Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) /syöpää aloittamista solujen (CIC) on määritelty pieni väestö syöpäsolujen, joilla on suurta kasvainten muodostumiseen. Lisäksi CSCS /CIC kestävät useita syövän hoitomuotoja, ja CSCS /CIC vuoksi ajatellaan olevan vastuussa syövän uusiutumisen hoidon jälkeen ja etäinen etäpesäke. Vuonna epiteelin munasarjasyöpä (EOC) tapauksissa uusiutunut kemoterapian jälkeen havaitaan usein, mikä viittaa munasarjan CSCS /CIC ovat mukana. On olemassa neljä suurta histologisia alatyyppejä EOC, ja serous adenokarsinooma ja selkeä adenokarsinooman ovat korkealaatuisia syöpäsairauksia. Siksi analysoidaan munasarjojen CSCS /CIC alkaen munasarjasyöpäsolulinjoihin (serous adenokarsinooma ja selkeä solu adenokarsinooma) ja ensisijainen munasarjasyöpäsoluja tässä tutkimuksessa. Me eristetty munasarjojen CSCS /CIC kuin aldehydidehydrogenaasille 1 korkea (ALDH1

korkea) väestön lisääntyminen 6 EOC solulinjoista (3 serous adenokarsinomia ja 3 kirkas solu adenokarsinoomat) jonka ALDEFLUOR määrityksessä. ALDH1

korkea solut osoittivat suurempaa palloja muodostavan kyky, korkeampi tuumorigeenisyyteen ja enemmän invasiivisia ominaisuus, joka osoittaa, että munasarjojen CSCS /CIC rikastuvat ALDH1

korkea soluja. ALDH1

korkea soluja voitaisiin eristää 8 11 ensisijaisen munasarjasyöpäpotilailla näytteitä. Immunohistokemiallinen värjäys paljasti, että korkeammat ALDH1 ekspressiotasot munasarjasyöpä tapauksissa liittyy huonompi ennuste molemmissa serous adenokarsinooma tapauksissa ja selkeä adenokarsinooman tapauksissa. Yhdessä tulokset osoittavat, että ALDH1 on merkkiaine munasarjojen CSCS /CIC: t, ja että ilmentymistaso ALDH1 saattaa olla uusi biomarkkeri ennustamiseen huonoon ennusteeseen.

Citation: Kuroda T, Hirohashi Y, Torigoe T , Yasuda K, Takahashi A, Asanuma H, et al. (2013) ALDH1-High munasarjasyöpä Stem kaltaisia ​​soluja voidaan eristää seroosit ja Clear Cell adenokarsinoomasolua, ja ALDH1 korkea ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen. PLoS ONE 8 (6): e65158. doi: 10,1371 /journal.pone.0065158

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 08 helmikuu 2013; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2013; Julkaistu: 06 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Kuroda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-tuki Scientific Research opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (lupanumeroita 16209013, 17016061 ja 15659097) Harjoittelun Application Research Japan Science and Technology Agency, ja Cancer tutkimus (15-17 ja 19-14) alkaen terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan, Onon Cancer Research Fund (NS) ja Takeda Science Foundation (YH). Tätä työtä tukee osittain National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (23-A-44). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on pahanlaatuinen sairaus, korkea kuolleisuus ja se on neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvien naisten yleisin kuolinsyy maailmassa. [1], [2] Obscure ja epäselviä oireita tehdä havaitseminen munasarjasyövän alkuvaiheessa vaikea. [3] Yleensä munasarjasyöpä on suhteellisen herkkä ensilinjan kemoterapia perustuu platina /taksaania. [4] Kliininen täydellinen vaste (CR) voidaan usein saavuttaa sytoreduktiivisen leikkauksen ja kemoterapian kehittynyt munasarjasyöpä potilaille; kuitenkin suurin osa potilaista, joilla on edennyt vaiheeseen on uusiutunut, joka on syynä korkeaan kuolleisuuteen tästä taudista. [5] Jotkin terapeuttiset ehdokkaita molekyylikohteena lääkkeiden munasarjasyöpä oli testattu, mutta merkittäviä parannuksia ennusteeseen ei saavutettu. [2], [6].

Viimeaikainen kehitys syövän tutkimus on paljastanut, että syövät koostuvat heterogeenisen solupopulaation, ja että vain pieni populaatio soluja kutsutaan syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSCS) /syöpä -initiating soluja (CIC) on korkea kasvaimeen aloittamista potentiaali (syöpä kantasolujen hypoteesi). CSCS /CIC määritellään pieni populaatio soluja, jotka ovat (1) korkea tuumorigeenisyyteen, (2) useiden erilaistumista kyky ja (3) itseuudistumisen ominaisuus. [7] – [9] tulokset tuoreessa tutkimuksessa ovat myös osoittaneet, että CSCS /CIC liittyvät syövän uusiutumiseen ja Säteilynsietotestin tai kemoterapiaa. [10], [11] Siksi CSCS /CIC uskotaan olevan vastuussa syövän uusiutumiseen ja etäinen etäpesäke, ja poistaminen CSCS /CIC on siis välttämätön kuivatuksen syöpä.

On olemassa useita lähestymistapoja tunnistamiseksi CSCS /CIC syövistä erilaisissa elinkudokset. [12] Näitä lähestymistapoja ovat (1) käyttö solunpintamarkkeria kuten CD44

+ CD24

– /lowESA

+ [13], CD133

+ [14], CD44

+ CD117

+ [15], ja CD166

+ [16], (2) puoli väestöstä (SP) määritys [17], jossa solupopulaatio, jolla on kyky pumpata ulos huume (Hoechst33342 [18 ] tai Dye Cycle Violet [19]) kautta ATP-sitova kasetti kuljettaja katsotaan CSCS /CIC, ja (3) ALDEFLUOR määritys perustuu tasoon aldehydidehydrogenaasille 1 (ALDH1) entsyymin aktiivisuus. [20].

toiminta solunsisäisen ALDH on katalysoivat aldehydiä, ja ALDH vuoksi on tärkeä rooli solujen homeostaasin. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä normaali ja syöpäsolujen, joilla on korkea ALDH1 toiminnan on potentiaalia toimia kantasoluja ja mahdollisuudet itseuudistumiseen valmiudet ja stressi kestävä ominaisuuksia. [20] – [22].

Myös epiteelin munasarjasyöpä (EOC), jotkut tutkijat ovat ehdottaneet hyödyllisyyttä ALDH1 toiminnan tunnistamiseksi CSCS /CIC. Olemassaolo solujen korkea ALDH aktiivisuus (ALDH1high soluja, verrattuna ALDH1low soluja) on myös esitetty EOC solulinjoissa ja kliinisistä näytteistä. [23] – [25] välinen korrelaatio ALDH1 aktiivisuutta ja ennusteen potilailla, on kuitenkin edelleen kiistanalainen EOC. [26] Samaan aikaan merkitystä ALDH1 ilmaisun kunkin histologisen alatyypin EOC ei ole selvitetty vielä.

Tässä tutkimuksessa tunnistimme ja arvioitiin stemness on ALDH1

korkea solujen serous adenokarsinooma ja selkeä adenokarsinooman munasarja-, paitsi vakiintuneista solulinjoista mutta myös primääri munasarjojen syöpäsolujen. Olemme myös analysoitiin tilastollisesti yhdistyksen välillä ALDH1 ilmaisun ja kliininen lopputulos munasarjasyöpä potilaille.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Hiiriä seurattiin ja kokeita mukaisesti suuntaviivat ja hyväksynnän jälkeen komitean Sapporo Medical University School of Medicine, Animal koe keskus alle luvan numero 08-006. Jos jonkin eläimen huomataan epäterveellistä tai sairaita oli heti eutanasia. Kaikki tutkimukset hyväksyi Institutional Review Boards (IRB) Sapporo Medical University Hospital ja IRB Hakodate Goryokaku Sairaala. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ohjeiden mukaan ja Helsingin julistuksen.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Tässä tutkimuksessa 3 munasarjan serous adenokarsinooma solulinjoja (Amoc-2, HUOA ja OVCAR-3) ja 3 munasarjojen selvä adenokarsinooman solulinjoja (ES-2, RMG-1 ja TOV21G) käytettiin. Amoc-2 (ystävällisesti Dr. Yabushita laitos Naistenklinikka, Aichi- Medical University, Aichi, Japani) [27], HUOA (ystävällisesti Dr. Ishiwata, synnytysten ja naistentautien sairaala, Ibaraki, Japani) [28 ], OVCAR-3 ja TOV-21G (ATCC, Manassas, VA, USA) viljeltiin RPMI1640-elatusalustassa (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). ES-2-soluja (ATCC) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Sigma-Aldrich). RMG-1-soluja (JCRB Cell Bank, Osaka, Japani) viljeltiin DMEM /F-12 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Kukin väliaine täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Soluja inkuboitiin kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

eristäminen Ensisijainen Syöpäsolut kliinisistä näytteistä

Kaikki tutkimukset hyväksyttiin Institutional Review Boards (IRB) Sapporo Medical University Hospital ja IRB Hakodate Goryokaku sairaala. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ohjeiden mukaan ja Helsingin julistuksen.

Kiinteä kasvaimet leikattiin palasiksi, pestä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja sentrifugoitiin 2000 rpm 10 minuuttia. Sitten solu aggregaatit inkuboitiin 37 ° C: ssa noin 30 min 2 mg LiberaseÖ ™ tutkimuksen laatu (Roche, Basel, Sveitsi) 10 ml: ssa Iscoven muokattu Dulbeccon Medium (IMDM, Life Technologies), kunnes erottaa yksittäisiksi soluiksi. Solut on saatu näitä menettelyjä analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu alla.

ALDEFLUOR Pitoisuus ja eristäminen fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) B

Käytimme ALDEFLUOR iinianalyysikitissä (Stem Cell Technologies ™, Vancouver, BC, Kanada) sen määrittämiseksi, ALDH1 aktiivisuuden solujen mukaan valmistajan protokollaa. Solut suspendoitiin ALDEFLUOR määrityspuskuriin, joka sisälsi 1 umol /l per 1×10

6 soluja ALDH substraatin, boori-dipyrromethene-aminoasetaldehydi (BAAA), ja inkuboitiin 50 min 37 ° C: ssa. Jokainen näyte käsiteltiin 50 mmol /l olevan ALDH-spesifinen estäjä, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), negatiivisena kontrollina. Stained solut analysoitiin BD FACSAria ™ II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Solut värjättiin 1 ug /ml propidiumjodidia arvioida niiden elinkelpoisuutta ennen analyysiä.

eristämiseksi epiteelisolujen kiinteiden munasarjasyöpä yksilöitä, me järjestetty epiteelisyöpäsolujen käyttäen anti-CD326 (Ep-CAM) APC-ainetta (BD Biosciences). Käytimme anti-CD326 mikrohelmien (BD Biosciences) ja Automacs järjestelmä (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) rikastuttaa epiteelisolut maligni askites munasarjasyövän tapauksista ennen ALDEFLUOR määritystä.

Cell Cycle Analysis ja

in vitro

Cell Grow Analysis

ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen solut suoraan kiinnitettiin 70% etanolilla lajittelun jälkeen. Sitten ne suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 250 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma-Aldrich) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Värjätyt solut analysoitiin FACSCalibur (BD Biosciences), ja tiedot analysoitiin käyttäen Mod-Fit solukierron analyysiin ohjelma.

in vitro

solukasvumäärityksessä, ALDH1

korkea-soluja ja ALDH1

alhainen eristetyt solut AMOC-2 ja RMG-1-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Kun oli inkuboitu 48 ja 96 tuntia, solut poistettiin trypsiinillä ja elinkelpoisten solujen määrä määritettiin käyttäen Countess® (Life Technologies).

Sphere muodostavan määritys /yhden Cell Sphere muodostava määritys

ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen solut eristettiin FACS ja sitten viljeltiin 6-hyvin ultra-low kiinnityspinta astiat (Corning, Tewksbury, MA, USA) 1000 solua kuoppaa kohti. Sillä yksisoluisia palloja muodostavan määritys, sekä ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen lajiteltiin 96-ultra-low kiinnitys astiat (Corning) on ​​yhden solun kuoppaa kohti. Soluja viljeltiin in kantasoluja väliaineessa, seerumittomassa DMEM /F12 (Life Technologies), johon on N-2 täydentää (Life Technologies), 20 mg /ml ihmisen rekombinantti epiteelisolujen kasvutekijää (Life Technologies), 10 mg /ml ihmisen emäksinen fibroblastikasvutekijä (Sigma-Aldrich), 4 ug /ml hepariinia (Sigma-Aldrich), 4 mg /ml naudan seerumin albumiinia (Life Technologies), 20 g /ml ihmisen insuliinia, sinkki-liuos (Life technologies), ja 2,9 mg /ml glukoosia (Sigma-Aldrich). [29] Morfologiset havaittu muutosta päivittäin valomikroskoopilla 14 päivän ajan.

In vivo

tuumorigeenisyystesti

Lajittele ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen solujen suspendoitiin uudelleen 1,0 x 10

2, 1,0 x 10

3 ja 1,0 x 10

4 solua 100 ul: ssa PBS: ää ja Matrigel (BD Biosciences) seosta (1: 1). Sitten kutakin seosta ihonalaisesti oikeaan /vasemmalla keskellä takana alueilla 6-viikkoisen naaras-ei-lihavilla diabeetikko /severe combined immuuni-puutos (NOD /SCID) hiiriä (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japani) inhalaatioanestesian isofluraanilla. Kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen havaittiin viikoittain, kunnes hiiret tapettiin 7 viikkoa injektion jälkeen. Ulkoiset kasvaimen tilavuus laskettiin 0,5 × Dmax x (Dmin)

2 [mm

3] (Dmax: pitkä akseli, Dmin: lyhyt akseli massa).

immunohistokemiallisella värjäyksellä munasarjasyöpäpotilaista Tissue

immunohistokemiallinen värjäys ALDH1 ja Ki-67 suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet 123 munasarjan epiteelin syövän kudosten (62 vakavien adenokarsinoomat, 37 selkeä solujen adenokarsinoomat, 18 endomet- adenokarsinoomien ja 6 mucinous adenokarsinoomat), kuten on kuvattu aikaisemmin. [30] [31] Antigeeni haku on tehty keittämällä osiot 120 ° C: ssa 5 minuutin ajan mikroaaltouunissa esilämmitetään 0,01 mol /l natriumsitraattia (pH 6,0). Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia etanolissa 10 minuutin ajan. Kun oli salvattu 1% rasvatonta kuivamaitoa PBS-liuoksessa (pH 7,4), leikkeet saatettiin reagoimaan hiiren anti-ALDH1 monoklonaalinen vasta-aine (1: 250, Sigma-Aldrich), tai hiiren anti-Ki-67 monoklonaalista vasta-ainetta (1: 100 , DAKO, Glostrup, Tanska) 1 tunnin jälkeen inkuboitiin biotinyloidun anti-hiiri-IgG (Nichirei) 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen leikkeet värjättiin setreptavidin-biotiini-kompleksia (Nichirei Biosciences, Tokio, Japani), jonka jälkeen inkuboitiin 3,3′-diaminobentsidiiniä käytetään kromogeenin ja vasta-värjäys hematoksyliinillä. Sytoplasmisen värjäys katsottiin positiiviseksi ALDH1, ja ytimet värjäys katsottiin positiivisiksi Ki-67. Arviointiin ALDH1 värjäystä, tapaukset jaettiin kahteen ryhmään (ALDH1

korkean ryhmän ja ALDH1

pieni ryhmä) mukaan mediaanit (mediaanit serous adenokarsinooma mediaanin ja selkeä adenokarsinooman ollessa 20% ja 15%, tässä järjestyksessä) .

matrigeelin invaasiomääritys

invasiivisia kyky solujen arvioitiin käyttäen matrigeelin invaasiota kammiot (BD Biosciences). Isolated ALDH1

korkea ja ALDH1

pieni soluja (1,0 x 10

4) maljattiin kuhunkin ylempään kammioon seerumittomassa DMEM. Ulkokammioiden täytettiin DMEM sisältäen 10% FBS kuin kemoattraktantti. Soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan, ja invasiivisia solut värjättiin hematoksyliinillä, asennettu dioja, ja laskettiin 400-kertainen ylempi kenttä valomikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi, data istuva ja grafiikka tehtiin SPSS ohjelmistopakettia ver.19 (SPSS, Chicago, IL, USA). Data näytetään keskimääräisenä ±

SD

vähintään 3 itsenäisestä kokeesta, ja Studentin t-testiä käytettiin arvioimaan tilastollisesti merkitseviä eroja (p 0,05). Kokonaiselinaika (OS), määritellään aikaväli alkaen ensimmäisestä diagnoosi kuolinpäivä peräisin taudin etenemistä, ja ilman taudin etenemistä (PFS), määritellään aikaväli alkaen ensimmäisestä diagnoosi päivämäärä taudin etenemistä, arvioitiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin käyttäen log-rank-testi. Associations of ALDH1 ilmaisutapoja kliiniseen vaiheeseen, imusolmukemetastaaseja ja levittämistä analysoitiin Fisherin testiä.

Tulokset

eristäminen ALDH1

korkea Solut EOC Cell Lines

useita menetelmiä eristää CSCS /CIC on jo kuvattu [12], ja aldehydidehydrogenaasin 1 suuren kannan (ALDH1

korkea) tunnistetaan ALDEFLUOR määritys kuvattiin olevan rikastettu CSCS /CIC. [20] Tästä syystä analysoitiin munasarjasyöpäsolulinjoihin jonka ALDEFLUOR määrityksen eristää munasarjojen CSCS /CIC. Tutkimme 3 ihmisen munasarjan serous adenokarsinooma solulinjoja (Amoc-2, HUOA ja OVCAR-3) ja 3 ihmisen selkeä adenokarsinooman solulinjoja (ES-2, RMG-1 ja TOV-21G) (kuvio 1). ALDH1

korkea väestön tunnistettiin kaikissa munasarjakarsinooma- linja soluja, ja suhde ALDH1

korkea solut vaihtelivat 0,7%: ES-2-solut 7,9% varten TOV-21G soluissa. Voisimme eristää ALDH1

korkea solujen vakaasti 4 solulinjoista (Amoc-2, ES-2, RMG-1 ja TOV-21G), ja siksi käytetään näissä solulinjoissa tarkempaa analysointia.

ALDH1

korkea-soluja havaittiin 3 serous adenokarsinooma solulinjoja (Amoc-2, HUOA ja OVCAR-3) ja 3 selkeä adenokarsinooman solulinjoja (ES-2, RMG-1 ja TOV-21G). SSC-A: yksijuosteinen konformaatioanalyysi. BAAA: boori-dipyrromethene- aminoasetalde-. FITC-A: fluoreseiini analyysi. Prosentit laatikot osoittavat ALDH1

korkea solusuhteilla. Diethylaminobenzaldehyde (DEAB), joka on ALDH-spesifinen estäjä, käytettiin negatiivisena kontrollina.

karakterisointi ALDH1

korkea Solut

Koska CSCS /CIC: t tiedetään muodostavan palloja kelluvissa viljelyolosuhteet [29], analysoimme ALDH1

korkea soluissa palloja muodostavan määrityksessä. Yhteensä 10

3 solua kuoppaa kohti lajiteltiin ja inkuboitiin osaksi 6-kuoppalevyllä käynneistä-riippumaton ympäristössä. Päivänä 10, ALDH1

korkean peräisin olevia soluja Amoc-2-solut osoittivat suurempaa palloja muodostavan kyky kuin ALDH1

alhainen soluja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin ES-2-solut, RMG-1-soluja ja TOV-21G-solut (kuvio 2A). Koska palloja muodostavan määritys ei sovellu kvantifiointiin suhteiden CSCS /CIC in ALDH1

korkea-soluja, teimme yhden solun palloja muodostavan määrityksessä. Sphere muodostuminen havaittiin 4,86%: n kuoppiin ALDH1

korkea-soluja, jotka ovat peräisin AMOC-2 soluissa ja 3,13%: n kuoppiin ALDH1

korkea-soluja, jotka ovat peräisin ES-2-soluja (kuvio 2B). Toisaalta, kaivot ALDH1

alhainen peräisin olevia soluja sekä Amoc-2 ja ES-2-soluissa ei havaittu alalla muodostumista.

Sphere muodostava määritys Tuhat ALDH1

korkea solujen ja ALDH1

alhainen soluja viljeltiin kelluvassa tilassa. Pallot laskettiin päivänä 10. Suurennus Kuvien: × 100. Kriteerinä sferoidi koko: yli 100 pm. Jokainen arvo on keskimääräinen lukumäärä pallosia ± SD. * P-arvot. B Single solu palloja muodostavan määritys Lajittele ALDH1

korkea solujen ja ALDH1

alhainen soluja viljeltiin kelluva kunnossa yhden solun kuoppaa kohti. Pallot laskettiin päivänä 12. Vain ALDH1

korkea soluja Amoc-s ja ES-2-solut aloittanut yhden solun pallosia. Suurennus kuvia: × 200. Kukin arvo on keskiarvo prosentteina pallosia ± SD. C Matrigel invaasiomääritys Kuvat: matrigeelin-tunkeutuvat soluihin peräisin ALDH1

korkea /matala solujen ES-2 ja TOV-21G soluissa. Suurennus kuvia: × 100. Kukin arvo on keskimääräinen lukumäärä hyökkäävän solujen ± SD. * P-arvot.

Sitten tutkittiin hyökkäyksen kykyä ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen solujen Matrigel invaasiomääritys. ALDH1

korkea solut johdetaan kaikista neljästä linjan solut osoittivat suurempaa matrigeeliä hyökkäävän kyky kuin teki ALDH1

pieni soluja (kuvio 2C).

solusyklin tilan ALDH1

korkea soluja ja että ALDH1

alhainen solut analysoitiin. Suhteet ALDH1

korkea solujen S-vaiheessa ja G2 /M vaiheessa olivat suurempia kuin suhde ALDH1

alhainen solujen S-vaiheessa ja G2 /M vaiheessa (kuvio 3A). Cell kasvaa analyysi paljasti, että ALDH1

korkea-soluja, jotka ovat peräisin AMOC-2 ja RMG-1-soluissa oli korkeammat kasvaa hinnat kuin ALDH1

alhainen soluja (kuvio 3B).

Solusyklianalyysiä ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen solut analysoitiin solusyklin määrityksessä. Käyrä osoittaa suhde solujen G0 /G1 vaiheessa S-vaiheessa ja G2 /M vaiheessa. B-solujen kasvua analyysi kasvu valmiuksia ALDH1

korkea solujen ja ALDH1

alhainen soluja tutkittiin. Kukin arvo on solujen keskimääräinen lukumäärä ± SD.

Korkeampi aiheuttavan kasvaimia ALDH1

korkea Solut kuin ALDH1

alhainen Solut

Vastatakseen

in vivo

aiheuttavan kasvaimia ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen soluja EOC solulinjoista, ksenografti- siirrettäväksi NOD /SCID hiirillä ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen peräisin olevia soluja Amoc-2 ja RMG-1-soluissa suoritettiin (kuvio 4A, 4B ja 4C). Kuten on esitetty taulukossa 1, kasvainten havaittiin 5 5-hiirten (10

4 solut injektio), 4 5 hiiren (10

3-solujen injektio) ja 2 5-hiirten (10

2-solujen injektio ), jossa ksenotransplantaatiota ALDH1

korkean peräisin olevia soluja Amoc-2-soluissa suoritettiin. Toisaalta, kasvaimia havaittiin vain 3 5 hiirtä (10

4 solut injektio) ja 2 5 hiiren (10

3-solujen injektio), jossa ksenotransplantaatiota ALDH1

alhainen soluja suoritettiin. Lisäksi kasvuvauhti kasvainten johdettu Amoc-2 ALDH1

korkea soluja oli selvästi nopeampaa kuin kasvaimista peräisin Amoc-2 ALDH1

pieni soluja (kuvio 4C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin RMG-1-soluissa (kuvio 4B ja 4C).

ALDH1

korkea /matala kasvaimia, jotka ovat peräisin AMOC-2-soluissa. B ALDH1

suuri /pieni kasvaimia peräisin RMG-1-soluissa. Kuva: NOD /SCID hiiriin, jotka oli injektoitu 1,0 x 10

3 ALDH1

korkea /matala soluissa ja kasvaimia havaittiin molemmin puolin niiden takaisin. Histologinen kuvat: värjäys hematoksyliini-eosiinilla (H-E, vasen paneeli), ALDH1 immunohistokemiallisella värjäyksellä (keskimmäinen paneeli), Ki-67 immunohistokemiallisella värjäyksellä (oikea paneeli) on ALDH1

korkea /matala kasvaimia. Suurennus kuvia: x 400. C kasvukäyrät ALDH1

suuri /pieni kasvaimia peräisin Amoc-2 ja RMG-1-soluissa. Vasen sarake: Amoc-2-solut, 1,0 x 10

3 injektiona. Keskimmäinen sarake: Amoc-2-solut, 1,0 x 10

2 injektio. Oikea sarake: RMG-1-soluissa, 1,0 x 10

3 injektiona. Jokainen arvo on keskimääräinen kasvaimen tilavuus ± SD. * P-arvot. D immunoreaktiivisuus on ALDH1 tai Ki-67 ALDH1

suuri /pieni kasvaimia peräisin Amoc-2 ja RMG-1cells Kukin arvo on keskimääräinen positiivinen prosentuaalinen ± SD. * P-arvot.

histologinen näkökohtia kasvaimia peräisin ALDH1

korkea solujen ja ALDH1

pieni soluja, jotka eristettiin Amoc-2 ja RMG-1-solut tutkittiin ( Kuvio 4A ja 4B). Kasvaimet johdettu Amoc-2 ALDH1

korkea solujen ja Amoc-2 ALDH1

alhainen soluista osoitti huonosti eriytetty adenokarsinooma ja ei ollut merkittävää eroa. Samoin kasvaimet johdettu RMG-1 ALDH1

korkea solujen ja RMG-1 ALDH1

alhainen soluista osoitti huonosti eriytetty selkeä solu adenokarsinooma. Immunohistokemiallinen värjäys paljasti, että ei ollut merkitsevää eroa ALDH1 positiivisten määrä välillä kasvainten johdettu Amoc-2 ALDH1

korkea solujen ja kasvaimia, jotka ovat peräisin Amoc-2 ALDH1

alhainen soluja, kun taas kasvain peräisin RMG-1 ALDH1

korkea solut osoittivat merkitsevästi paremmat ALDH1 positiivisia hintoja kuin kasvain peräisin RMG-1 ALDH1

pieni soluja (kuvio 4D). Lisäksi kasvaimet johdettu Amoc-2 ALDH1

korkea solujen ja RMG-1 ALDH1

korkea solut osoittivat merkitsevästi korkeampi positiivinen hinnat Ki-67 (MIB-1) kuin kasvaimista peräisin Amoc-2 ALDH1

alhainen solujen ja RMG-1 ALDH1

pieni soluja (kuvio 4D).

tunnistaminen ALDH1

korkea solut Ensisijainen EOC näytteitä

havaitsemiseksi ALDH1

korkea solujen primaarisissa munasarjasyöpä, analysoitiin yksitoista kliinisen aineista käyttämällä ALDEFLUOR määritystä (5 tapauksessa kiinteiden munasarjasyöpäsoluja ja 6 tapauksissa pahanlaatuisten askites munasarjasyövän tapauksessa esitetty taulukossa 2). CD326-positiiviset epiteelisolujen tunnistettiin kiinteässä munasarjasyövän kudoksiin, ja positiivinen vaihtelivat 8,1%: sta 81,0% (kuvio 5A, ylemmät paneelit). ALDH1

korkea-soluja havaittiin 4 5 tapauksissa ja positiiviset ALDH1

korkea solu hinnat vaihtelivat 0,9%: sta 12,0% (kuvio 5A, alempi paneeli). Lisäksi ALDH1

korkea-soluja havaittiin CD326-positiivisten solujen peräisin munasarjasyövän askiitteina 4 6 tapauksissa ja positiiviset hinnat ALDH1

korkea solut vaihtelivat 1,7%: sta 4,2% (kuvio 5B). Siksi ALDH1 aktiivisuus määritetään käyttämällä ALDEFLUOR määritystä voisi olla hyödyllinen lähestymistapa eristämiseen CSCS /CIC primääri munasarjojen syöpäsolujen.

analyysi ensisijainen kiinteiden munasarjasyöpäsoluja Ylähavas osoittaa CD326 värjäystä. Prosenttiosuus ind positiivinen korko CD326 soluja. Alempi paneeli esittää ALDEFLUOR määrityksessä CD326-positiivisia soluja. Vasen: Potilas No.1, kyseessä vaiheen le selkeitä adenokarsinooman. Oikea: Potilas No.3, kyseessä vaiheessa Ic endomet- adenokarsinooma. B Analyysi ensisijainen syöpäsolujen Vesivatsanesteestä CD326-positiivinen valinta tehtiin ennen ALDEFLUOR analyysiä. Vasen: Potilas No.4, kyseessä on vaiheen III c vakavasta adenokarsinooma. Oikea: Potilas No.6, kyseessä vaiheen IIIb selkeitä solun ja endomet- adenokarsinooma. CD326: epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM). APC: allofykosyaniini alue. Prosenttia arvosanat ruutu osoittaa CD326-positiivisia tai ALDH1-aktiivisuuden suhde.

Association of korkean ilmentymistason ALDH1 on huonon ennusteen

yhteensä 123 epiteelin munasarjasyöpä kudokset immunohistokemiallisesti värjättiin anti-ALDH1-vasta-ainetta (taulukko 3, kuvio 6A). Mediaanit ALDH1-positiivisten hintojamme serous adenokarsinooma tapauksissa ja selkeä adenokarsinooman tapaukset olivat 20% ja 15%, vastaavasti. Siksi jaettu tapauksia kahteen ryhmään, ALDH1

korkean ryhmän ja ALDH1

pieni ryhmä, mukaan medians. Kuten on esitetty taulukossa 3, ei ollut merkitsevää korrelaatiota ilmentymisen tason ALDH1 iän tai kunkin FIGO kliinisessä vaiheessa. Korkea ilmentymistaso ALDH1 ei osoittanut mitään merkittävää korrelaatiota on pitkälle edennyt (vaihe III + IV), T tekijä tai imusolmuke etäpesäke molemmissa serous adenokarsinooma tapauksissa ja selkeä adenokarsinooman tapauksissa. Log-rank-testi paljasti, että korkeampi ilmentymistaso ALDH1 liittyy huonompi ennuste, joilla on merkittävä ero OS sairastavien potilaiden vakavien adenokarsinooma (P = 0,006) ja OS potilailla, joilla on selkeät adenokarsinooman (P = 0,047) kuin pienempi ilmentymistaso ALDH1 (kuvio 6B). Korkeampi ilmentymistaso ALDH1 osoitti taipumusta lyhyempi PFS kuin alemman ilmentymistason ALDH1, mutta erot eivät olleet merkittäviä (serous adenokarsinooma: P = 0,062; selvä adenokarsinooman: P = 0,058).

HE värjäystä ja ALDH1 immunohistokemiallisella värjäyksellä primääri munasarjojen vakavien adenokarsinooma (vasemmalla) ja primääri munasarjojen selvä adenokarsinooman (oikealla) ylempi vasen paneeli: HE värjäystä of ALDH1

korkea yksilö. Oikea yläpaneeli: ALDH1 immunohistokemiallisella värjäyksellä ALDH1

korkea yksilö. Alempi vasen paneeli: H-E värjäys ALDH1

pieni näyte. Oikea alapaneeli: ALDH1 immunohistokemiallisella värjäyksellä ALDH1

pieni näyte. Suurennus kuvia: × 400. B Log-rank testi ALDH1

korkea /matala ryhmien munasarjojen vakavien adenokarsinooma ja selkeä adenokarsinooman potilaille. Vakavien adenokarsinooma: 62 tapausta /selvä adenokarsinooman: 37 tapauksessa. Tapaukset ALDH1

korkean ryhmä tapauksia positiivista suhdetta ALDH1 yli 20%: serous adenokarsinooma tapauksissa ja 15% selkeää adenokarsinooman tapauksissa. Vasen: pylväs: ilman taudin etenemistä (PFS). Oikea sarake: kokonaiselossaoloaika (OS). * P-arvot.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme eristetty munasarjojen CSCS /CIC korkealla tuumorigeenisyystesti jonka ALDEFLURO määrityksessä. ALDH1

korkea määrä voi eristää paitsi munasarjasyövän solulinjoissa, vaan myös ensisijainen munasarjasyöpä näytteitä. Useita menetelmiä eristämiseksi CSCS /CIC: t, on raportoitu. Todellakin, munasarjojen CSCS /CIC onnistuneesti eristää eri menetelmillä kuten ALDEFLUOR määritys [25], puoli väestöstä (SP) analyysi [32], [33], ja käyttö CD133

+ [34], CD44

+ CD24

– [35] ja CD24

+ soluja. [36] On kuitenkin kiistanalainen raportti osoittaa, että CSC /CIC merkki ei toimi joidenkin solujen. [37], [38] Näin ollen, on tärkeää vahvistaa eristetty solupopulaatio CSC /CIC markkereiden useita erilaisia ​​analyysi. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että ALDH1

korkea väestöstä oli korkeampi tuumorigeenisyyteen ja enemmän palloja muodostavan kyky. Nämä havainnot osoittavat, että ALDH1

korkea soluja käytimme tässä tutkimuksessa on rikastunut CSCS /CIC. On ollut muutamia raportteja onnistunut eristäminen CSCS /CIC välillä pysyisi ylhäisesti sivussa munasarjasyöpäsoluja. Me eristetty ALDH1

korkea soluja 8 11 ensisijaisen munasarjasyöpä tapauksissa. Emme voineet analysoida ALDH1

korkea solujen ensisijainen munasarjasyöpiä takia rajoittamisesta solujen määrä; kuitenkin, meidän lähestymistapamme on mahdollinen ja lupaava menetelmä eristämiseksi CSCS /CIC primääri munasarjojen syöpiä.

Major histologisia alatyyppejä EOC ovat vakavien adenokarsinooma, kirkas solu adenokarsinooma, endomet- adenokarsinooma ja mucinous adenokarsinooma, ja nämä alatyypit ovat tiedossa olla eri ominaisuuksia riskitekijä karsinogeneesin molekyylibiologisia näkökohdat ja niin edelleen. Lisätietoa yksittäisistä alatyyppien parantamiseksi tarvitaan potilaiden selviytymiseen. Serous adenokarsinooma on histologia alatyypin kanssa huonoin prognoosi; kuitenkin, serous adenokarsinooma tapaukset ovat usein diagnosoidaan pitkälle. Tyhjennä solu adenokarsinooma kasvaa asteittain jopa lähes 12%: EOC Aasian maissa, ja vertailu tapauksista samassa vaiheessa 3 histologisia alatyyppejä (kirkas solu adenokarsinooma, endomet- adenokarsinooma ja mucinous adenokarsinooma) paljasti, että selkeä solu adenokarsinooma on köyhin ennuste jokaisessa vaiheessa. Siksi selkeä adenokarsinooman ajatellaan olevan korkein arvosana EOC, äskettäin. [39], [40] seroosit adenokarsinooman tapausta lähinnä analysoitiin aiemmissa tutkimuksissa, ja on ollut vähän tutkimuksia, joissa kirkas adenokarsinooman tapauksia analysoitiin. [23] – [25] Tässä tutkimuksessa kartoitettiin paitsi serous adenokarsinooma tapauksissa, mutta myös selkeä adenokarsinooman tapauksissa. Siksi nämä tiedot tuovat käsityksen paitsi vakavasta adenokarsinoomat, mutta myös useimmat ylin luokka selkeä solu adenokarsinoomia.

Huomasimme, että 4 EOC solulinjojen 3 selkeä adenokarsinooman linjat olivat positiivisia pallo muodostus 1000 solua /hyvin. Toisaalta, vain kaksi solulinjaa (Amoc-2 ja ES-2) osoitti pallo muodostumista yksittäisen solun alalla analyysi. Nämä tulokset osoittavat, että CSCS /CIC: t, joilla on kyky muodostaa pallon vain yhdestä solusta, on rikastettu ALDH1

high-solut; mutta suhteet CSCS /CIC eivät ole niin suuri edes ALDH1

korkea populaatiot. Tämä tulos osoitti, että ALDEFLUOR määritys on vain surrogaattimarkkerina CSCS /CIC ja että yhdistelmä ALDEFLUOR määrityksen muiden merkkiaineiden voisi olla parempi lähestymistapa eristää CSCS /CIC.

Aiemmissa tutkimuksissa immunohistokemiallisella värjäyksellä, ristiriitaisia ​​tuloksia koskevat yhdistys ALDH1 ilmaisun kanssa ennustetta EOC saatiin. Chang

et al

. kertoi, että ALDH1 ilmaisu korreloi suotuisa ennustetta vakavien tai ei-vakavien munasarjasyöpäpotilailla [26], kun taas Deng

et al

. ja Wang

et al

.