Krooninen sairaus

tiivistelmä

TRAIL on lupaava terapeuttinen aine ihmisen syöpäsairauksia. TRAIL vaatii usein mitokondrioiden toimintahäiriöitä, kutsutaan tyypin II kuolema reseptorin reitin, edistää sytotoksisuuteen. Kuitenkin lukuisat pahanlaatuisia soluja ovat TRAILin resistenttejä estämällä tämän mitokondrioiden kautta. Käyttäen kolangiokarsinooma solujen mallina TRAILin vastarintaa, huomasimme, että siili signalointi saarto herkistyneet nämä syöpäsolut TRAIL sytotoksisuuden riippumaton mitokondriohäiriöitä, kutsutaan tyypin I kuolema reseptorin signalointi. Tämä kytkin TRAIL vaatimus tyypin II tyyppi I kuolema reseptorin signalointi osoitettiin puute toiminnallinen riippuvuus Bid /Bim ja Bax /Bak, proapoptoottiset komponentteja mitokondrioiden kautta. Hedgehog signalointi moduloitua ilmentyminen X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin (XIAP), jonka tehtävänä on tukahduttaa tyypin I kuolema reseptorin kautta. siRNA kohdennettua knockdovvn

XIAP

jäljittelee herkistymiseen mitokondrioiden-riippumattomia TRAIL tappaminen saavuttaa Hedgehog esto. Sääntely XIAP ilmentymisen Hedgehog signalointi välittyy gliooma liittyvän onkogeenin 2 (GLI2), alavirran transkriptiotekijäksi Hedgehog. Yhteenvetona nämä tiedot antaa lisää mekanismeja moduloimiseksi solukuoleman TRAIL ja ehdottaa Hedgehog esto terapeuttisena lähestymistapa TRAIL-resistenttejä kasvaimet.

Citation: Kurita S, Mott JL, Cazanave SC, Fingas CD, Guicciardi ME, Bronk SF, et ai. (2011) Siili esto Edistää Siirtyminen tyypin II tyyppi I solukuolemaa reseptorisignalointi syöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (3): e18330. doi: 10,1371 /journal.pone.0018330

Editor: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 tammikuu 2011; Hyväksytty: 25 helmikuu 2011; Julkaistu: 31 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Kurita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health R01 Avustukset DK59427 (GJG), Division of Oncology Research, Mayo Clinic Cancer Center, Mayo Clinic Haiman SPORE P50 CA102701, ja Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology NIDDK P30 DK084567 (MEF-Z) ja Mayo Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL), joka on voimakas ja syöttämällä ligandi, joka edullisesti indusoi apoptoosia transformoiduissa soluissa, aloittaa signa- ligoimalla kaksi syöttämällä reseptoreihin DR4 (TNFRSF10A, jota kutsutaan myös nimellä TRAIL-reseptori 1) ja DR5 (TNFRSF10B, jota kutsutaan myös nimellä TRAIL-reseptori 2 /Killer /TRICK-2) [1]. TRAIL aiheuttama klusterointi ja oligomerointi DR4 ja DR5 aiheuttaa konformaatiomuutoksia kuoleman verkkotunnuksia sytoplasmisen hännät, helpottaa rekrytointia ja kaspaasien aktivaatio 8 ja 10 sisällä kuoleman indusoimalla signalointikompleksiin (DISC) [2], [3], [ ,,,0],4]. Jos aktivointi näistä initiaattorin caspases on riittävän vahva, ne suoraan aktivoida kaspaasi 3, mikä puolestaan ​​johtaa solujen kuolema mukaan ns tyypin I kuolema reseptorin reitin apoptoosin [5], [6]. Kuitenkin, jos suuruus kaspaasin 8 ja 10 aktivointi ei ole riittävä aktivoimaan suoraan kaspaasi 3, TRAIL voi silti aiheuttaa apoptoosia pilkkomalla proapoptoottiset BH3 vain proteiini Bid tuottaa katkaistun Bid (tBID). tBid proteiini laukaisee mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi edistämällä oligomeroimalla pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinien Bak ja /tai Bax tämän kalvon läpi. Mitokondrioiden ulkokalvon läpäiseväksi tuloksia ulosmenon proapoptootti- proteiinien mitokondrion intermembrane tilaan (ts sytokromi c, Smac /DIABLO, HtrA2, AIF, ja endonukleaasi G), joka huipentuu mitokondrioiden koulutusjakson apoptoosin [7], [8 ]; riippuvuus mitokondrioiden solukuoleman kutsutaan tyypiksi II kuolema reseptorireitin apoptoosin [6]. Tyypin I kuolema reseptorin signalointi näyttää säännellä tasolla kaspaasi-3 aktivaation, kun taas tyypin II kuoleman reseptori signalointi säätelee tasolla mitokondrioita jäsenten antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinin perhe [7], [8], [ ,,,0],9], [10]. TRAIL yleensä viestittää läpi Type II, mitokondriot-riippuvaisen reitin [11], reittiä joka on usein estyy syövissä johtaen TRAIL vastus [12], [13].

Tässä osoitamme, että esto onkogeeniset Hedgehog-reitin tukahduttaa ilmentymistä XIAP ja herkistää syöpäsolut TRAIL sytotoksisuus, käyttäen kolangiokarsinooma solujen mallina tutkia TRAIL vastus. Nämä syöpäsolut runsaasti ilmaista antiapoptoottisten Bcl-2-perheen proteiineihin, erityisesti Mcl-1, joka välittää TRAIL vastus [14], [15]. MCL-1 inhibition mitokondrioiden reitin solukuoleman on erityisen tärkeää kolangiokarsinooma soluihin kuin ne paradoksaalisesti ilmaista TRAIL

in vivo

, ja todennäköisesti on jatkuvasti kiertää TRAIL sytotoksinen signalointi hengissä [16]. Koska kyse on kehittyvistä data syytetään onkogeeninen Hedgehog signalointi ruoansulatuskanavan tuumoribiologiassa [17], [18], selvitimme Hedgehog signalointi mekanismi edistää TRAIL vastarintaa syöpäsoluja. Olemme aiemmin raportoitu, että Hedgehog polku on konstitutiivisesti aktiivinen näissä soluissa ja että sen estäminen herkistää kolangiokarsinooma solujen TRAIL sytotoksisuuden osuvat ylössäätöä TRAIL reseptori DR4 [19]. Se oli kuitenkin epäselvää, kuinka ylös-säätely DR4 yksinään voi voittaa Mcl-1 saarto mitokondrioiden reitin apoptoosin. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että alas-säätely XIAP Hedgehog esto muuntaa tyypin II TRAIL signaloinnin tyypin I reittiin. Näin ollen tietomme määritellä mekanismi, jonka avulla Hedgehog signalointi moduloi TRAIL-indusoitua solukuolemaa syöpäsoluissa ja ehdottaa inhibitio tämän kaskadin mahdollisina terapeuttisina lähestymistapa TRAIL-resistenttien kasvainten ..

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Mayo Clinic IRB komitean tarkistettu ja hyväksytty ihmisten tutkimuksissa protokolla nimeltä ”Genome ilmentymisen analyysi ihmisen kolangiokarsinooma (CCC).” komitea päätti, että tämä muodostaa vähäinen riski tutkimusta. Tiedot analysoitiin anonyymisti.

Cell Culture

Ihmisen kolangiokarsinooma solulinjat, KMCH, HuCCT-1, ja Mz-Cha-1, viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100000 yksikköä /L penisilliiniä, 100 mg /l streptomysiiniä ja 100 mg /l gentamisiiniä kuten aiemmin on kuvattu [20], [21].

Quantitative Käänteiskopiointia polymeraasiketjureaktio (RT- PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja cDNA valmistettiin käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia, kuten on aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti [22]. CDNA-tuote monistettiin PCR: llä Taq-DNA-polymeraasilla käyttämällä standardimenetelmiä. PCR-alukkeet on esitetty taulukossa 1. Alukkeet 18S ribosomaalista RNA: ta (rRNA) ostettiin Ambion Inc (Austin, TX). Reaaliaikainen PCR suoritettiin Roche LightCycler käyttäen SYBR vihreä, kuten fluorofori, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Kopioluku kohde-mRNA kussakin näytteessä normalisoitiin suhteessa käyttäen kopioluvun 18S rRNA nimittäjään.

immunoblot-analyysi

Koko-solulysaateista saatiin aikaisemmin kuvannut meille yksityiskohtaisesti [21]. Proteiini näytteet erotettiin SDS-PAGE-geeleillä, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja blotattiin, jossa on esitetty ensisijaisen vasta-aineet laimennoksella 1: 500-1: 1000. Peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Biosource International, Camarillo, CA), inkuboitiin laimennoksella 1: 3000 ja 1: 5000. Sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- reagensseja (Amersham, Arlington Heights, IL) ja Kodak X-OMAT kalvon (Eastman Kodak, Rochester, NY). Ensisijainen antiseerumit ne nostettiin aktiini, Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, ja Smoothenedin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: C11, B19, S18, S19, ja H-300, vastaavasti), Bid ja CIAP-1 (R

Bax,

5′-AAG ACG AAC TGG ACA GTA ACA CCT GTC TC-3 ’(osittainen T7-promoottorisekvenssi on lihavoitu). Kontrollina solut transfektoitiin salattu RNA duplex seuraava sekvenssi: 5’-AAC GTG ATT TAT GTC ACC AGA-3 ’. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä transfektoitiin lyhytaikaisesti 30 nM siRNA käyttäen 5 ul /ml SIPORT

TM NeoFX

TM (Ambion Inc.). Kohdeproteiinin ilmentyminen arvioitiin immunoblot-analyysillä transfektion jälkeen siRNA.

Short hiusneula-RNA (shRNA) ja Bid oli Sigma Aldrich [MISSION lyhyt hiusneula-RNA lentiviruksen plasmidi, kohdistaminen Nukleotidit 376-396, Genebankin liittymistä # NM_001196 ]. Tuottaa Bim kohdennettuja shRNA konstruktissa pSSH1 plasmidi, joka sisältää ihmisen H1 promoottorin ilmentymisen shRNA käytettiin. Kaksijuosteinen DNA-templaatti (5′-GAT CCC CGC AAT AGG CTT TAG GAA AAT TCA AGA GAT TTT CCT AAA GCC TAT TGC TTT TTG GAA A-3 ’) insertoitiin pSSH1 plasmidiin jälkeen H1 RNA promoottori. DNA-insertin sisältävät sense- ja antisense-sekvenssit (lihavoitu) varten Bim mRNA: ta ja 9 nukleotidin linkkeri-sekvenssin, jolloin saatiin transkription shRNA kohdistaminen Bim. Stabiilia transfektiota, KMCH solut transfektoitiin käyttäen OPTI-MEM I (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 5 ui /ml Lipofectamine 2000 -reagenssia (Invitrogen), ja 3 ug /ml plasmidi-DNA: ta. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen lisättiin tuoretta elatusainetta, joka sisälsi 2 ug /ml puromysiiniä lisättiin shRNA plasmidin kohdistamista Bid tai 1,2 g /l neomysiiniä lisättiin shRNA plasmidin kohdistaminen Bim. Elossa kloonit erotettiin käyttämällä kloonauksen renkaita ja yksilöllisesti viljeltiin. Lentivirusvektorikonstruktit sisältävät hiukkaset shRNA SMO rakennettiin käyttäen BLOCK-IT indusoituva H1 Lentivirusvektorikonstruktit RNAi System (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Jaksot (työnnetään pLenti4 /BLOCK-IT-DEST) kuvattiin ovat aikaisemmin kuvanneet meille [19]. Stabiilia transfektiota, tuoretta alustaa, joka sisälsi 10 ug /ml Blasticidine-S: n ja 500 ug /ml tseosiinia (Invitrogen), lisättiin soluihin 48 tunnin transfektion jälkeen. Elossa kloonit erotettiin käyttämällä kloonauksen renkaita ja yksilöllisesti viljeltiin. Indusoitiin 1 mg /ml tetrasykliiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Vielä 48 tunnin kuluttua solut käytettiin kokeita varten. Target tukahduttaminen arvioitiin immunoblot-analyysillä.

elektroforeettinen liikkuvuus shift (EMSA) B

Nuclear solu-uutteet valmistettiin käyttämällä NE-PER ydin- ja sytoplasman uuttoreagenssit (Pierce, Rockford, IL) mukaan valmistajan ohjeita. EMSA, 20 ug tumaproteiinien inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 minuuttia sitomispuskuriin (25 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM EDTA, 6% glyserolia, 0,1% Triton X-100, 0,1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia fluoridi, 0,4 mM ditiotreitoli, 0,5 ug /ul poly (dl-dC), 0,5 ug /ui lohen sperma) 0,04 pmol Cy5.5-leimattua kaksijuosteista DNA-oligonukleotidi (syntetisoitiin Mayo Clinic Advanced Genomics Technology Core, Rochester MN), joka sisälsi villityypin oletetun GLI sitovat sekvenssit promoottorialueella ihmisen

XIAP

geenin. Proteiini-DNA-kompleksit erotettiin sitoutumattomasta DNA-koettimen elektroforeesilla 5% natiivi polyakryyliamidigeeleillä, jotka sisältävät 0,5 x Tris boraatti-EDTA. Fluoresenssi visualisoitiin suoraan geelillä käyttäen Odyssey loisteputki Imager (Licor Biosciences, Lincoln, NE). Kilpailun määrityksiä, 200-kertaisen molaarisen ylimäärän leimaamatonta kaksijuosteista oligonukleotidia lisättiin reaktioseokseen 20 min ennen lisäämistä fluoresoiva koetin.

Kromatiini immunosaostus

ChIP suoritettiin alkaen KMCH solut, joita käsiteltiin 250 nM rekombinantti-Sonic Hedgehog 5 tuntia käyttäen solun kokonais-DNA leikattiin ja ~500 bp fragmentit, käyttäen ExactaCHIP kromatiinin immunosaos- kit (R Rev: 5 ’CATCTCTCCATGCTCTGAACTC.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. Erot ryhmien verrattiin käyttämällä ANOVA Bonferroni jälkikäteen korjaaminen.

Materiaalit

Reagenssit ostettiin seuraavilta toimittajilta: DAPI oli Sigma; rekombinantti ihmisen TRAIL ja yhdistelmä Sonic Hedgehog oli R anti-ihmisen Fas-vasta (CH-11) oli peräisin MBL International (Nagoya, Japani); syklopamiinia oli LC Laboratories (Woburn, MA).

Tulokset

tasoittaa esto down-regulation CIAP-1 ja XIAP ilmaisun

Koska keskeinen mekanistinen rooli estäjä apoptoosin proteiinit (IAP: t) kuolemaan reseptorin signalointi [23] ja rooli Hedgehog solujen selviytymisen, ensin selville jos estämällä smoothened (SMO), signalointi komponentti Hedgehog reseptorikompleksin, moduloi ilmaus IAP: t. Hoito syklopamiinia, vakiintunut farmakologinen estäjä SMO [24], [25], väheni cellular IAP-1 (CIAP-1) ja X-sidottu IAP (XIAP) proteiini tasoilla, mutta ei vaikuttanut CIAP-2-proteiinin ilmaisu. Alas-säätely XIAP oli nopeampi, ilmenevät 4 tuntia, kun taas tappio CIAP-1-proteiinia esiintyi vasta 24 tunnin kuluttua (Fig. 1A). Farmakologinen vaikutus syklopamiinin validoitiin käyttäen shRNA suunnattu pudotus SMO, signalointikaavio osa Hedgehog-reseptorin, joka myös laski sekä CIAP-1 ja XIAP solun tasolla, mutta ei CIAP-2 (Fig. 1 B). Sen määrittämiseksi, SMO esto vaikuttaa mRNA-tasoja tai toimi yksinomaan transkription jälkeen,

CIAP-1

,

CIAP-2

, ja

XIAP

mRNA ilmentyminen määritettiin jälkeen syklopamiinihoidon tai shRNA SMO. Molemmat

XIAP

ja

CIAP-1

mRNA-tasot laskivat SMO esto (Fig. 1 C). Kliinistä merkitystä IAP asetuksen arvioitiin kasvaimen ja viereisten hyvänlaatuinen näytteitä potilaista, joilla kolangiokarsinooma. Kahden-kertainen

XIAP

mRNA-tasot havaittiin kasvainkudoksessa (Fig. 1 D). Tasot

CIAP-1

ja

-2

eivät olleet merkittävästi erilaiset. Tämä

CIAP-1

ei kohonnut Tuumorinäytteissä huolimatta sääntelyn Hedgehog (Fig. 1 C) voivat ilmoittaa as-vielä-tuntemattomia tekijöitä myös osaltaan valvontaa IAP ilmaisun kasvain. Nämä tiedot viittaavat Hedgehog signalointireitille säätelee

CIAP-1

ja

XIAP

ilmaus, mutta vain

XIAP

tasot ovat koholla kliinisissä näytteissä. Siksi olemme pitkälti keskittyneet

XIAP

jäljellä tutkimustemme.

A

Cell lysaatit KMCH soluista käsiteltiin syklopamiinilla (5 uM) varten osoitetut ajat immunoblotattiin for CIAP-1, CIAP-2 ja XIAP. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

B,

KMCH solut transfektoitiin tetrasykliini-indusoituva shRNA ekspressiovektoriin kohdistaminen smoothened (shSMO) tai salattu shRNA vektori; shRNA ilmentyminen indusoitiin 48 tuntia käsittelemällä tetrasykliiniä (1 mg /ml), jota seurasi immunoblottaus varten CIAP-1, CIAP-2 ja XIAP käyttäen kokosolulysaateista.

C

, Soluja käsiteltiin ajoneuvo, syklopamiini (5 uM) 24 tunnin ajan, tai transfektoitu shSMO kuin paneelissa

B,

analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR

CIAP-1

,

CIAP-2

ja

XIAP

käyttäen kokonais-RNA.

D

, kokonais-RNA kudosnäytteistä joko kolangiokarsinooma (CCA) tai sen viereen hyvänlaatuisia käytettiin arvioimaan

XIAP, CIAP-1, ja CIAP-2

mRNA: n ekspression, normalisoitu 18S ja ilmaistaan ​​kertainen muutos hyvänlaatuinen. Keskiarvo ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 verrattuna ajoneuvoon.

GLI2 sitoutuu

XIAP

promoottori ja säätelee sen ilme

Voit selvittää

XIAP

on transkriptionaalisesti säätelee Hedgehog-reagoiva GLI transkriptiotekijöiden, etsimme 5 Kb 5′-reunustava alue ihmisen

XIAP

geenin 5′-

GACCACCCAXXXXG

-3 ’GLI konsensus sitova motiivi. Kaksi lupaavien GLI-sitoutumiskohtia (Fig. 2A) tunnistettiin ylävirtaan

XIAP

transkription aloituskohdasta (NM_001167) kohdissa -2820 /-2807 (Site I) ja -1594 /-1581 (Site II ). Kukin oli kaksi epäsuhta verrattuna konsensussekvenssi [26]; Site I on identtinen validoitu 9 nukleotidin Bcl-2 GLI-sitoutumiskohta, BS1 [27], kun taas sivusto II on identtinen vahvisti DR4 GLI-sitoutumiskohtaan [19]. Suoritimme elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä kokeiluja. Sitoutuminen molemmat otaksuttu GLI sitovat sekvenssit havaittiin ydin- otteita KMCH soluista. Liikkuvuuden muutos CY 5,5-leimattu koetin voidaan estää lisäämällä 200-kertainen molaarinen ylimäärä leimaamatonta koetinta (kilpailijan, Fig. 2B). Kolmesta GLI perheenjäseniä, siRNA jotta GLI2 aiheutti merkittävän laskun XIAP proteiinin ilmentyminen, kun siRNA on GLI1 tai Gli3 ei muuttanut XIAP tasoja (Fig. 2C). Selvittääkseen, GLIS sitoutuvat

XIAP

promoottori, suoritimme kromatiinin immuunisaostuskokeissa arvioida ammattiin endogeenisen

XIAP

promoottori käyttää vasta GLI1, GLI2, ja Gli3. Sitovat GLI2 havaittiin käyttäen alukkeita, jotka vahvistavat Site I (Fig. 2D). Ohjaus IgG ei tuottanut tuotetta, mikä osoittaa spesifisyyden antiseerumien käytetty, ja positiivinen kontrolli promoottorikohtien osoitti odotetun miehityksen GLI1 ja GLI2 (

Bcl-2

promoottori), ja Gli3 (

GLI1

promoottori). Nämä tiedot viittaavat siihen, että siili suoraan säätelee

XIAP

ilmentymisen GLI2 transkriptiotekijän sitoutumiseen Site I

XIAP

promoottori.

A

Otaksuttavat GLI sitoutumiskohdat XIAP promoottorialueen. Nukleotidipaikat laskettiin transkription aloituskohdasta (TSS). Mahdolliset sitoutumispaikat havaittiin, kuten nuolilla on kaavamainen (I ja II).

B,

tumaproteiiniuutteet eristettiin KMCH soluista. EMSA suoritettiin käyttäen Cy5.5-leimattua kaksijuosteisia oligonukleotideja, jotka sisältävät otaksutun GLI sitovia sekvenssejä ihmisen XIAP promoottori, ja kilpailu kokeilut 200-kertainen mooliylimäärä kylmä oligonukleotideja kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”.

C

, totaalisoluproteiinia eristettiin 48 tunnin kuluttua ohimenevän transfektion kanssa osoitti siRNA vastaan ​​GLI perheenjäseniä. XIAP proteiinin ilmentyminen määritettiin immunoblottauksella ja signaali kvantifioitiin densitometrialla sen määrän suhteessa aktiinin ilmentymistä.

D,

Kromatiini immunosaostus käyttäen antiseerumia GLI1, GLI2, Gli3, tai kontrolli-IgG suoritettiin seurasi PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka reunustavat site I (341 emäsparia) sisällä

XIAP

promoottorialueen, kuten osoitettu. Positiivisena kontrollina, ChIP suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka reunustavat

Bcl-2

promoottori GLI-sitoutumiskohta (GLI1 ja GLI2), tai alukkeita, jotka reunustavat Gli3 sitoutumiskohdan sisällä

GLI1

promoottori.

herkistymistä Hedgehog esto on riippumaton mitokondrioiden apoptoottisten välittäjien, Bid /Bim tai Bax /Bak

XIAP on keskeinen syrjivä muuntaa tyypin II tyyppi I kuoleman reseptori signalointi [9 ], joten me pidetään menetys XIAP proteiinin mekanismi, jonka Hedgehog esto herkistyneet kolangiokarsinooma solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Bid ja Bim ovat keskeisiä signalointi välituotteita tyypin II proapoptoottiset kuoleman reseptori signalointi [28], [29]. Näiden tietojen perusteella, seuraavan kerran selville jos Hedgehog esto herkistyneet solujen TRAIL sytotoksisuuden puuttuessa Bid tai Bim. shRNA konstruktit kohdistaminen Bid ja Bim tehokkaasti pudotti kunkin solun proteiinien tasoja (Fig. 3A). Lähellä täydellinen vaiennettu Bid tai Bim proteiinin tasot on toiminnallisesti vahvistettiin hyödyntämällä havainto, että Fas tyypin II kuoleman reseptori signalointi riippuu Bid tai Bim [30]. Todellakin, Bid tai Bim pudotus oli riittävä estämään Fas-indusoitua solukuolemaa, jonka agonistinen vasta-aine CH-11 (Fig. 3B ja 3C), klassinen tyypin II reitti solukuoleman [31]. Jos siis TRAIL aiheuttama solukuolema syklopamiinilla herkistyneet solut oli riippuvainen tyypin II signalointi, sitten Bid tai Bim hiljentäminen pitäisi samalla suojata TRAIL sytotoksisuutta. Kuitenkin puuttumisesta huolimatta Bid tai Bim, the Hedgehog estäjä syklopamiiniin vielä herkistyneet ihmisen kolangiokarsinooma solujen TRAIL-solukuolema (Fig. 3d ja 3E).

A

immunoblottianalyysi oli suoritetaan kokosolulysaateista saatu KMCH pysyvästi transfektoitujen solujen erityisten shRNA kohdistaminen

Bid

tai

Bim,

käyttäen ilmoitettu antiseerumeita. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

B

, KMCH pysyvästi transfektoitujen solujen Bid- tai Bim-shRNA ja transfektoimattomia vanhempien KMCH soluja käsiteltiin Fas agonistista vasta-ainetta CH-11 (100 ug /ml) 5 tunnin ajan, jota seuraa DAPI-värjäyksellä. Solut, joissa apoptoottinen morfologia laskettiin. Keskiarvo ± SEM, *** p 0,001 verrattuna vanhempien soluissa, joita käsiteltiin CH-11.

C; Vie Samanaikaisesti kaspaasi-3/7-aktiivisuus mitattiin soluissa käsiteltiin kuten paneelissa

B

. Keskiarvo ± SEM, *** p 0,001.

D

, KMCH pysyvästi transfektoitujen solujen Bid- tai Bim-shRNA esikäsiteltiin ajoneuvon tai syklopamiinilla (5 uM) 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten TRAIL (5 ng /ml) 5 tunnin ajan, jota seuraa DAPI värjäystä. Solut, joissa apoptoottinen morfologia laskettiin. Keskiarvo ± SEM, *** p 0,001 verrattuna käsiteltyjen solujen TRAIL yksinään.

E

, KMCH stabiileja solulinjoja käsiteltiin kuten paneelissa

D

, ja 5 tunnin kuluttua kaspaasi-3/7-aktiivisuus mitattiin. Keskiarvo ± SEM, *** p 0,001 verrattuna käsiteltyjen solujen TRAIL yksinään.

F

, kaikkiaan solulysaatteja KMCH, HuCCT-1, ja Mz-Cha-1 solut, joita käsiteltiin vehikkelillä tai syklopamiinilla (5 uM) 24 tunnin ajan, analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-Bcl-2, Mcl- 1, tai Bcl-x antiseerumeita. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

G

, kokosolulysaateille saatu shBid-, shBim- ja transfektoimattomia vanhempien KMCH soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä tai syklopamiinilla (5 uM) 24 tunnin ajan ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-Bcl-2, Mcl- 1, tai Bcl-x antiseerumeita. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

Koska epätasapainossa anti ja proapoptoottiset Bcl-2-perheen proteiinien syklopamiinilla voisi selittää sen vaikutuksista herkistävät solujen TRAIL tappaminen, me profiloitu tämän luokan proteiinien immunoblot-analyysillä. Bcl-x

L-proteiinin ekspressio oli merkittävästi vähemmän KMCH soluja kuin HuCCT-1 tai Mz-Cha-1-soluissa, mutta yksikään kolmesta antiapoptoottisten proteiinien (Bcl-2, Mcl-1, tai Bcl-x

L) muuttui syklopamiinihoidon (Fig. 3F). Syklopamiinia ei myöskään muuttanut solun tasoja antiapoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinien KMCH pysyvästi transfektoitujen solujen shRNA kohdistamista Bid tai Bim (Fig. 3G). Samoin SMO esto ei muuta BH3 vain proteiineja tai pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit, Bax ja Bak [19]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio Hedgehog-reitin herkistää ihmisen kolangiokarsinooma solujen TRAIL sytotoksisuuden prosessilla riippumaton Bid tai Bim tai muutoksia ilmaus multidomain Bcl-2-perheen proteiineja. Riippumattomuus Bid tai Bim ehdotti kiehtova mahdollisuus, että syklopamiini voi herkistää kolangiokarsinooma solujen TRAIL muuntamalla apoptoottiset signaloinnin tyypin II tyypin I kuolema reseptorin kautta.

Voit testata tätä hypoteesia, me seuraavaksi ratkaistava, onko Hedgehog esto muuntaa tyypin II kuolema reseptorin signalointi tyypin I signalointi. Ehdoton edellytys tyypin I kuolema reseptorin signalointi on sen puute riippuvuus Bax ja Bak [32]. Tehokas Knockdown Bax ja Bak-proteiinin tasot saatiin aikaan siRNA kohdentamalla (Fig. 4A). Kohdennettu Knockdown Bax plus Bak-proteiini toimi estävän Fas-välitteistä apoptoosia CH-11 (Fig. 4B ja 4C), joka noudattaa tyypin II signalointi. TRAIL yksinään oli pieni apoptoottinen vaikutus KMCH soluihin, jotka oli tehokkaasti estetty Bax /Bak vaiennettu, mikä osoittaa, että TRAIL yleensä tappaa kolangiokarsinooma solujen tyypin II reitin (Fig. 4D). Kuitenkin, TRAIL: n indusoiman apoptoosin kasvoi jyrkästi syklopamiinilla (Fig. 4D ja 4E). Lisääntynyt apoptoosi oli täysin (kuvio. 4E) tai lähes kokonaan (Fig. 4D) epäherkkiä Bax /Bak hiljentäminen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että siili inhibitio kiertää mitokondrioiden vastustuskyky TRAIL sytotoksisuuden muuntamalla tyypin II signaloinnin tyypin I signalointireitin.

A,

kaikkiaan solulysaatteja KMCH soluja transfektoitiin ohimenevästi erityisiä siRNA kohdistaminen Bax ja /tai Bak tai salattu siRNA saatiin 48 tunnin kuluttua transfektion ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-Bax tai anti-Bak antiseerumeita. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

B

, KMCH soluja transfektoitiin ohimenevästi Bax- ja Bak-siRNA tai salattu siRNA esikäsiteltiin (24 tuntia) ja keski- tai syklopamiinilla (5 uM) kuten, sitten käsiteltiin Fas agonistista vasta-CH-11 (100 ug /ml) 5 tunnin ajan. Solut, joissa apoptoottista ydin- morfologia laskettiin. Mean +/- SEM; *** P 0,001.

C,

KMCH soluja käsiteltiin kuten paneelissa

B

ja kaspaasi-3/7-aktiivisuus mitattiin 5 tunnin kuluttua. Mean +/- SEM; *** P 0,001

D

, KMCH soluja transfektoitiin ohimenevästi Bax- ja Bak-siRNA tai salattu siRNA esikäsiteltiin ajoneuvon tai syklopamiinilla (5 uM) 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten TRAIL (5 ng /ml) 5 tunnin ajan. Solut, joissa apoptoottista ydin- morfologia laskettiin. Keskiarvo ± SEM, # p 0,05 ja *** p 0,001 verrattuna soluihin transfektoitu salattu siRNA ja käsitelty TRAIL.

E

, KMCH soluja transfektoitiin ohimenevästi merkitty siRNA ja käsiteltiin kuten paneelissa

D

, testattiin 5 tunnin jälkeen kaspaasi-3/7-aktiivisuus. Keskiarvo ± SEM; *** P 0,001.

knockdovvn

XIAP

herkistyneet kolangiokarsinooma solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin huolimatta esto Bid

Seuraavaksi määritetään toiminnallinen merkitys of XIAP ilmaisun näissä syöpäsoluissa käyttämällä siRNA kohdistetun knockdovvn

CIAP-1

tai

XIAP.

tehokkaampi kohdentaminen CIAP-1 ja XIAP-proteiinin ilmentyminen varmistettiin immunoblot-analyysillä (Kuva. 5A ). Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [33], [34], [35], [36], knockdovvn

XIAP

merkittävästi herkistyneet solujen TRAIL sytotoksisuuden, kun taas knockdovvn

CIAP-1

vain vaatimattomasti herkistyneet solut TRAIL-indusoitua solukuolemaa, mitattuna joko morfologisesti (Fig. 5B) tai biokemiallisesti (Fig. 5C). Siten säätely XIAP ilmaisu on mahdollinen mekanismi, jolla Hedgehog signalointi estää TRAILin sytotoksisuutta.

KMCH solut transfektoitiin salattu siRNA tai erityisiä siRNA varten

CIAP-1

tai

XIAP

.

, kaikkiaan solulysaatteja valmistettiin immunoblottauksella päässä KMCH solut 48 tunnin kuluttua siRNA transfektion.

B

, Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen kuin paneelissa

, soluja käsiteltiin ihmisen rekombinantti TRAIL (5 ng /ml) tai väliaineen 5 tuntia. Sitten solut värjättiin DAPI ja solujen apoptoottista ydin- morfologia laskettiin ja ilmaistiin prosentteina koko ytimeksi.

C,

Samanaikaisesti solut transfektoitiin ja käsiteltiin TRAIL kuin paneelissa

B

, ja 5 tunnin kuluttua kaspaasi-3/7 aktiivisuus mitattiin. Keskiarvo ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

Yllä olevat tiedot ovat yhdenmukaisia ​​siirtyminen tyypin II tyypin I reseptorivälitteisen apoptoosin SMO esto; SMO esto näyttää välittävän tämän kytkimen alaspäin säätäminen

XIAP

geeniekspressiota. Tämän testaamiseksi tietojen tulkinta, suunnittelimme kokeita selvittämään, jos knockdovvn XIAP proteiinin riitti muuntamaan TRAIL signalointi on mitokondrioiden-riippumattomia, tyyppi I reittiin. Käytimme pienmolekyylisalpaaja- of Bid, BI-6C9, kiertää mitokondriot riippuvaista solukuolemaa [37]. Ensimmäinen, vahvistaa, että BI-6C9 inhiboi toiminnallisesti solukuoleman tässä järjestelmässä, KMCH solut on esikäsitelty BI-6C9 tai vehikkeliä (DMSO), jota seuraa Fas agonistinen vasta-aine. Todellakin, farmakologinen esto Bid BI-6C9 riitti tukahduttaa Fas indusoiman apoptoosin. Jälleen SMO esto ei vaikuttanut apoptoosia CH-11 hoitoa (Fig. 6A). Sen sijaan, BI-6C9 ei toiminnallisesti estää TRAIL-indusoitua solukuolemaa syklopamiinilla käsitellyissä soluissa (Fig. 6B). Tärkeää on, vastaan ​​suunnattu siRNA XIAP myös herkistyneet solut TRAIL: n indusoiman apoptoosin, ja BI-6C9 eivät lieventäneet solukuolemaa (Fig. 6C). Siten SMO esto, vähentämällä solun XIAP proteiinin tasot, muuntaa tyypin II TRAIL kuolema reseptorin signalointi tyypin I koulutusjakson vaikutus toisteta siRNA suunnattu pudotus on

XIAP

.

A,

KMCH soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan väliaineessa tai syklopamiinilla (5 uM) ja sen jälkeen käsittelemällä joko ajoneuvon (DMSO, lopullinen konsentraatio 0,1% v /v) tai Bid-inhibiittori, BI-6C9 (10 uM) 1 tunti. *** P 0,001; *** P 0,001;