Krooninen sairaus

tiivistelmä

tutkimiseksi yksittäisten toimintojen hyaluronaanin vuorovaikutuksessa proteiinien eturauhassyöpä (PCA) motiliteetti kautta sidekudosta, olemme kehittäneet uuden kolmiulotteisen (3D) hyaluronihappoa (HA) hydrogeeliä määritys, joka antaa joustava, mitattavissa, ja fysiologisesti relevantti vaihtoehdon nykyisiin menetelmiin. Invasion tässä järjestelmässä heijastaa esiintyvyys HA sidekudoksen ja sen rooli edistämisessä syöpäsolun liikkuvuutta ja kudosinvaasio, tekee järjestelmästä ihanteellisen tutkia invaasion kautta luuytimestä tai muista HA-rikas sidekudosta. Bioyhteensopiva ristisilloitukseen prosessi käytimme mahdollistaa suoran kapselointi syöpäsolujen sisällä geeli, jossa he vahvistettava erilliset, klusteri kaltainen morfologia. Metastaattinen PCa solut näissä hydrogeelien kehittää sormimaista rakenteita, ”invadopodia”, sopusoinnussa niiden invasiivisia ominaisuuksia. Määrä invadopodia sekä klusterin koko, muoto, ja lähentymistä, voi tarjota määrällisesti mitta invasiivisen potentiaalia. Niistä ehdokas Hyaluronaani vuorovaikutuksessa proteiineja, jotka voisivat olla vastuussa käyttäytymisestä havaitsimme, huomasimme, että kulttuurin HA hydrogeeliin laukaisee invasiivisia PCa solujen differentiaalisesti ilmaista ja paikallistaa reseptori Hyaluronaani välittämän motiliteetin (RHAMM) /CD168 jotka, ilman CD44, ilmeisesti osaltaan PCa liikkuvuutta ja invaasio vuorovaikutuksessa HA hydrogeeliin komponentteja. Eturauhassyövän soluinvaasiota läpi HA hydrogeeli myös todettiin riippuvan aktiivisuuden hyaluronidaaseista. Tutkimukset kuvassa paljastavat, että vaikka hyaluronidase toiminta on välttämätöntä invadopodia ja yhdistää toisiinsa klusterin muodostumista, toiminta ei yksin riitä hankintaan invasiivisuus esiintyy. Siksi ehdotamme, että kehitys invasiivisen käyttäytymisen 3D HA-pohjaisissa järjestelmissä vaatii kehittämistä uusia solun ominaisuuksia, kuten aktivointi motiliteetti liittyvän reittejä, jotka säätelevät muodostumista invadopodia. Siten me raportoimme kehittäminen 3D järjestelmän rohkaistaisiin leikkely biologisten prosessien syöpään liittyvän soluliikkuvuus läpi HA-rikas sidekudosta.

Citation: Gurski LA, Xu X, Labrada LN, Nguyen NT, Xiao L, van Golen KL, et ai. (2012) Hyaluronaani (HA) Vuorovaikutus proteiinit RHAMM ja Hyaluronidase Impact Eturauhassyöpä Cell Käyttäytyminen ja Invadopodia Formation in 3D HA-hydrogeelit. PLoS ONE 7 (11): e50075. doi: 10,1371 /journal.pone.0050075

Editor: Sharon Gerecht, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 15 lokakuu 2012; Julkaistu: 16 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Gurski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health (www.nih.gov) P01CA098912 (MCFC) ja P20RR016458, P20RR017716, R01DC008965 (XJ), National Science Foundation (www.nsf.gov) DMR 0643226 (XJ) ja IGERT 0221651 (LG) ja Delaware Health Science Alliance (DHSA) (www.delawarehsa.org) (XJ), Department of Defense (www.defense.gov) PCRP W81XWH-05-1-0005 ja W81XWH-08-1-0356 ( KLVG) ja PCRP W81XWH-11-1-0564 (LG), ja Center for Translational Cancer Research (www.udel.edu/ctcr). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suurin osa potilaista, jotka kuolevat kiinteitä kasvaimia vuosittain kärsii luuetäpesäkkeistä [1]. Kolme yleisimmin diagnosoitu syöpä tyyppejä, eturauhas-, keuhko-, ja rinta-, etäpesäkkeitä luuhun. Luumetastaasipotilailla dramaattisesti alentaa elämänlaatua johtuu kipu, murtumia, ja hyperkalsemia [2]. Lisäksi läsnäolo luun etäpesäkkeiden alentaa eloonjäämisaste. Eturauhasen syöpä (PCA), viiden vuoden eloonjäämisaste paikallinen tauti on 100%, kun taas putoaa 30% pitkälle taudin etäispesäkkeitä [1]. Nykyisin on olemassa muutamia tehokkaita hoitomuotoja luumetastaasipotilailla tai estää etäpesäkkeiden luuhun tai muihin sivustoihin [2]. Määrätty kliininen tarve siis olemassa kehittää uusia hoitomuotoja ja estää luun etäpesäkkeiden mukana liikkuva, kohdunkaulan syöpä soluja, jotka voivat helposti asuttaa sidekudosta kuten luuytimestä.

Tutkimus polkuja, jotka ohjaavat syöpäsoluinvaasiota tai muuttoliikkeen , ja uusien huumeiden estää näitä prosesseja edellyttää järjestelmiä, joilla voidaan mitata invasiivisia ominaisuuksia näiden solujen [3], [4]. Nykyisin saatavilla invaasio ja muuttoliike määritykset ovat vähemmän ihanteellisia, koska ne usein: 1) on vaikea määrittää, 2) on vaikea räätälöidä yksittäisiin syöpäsolujen käyttäytymistä, tai 3) käytetään matriisien kuten eläinperäisiä matrigeelin ™, jotka sisältävät kasvutekijöitä, mutkistaa koetulosten [3], [5], [6].

luuydin matriisi koostuu pehmeä, geelimäinen sidekudosta runsaasti hyaluronihappoa (HA) [7], [8]. HA on suuri, ei-sulfatoitu glykosaminoglykaani, joka koostuu toistuvista β-1,4-kytketty D-glukuronihapon ja β-1,3-N-asetyyli-D-glukosamiini disakkaridiyksiköistä [9]. HA esiintyy kaikkialle in soluväliaineen (ECM) on kaikissa solutyypeissä, mutta on erityisen rikastettu sidekudokset. Solut voivat sitoa HA erilaisten reseptoreihin, kuten klusterin erilaistumisen 44 (CD44) tai reseptori Hyaluronaani välittämää liikkuvuutta (RHAMM) [10]. Syöpäsoluissa, RHAMM on osoitettu sitoutuvan CD44 solun pinnalla, ja HA sitova tämän monimutkaisen edistää alavirtaan signalointi johtaa Rho GTPaasina aktivointi ja lisääntynyt solujen vaeltaminen [11], [12]. Sekä RHAMM ja CD44 ekspressiotasot on yhdistetty etenemisen useita syöpiä, kuten PCa [13], [14].

Toinen tapa, että solut ovat vuorovaikutuksessa HA on hajottamalla se, jonka ilmentyminen ja eritys hyaluronidaaseista (HAases). Asiaan PCA hyökkäystä ovat HAases, HYAL-1 ja HYAL-2, joiden ekspressiotasoja on liitetty PCa etäpesäkkeiden [13], [15], [16]. HYAL-1 on aktiivinen pienessä pH 3,5-3,8 ja pilkkoo minkä tahansa molekyylipainon HA osaksi tetrameerejä [17]. HYAL-2 esitetään optimaalinen aktiivisuus pH: ssa 6,0-7,0 ja pilkkoo suuri molekyylipaino HA välituotteisiin, 20 kDa koko fragmentit [18]. Glykosyloitu, 57 kDa: n muotoon HYAL-1 voidaan erittää solujen [19]. Haase eritys voi helpottaa PCa etäpesäke sallimalla syöpäsolujen hyökätä HA-rikas tukikudoksen.

Mikä tärkeintä, HAases ovat druggable tavoitteita, mikä osoittaa niiden mahdollinen käyttö kohteina hidas hyökkäys ja mahdollisesti estää etäpesäkkeiden [20], [21]. Yksi Haase estäjä, dinatriumkromoglikaatti (DSC) [22], [23] on FDA hyväksytty käytettäväksi lievittää allergiaoireita ja astma, ja näyttää alhainen myrkyllisyys potilailla [24], [25]. Sen kyky estää PCa ja metastaasit ei ole tutkittu.

aiemmin kuvattu kehittämään HA-pohjainen hydrogeeliä kulttuuriin huonosti kiinni luun metastaattinen PCa soluihin [26]. Hydrogeeli käsittää kaksi kemiallisesti modifioitu HA komponentteja, aldehydi-kantaa HA (HAALD) ja adipiinihappodihydratsidi-HA (HAADH). Nämä komponentit silloittamiseksi muodostumisen kautta hydratsiinia sidoksia, vapauttaa vettä ainoana sivutuotteena [27]. PCa solut voidaan kapseloida HA hydrogeelin silloitusreaktion aikana prosessissa. Elinkelpoisuuden kapseloidut solut pysyy suurena vähintään viikon [26]. Koska HA on peräisin bakteereista, se on vailla eukaryoottisten kasvutekijöitä, jotka voivat vaikuttaa solujen kasvuun, invaasio, ja muuttoliike.

Tutkia kehittämistä invasiivisia ominaisuuksia Eturauhassyövän soluja natiivin tukikudoksen, me käytetyt LNCaP sarja ihmisen PCa solun alilinjat jotka kehitettiin jäljitellä prosessia Eturauhassyövän luun etäpesäke. Nämä solut pidetään yhtenä paremmin PCa etenemistä malleja, koska niiden kyky muodostaa kliinisesti merkittäviä osteoblastic vaurioita hiirissä [28]. Yksittäiset alalinjoja että LNCaP Sarjat kuvaavat vaiheita taudin etenemistä kanssa LNCaP edustaa varhaisessa eturauhasen kasvain, joka on saavuttanut lähellä imusolmuke, C4-solut edustavat aggressiivinen, paikallisesti invasiiviset syöpäsolujen että hengissä jälkeen kastraation, C4-2 solut edustavat aggressiivinen, metastaattisen sairaus, ja C4-2B solut edustavat PCa kastraatio kestävä luuetäpesäkkeistä [29]. Käyttämällä näitä soluja ja uusi 3D-HA geeli hyökkäyksen järjestelmä kehitimme, tutkimme roolia HA reseptorien ja HAases PCA hyökkäyksen ja maahanmuuton HA-rikas sidekudoksen matriisi. Tarkoitetaan tässä työssä kuvataan liikkumista PCa solujen 3D hydrogeelien, joka eroaa siirtymät muovipintojen, kuvaamme maahanmuuttoa näennäisen liikkuvuuden solujen läpi huokoisen hydrogeelejä osoituksena laajentaminen solun prosesseja kutsumme ”invadopodia” ja jonka yhdistäminen aiemmin erotettu klustereita hydrogeelien.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Elektroforeesilaitteet, soluviljelmissä, ja transfektioreagenssit ja tarvikkeita ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA) . TCM ™ määritelty seerumin korvaaminen ostettiin MP Biomedicals (Solon, OH). Hyaluronihappo (natriumsuola, 500 kD ja 1,3 MDA) oli anteliaasti lahjoittanut Genzyme Corporation (Cambridge, MA). RHAMM (HMMR) ja CD44-vasta-aineita ostettiin Novus Biologicals (Littleton, CO). Hyal2 ja β-aktiini-vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, MA). Equine-α-hiiri-HRP sekundaarisen vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Hyal1 vasta-ainetta, naudan kivesten hyaluronidaasia (BTH), β-merkaptoetanoli (ÖME), glysiini, Tween 20, naudan seerumin albumiinia (BSA), natriumformaattia, Coomassie brilliant blue, dinatriumkromoglikaatti (DSC), ja deoksikoolihappo hankittiin Sigmalta Aldrich (St. Louis, MO). Vuohi-α-kani-HRP-sekundäärisen vasta-aineen, proteaasi-inhibiittorit (PI), 5 x näytepuskuria, sulfo-NHS-SS-biotiinia, ja avidiini agaroosi ostettiin Thermo Scientific (Rockford, IL). Laemmli-näytepuskuria ja alcian sininen ostettiin Biorad (Richmond, CA). Tris-puskuria, jääetikkaa, metanoli, alhainen sulamispiste (LMP) agar, dimetyylisulfoksidi (DMSO), natriumdodekyylisulfaattia (SDS), Triton X-100, ja natriumkloridia (NaCl) ostettiin Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Nonidet P-40 hankittiin Roche (Indianapolis, IL) ja etanolin ostettiin Decon Labs, Inc (King of Prussia, PA). Kaikki yhdisteet käytettiin reagenssilaatua tai parempaa.

Cell Culture

Low jakolukuun PCa soluja pidettiin Corning (Lowell, MA) kudosviljelmässä 75 mm pulloissa 37 ° C: ssa 5,0% ( v /v), CO

2 T-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 U /ml G-penisilliini ja 100 ug /ml streptomysiiniä sulfaatti 0,085% (paino /tilavuus ) suolaliuosta (PS). Medium vaihdettiin joka 2-3 päivää. Solut siirrostettiin noin 80% konfluenssiin, arvioidaan silmämääräisesti käyttäen 0,25% (w /v) trypsiinillä, jossa etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 4 • Na. LNCaP alalinjoja [30] oli jalomielinen lahjoitus tohtori Leland Chung ja PC3-solut hankittiin ATCC (Manassas, VA).

valmistaminen HAALD ja HAADH

syntetisoimiseksi HA aldehydi (HAALD ), hapettumisreaktiotuote HA (1,3 MDa) suoritettiin, kun läsnä on natriumperjodaattia vesipitoisissa olosuhteissa. Adipiinidihydratsidin (ADH) modifioituja HA (HAADH) syntetisoitiin karbodi-välitteinen kytkentä ADH karboksyyliryhmien kanssa HA (500 kDa), vesipitoisissa olosuhteissa. Yksityiskohtaiset menettelyt synteesiä ja luonnehdinta molemmat HA johdannaisten kerrottiin edellisessä tutkimuksessa [26].

Soluviljely 2D- ja 3D-olosuhteet

HAALD ja HAADH liuotettiin erikseen Dulbeccon fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (DPBS) pitoisuuteen 10 mg /ml yön yli 37 ° C: ssa. 2% (w /v) LMP agar DPBS: ssä valmistettiin ja sulatettiin 70 ° C heatblock (Labnet International, Woodbridge, NJ) vähintään 1 tunnin ajan ennen käyttöä. Liuotetaan HA johdannaisia ​​steriloitiin UV-säteilyllä 254 nm: ssä 15 minuutin ajan ennen käyttöä.

PCa solut vapautettiin pulloon käyttäen 0,25% (w /v) Trypsiini-EDTA 4NA ja solujen kokonaismäärässä laskettiin hemosytometrillä (Hausser Scientific, Horsham, PA). 100000 (24-kuoppainen levy) tai 600000 (6-kuoppaisella levyllä) solut pelletoitiin kutakin viljelmää. Soluviljely insertit (Millipore, Billerica, MA, huokoskoko: 0,4 mm, läpimitta 12 mm 24-kuoppalevylle, 30 mm 6-kuoppaisella levyllä) esi-märkä T-väliaineessa sitten laitetaan kuoppiin 24-kuoppaisen tai 6-kuoppaisen kuoppalevyn kuoppaa (Becktonin-Dickenson Labware, Franklin Lakes, NJ). 2D kulttuureissa, solupelletti sekoitettiin T-väliaine (1 ml 24-kuoppalevylle, 4 ml 6-kuoppaisella levyllä) ja päällystetty.

3D HA hydrogeeli kulttuuri, solupelletti sekoitettiin 100 il (24-kuoppainen levy) tai 300 ui (6-kuoppalevyllä) ja HAALD. Yhtä suuri tilavuus HAADH lisättiin ja viljelmää sekoitettiin hyvin tasaisesti hajottamaan soluja. Hydrogeeli jälkeen liuos pipetoitiin esikostutettiin soluviljelmässä insertit ja sen annettiin jähmettyä noin 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. T-väliaine (1 ml 24-kuoppaisella levyllä, 4 ml 6-kuoppaisella levyllä), jota oli täydennetty 1% (v /v) PS ja joko 5% (v /v) FBS: ää tai 2% (v /v) TCM ™ oli lisätään noin insertin ja viljelmää inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% (v /v) CO

2. Tämä pitoisuus TCM ™ on yhdenmukainen aiempien tutkimusten täydentämällä C4-2 kulttuuri [31], [32].

3D agar, solupelletti sekoitettiin 85 ui (24-kuoppainen levy) tai 510 ui (6-kuoppaisella levyllä) DPBS lämmitettiin 37 ° C: ssa. Esisulatettua 2% (w /v) LMP agaria lisättiin DPBS /solu seoksen lopullinen pitoisuus on 0,3% (w /v) LMP agar. Agar Viljelmää inkuboitiin huoneen lämpötilassa noin 5 minuuttia ennen pipetoimalla kohdalla soluviljelyinsertissä estää agar gel vuotamasta kalvon huokosten läpi. Kun päällystetty insertin, agar geelin annettiin jähmettyä noin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kiinteytys suoritettiin huoneenlämpötilassa nopeuttamiseksi geeliytymisen pehmeässä agarissa. T-väliaine (1 ml 24-kuoppaisella levyllä, 4 ml 6-kuoppaisella levyllä) lisättiin tämän jälkeen sisäkkeen ympärille ja viljelmää inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% (v /v), CO

2. Kaikkien kulttuurien, puolet keskipitkän muutoksia tehtiin kahden päivän välein.

Metabolinen aktiivisuus ja solumäärät tehtiin solutyypeistä ja viljelyolosuhteet on kuvattu. Mittaamiseksi metabolinen aktiivisuus solujen, vesiliukoista tetratsoliumsuolaa-1 (WST-1, Roche) reagenssi käytettiin kuten on kuvattu [33] seuraavin muutoksin: määritys suoritettiin 24 kuoppalevyllä soluihin kasvatettu joko kolme tai kuusi päivää. WST-1-reagenssia (100 pl) levitettiin 1 ml: aan viljelyalustaa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Inkubaation jälkeen 100 ui elatusainetta poistettiin ja sijoitettiin 96-kuoppaiselle levylle. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä DTX880 multimode ilmaisimen (Beckman Coulter, Brea, CA). Laskea solujen määrä sisällä HA hydrogeeli, vaihekontrasti kuvia käytettiin. Näiden kuvien, keskikokoisen solun klusterin selkeät Solurajat valittiin ja solujen lukumäärä klusterin laskettiin. Tämä määrä kerrottiin kokonaismäärä klustereita kuvan, mikä tuottaa yhteensä noin solumäärän kohti valokuvataan kenttään.

invaasiomääritys Kvantifiointimenetelmät

Kaikille invaasio määrityksissä, vaihekontrasti kuvat on otettu kunkin soluviljelmässä käyttämällä Nikon Eclipse TE2000-U (Tokio, Japani) mikroskoopilla ja 10X tavoite. Keskimäärin invadopodia määritettiin laskemalla kokonaismäärä invadopodia kohden valokuvattu kentän kolmen biologisen rinnakkaista. ”Invadopodium” määriteltiin ohuena soluprosessia ulottuu ulospäin solun klusterin, ja riittävän selkeitä helposti tunnistaa silmään. Prosenttiosuus sulautuvan klustereiden laskettiin sekä niiden lukumäärästä klusterien fyysisessä kosketuksessa toisen klusterin ja useita vapaa klustereita kolmen biologisen rinnakkaista. Näistä arvoista prosenttiosuus sulautuvan klustereiden laskettiin ja pidetään indeksi muuttoliikkeen 3D hydrogeelien. Näytteissä, joissa verkostojen soluklusterien havaittiin, yhden solun klusteri määriteltiin erillisenä, pyöristetty alue matkapuhelinverkon joskus esiintyy sisältämään suuremman solutiheyden. Molemmissa kvantifiointiin, huolellisuutta johdonmukaisuuden kun määrä oli meneillään.

Rheology

Reologista luonnehdinta hydrogeelinäytteet suoritettiin stressiin ohjattu rheometer (AR-G2, TA Instruments, New Castle, DE), jossa on halkaisijaltaan 20 mm standardi terästä rinnakkain levygeometria ja 100 um rako. Dynaaminen oscillatory aika pyyhkäisee suoritettiin 25 ° C: ssa tai 37 ° C: ssa agar ja HA geelit vastaavasti, ja varastointi (G ’) ja tappio (G’) moduli kirjattiin. 30 ui agar-liuosta (0,3% w /v) tai HAADH /HAALD seosta (1% w /v) ladattiin geometria, joka myöhemmin peitettiin mineraaliöljyllä reunalla estää veden haihtumista. Näitä seoksia annetaan jähmettyä

in situ

kuin mittaukset tehtiin. Dynaaminen oscillatory aika pyyhkäisee kerättiin kulmataajuudet 6 rad /s ja 1% kanta valitaan lineaarisesta viskoelastinen järjestelmää [34]. Nämä kokeet toistettiin vähintään kolme näytettä, ja keskimäärin tiedot esitetään.

Protein Extraction

Solut yhdistetty kahdesta kuopissa 6-kuoppalevyllä viljelmää käytettiin proteiinin uuttamalla kokeissa. BTH (180 ui 10 mg /ml) levitettiin ja viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Viljelmät siirrettiin sentrifugiputkeen ja solut pelletoitiin sentrifugoimalla 1 minuutin ajan 3000 rpm. Solut pestiin kerran DPBS: llä. Radioimmunosaostuksella (RIPA) puskurissa (50 mM Tris-puskuria, pH 8,0, 150 mM NaCI, 0,5% (w /v) deoksikolihappo, 1% (v /v) Nonidet P-40, 0,1% (w /v) SDS: ää, DDH

2O, 200 ui), joka sisälsi PI: n kennoon pellettejä. Lysaatit inkuboitiin jään päällä 45 minuuttia ajoittain vorteksoimalla. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 13000 kierrosta minuutissa (rpm) 10 minuutin ajan. Koko proteiinipitoisuus lysaateista määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa (BCA) proteiinimäärityksellä (Thermo Scientific) jälkeen protokollaa. Lysaatit säilytettiin -20 ° C: ssa.

Western-blottaus

Protein (50 ug) sekoitettiin RIPA-puskurilla ja 5X Lane Marker Sample Buffer ja pME (3% (v /v) lopullinen ) yhteensä 25 ui. Näytteitä keitettiin 5 minuutin ajan, sitten jäähdytettiin ja nopeasti kehrätty. Näytteet ja proteiini tikkaat elektroforoitiin NuPAGE 4-12% Bis-Tris geelillä käyttäen X-Cell Surelock ™ roforeesikennossa ja MOPS-ajopuskurissa. Näytteet siirrettiin nitroselluloosakalvolle käyttäen X-Cell ™ II siirtolaitteeseen ja siirto puskurin, joka koostuu 1,5125 mg /ml Tris, 7,2 mg /ml glysiiniä ja 0,01% (w /v) SDS, jonka asettaminen 21V 1,5 tuntia.

membraani blokattiin 3% (w /v) BSA: ta DPBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween 20 (PBST) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa kevyesti ravistellen. Primaaristen vasta-aineiden (1:10,000 varten RHAMM, 1:5000 CD44 ja β-aktiini, 1:500 varten Hyal1 ja Hyal2) 3% (w /v) BSA: lla PBST: ssä inkuboitiin kalvon kanssa 2,5 tuntia huoneenlämpötilassa, jossa vapina. Kalvo pestiin 3 kertaa, 10 minuuttia kerrallaan, PBST: llä. Toissijainen vasta-aineita (1:5000 vuohi-α-kanin HRP tai 1:10,000 hevosen-α-hiiri-HRP) 3% (w /v) BSA: ta (ja Hyal1, Hyal2, ja β-aktiini-blotteja) tai 3% (w /v) rasvatonta kuivattua maitoa (ja RHAMM ja CD44 blotteja) inkuboitiin kalvon kanssa 1 tunti huoneenlämpötilassa ravistellen. Kalvo pestiin 3 kertaa, 10 minuuttia kerrallaan, PBST: llä. Supersignal® West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific) valmistettiin, kuten on suunnattu ja levitetään kalvon 5 minuuttia huoneenlämpötilassa ravistellen. Blotti altistettiin käyttäen BioMax Light Film (Kodak, Rochester, NY) ja kehitti käytettäessä SRX-101A kehittäjä (Konica Minolta Medical graafinen Inc, Tokio, Japani). PC-3 solulysaattina (50 ug) käytettiin positiivisena kontrollina CD44 westernit.

Immunovärjäys Protocol

Solut viljellään 2D viljeltiin 8 hyvin Lab-Tek II Chambered peitelevyllä ( Nalge Nunc, Naperville, IL). Väliaine poistettiin ja kammiot pestiin 2 kertaa DPBS: llä. Solut kiinnitettiin 10 minuuttia 4% (v /v) paraformaldehydillä (PFA) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) in ddH 2O: lla. Ylimääräinen PFA poistettiin ja kammiot pestiin kahdesti DPBS: llä. Triton X-100 DPBS: ssä (0,2% (v /v)) valmistettiin ja levitettiin kammioihin 10 minuuttia. Ylimääräinen Triton X-100-liuos poistettiin ja kammiot pestiin kahdesti DPBS: llä. Viljelmät blokattiin 3% (w /v) BSA: ta DPBS: ssä 4 ° C: ssa yön yli. Soluja inkuboitiin 1:1000 (v /v) liuokseen, RHAMM tai CD44 primaaristen vasta-aineiden 3% BSA: ta 4 ° C: ssa yön yli. 1:1000 (v /v) liuokseen, Draq5 (Biostatus Limited, Leicestershire, UK) DPBS: ssä käytettiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Chambers taas pestiin DPBS: llä ja Gel /Mount ™ (Biomeda, Foster City, CA) lisättiin kammioihin estämiseksi fotobleknande. Solut visualisoitiin käyttäen konfokaalimikroskopialla Zeiss LSM 510 VIS (Carl Zeiss, Maple Grove, MN).

soluja 3D viljeltiin 24-kuoppalevyillä, kuten on kuvattu edellä. Soluklusterien hellävaraisesti poistettiin hydrogeelistä mikropipetin avulla. Klusterit pestiin varovasti 1 ml DPBS 2 kertaa, nopeasti linkoamalla kerätä soluklusterien joka kerta. Clusters oli huolellisesti uudelleen vuonna 4% (v /v) PFA ja siirrettiin 8 hyvin chambered peitelevyllä. Viljelmiä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan. Kun siirretään chambered peitelevyllä, samoja värjäysmenetelmistä käytettiin käytetään 2D kulttuuriin. Oltiin erittäin varovaisia ​​säilyttää niin monta soluklusterien mahdollisimman kunakin Nesteenpoistosta.

Cell Surface Biotinylaatio määritys

C4-2 soluja viljeltiin T-75 pullo noin 90% konfluenssiin. Solut irrotettiin pullosta, suspendoitiin T-väliaineessa ja lasketaan. Solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä (pH 8,0, 5 ml). Solut suspendoitiin uudelleen jääkylmään PBS: ään (pH 8,0) lopulliseen konsentraatioon 20 x 10

6 solua /ml. Juuri valmistettu, 10 mM sulfo-NHS-SS-biotiinia (80 ui) lisättiin solujen seokseen ja seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia ravistellen. 50 mM Tris (pH 8,0, 2 ml) lisättiin poistaa biotinylaatio reaktio, ja solupelletti pestiin sen jälkeen kahdesti PBS: llä (pH 8,0, 2 ml). Lopullisessa PBS pesu poistettiin kokonaan solupelletti, ja RIPA-puskuria, joka sisälsi PI (500 ui) levitettiin solupelletti. Lyysi Reaktiota inkuboitiin jäillä yhden tunnin ajan. Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla 12000 rpm 10 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantti poistettiin ja varastoitiin -20 ° C: ssa.

BCA-määrityksellä suoritettiin biotinyloidulla lysaatti, kuten on kuvattu aiemmin; noin 1,5 mg proteiinia saatiin. Avidin-agaroosi (1 ml) pantiin mikrosentrifugiputkeen ja hartsi ratkaistaan ​​sentrifugoimalla 1 minuutti nopeudella 2000 kierrosta minuutissa. Hartsi pestiin kolme kertaa RIPA-puskurilla (500 ui). Lysaatti levitettiin hartsia ja seosta inkuboitiin koeputkipyöritin 4 ° C: ssa yön yli. Hartsi ratkaistu sentrifugoimalla 1 minuutti 2000 rpm ja sitoutumattomat lysaattia poistettiin. Sitoutumattoman lysaattia (10 ui), sekoitettiin Laemmli-näytepuskuria, joka sisälsi 5% (v /v) pME (10 ui). Hartsi pestiin kolme kertaa RIPA sisälsi PI (500 ui). Laemmli Näyte, joka sisälsi 5% pME (50 ui) levitettiin helmiä. Laemmli sisältäviä seoksia keitettiin 5 minuutin ajan, sitten sentrifugoitiin 13000 rpm. Biotinyloidun avattavasta ja sitoutumaton fraktio ajettiin elektroforeesissa ja siirrettiin nitroselluloosalle, kuten edellä on kuvattu. Bone metastaattinen PCa solu (PC3) lysaattia (10 ui) sekoitettuna Laemmlin näytepuskuria, joka sisälsi ÖME (10 ui) otettiin mukaan positiivisena kontrollina CD44 ilmaisua. Western blotting ja CD44, RHAMM, ja GAPDH suoritettiin, kuten on kuvattu alla ”Western-blottaus” -osiossa.

RHAMM pudotus

C4-2-soluja pidettiin antibiootti-väliaineessa kolme päivää ennen transfektiota. Mixed 6 pmol /cm

2 Stealth RNAi ™ siRHAMM duplex (GGCGUCUCCUCUAUGAAGAACUAUA ja UAUAGUUCUUCAUAGAGGAGACGCC) ja 0,5 pl /cm

2 Lipofectamine ™ RNAiMAX in Optimem® I RHAMM Knockdown tai 6 pmol /cm

2 alhainen GC Stealth RNAi ™ negatiivinen kontrolli duplex ja 0,5 ul /cm

2 Lipofectamine OptiMEMiin transfektioon valvontaa. Transfektio seoksia inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämmössä ennen kuin soluihin. Transfektio reaktioita inkuboitiin kuusi tuntia 37 ° C: ssa ja levyjä pyöritettiin varovasti tunnin välein sekoitetaan transfektioreagensseja.

Transfektioseos imettiin pois soluista ja solut pestiin DPBS: llä. Antibiootti väliaineessa levitettiin soluja ja transfektoituja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli ennen kokeita varten. Teho RHAMM Knockdown arvioitiin kautta Western blotting varten RHAMM kuvatulla alla ”Western-blottaus” -osiossa.

Hyaluronidase Activity Assay

Haase Aktiivisuus tutkittiin kautta alustan geelielektroforeesilla [35], [36 ]. Alhaisen molekyylipainon HA liuotettiin yön yli 37 ° C: ssa tislatussa vedessä (0,17 mg /ml). Tämä HA liuosta sijasta käytettiin vettä valmistettaessa 12% (w /v) ProtoGel® akryyliamidigeelissä (National Diagnostics, Cherry Hill, NJ). LNCaP, C4, C4-2 ja C4-2B lysaattien tai 50 ug BTH sekoitettiin yhtä suurilla tilavuuksilla Lamelli näytepuskuria (5% (v /v)), ja ladattiin HA sisältävä geeli. Geeli elektroforeesi käyttäen X-Cell Surelock ™ roforeesikennossa ja MOPS-ajopuskurissa. Geeli sitten poistettiin kasetista ja pestiin yksi tunti huoneen lämpötilassa 3% (v /v) Triton X-100 PBS: ssä. Geeli sitten inkuboitiin formaatti-NaCl-puskuria (0,1 M natrium- formaatti ja 0,15 M natriumkloridia liuotetaan tislattuun veteen, pH 4,6) 16-20 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Geeli pestiin kahdesti tislatulla vedellä ja sitten inkuboitiin 0,5% (w /v) Alcian Blue 3% (v /v) jääetikkaa, liuos yhden tunnin havaitsemaan HA. Geeli pestiin kolme kertaa yhden tunnin ajan kullakin on 7% (v /v) etikkahapon liuos värin poisto ja kiinnitys. Geeli pestiin sitten kahdesti tislatulla vedellä, ja kaksi kertaa 50% (v /v) metanolia, 10% (v /v) jääetikkaa liuoksen. Läsnäolon havaitsemiseksi proteiinin geelillä, se sitten inkuboitiin 0,25% (w /v) Coomassie brilliant blue 9% (v /v) etanolia, 45,5% (v /v) jääetikkaa yhden tunnin ajan. Tätä seurasi kolmen tunnin pesun metanoli /etikkahappo pesuliuosta.

Hoitoon Viljelmiä Haase Inhibitor

Liuosta, jossa oli 125 mM DSC valmistettiin 40% (v /v) DMSO ja suodatetaan Steriflip suodattimen (Millipore) steriloida. DSC (3,33 tai 10 ui 125 mM) lisättiin 800 ul tai 2,4 ml T-väliainetta 24 tai 6-kuoppaisille levyille, vastaavasti, siten, että lopullinen konsentraatio on 500 uM DSC, IC-50-arvo tämän inhibiittorin [37] . Sama määrä 40% (v /v) DMSO: ta käytettiin ajoneuvon ohjaus. Väliaine vaihdettiin joka kolmas päivä ja tuoretta DSC tai DMSO-liuosta levitettiin, kuten on kuvattu.

trypaanisiniekskluusiolla

myrkyllisyys DSC PCa-soluissa määritettiin käyttämällä trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. 600000-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille, joissa T medium, 5% (v /v) FBS: ää, 1% (v /v) PS (4 ml). 24 tunnin kuluttua viljelyn jälkeen viljelmät käsiteltiin DSC tai ajoneuvon hallinnan, kuten on kuvattu aikaisemmin. Kolmella ja kuusi päivää ajankohtina, imettiin ja solut vapautettiin trypsiinillä (250 ui). Solut pelletoitiin, sitten uudelleen 500 ui T välineellä. 50 ui 0,4% (w /v) liuosta, jossa oli trypaanisinistä puskuroidussa isotonisessa suola- liuosta lisättiin kuhunkin näytteeseen. Kokonaismäärä valkoinen (live) ja sinisen (kuolleet) solut määritettiin laskemalla hemosytometrillä. Prosenttiosuus elävien solujen määritettiin tästä datasta.

Tilastollinen analyysi

Error kalterit kaikki luvut näyttämään standardin keskivirhe (SEM). Merkittävyys määritettiin Studentin kaksi näytettä kaksitahoiset t-testit p 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Invadopodia ja Cluster Formation 3D HA hydrogeelit

Invadopodia ja klusterin muodostuminen vastaus motogenic tekijöistä.

Alkukokeissa, arvioimme C4-2 solujen morfologia HA hydrogeelin soluviljelmä järjestelmä määrittää, jos erot voitiin nähdä vastauksena FBS käytetään motogenic tekijä edistää liikkuvuutta. Ohjaus viljelmiä käsiteltiin TCM ™, kasvipohjainen seerumin korvaavan ylläpitää solujen kasvun ja kannattavuuden ilman kyky edistää hyökkäyksen ja muuttoliike. Vaikka TCM ™ käsitelty C4-2 solut osoittivat alempaa metabolinen teho verrattuna FBS, arvioi WST määrityksessä ei ollut merkitsevää eroa arvioidun solumäärä soluille kasvaa joko kunnossa joko kolme tai kuusi päivää ajankohtina (katso taulukko S1). Havaitsimme myös määrällisesti morfologia eroja solujen näissä geelit mittana soluinvaasiota potentiaalia ja muuttoliike kyky.

Kuten kuviossa 1A, sekä kolme ja kuusi päivää ajankohtina, TCM ™ käsitelty C4-2 kulttuureissa osoittivat pienempiä, hyvin määritelty soluklusterien enimmäkseen vailla invasiivisia soluprosesseihin (invadopodia). Sen sijaan FBS-käsitellyissä viljelmissä osoitti suuremman solun klustereiden joka ilmestyi epätasaisempi kunnossa. Merkillistä, FBS käsitelty klusterit olivat säännöllisesti nähtävä sulautuvat yhteen ja näytetään huomattava määrä selvästi havaittavissa invadopodia kussakin aikapisteessä. Insertti kuvion 1A näyttää suurennetun Näiden invadopodia rakenteita. Solun klustereiden esiintyi suurempi kuuden päivän jälkeen yli kolmen päivän jälkeen kussakin käsittelyssä, mutta määrä invadopodia oli suhteellisen vakio välillä ajankohtina.

Kuvia C4-2-soluja viljeltiin kolme tai kuusi päivää joko 2 % TCM ™ (kontrolli) tai 5% FBS (motogenic tekijä) HA hydrogeeliin invaasiomääritys. Arrow ja upotettavat esittävät suurennettuna kuvan paremmin näkyviin invadopodia. Musta asteikko pylväät edustavat 200 pm, valkoinen asteikko bar upotettavat edustaa 50 um (A). Kvantifiointi varten keskimäärin invadopodia (B) tai prosentti sulautuvan klustereiden (C) kussakin mittausta kenttään. Virhepalkit = SEM, n = 3, *** p 0,001.

kvantifiointi määrä invadopodia kävi ilmi, että monet näistä rakenteista oli merkitsevästi korkeampi (p 0,0001) ja FBS kohtelun kuin TCM ™ periaatteita sekä kolme ja kuusi päivää ajankohtina (kuvio 1 B). Määrä invadopodia ei lisääntynyt joko hoidon välillä ajankohtina. Kvantifiointi yhdistämistä klusterin prosenttiosuus osoitti FBS käsitelty C4-2 soluklusterien olivat todennäköisemmin sulautuvat verrattuna TCM ™ käsiteltyjä soluja sekä kolme ja kuusi päivää ajankohtina (kuvio 1 C).