ei ole, koska hajoamista tai muuttaminen hiilihydraattiosien näytteen valmistuksen aikana ja sen soveltamisesta MS-analyysiä. Yhdessä tämä on-tavoitteen erottaminen menetelmä voi tulla tehokas helppo työkalu analysoida heterogeenisiä glykosyloitumismalleja proteiinien valinta.

havaitseminen Glykosyloimaton peptidien Same Target Plate

MS-spektrit glykopeptidien saatiin edullisesti saatu keskialueella näytteen ladattu matriisi. Tämä tulos osoittaa, että me aikaan erottaminen glykosyloidun ja Glykosyloimaton peptidien nestematriisissa. Vahvista edelleen erottaminen Glykosyloimaton peptidien matriisi, olemme analysoineet kehän näytteen ladattu alue nestematriisissa lasersäteilyn. Monet muunneltua johdettujen peptidien MT1-MMP digest havaittiin (Fig. S5, huiput merkitty tähteä), kun taas glykopeptidien ei havaittu tällä alueella.

Kaiken kaikkiaan olemme saavuttaneet noin 50% sekvenssin kattavuus ekstrasellulaarisen alueen MT1-MMP käyttäen tätä menetelmää (kuvio. S6). Siten koko proteiini analyysi glykosyloidun ja Glykosyloimaton peptidejä toteutettiin seuraavia tavanomaisia ​​SDS-PAGE, in-geeli ruoansulatusta, ja suora soveltaminen yksittäisen pisaran näytteen sulattaa päälle nestematriisissa 3AQ /CHCA annetun MALDI tähyslevyn.

alaraja Protein määrä varten Pitoisuus

lopullisesti määritelty MS spektri syntyvät glykopeptidien sisällä pienempi määrä näytteen proteiinia. Eri määriä MT1-FLAG-proteiinia tehtiin SDS-PAGE, ja geeli värjättiin Coomassie Blue. Määrä MT1-FLAG arvioitiin käyttäen BSA: ta standardina proteiinin (Fig. 6A). Osia sisältävä geelin näytteen proteiinit leikattiin irti ja analysoitiin samalla tavalla (Fig. 6B). Vaikka huippuintensiteetit MS spektrien laski mukaan näytteen määrä, voisimme havaita glykopeptideihin huiput jopa pienin määrä näytettä ja proteiinin määrä lastattu nestematriisissa tässä tapauksessa arvioitiin olevan noin 1,6 ng.

(A) MT1-FLAG laimennettiin sarjoittain ja sitten erotettiin SDS-PAGE: lla ja värjättiin Coomassie Blue. Sialidaasi, joka sisältää BSA kantajana proteiinia, ladattiin pitkälle vasemmalla kaistalla (merkitty tähdellä). Numerot vasemmalla paneelien edustaa molekyyli- massat kilodaltonia (kDa). (B) polypeptidi vastaavat vyöhykkeet MT1-FLAG leikattiin, geelissä pilkottiin trypsiinillä, ja analysoitiin MS: n avulla nestematriisissa 3AQ /CHCA. Glykopeptidit sisälsi koko proteiinia sulattaa saatu MT1-FLAG (noin 1,6 ng, joka perustuu vertaamalla BSA-standardi) havaittiin nesteen keskelle matriisin. Numerot edustavat kumulatiivinen intensiteetti alkuun huiput (mielivaltaisina yksikköinä). Arrowheads osoittavat glykopeptidien ioneja (katso Fig. 3).

Keskustelu

Monet biokemialliset ovat käytettävissä analysoida

N

-glycosylation proteiineja, kun taas ne,

O

-glycosylation ovat rajalliset. Siksi analyysi

O

-glycosylation tilasta proteiinien käyttämällä pieniä määriä näyte on teknisesti haastavaa. On-kohde erotusmenetelmällä, hyödyntäen nestematriisissa 3AQ /CHCA MALDI-MS, kehitettiin äskettäin ja voidaan hahmottaa

N-

glykosylaation ribonukleaasi B. Käytimme tätä menetelmää analysoida

O

-glycosylation of MT1-MMP ilmaisi alhaisilla tasoilla syöpäsoluissa.

paikan tavoite erotusmenetelmä käyttää nestematriisissa on erittäin helppo ja nopea analysoida sekoitus glykosyloidun ja Glykosyloimaton peptidejä verrattiin tavanomainen MS-analyysillä käyttäen DHB. Koska glykosyloitu peptidit heikosti ionisoitu verrattuna Glykosyloimaton niitä, glykopeptidi signaaleja ei voitu havaita silloin, kun sama MT1-FLAG digestio levitettiin DHB matriisin (Fig. S3). Näin ollen, DHB ei voida käyttää glykopeptidien analyysiin ilman esikäsittelyä erottamiseksi jälkimmäisen. Sitä vastoin, ennen erottamista glykosyloidun ja Glykosyloimaton peptidejä ei tarvita MS-analyysi, kun käytetään 3AQ /CHCA. Koska ylimääräinen erotusvaihe seuraavasti proteolyyttinen digestio ei tarvita, vain pieni määrä proteiinia näyte oli riittävä, jotta saadaan selviä tuloksia kuten on osoitettu kuviossa. 6. Lisäksi, neste matriisi 3AQ /CHCA on yhteensopiva paitsi analyysit Coomassie Blue -värillä värjättyjen proteiinien näytteille, mutta myös, että hopeavärjätyn niitä (tuloksia ei ole esitetty). Hopeavärjäys avulla voidaan todeta useimpien proteiinien, koska se on herkempi kuin värjäämällä Coomassie-sinisellä. Yhdessä MALDI-MS-menetelmällä 3AQ /CHCA voi mahdollistaa tutkia glykosylaatio proteiini, joka ilmentyy pieninä määrinä ja /tai läsnä spesifinen pinta-ala, kuten lipidilauttoja, jossa puhdistaminen on monimutkaisempaa.

tässä tutkimuksessa olemme lähinnä käytetty MT1-FLAG-proteiinia ilmaistu HT1080 soluissa arvioimiseksi monipuolisuutta uuden sovelluksen nesteen matriisi analysoida glykoproteiineja MS. Tämä on yksinkertaisesti, koska olemme tutkineet MT1-MMP ilmaistu syöpäsoluissa ja halusi käyttää sitä tavallisena transmembraaniproteiiniksi ilmaistaan ​​matalalla tasolla. Havaitsimme glykosyloitu MT1-MMP peptidi huiput johdettu

278GIQQLYGGESGFPTK

292 ja

299TTSRPSVPDKPK

310 (Fig. 3). Siksi Thr ja Ser-tähteitä näissä peptidit edustavat mahdollista

O

-glycosylation sivustoja. Thr

291, Thr

299, Thr

300, ja Pa

301 ehdotettiin olevan paikkoihin

O

-glycosylation mutaation analyysi [10], [13]. Lisäksi olemme havainneet, että Ser

304 myös glykosyloitunut HT1080 soluissa ilmaisemalla glykopeptideihin signaalin

303PSVPDKPK

310 MS

2 analyysi sodiated ioni [M + Na]

+ piikin kohdassa

m /z

2,791.9 kuten kuvassa. 3 (dataa ei esitetty). Vaikka nämä tulokset ovat pitkälti vahvistavia, analyysi paljasti myös heterogeeninen

O

-glycosylated peptidi piikkien

299TTSRPSVPDKPK

310 (Fig. 4). Siten koko proteiini MS-analyysillä käyttäen nestematriisissa on tehokas väline analysoida heterogeenisuus glykosylaation. Menetelmä on helppo käyttää jopa kliinistä näytettä, jossa spesifisiä vasta-aineita on saatavilla immunoaffiniteettipuhdistusta kohdeproteiinien soluista, kudoksesta, seerumit, ja virtsan. Koska muuttunut proteiinien glykosylaatio on yhdistetty syövän etenemisessä [3], [4], [5], on-kohde erotusmenetelmä käytetään 3AQ /CHCA nopeuttaa analyysin heterogeenisuus

O

-glycosylation eri syöpään liittyvien proteiinien. Jos on syöpä-vaihtelut, tunnistetut

O

glykaanien voivat edustaa uutta ehdokasta biomarkkereita pahanlaatuisia kasvaimia. Lisäksi kasvaa kiinnostus biotekniikan perustuvia lääkkeitä, joita valmistetaan eläviä soluja. Glykosylaatio asema näiden biologisten tuotteiden on osoitettu olevan tärkeä sen farmakologisia ominaisuuksia [22]. Esillä MALDI-MS menetelmä voi tulla arvokas väline glycoanalysis kliinisten näytteiden sekä arvioinnin laadusta biologisten lääkevalmisteet.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen HT1080 fibrosarkoomasoluissa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 10 uM MMI270 (synteettinen hydroksaami- matriisimetalloproteinaasin estäjä, jollaisia lahja Novartis Pharma AG, Basel, Sveitsi), ja 1% penisilliini /streptomysiinillä 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa.

lentivirusvektoreita varten MT1-MMP Expression ja knockdown

shRNA käytetyn sekvenssin knockdovvn MT1-MMP oli 5′-CACCGCAGCCTCTCACTACTCTTTCCGAAGAAAGAGTAGTGAGAGGCTGC-3 ’. DNA-fragmentti, joka koodaa sekvenssi subkloonattiin pENTR /U6 TOPO (Invitrogen) ja siirretään sitten rekombinaatiolla lentivirus vector pLenti6 BLOCK se (Invitrogen). Koodaavan konstruktion ihmisen MT1-MMP koodattu FLAG-epitooppia (DYKDDDDK) kuvattiin aiemmin [23]. CDNA-klooni, FLAG-leimatun MT1-MMP (MT1-FLAG) monistettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: 5’-CACCATGTCTCCCGCCCCAAGACC-3 ’ja 5′-TCAGACCTTGTCCAGCAGGG-3’. Monistettu MT1-FLAG-sekvenssi subkloonattiin pENTR /D-TOPO ja siirretään sitten rekombinaatiolla lentiviruksen pLenti6 /V5-DEST ekspressiovektoriin (Invitrogen). Nämä lentivirusvektoreita tuotettiin ja käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

MT1-MMP pudotus ja revertanttien Cell Line

MT1-FLAG on ilmaistu lentivirus-tartunnan HT1080-solut (revertanttien solut), jossa endogeenistä MT1-MMP poistettiin ensin ilmaisemalla shRNA suunnattu endogeenisen MT1-MMP (pudotus-solut). MT1-FLAG ilmentyi tasolle samanlainen kuin villityypin proteiini perustuu Western blot-analyysi.

Kokosolulysaatti valmistaminen

35 cm

2 soluviljelmämallissa ruokia sisältävien subkonfluenteista villityypin, MT1-MMP pudotus ja MT1-FLAG revertanttien HT1080-solujen, jota oli täydennetty 10 uM MMI270 pestiin PBS: llä ja lyysattiin keittämällä 200 ul: lla Laemmlin näytepuskuria [24], joka sisältää 5% β-merkaptoetanolia. 10 ui: n alikvootti lysaattia käytettiin Western blot-analyysi.

Kalvon Lysate valmistus

Kaikki menettelyt suoritettiin 4 ° C: ssa. Kuusitoista 150 cm

2 soluviljelmämallissa ruokia sisältävä subkonfluenteista viljelmiä villityypin tai MT1-FLAG revertanttien HT1080-solujen supplementated 10pM MMI270 median pestiin PBS: llä ja kaavittiin 32 ml sakkaroosia /Hepes-puskuria (0,25 M sakkaroosi /20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (proteaasi-inhibiittori cocktail joukko I, Calbiochem, San Diego, CA). Solut puskurissa olivat dounce-homogenoitiin (10 kertaa). Homogenaatti sentrifugoitiin 1000 x g: ssa 7 minuutin ajan. Pelletti homogenoitiin uudestaan ​​16 ml: aan sakkaroosi /Hepes-puskuria ja suspensio sentrifugoitiin 1000 x g: ssa 7 minuutin ajan. Supernatantit yhdistettiin ja niitä sentrifugoitiin nopeudella 2000 x g 30 minuuttia. Tämän sentrifugoinnin supernatantti otettiin ultrasentrifugoitiin 105000 x g 1 tunti. Pelletit suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan lyysipuskuria (1% Triton X-100/20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2), joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit, ja sitten sentrifugoitiin 20000 x g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kutsutaan kalvon lysaattia, jolloin proteiinipitoisuus on noin 10 mg /ml. Proteiinikonsentraatio lysaattia määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Labs, Hercules, CA), jossa BSA vertailustandardina.

Endogeeninen MT1-MMP Isolation

monoklonaalinen vasta-aine endogeenisen MT1-MMP eristäminen valmistettiin laboratoriossamme geneettinen immunisointi menetelmällä [25] käyttämällä täysimittaista ihmisen MT1-MMP-ekspressioplasmidin. Tämä vasta-aine tunnistaa alueen sisällä varsi verkkotunnuksen MT1-MMP (paperi valmisteilla). 70-ug: n näyte MT1-MMP spesifistä vasta-ainetta on sitoutunut kovalenttisesti 10 mg epoksifunktionalisoituihin magneettisia helmiä sen jälkeen, jos protokollan (Dynabeads M-270 epoksi, Invitrogen). Immunosaostukseen, 1 ml kalvon lysaatit valmistettiin villityypin HT1080-soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa 10 mg: lla anti-MT1-MMP-vasta-aine-konjugoituja helmiä. Inkuboinnin jälkeen hartsi kerättiin magneetin ja pestiin lyysipuskurilla. Sitoutunut MT1-MMP eluoitiin 0,1 M glysiini-HCl (pH 3,0), ja sitten se neutraloitiin 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Eluaatti konsentroitiin 20 ul (noin 7,5 ng proteiinia /ui) diasuodatuksel- käyttäen Amicon Ultra laite (cut-off: 10 kDa, Millipore, Billerica, MA).

FLAG-merkittyä MT1-MMP Isolation

eristäminen MT1-FLAG suoritettiin käyttäen anti-FLAG M2 magneettiset helmet (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 1 ml kalvon lysaatit valmistettiin MT1-FLAG revertanttien HT1080-soluja inkuboitiin 16 tunnin ajan 4 ° C: ssa 20 ui hartsia. MT1-FLAG eluoitiin 3 × FLAG-peptidi TBS, joka sisälsi 0,1% CHAPS. Eluaatti konsentroitiin 20 ui (noin 25 ng proteiinia /ui) edellä kuvatulla tavalla.

Liukoinen MT1-MMP valmistus

MT1-MMP transmembraaninen deleetiomutantti puhdistettiin esikäsitellystä väli- ja Madin-Darby koiran munuaissolut (MDCK) soluja, kuten aiemmin on kuvattu [26].

sialidaasi hoito

desialyloinnin, 500 ng analyytin käsiteltiin 5 mU sialidaasia /neuraminidaasin F (EY 3,2 .1.18. alkaen

Streptococcus

, Seikagaku Co., Tokio, Japani) 37 ° C: ssa 16 tunnin ajan 20 ul: aan TBS, joka sisälsi 0,1% CHAPS.

SDS-PAGE

näytteet Laemmlin näytepuskuria, joka sisälsi 5% β-merkaptoetanolia keitettiin 5 minuutin ajan ja sitten sentrifugoitiin 20000 x g: ssä 5 minuutin ajan 25 ° C: ssa. Supernatantit altistettiin epäjatkuva Tris-glysiini-SDS-PAGE käyttäen 4% -vertailugeeliä ja 10% -erotusgeeliä.

Western Blot

Elektroforeesin jälkeen materiaalit SDS-PAGE-geelien oli sähköllä PVDF-kalvoja (Millipore), ja kalvot estettiin 5% kuorittua maitoa PBS: ssä. Immunoreaktiivisia materiaaleja havaittiin värjäämällä mainituilla vasta-aineilla käyttäen kemiluminesenssi substraattia Western Salama (Perkin Elmer Inc., Waltman, MA). Seuraavia vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa: monoklonaalinen anti-MT1-MMP-vasta-ainetta (222-1D8, antelias lahja tri Kazushi Iwata, Daiichi Fine Chemical, Takaoka, Japani), polyklonaalinen anti-FLAG-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich ), monoklonaalinen anti-β-tubuliinia-vasta-ainetta (E7, Development Studies Hybridoma Bank, Iowan yliopisto, USA), piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-IgG-vasta-aineen ja anti-kani-lgG-vasta-aineella (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ).

Densitometria

voimakkuus Coomassie Blue-värjätty proteiini kvantitoitiin käyttäen ImageJ 1,43 ohjelmistoa (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

3AQ /CHCA Liquid Matrix

Väkevää 3AQ /CHCA valmistettiin liuottamalla 35 mg 3-aminokinoliinia (Fluka Analytical, Sigma-Aldrich) 150 ui kylläistä liuosta α-syano-4-hydroksikanelihappoa (LaserBio Labs, Sophia-Antipolis Cedex, Ranska) metanolissa. Väkevöity 3AQ /CHCA laimennettiin 10-kertaisesti käyttäen 100 mM ammoniumfosfaatti, ja suhteutettuna neste matriisi 3AQ /CHCA. Kylläistä CHCA liuos valmistettiin liuottamalla 10 mg CHCA 540 ui 50% asetonitriili /0,1% trifluorietikkahappo ja 60 ui 100 mM ammoniumfosfaatin.

DHB Matrix

DHB (2 , 5-dihydroksibentsoehappo) matriisi liuos valmistettiin liuottamalla 10 mg DHB (LaserBio Labs) 1 ml: ssa 50% asetonitriiliä /0,1% trifluorietikkahappoa. Sillä DHB matriisi analyysi, 0,5 ui: n erä tryptisten MT1-MMP digest, joka oli sekoitettu yhtä suureen tilavuuteen DHB matriisin liuosta täpläksi kohdelevyä ja sen annettiin kuivua.

Tryptic In-gel Digestion

-geeli pilkkominen suoritettiin menetelmän Shevchenko

et ai

[27]. A-alueen sisältävä geelin MT1-MMP-proteiinin värjättiin kolloidisella Coomassie Blue G-250 (SimpleBlue SafeStain, Invitrogen) leikattiin ja leikattiin pieniksi paloiksi. MT1-MMP geelipalat väri poistettiin 50 mM ammoniumbikarbonaattia 50% metanolia ja kuivattiin sitten vakuumissa sentrifugoimalla.