Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monet johdetut solulinjat kasvaimista sekä transformoitujen solulinjojen ovat paljon herkempiä V ATPaasi inhibiittorit kuin normaali kollegansa. Molekyylimekanismeja taustalla näitä eroja herkkyydessä ei tunneta. Käyttämällä globaali geenien ilmentyminen tietojen osoitamme että kaikkein herkimmät vastauksia HeLa-solut pieniä annoksia V–ATPaasiestäjiä liittyy geenien reagoivat vähentämällä solunsisäisten rautaa tai vähentämällä kolesterolin ja että herkkyys raudan ottoa on tärkeä tekijä V-ATPaasi herkkyys useat syöpäsolun linjat. Yksi herkkien solulinjojen, melanooma peräisin SK-Mel-5, yli-ilmentää rauta effluksitransportteri ferroportin ja on pienentynyt proteiinien ilmentymisen mukana raudan oton, mikä viittaa siihen, että se estää aktiivisesti sytoplasmisen rautaa. SK-Mel-5-solut ovat kasvaneet reaktiivisten hapen lajien ja voidaan pyrkii rajoittamaan uusia tuotanto ROS rauta.

Citation: Straud S, Zubovych I, De Brabander JK, Roth MG (2010) Inhibition Iron otto vastaa Differential Herkkyys V–ATPaasiestäjiä useissa Cancer Cell Lines. PLoS ONE 5 (7): e11629. doi: 10,1371 /journal.pone.0011629

Editor: Anthony Robert White, University of Melbourne, Australia

vastaanotettu: 31 joulukuu 2009; Hyväksytty: 19 Kesäkuu 2010; Julkaistu: 16 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 Straud et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia CA095471 ja CA09349 National Cancer Institute (NCI), 5P30 AR41940 National Institutes of Health (NIH) ja myöntää I-1422 alkaen Robert A. Welch Foundation. Tutkimus toteutettiin laitoksessa rakennettu tuella Research palvelut parannusohjelma Grants C06-RR15437 National Center for Research Resources (NCRR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

estäjät vakuolaarisen-tyyppi (H +) – ATPaasi (V-ATPaasi) on tutkittu mahdollisina terapeuttisina syöpään [1], [2], koska ne osoittavat vaikuttava ero sytotoksisuutta varten 60 solulinjoja NCI vertaa paneelia. Lisäksi, solulinjat, jotka on transformoitu onkogeenit ovat herkempiä V–ATPaasiestäjiä kuin ovat vanhempien, transformoimattoman solulinjat [3], [4]. Monet syövän solulinjat ylössäätävät ilmentyminen V-ATPaasi alayksiköiden verrattuna normaaleissa kudoksissa [1] ja V-ATPaasien uskotaan rooli etäpesäke [5], [6] ja chemoresistance [2], [7]. Kuitenkin perusmekanismeista että mitkä syöpäsolut ovat kaikkein herkimpiä V–ATPaasiestäjiä ei toistaiseksi tunneta. Tämä on tärkeää tietoa, kuten inhiboimalla V-ATPaasin itsessään voi estää synaptisen transmission [8]. Näin ollen proteiinit, jotka osallistuvat solun prosesseja, jotka ovat kaikkein differentiaalisesti herkkiä inhibition V-ATPaasin ehkä parempi terapeuttisia kohteita kuin V-ATPaasin itse.

V-ATPaasin on suuri, proteiinikompleksi, joka voi kuljettaa protoneja yli kalvot vastaan ​​pH-gradientti, ja näin ollen tuottavat happamassa ympäristössä löytyy endosyyttisiin soluelimiin, Golgin laitteessa ja Trans-Golgi Network [9]. Se koostuu suuri, sytosolin heksameeristen ATPaasi, V

1, joka on liittynyt useita yhteyksiä kiinteä kalvo monimutkainen, V

0. Hydrolyysi ATP alayksiköiden V

1 muunnetaan mekaaninen kierto V

0, joka liikkuu protonit sytosolin ja luumenin membraanin, jossa V

0 asuu. Aktiivisuus V-ATPaasi ohjaa useita mekanismeja niin, että kun puretaan, V

1 ei hydrolysoidu ATP ja V

0 ei pyöri ja liikenne protonien [9]. Useat estäjiä V-ATPaasi ovat tunnettuja, jotka ovat eri sitoutumiskohtia [10].

Sekä eritys- ja endosyyttisten reitit pH gradientit ovat kriittisiä monia toimintoja. Ontelon Endoplasmakalvosto on neutraali ja että Golgin monimutkainen on hapan, ja tämä ero on käytetään säätelemään sitoutuminen karannut ER chaperones happamassa Golgin jonka KDEL-reseptorin, joka kierrättää vapauttaa ne neutraalissa ER [11] . pH laskee poikki Golgin monimutkainen, jotta prohormone-kon- aktivoidaan hapan exit kasvot trans-Golgi verkon ja eritysrakkuloiden, mutta ei aiemmin koulutusjakson [12]. Samalla tavalla, monia lysosomaalisen proentsyymejä ovat inaktiivisia pH eritysreitille ja aktivoidaan saavuttamisen jälkeen lysosomiin, jossa pH on yleensä alle 5,0 [13]. Vuonna endosyyttisten reitin, tiettyjä ligandeja, kuten alhaisen tiheyden lipoproteiinien (LDL), sitoutuvat reseptoreihin neutraalissa pH: ssa solun pinnalla, ja ne vapautetaan, kun reseptorit saavuttaa happamien endosomien [14]. Tällä tavalla LDL tehokkaasti otettu solun ja toimittaa sen lasti kolesterolin lysosomeihin, kun taas reseptorin kierrättää solun pintaan sitoutuvan ligandin. Tehokas raudan imeytyminen soluihin edellyttää myös alhainen pH endosomeihin. Transferrin, kantajana solunulkoisen rautaa, on korkea affiniteetti raudan ja sen solun pinnan reseptoriin tyypillisissä solunulkoinen pH yli 7,0. Transferriinireseptori jatkuvasti hintoihin, ja kierrättää sen solukalvon kuljettaa transferriini happamien endosomien jossa se luovuttaa rautaa. Rauta-free apotransferriinille on korkea affiniteetti reseptorin matalassa pH: ssa ja alhainen affiniteetti neutraalissa pH: ssa. Siten apotransferriinille kierrättää sen reseptorin takaisin solukalvon, jossa se vapautuu ja saa takaisin suuri affiniteetti solunulkoisen raudan [15]. Alhainen pH käytetään myös määritettävä endosyyttistä organelles. Tietyt soluliman tarvittavia proteiineja säädellään kalvon liikenteen sitoutuvat soluliman puoleisella pinnalla endosomissa kalvojen vain kun sisäinen pH organellin on hapan [16]. Happamoitumista lysosomeihin tarvitaan myös prosessin autophagy [17]. Vaikka normaalisti ilmaistu pienillä tasoilla solukalvon paitsi joissakin happo erittävien solujen, V-ATPaasi on yli-ilmennetään solukalvon joidenkin syöpäsolujen ja voi olla rooli säätelevä sytosolin pH [5], [6], [18 ]. Mikä tahansa tai kaikki näistä olennaiset toiminnot saattavat olla alttiimpia eston V-ATPaasi erityisesti syöpäsolun taustat.

Tutkiakseen perustan erilaiseen herkkyyteen syöpäsolujen estäjiä V-ATPaasi, me ovat hyödyntäneet havainto, että solut reagoivat usein korostaa jopa säätelevä kriittisiä komponentteja polkuja, jotka ovat aisti on puutteellista, koska esimerkiksi vastata epäonnistuminen proteiinin taitto endoplasmakalvostossa [19]. Meidän hypoteesi on, että lievä inhibition V-ATPaasin paljastaa herkin biologisia toimintoja, jotka entsyymiä, joka on ilmaistu sen geenit, jotka ensin lisätä transkriptiota vasteena inhibition. Tämän hypoteesin testauksessa, olemme havainneet, että reitit raudan asetuksen ovat kaikkein herkimpiä estämällä osittain V-ATPaasin HeLa-soluissa ja että jotkin syöpäsolulinjat herkin V–ATPaasiestäjiä voidaan tehdä paljon vastustuskykyisiä lisäämällä eksogeeninen rauta viljelyalustaan. Tämä viittaa siihen, että osat rautaa aineenvaihduntaan tai kuljetus voi olla ehdokkaita terapeuttisina kohteina tietyissä syövissä, ja nämä syöpiä voidaan tunnistaa kautta niiden herkkyyttä V–ATPaasiestäjiä tai muuttuneen ilmentymisen rautaa liikenteen proteiinien.

Tulokset

Voit selvittää metaboliareitit aiheutettiin stressiä matalia annoksia V–ATPaasiestäjiä, ensin määritetään annos-vaste kahdelle eri estäjiä V-ATPaasi useilla solulinjoilla. Halusimme löytää pitoisuuteen kunkin estäjän jotka osoittavat vaikutusta kasvuun, mikä osoittaa, että solut vastaaminen ärsyke, mutta joka ei ollut niin myrkyllinen, että vastaus voidaan ehkäistä ja vaikeuttaa solujen kuolemassa kokeen aikana. Solulinjat testasimme oli IC50 on bafilomysiini A, joka vaihteli 10 nM yli 10 uM, ja me valitsimme kohtalaisen herkkä solulinja HeLa (IC 50 = 150 nM) kokeissa, koska suhteellisen matala annos-vaste tehty tasaisempi kasvun estäminen kokeita, mikä viittaa siihen, että geeni-ilmentymisen kokeet olisi myös toistettavissa. Päätimme myös vertailla kahta estäjiä V-ATPaasi jotka toimivat läpi erillisten mekanismien [20], bafilomysiini A (Baf) ja phenylsalicylihalamide (LX1077), hallita mahdollisia off-tavoite Kunkin yhdisteen vaikutukset. Pitoisuudet kutakin yhdistettä, joka inhiboi solun kasvua noin 25% 48 tunnin jälkeen (kuvio 1) valittiin geenin ilmentymisen kokeissa. HeLa-soluja viljeltiin yön yli, ja sitten näytteitä käsiteltiin 15 nM Baf 6, 12 tai 24 tuntia, tai 200 nM LX1077 12 ja 24 tuntia, ja RNA kerättiin ja prosessoitiin analyysiä microarray. Verrokkeina näytteitä HeLa-soluja käsiteltiin samalla aikavälillä 0,1% DMSO: ta (lopullinen pitoisuus laimentimesta Baf tai LX1077 kokeellisissa näytteissä), ajettiin rinnan kunkin koeolosuhteissa. Kukin koeolosuhteissa toistettiin erillisellä kokeella suoritetaan eri päivänä.

HeLa-soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi Bafa tai LX1077 pitoisuuksilla on esitetty 48 tuntia ja solujen määrä laskettiin. Tiedot on normalisoitu valvontaa käsiteltiin 0,1% DMSO. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta näytteestä ja virhepalkkeja ovat SEM.

Kaksi suurta väyliä käyttöönottoa ravinteita soluihin riippuu happamuus endosomeihin toimittama V-ATPaasi. Estämällä V-ATPaasi häiritsee toimituksen raudan soluun estämällä vapauttamaan raudan transferriini ja estää myös otto kolesterolin estämällä vapauttamaan LDL sen reseptori. Siksi käsitelty HeLa-soluista 6 tai 12 tuntia deferoksamiinilla (DFO) ja kelaatin raudan ja erikseen josta puuttui LDL matkivat estämällä imeytymistä eksogeenisen kolesterolin LDL-reseptorin. Kontrollit Hyväksytty näytteitä viljeltiin normaalissa viljelyalustassa. Nämä näytteet käsitellä mikrosiruja täsmälleen käsitellyt näytteet V–ATPaasiestäjiä. Tällä tavoin voitaisiin tunnistaa kaikki geenit vastata lisääntyneen transkription, kun rauta oli puutteellinen tai LDL sisäänotto tukossa. Aineisto käsittelemät UT Southwestern DNA Micro Array Core Facility käyttäen GCOS-ohjelmiston kanssa MAS5 normalisoinnin ja koenäytteiden verrattiin DMSO käsiteltyjen näytteiden tai vuodeksi DFO tai matala LDL olosuhteissa näytteet viljeltiin normaalissa keskipitkällä aikavälillä samalla laskea muutoksen suuruus.

Genes katsottiin osoittaa merkittävästi lisääntyneen ilmentymisen, jos molemmat näytteet kerralla vaiheessa joko Baf tai LX1077 oli muutos P-arvo on pienempi kuin 0,002 ja keskiarvo kahdesta näytteestä kasvoi yli 2-kertainen. Useimmissa tapauksissa, Baf indusoitu transkriptio yli LX1077, vaikka geenit vastaa Baf vastasi myös LX1077. Geenit, jotka lisääntynyt transkriptio pian on esitetty taulukoissa S1, S2 ja taulukossa 1. Taulukko S1 esittää 47 geenien lisääntynyt ekspressio, kun HeLa-soluja käsiteltiin V–ATPaasiestäjiä tai alhainen kolesteroli keskipitkällä ja ovat vastaus estämällä V-ATPaasin joka johtuu estää toimituksen eksogeenisen kolesterolia. Vaste useimmat näistä geeneistä on nopeampaa, kun läsnä on V–ATPaasiestäjiä kuin se on elatusaineessa, josta puuttuu LDL, ehkä siksi, josta puuttuu LDL ei estä toimituksen kolesterolin LDL-partikkeleiden, jotka ovat joko sitoutuneet niiden reseptoriin on solun pinnalla tai jo päästetään endosyyttistä reittiin hetkellä keskipitkällä puutteellinen LDL lisättiin. Suurin osa geeneistä on esitetty taulukossa S1 toiminto lipidi- biosynteesireiteissä ja 23 ovat tunnettuja tavoitteet SREBP1 tai 2 [21]. Lukuun ottamatta EGLN1 ja STARD4, yksikään geenejä, jotka lisäävät transkriptiota alussa vastauksena alhainen LDL vastata, että rautaa kelatoiva DFO. EGLN1 koodaa riippuvaisia ​​raudasta prolyylihydroksylaasi että tukahduttaa Hif-1α mukaista toimintaa happiolosuhteissa [22] ja ei tiedetä olevan herkkä aktiivisuuden kolesterolin biosynteesireitissä. Kuitenkin hiiva ja nisäkkäillä on cross-talk välillä kolesterolin biosynteesiä ja polkuja mukautumisen hypoksia [23], [24]. STARD4 koodaa soluliman kolesterolin siirtävän proteiinin, joka on SREBP tavoite [21] ja on myös voimistuvan ER stressi [25], ja sitä voidaan vain epäsuorasti voimistunut, että rautaa kelatoiva. Mielenkiintoista on, että lisääntynyt transkriptio INSIG1, joka koodaa negatiivinen säätelijä SREBP transkriptiotekijöiden, jotka ohjaavat kolesterolin biosynteesin, on yksi reagoimaan nopeammin V–ATPaasiestäjiä. Tämä on mahdollisesti negatiivinen palaute mekanismi rajoittaa transkription vastaus kerran lipidejä metaboliareittiä ovat lisääntynyt tuotanto endogeenisen kolesterolin [26].

Taulukko S2 luettelee 64 geenien lisääntynyt transkriptio nopeimmin, kun rauta kelatoitiin ja myös reagoida estämällä V-ATPaasi. Nämä ovat geenejä polkuja, jotka oletettavasti vastaa inhibition raudan vapautuminen transferriiniä endosomeihin, kun V-ATPaasin estyy. Ainakin 29 näistä geeneistä tunnetaan tavoitteita Hif-1α ja reagoida hypoksia. Kuten odottaa saattaa, nämä geenit toimivat monessa polkuja. Aldolaasisekvenssien C on Hif-1α tavoite [27] ja on vahvasti voimistuvan V–ATPaasiestäjiä. Vaikka emme havaitse varhainen kasvu aldolaasisekvenssien C käsitellyissä soluissa alhainen LDL välineellä Aldolaasientsyymit C on myös tunnettu kohde SREBPs [21]. Aldolaasisekvenssien C sitoutuu V-ATPaasi [28] ja hiiva on vastuussa glukoosin sääntelyä V-ATPaasiaktiivisuutta [29], [30]. Koska aldolaasisekvenssien C vastaa hypoksia keuhkojen epiteelisoluissa ja V–ATPaasiestäjiä HeLa-soluissa, kun taas runsaammin glykolyyttisen entsyymin aldolaasi A ei, on mahdollista, että merkittävä tehtävä aldolaasisekvenssien C vastauksena puute rautaa tai hypoksia on säännellä V-ATPaasi osana, jolla varmistetaan raudan homeostaasiin. HIF-1α on tukahdutettu ensisijaisesti olemalla Hydroksyloituneet on proliini by riippuvaisia ​​raudasta prolyhydroxylases, joka kohdistuu sen hajoamista [31]. Immunoblot huomasimme, että inkuboimalla Hela-solua 15 nM Baf 1 h stabiloitua Hif-1α (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että reitit säätelee Hif-1α ovat herkin inhibition V-ATPaasi. Siten V–ATPaasiestäjiä aikaan tehokkain tapa harjoittaa Hif-1α reittejä kokeellisesti.

Taulukko 1 esittää 7-geenien, että lisääntynyt transkriptio vasteena V–ATPaasiestäjiä, mutta ei HeLa-soluissa, joita käsiteltiin alhaisen LDL keski tai kanssa rautakelaattori. Nämä ovat ehdokkaita, jotka aistivat puute V-ATPaasiaktiivisuutta riippumatta vaikutusta transferriini tai LDL. Muut kuin CLCN6, nämä geenit eivät ole voimakkaasti säädelty ja useat niistä ovat mukana solusyklin ja kasvun säätelyssä ja se voi olla alku- kasvun inhibitio, joka tapahtuu sen jälkeen, kun pidempi inkubaatio-inhibiittorit. CLCN6 on kloridi kanava löytyy neuronien ja epiteelisoluissa [32], [33], ja paikantuu myöhään endosomeista [33]. Kloridikanavia endosomeihin työskennellä yhteistuumin V-ATPaasi ja siten CLCN6 säätelyä voi olla vastaus menetys myöhään endosomissa toiminto. SREBF2 (SREBP2) on tärkeä säätelijä kolesterolin biosynteesiä ja se on ensisijaisesti säännelty post-transkription kalvo liikenteen ja proteolyysin [34]. Vaatimaton transkription lisääntyminen todennäköisesti tasapainottavat kasvua ilmentymisen estäjä SREBP aktivointi, INSIG1.

Taulukossa 2 on esitetty tulokset ottaen vähemmän rajoittava analyysi geenien, jotka muuttavat HeLa-soluissa, joita käsiteltiin 15 nM BAF 6 tuntia. Kaikki geenit, jotka osoittivat tilastollisesti merkitsevä muutos (muutos P-arvo 0,00025) suunnasta riippumatta muutoksen analysoitiin Ingenuity Keinot mitkä kanoninen reittejä nerokkuus Database rikastuneet geenejä, jotka muutettiin vastauksena Baf. Polkuja, jotka vastasivat huomattavasti Baf sisälsi harvoja geenejä, jotka laskivat ilmaus, joka vahvistaa meidän oletetaan, että varhaisen reagoinnin kasvaisi geeniekspression. Ylivoimaisesti eniten vaikuttanut merkittävästi väyliä olivat steroidien biosynteesissä, jonka jälkeen Glykolyysivaiheen, ja mukana geenit suurimmaksi osaksi myös tunnistaa meidän tiukempien analyysi.

Kun harvemmin hoidon V–ATPaasiestäjiä, 52 geenit oli kasvanut vastauksena 12 tuntia kulttuurin alhainen LDL väliaineessa osoitti myös lisääntynyt ilmentyminen soluissa käsiteltiin 24 tuntia V–ATPaasiestäjiä (taulukko S3). Kahdeksan kolesterolin reagoiva geenit, jotka oli voimistunut aiemmin enää kasvoi ja 15 uutta kolesteroli reagoiva geenejä oli kohonnut transkriptio, jossa 6 näistä koodaavat proteiineja, jotka liittyvät lipidien biosynteesireiteissä. 104 ”rauta reagoi” geenejä (taulukko S4) lisättiin käsitellyissä soluissa V–ATPaasiestäjiä 24 tuntia, mukaan lukien useita geenejä, jotka koodaavat glykolyyttisiä entsyymejä tai repressoreina mitokondrioiden toimintaa, transkriptiotekijöiden ja proteiinien säätelemällä solujen kasvua. STXBP1, joka koodaa MUNC-18 säädin on membraanifuusioaktiivisuutta, osoitti lievää kasvua vasteena joko heikentäviä kolesteroli tai raudan ja vahvempi kasvu soluissa, joita käsiteltiin V–ATPaasiestäjiä. Tämä on yksi niistä harvoista geenejä, jotka koodaavat proteiineja, jotka säätelevät kalvo liikenne että lisääntynyt vasteena estämiseksi V-ATPaasin (HIP1R, SV2A ja OPTN olivat muut). Kuusikymmentä kaksi geeniä voimakkaammin ilmentävät vähintään kaksinkertaiseksi vastauksena estämällä V-ATPaasi 24 tuntia, mutta ei vastannut kolesterolin puutteellinen keskipitkällä tai DFO (taulukko S5). Tämä joukko geenejä analysoitiin käyttämällä Ingenuity Keinot ohjelmisto tunnistaa aineenvaihduntareitit joissa geenit merkittävästi voimistunut (kuva 2). Ylivoimaisesti merkittävin vastaus oli geenien lipidien ja steroidien biosynteesissä.

geenit Taulukossa S4 analysoitiin Ingenuity polut liittää ne kanoninen polkuja. Prosentuaalinen geenien koulutusjakson edustettuina tässä tietojoukon, ja muutoksen merkitys on esitetty.

Kuten odottaa saattaa, jos molemmat lisäykset ja vähennykset geeniekspression katsotaan, 24 tunnin kuluttua in Baf on monimutkainen vastaus liittyy useita polkuja, jotka ohjaavat kasvua ja vasteena stressille (taulukko S6). Merkittävin näistä on Nrf2-välitteinen oksidatiivisen stressin vastetta, mikä viittaa siihen, että estämällä V-ATPaasin lisää reaktiivisia hapen lajeja. Koska tärkeä osa mitokondrion hengitystä koulutusjakson edellyttävät rautaa, ja estämällä oksidatiivisen fosforylaation voi tuottaa ROS, muutokset Nrf2 välittämä polkuja voisi olla toissijainen eston seurauksena raudan tuonti transferriini.

alkuperäinen tarkoitus pyrkiessään näissä tutkimuksissa oli selvittää syitä ero vastaus V–ATPaasiestäjiä nähdään syöpäsoluja. Koska suuret välittömistä estämällä V-ATPaasin oli puute rautaa tai kolesterolin, tutkimme, jos ne olivat vastuussa yliherkkyyttä joidenkin syöpäsolujen V-ATPaasin estäjät (kuvio 3). Mittasimme annos-vaste kohdunkaulan syövän HeLa, melanooma solulinjoissa SK-Mel-5 ja SK-Mel-28, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä line H1299, rintasyöpä MCF-7 ja Morris hepatooma (MH) solut BAF läsnä ollessa tai poissa ollessa 150 uM rautaa sitraatti. BAF oli hyvin samankaltainen IC50 pitoisuudet HeLa, MCF7 ja H1299. Sekä MH ja SK-Mel-5-solut olivat 10 kertaa herkempi kuin HeLa, ja SK-Mel-28 olivat erittäin herkkiä (kuvio 3). Sillä Hela, SK-Mel-5 ja SK-Mel-28 testasimme myös lisäämisen vaikutusta kolesterolin toimitetaan soluihin, joissa metyyli-β-syklodekstriini, mikä lisää kolesterolin suoraan solukalvon [26]. Lisäämällä rautaa väliaineessa valmistettu HeLa-soluja 20-kertaisesti enemmän resistenttejä kasvun aiheuttama esto 20-200 nM bafilomysiini, mutta jos vain vähän suojaa sytotoksisia vaikutuksia ei havaittu suuremmilla pitoisuuksilla (kuva 3). Kolesteroli on suojaava HeLa-solut, mutta ei Baf-herkkä SK-Mel-5-soluja tai Baf resistenttejä SK-Mel-28 (kuvio 4). Tämä osoittaa, että sytostaattinen vaikutus V–ATPaasiestäjiä HeLa-soluissa, johtuvat suurelta osin inhibition raudan ja kolesterolin ottoa, mutta sytotoksiset vaikutukset johtuvat vaihtoehto, ja vielä tuntemattomia, funktio. Täydentämällä H1299, MCF7 tai herkempi SK-Mel-5 melanoomasolulinjaa rauta suojattu niitä alhaisemmilla Baf samanlainen HeLa-soluja (kuvio 3). Itse asiassa, MCF7 tai SK-Mel-5-solut käsiteltiin rauta- ja bafilomysiini oli annosvaste hämmästyttävän samankaltaisia ​​HeLa käsitelty bafilomysiini yksin, mikä viittaa siihen, että nämä solulinjat olivat erityisen herkkiä inhibitiolle raudan oton. Kumpikaan rautaa tai kolesterolia ollut suojaava vaikutus kestää erittäin hyvin solulinja SK-Mel-28 tai varsin herkkä MH solulinjassa.

annos-vaste kuuden syövän solulinjojen Baf läsnä tai poissa 150 uM rauta sitraatti määritettiin, kuten on kuvattu selityksessä kuvioon 1.

annos-vaste-käyrät HeLa, SK-MEL-5 ja SK-Mel-28-solujen Baf läsnä tai poissa eksogeenisen kolesterolia soluihin metyyli-β-syklodekstriini määritettiin, kuten on kuvattu selityksessä kuvioon 1.

tutkimiseksi sytotoksisuusmekanismin aiheuttama Baf SK-Mel-5 ja HeLa-soluissa käsittelimme soluja jokaisen rivin 0-1000 nM Baf 24 tuntia, ja sitten tutkittiin pilkkomalla PARP tai kaspaasi 3: merkkejä apoptoosin (kuvio 5). Molemmissa solulinjoissa Baf aiheuttaman apoptoosin 24 tunnin kuluttua; kuitenkin vaadittu pitoisuus oli yli 20 kertaa alhaisempi SK-Mel-5 kuin HeLa-solut, ovat hyvin samankaltaisia ​​kuin erot tappava annos kahden solulinjat. Siten sytotoksisuus johtuvat estämällä V-ATPaasin on yliherkkä solulinjassa SK-Mel-5 kautta apoptoosin induktion.

HeLa ja SK-Mel-5-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla Baf 24 tuntia ja sitten valmistettiin immunoblottaus vasta-aineita lohkaistaan ​​PARP tai lohkaistaan ​​kaspaasi-3 pilkotaan proteiinit näyttävät paljon alemmissa konsentraatioissa Baf SK-Mel-5-soluissa verrattuna HeLa, jossa pitoisuus ero ulkonäkö katkaistun proteiinin samanlainen erot tappavien annosten kahden solulinjat. Immunoblot Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Sekä SK-Mel-5-solut ja MCF7-solut olivat herkempiä Baf kuin HeLa-solut, ja tämä ero herkkyydessä poistettiin täydentämällä elatusainetta rauta (kuvio 3). Siten tutkimme proteiinien ilmentymisen mukana raudan oton, varastoinnin tai ulosvirtaus näissä solulinjoissa ja HeLa-solut (kuvio 6). SK-Mel-5-soluissa ilmaistuna pienempi transferriini-reseptori kuin kumpikaan kahdesta muusta solulinjat ja erittäin alhainen DMT1, kuljettimen vastaava liikkumasta rautaa poikki endosomissa kalvon sytoplasmaan. Huomattavan, SK-Mel-5-solut ilmensivät runsaita tasoja rauta effluksitransportteri, ferroportin, joka kuljettaa rautaa plasmamembraanin läpi ja ulos kennosta. Ferroportin ei havaittu kummassakaan kahdesta muusta solulinjat. SK-Mel-5-soluissa ilmaistuna vähemmän ferritiini kuin HeLa-solut, sopusoinnussa joilla alhainen sytoplasmisen rautaa. Yhdessä tämä kuvio ilmaisun ehdotti, että SK-Mel-5-soluja aktiivisesti ylläpitää suhteellisen alhainen sytoplasman rauta tasolla. Sen sijaan, MCF7-solut oli tasolla transferriinin reseptorin samanlainen HeLa-solut, lisääntyneen ekspression DMT1 ja erittäin alhainen rautaa varastointi proteiini, ferritiini. Tämä on malli ilmaisun sopusoinnussa solu, joka on alhainen soluliman rauta tasolla ja on voimistunut rautaa liikenteen mekanismeja vastauksena. Siten SK-Mel-5-solut ja MCF7-solut, vaikka molemmat yliherkkä Baf estämällä raudan oton, erosivat molekyylitason mekanismeista tämän heikkouden.

ilmentyminen transferriinireseptorigeenien 1, ferritiini ja ferroportin vuonna HeLa ja SK-Mel-5-solujen läsnä tai poissa DFO mitattiin immunoblottauksella. Suhteessa HeLa-solut, SK-Mel-5 on vähentynyt ilmentyminen transferriini-reseptori ja ferritiini ja suuri ilmentymisen lisääntyminen rauta ulosvirtaus proteiinin ferroportin. TfR, transferriini-reseptori. DMT1, kaksiarvoisia metalli kuljettaja 1. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritiini H raskaan ketjun. Immunoblot Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

ilmentymis- eroja transferriinin reseptorin ja ferroportin SK-Mel-5-solut eivät johdu kyvyttömyydestä säädellä näiden proteiinien vastauksena rautaa. Kun SK-Mel-5-solut tai HeLa-soluja käsiteltiin DFO kelatoida rautaa, sekä upregulated ilmentyminen transferriinireseptori (kuvio 7). Vastauksena DFO, transferriini-reseptori-ilmentymisen SK-Mel-5-soluissa oli hyvin samanlainen kuin HeLa, mikä osoittaa, että mekanismit, jotka ilmentävät reseptoria vasteena rauta olivat vahingoittumattomia SK-Mel-5-soluissa. DFO hoito vähensi ilmaus ferroportin ja ferritiinin SK-Mel-5-solut, kuten odottaisi solun pyrkien säilyttämään solun raudan tasoja. Siten mekanismit säätelevät näiden proteiinien rauta olivat vahingoittumattomia SK-Mel-5-soluissa. Kun SK-Mel-5-soluja käsiteltiin Baf, ne myös lisääntynyt ilmentyminen transferriini-reseptori ja laski ferritiini. Kuitenkin ferroportin ekspressio oli merkittävästi lisääntynyt. Koska kelatoivat rautaa laski ferroportin ilmentymistä SK-Mel-5-soluissa, tämä vastaus oli aiheutunut muusta estävä vaikutus V-ATPaasi.

Hoito HeLa tai SK-Mel-5-solujen 100gM DFO varten 24 tuntia lisännyt ilmentyminen transferriini-reseptori molemmissa solulinjoissa, ja lasku ferroportin ja ferritiinin SK-Mel-5-soluissa. BAF käsittely oli samanlainen vaikutus, sillä poikkeuksella, että ferroportin ilmentymistä SK-Mel-5-soluissa lisääntyi BAF. HeLa-solut eivät ilmaisseet ferroportin ja SK-Mel-5-soluissa oli hyvin alhainen ilmentyminen DMT1. TfR, transferriini-reseptori. DMT1, kaksiarvoisia metalli kuljettaja 1. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritiini H raskaan ketjun. Immunoblottauksia Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Mahdollinen syy solun aktiivisesti painaa sytoplasman rauta tasot olisivat suojaamaan sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) rauta. Tutkia, SK-Mel-5-soluja voidaan tuottaa enemmän ROS, me merkitty SK-Mel-5 ja HeLa-solujen kanssa, väriaineita, jotka lisäävät fluoresenssia läsnä ROS. Solut valokuvattiin identtisten kameran asetuksia ja fluoresenssivoimakkuuksien solujen mitattiin Image J ohjelmisto. SK-Mel-5-solut tuottivat merkittävästi enemmän ROS kuin HeLa-solut, mitattuna sekä väriaineet (kuvio 8).

. Soluja leimattiin H2O2 herkkä koetin DCF, tai superoksidi herkkä koetin DHE, menetelmissä kuvatulla tavalla. Solut valokuvattiin identtisillä kameran asetuksia. B. Fluoresoivat solut esitetty kuva J ja fluoresenssi yksittäisissä soluissa mitattiin ja piirrettiin GraphPad Prism.

Koska SK-Mel-5-soluissa näytti olevan alhainen solunsisäinen raudan ja olivat yliherkkiä ja Baf, mikä edelleen vähentää raudan oton, tutkimme herkkyys SK-Mel-5-solujen rautaa kelatoiva DFO (kuvio 9). Kuten odotettua, SK-Mel-5-soluja, jotka ovat yliherkkiä DFO verrattuna HeLa-soluissa. Itse asiassa, DFO oli vain sytostaattinen varten HeLa-solut, kun se oli sytotoksinen SK-Mel-5. Lisätään ulkoisten rautaa soluviljelyväliaine SK-Mel-5 tai HeLa-solujen ei ollut vaikutusta solujen kasvuun (tuloksia ei ole esitetty).

Soluja käsiteltiin pitoisuuksien DFO esitetty Menetelmät kuvatulla tavalla ja sen jälkeen 72 tunnin kuluttua solut laskettiin. Kaksi kuoppaa kutakin pitoisuutta laskettiin, ja keskimääräinen lukumäärä kaksi erillistä koetta piirrettiin +/- SEM, n = 2.

Kolme havainnot viittaavat siihen, että ferroportin ilmaisua voisi indusoida ROS SK- mel-5-soluissa. SK-Mel-5-soluissa oli sekä lisääntynyt ROS tuotanto ja lisääntynyt ferroportin ilme. Yksi tärkeimmistä reittien aiheuttama Baf hoitoon HeLa-solujen 24 tunnin ajan oli antioksidantin nivasteeseen Nrf2, viittaa siihen, että Baf hoito voisi lisätä ROS. BAF aiheuttama sijaan tukahdutettu ferroportin ilmentymistä SK-Mel-5-solut, kun taas alentamalla rautaa tasoilla DFO vähentynyt ferroportin ilme. Jos ferroportin indusoitiin ROS, käsittelemällä sitten SK-Mel-5-solujen antioksidantti N-asetyylikysteiini (NAC), voidaan olettaa vähenevän ferroportin ilmentymistä. Kun SK-Mel-5-soluja käsiteltiin 48 tuntia kasvavilla pitoisuuksilla NAC, ferroportin ilmentyminen väheni (kuvio 10). Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että SK-Mel-5-solut ovat alttiita eston raudan oton koska ne ylläpitävät vähän rautaa varaa, ehkä suojautumaan tuottaa myrkyllisiä määriä ROS.

SK-Mel-5-soluissa käsiteltiin NAC, kuten on kuvattu menetelmät ja käsiteltiin sitten immunoblottauksella vasta-aineita proteiineja esitetty. TfR, transferriini-reseptori. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritiini H raskaan ketjun. Immunoblot Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Keskustelu

Vaikka useita solulinjoja, jotka ovat peräisin kasvainten tai solulinjoja transformoitu onkogeenit ovat erittäin herkkiä V–ATPaasiestäjiä, ongelmia myrkyllisyys eläimillä, erityisesti neurotoksisuus, ovat estäneet kehittäminen näiden estäjien syöpälääkkeet. Ilmeinen ongelma on, että V-ATPaasin on tärkeä entsyymi, joka vastaa monista perustavaa laatua solun prosesseja ja estämällä sillä on monia vaikutuksia monissa solutyypeissä. Tämä puolestaan ​​viittaa siihen, että yliherkkyyttä syöpäsolujen V–ATPaasiestäjiä pitäisi johtua haavoittuvuutta yhden tai useamman monet prosessit vaativat V-ATPaasi ja että tunnistaminen nämä heikkoudet voivat paljastaa hoitotavoitteet, joita voidaan hyödyntää vähemmillä myrkyllisiä vaikutuksia normaaleihin kudoksiin. Tuloksemme osoittavat, että esto raudan oton V–ATPaasiestäjiä on tärkeä tekijä erilaiseen herkkyyteen syöpäsolun riviä nämä inhibiittorit, mikä viittaa siihen, että mekanismeja, jotka ohjaavat solunsisäisiä rauta tasot voivat olla käyttökelpoisia terapeuttisia kohteita tietyt kasvaimet.