Krooninen sairaus

tiivistelmä

Organotyyppisiä, kolmiulotteinen (3D) soluviljelymalleissa epiteelituumori tyyppejä, kuten eturauhassyövän kerrata keskeisiä näkökohtia arkkitehtuurin ja histologia kiinteiden syöpien. Morfometrisiin analyysi monisoluisten 3D organoids on erityisen tärkeää silloin, kun muita komponentteja, kuten soluväliaineen ja kasvaimen mikroympäristössä, sisältyvät malliin. Monimutkaisuus Tällaisten mallien on toistaiseksi rajallinen niiden onnistuneen toteuttamisen. On olemassa suuri tarve automaattinen, tarkka ja vakaa kuva segmentointityökaluja analysoinnin helpottamiseksi tällaisten biologisesti relevantti 3D soluviljelymalleissa. Esitämme segmentointi perustuva menetelmä Markov random kentät (MRFs) ja kuvaavat meidän menetelmää käytetään 3D-pino kuvadatan organotyyppisen 3D-malli eturauhassyöpäsolujen viljeltiin yhdessä syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisien). 3D segmentointi lähtö viittaa siihen, että nämä solutyypit ovat fyysisessä kosketuksessa toisiinsa mallin sisällä, mikä vaikuttaa merkittävästi tuumoribiologiassa. Segmentointi suorituskyky kvantifioidaan maahan totuus etiketit ja osoitamme, miten kukin vaihe menetelmämme kasvaa segmentointia tarkkuutta. Tarjoamme kentällä totuus tarrat yhdessä kuvadatan ja koodin. Käyttämällä itsenäinen kuvadatan osoitamme, että meidän segmentointi menetelmä on myös yleisemminkin sovellettavissa muunlaisiin solujen mikroskopia ja ei rajoitu vain fluoresenssimikroskopiaan.

Citation: Robinson S, Guyon L, Nevalainen J, Toriseva M, Åkerfeltin M, Nees M (2015) segmentointi Kuva tiedot Complex Organotyyppisiä 3D mallit Cancer kudokset Markovin Random Fields. PLoS ONE 10 (12): e0143798. doi: 10,1371 /journal.pone.0143798

Leikkaus: Olivier de Wever, Gentin yliopisto, BELGIA

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2015 Hyväksytty: 10 marraskuu 2015; Julkaistu: 02 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Robinson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: VTT Oy on voittoa, täysin valtion omistuksessa tutkimuslaitos, joka virallisesti onnistuu edellisen organisaatio, joka perustettiin vuonna 1942, joka tunnettiin aiemmin nimellä valtion Teknillinen Tutkimuskeskus tai VTT (National Technical Research Centre of Suomi). VTT Oy perustettiin vuonna 01.1.2015 ja ylläpitää rakenne laajamittainen tutkimuslaitos. Tutkimus kuvattu tässä yksinomaan teoreettiselta, jotka eivät liity millään tavalla kaupallisia tuotteita, palveluita tai jatkuva sopimus tutkimus kolmansien osapuolten kanssa suoritettiin VTT Oy. Tätä työtä tukivat Suomen Akatemia myöntää numerot 284619 (M A) ja 267326 (MN). SR on edunsaaja CEA-teollisuus thesis sopimus ja VTT tutkielma sopimus. VTT tuettiin muodossa palkkojen tekijöille SR, MA, ja MN, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. MT on toiminut ulkoisena tutkijan sidoksissa VTT kautta tutkimusryhmä (johtama MN). Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet tekijän maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa liittyvät niiden kuuluminen VTT. Tämä kuuluminen ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Cellular prosessit luontaisesti esiintyvät kolmiulotteisesti (3D) ja solut tyypillisesti upotettu soluväliaineen , joka on keskeinen osa solujen microenvironment. Niinpä fysiologisesti relevantti soluviljelymalleissa yhä suunniteltu 3D muodoissa upotettu soluväliaineen kaapata monimutkaisia ​​kudosmainen biologian uskollisem- [1]. Kiinteä kasvain edustaa häiriintynyt ja monimutkainen kudos on oma ominainen kudos homeostaasiin ja ympäröivä kasvain microenvironment. Syöpäsolujen plastisuus ja tärkeitä ominaisuuksia, kuten erilaistumista versus kasvainsolun invaasiota vaikuttavat voimakkaasti kasvain microenvironment. Yhteenvetona ominaisuuksia kiinteiden kasvainten

in vitro

vaatii soluun perustuvissa määrityksissä, jotka samanaikaisesti jäljittelevät soluväliaineen ja kasvaimen mikroympäristössä, homeotypic ja heterotyyppisten solu-solu kontakteja, ja sallimaan asiaankuuluvien soluväliainekonstruktissa vuorovaikutuksia. Organotyyppisiä 3D soluviljelytekniikoilla muodostavat tällä hetkellä biologisesti relevantti

in vitro

malleja tutkinnan epiteelin syövän erilaistumista, polarisaatio ja hyökkäys [1-3]. Kuitenkin ei ole riittäviä mikroskopia kuva-analyysi menetelmiä on tähän mennessä rajoittunut onnistunut toteuttaminen ja tulkinta tällaisia ​​malleja.

lisäksi syöpäsolujen, eri stroomasoluista edustavat kriittisin komponentti kasvain microenvironment. Syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin) ovat runsain stroomasolujen tyyppi useimmissa karsinoomia ja niillä on tärkeä rooli syövän etenemistä [4-6]. Valuuttalisiin tarjoavat siis tärkeä kohde syövän hoitomuotoja. Vuorovaikutus kasvainsolujen ja valuuttalisiin on edelleen huonosti ja luotettavampia ja kestävä soluviljelymalleissa että parempi kerrata monimutkainen histologia

in vivo

kasvaimia täytyy tutkia kasvaimeen stroomavuorovaikutuksiin.

katsomme, monikanavainen 3D-pinon kuvadatan monimutkainen organotyyppinen 3D-soluviljelmässä malli eturauhassyövän kasvainsoluja viljeltiin yhdessä valuuttalisien. 3D-soluviljelymalli ja vantamismenetelmää liittyy monisoluisten tasolle, jossa yleinen ominaisuuksia kasvaimen organoids ja CAF rakenteet ovat kriittisempiä kuin syömällä yksittäisiä soluja tai solujen tumiin. Hankittu suhteellisen suuri etäisyys kuvia pinossa, resoluutiota kuvadatan kuvan sisällä oli jopa 20 kertaa parempi tarkkuus kuvien välillä pinossa.

Terveet eturauhaskudoksiin muodostuvat acini, jotka ovat ontto klustereita soluja, jotka muodostavat pienin toiminnallisia sekretorisen rauhanen. Alkuvaiheen eturauhassyöpä nämä acini alkaa tankata premaligneja tai pahanlaatuisten solujen tulla kiinteitä pallosia. Muoto ja koko monisoluisten organoids sisältää arvokasta morfometrisiin tiedot [7] ja kiinnostuksemme piilee monisoluisten kasvain ja CAF rakenteita erillisinä informatiivinen esineitä. Segmentointi sekä monisoluisten kasvain ja CAF rakenteissa on ensimmäinen askel tutkinnassa, missä muodossa ja skaalata nämä solutyypit voidaan muodostaen suoran solu-solu kontakteja. Siksi tavoitteenamme on tuottaa automaattinen segmentointi molempien kohteiden olematta etukäteen muototietoihin tai harkitsee yksittäisten solujen.

Automatisoitu konenäön tyypillisesti mahdollistaa paljon suuremman tehokkuuden ja objektiivisuus kuin manuaalinen ihmisen analyysi [8]. Segmentointi ja tunnistaminen osat kuvassa, jotka kiinnostavat on ensimmäinen askel monissa konenäkösovelluksia. Yksinkertaiset kynnystykseen menetelmät muodostavat perustan monet tyypilliset segmentointi menetelmien [9]. Suosittu ilmainen kuva-analyysi alustoilla kuten Cell Profiler [10] ja ImageJ /Fidžin [11] käytännön toteutukset tällaisen segmentoinnin menetelmiä suunniteltu erityisesti solujen mikroskopiaan tietojen ja mahdollistaa analyysin jälkeen segmentointi erikoistuneissa putkistot erityisesti tietokokonaisuuksien. Kuitenkin tällainen analyysi on tyypillisesti keskittynyt korkean resoluution mikroskoopilla dataa yksittäinen solu tai jopa solukomponenttien tasolla ja on myös keskitytty pääasiassa kaksiulotteinen (2D) yksikerroksinen soluviljelmissä, vaikka 3D-volyymin katselu ja renderöinti on mahdollista ImageJ. Kaupalliset ohjelmistoja, jotka keskittyvät 3D solujen mikroskopia kuva-analyysi kuten Imaris (Bitplane) ja Volocity (PerkinElmer) on suunniteltu erittäin yksityiskohtaisen analyysin korkean resoluution kuvia yksittäisen solutasolla, jossa voi olla niinkin pieni kuin 0,5

μ

m kuvien välillä 3D-pinossa. Erityistarpeet kuvadatan meidän monimutkaisia ​​3D soluviljelymalli, että monikanavainen 3D kuvadatan joissa on suuria etäisyyksiä kuvien välillä 3D-pinon, edellyttävät syvällistä manipulointi segmentointi menetelmän, joka ei ole saatavilla näiden alustojen.

Markov random kentät (MRFs) käytetään konenäön monilla eri aloilla ja laaja ongelmia [12]. Tällaiset mallit ovat suosittuja, koska Markovin ”naapuri” rakenne mahdollistaa paikkatietojen suhteet pikselien otettava huomioon, kun vielä laskennallisesti toteuttamiskelpoinen. Solujen mikroskopia kuvadatan, MRF perustuvia menetelmiä on sovellettu tutkia yksittäisten solujen [13, 14], luokittelu [15], liikkeentunnistus [16], kuva restaurointi ja dekonvoluutio [17, 18], ja tunnistaminen mitoosia [19, 20]. MRFs on myös laajalti käytetty kuvan segmentointia laajasti monilla aloilla, ja monet ”luonnollinen kuva” (non-mikroskopia) sovelluksiin [21]. Sillä

in vivo

solujen mikroskopian kuvat, MRFs on käytetty segmentointia tietyissä histologia sovelluksissa [22, 23] ja segmentoida erityispiirteet, kuten verisuonten [24]. Niitä on käytetty

in vitro

solujen mikroskopia kuvat segmentin yksittäisten solutumien [25] kuten käyttämällä erityistä ytimet muoto ennen [26, 27]. MRF perustuva menetelmä on myös käytetty segmentointi ja luokittelu solukomponenttien rakenteet yksittäisten solujen [28].

Toteutamme 3D segmentointi perustuva menetelmä MRFs ja osoittaa, että se toimii tarkasti kuvadatan monimutkainen organotypic 3D-malleja eturauhassyöpää. Vahvuuksia segmentointi menetelmän osoitettava käyttämällä erilaisia, mutta läheistä sukua kokeellisen kuvadatan ja määrällisesti verrataan muihin segmentointimenetelmät käytetään maahan totuus tarroja. Osoitamme, että MRF perustuva menetelmä tarkasti kaappaa biologisesti relevantteja, mutta usein ohuempi ja heikompi ominaisuuksia, kuten monimutkaiset CAF rakenteita ja ero kasvaimen versus strooman solujen 3D ympäristössä. Samalla osoitetaan, että segmentointi menetelmä on yleisesti sovellettavissa muihin solun mikroskopia kuvadatan ja ei rajoitu vain fluoresenssimikroskopiaan.

Materiaalit ja menetelmät

Cellular mikroskopia kuvadatan

Käytämme 3D pino konfokaalimikroskopia kuvadatan kolmesta eri mutta läheistä sukua organotyyppisiä 3D soluviljelymalleissa, jota me kutsumme nimellä ”IF kuvadatan”, The ’LIVE kuvadatan ”ja” FAK kuvadatan ”. Täydelliset tiedot kokeellisen ja kuvantamisen protokollat ​​on aiemmin julkaistu [29] ja lyhyesti kuvattu alla. Kaikki 3D kasana kuvia sekä IF ja LIVE kuvan tietoja manuaalisesti pirstaleiset biologit suorittaneen kokeita. Käsikirja segmentointi tehtiin Adobe Photoshop (Adobe Systems) ja johti kunkin pikselin annetaan kentällä totuus etiketissä joko ”tarkennettu tuumorisoluissa ’,’ in focus valuuttalisiin” tai ”epätarkka /tausta”. Nämä maa totuus tarrat käytetään validoineen segmentointimenetelmää.

Kaupallisesti saatavilla soluväliaineen valmisteita (kasvutekijä-vähennetty matrigeeliä kanssa kantakonsentraatiolla 8 mg /ml ja tyypin I kollageenin kanssa varastossa 3 mg /ml) hankittiin BD Invitrogen ja sitä käytetään kaikkiin 3D co-kulttuuri kokeissa. 25% tai 50% laimennoksena Matrigel käytettiin ja 1: 1 molempia valmisteita käytettiin rutiininomaisesti (2-4 mg /ml matrigeeliä, 1,5 mg /ml kollageenia). Sekä kasvaimen ja strooman solut ympättiin, kuten yhden solun suspensiot, alkuvaiheen tiheydet 700-1500 solua /kuoppa. 3D co-viljelmät valmistettiin käyttäen ”sandwich” periaatetta, jonka mukaan kaikki solut, mukaan lukien peruskudoskomponentit ympättiin samalla tasomaisen kerroksen helpottamiseksi kuvantamisen. Näissä tiloissa, aluksi kylvö tiheys oli noin 1800 solua /cm

2.

IF 3D rinnakkaisviljelmätilanteessa, LNCaP eturauhas- syöpäsolujen [30] oli viljeltiin yhdessä PF179T valuuttalisiin eristetty eturauhassyöpä potilas [31], on aluksi solun kylvö suhteessa 1: 2 soluväliaineen. Sen jälkeen, kun 14 päivää viljelyn, solut kiinnitettiin ja epäsuoralla immunofluoresenssilla värjäys suoritettiin. Spesifistä vasta-ainetta pan-keratiini käytettiin spesifisen värjäytymisen kasvaimen organoids, kun taas valuuttalisiin värjättiin vasta-aineen ihmisen vimentiinista. CAF-solut lopulta sulautetaan suuri monisoluisten rakenteita, jotka tyypillisesti ympäröivän kehän kasvaimen organoids.

LIVE 3D rinnakkaisviljelmätilanteessa, muunnelmia saman solujen IF-kuvadatan asetettu käytettiin. Tässä kokeessa LNCaP ilmentävien kasvainsolujen DsRed proteiinia olivat viljeltiin yhdessä PF179T valuuttalisiin ilmentävät GFP. Samat koeolosuhteissa, soluväliaineen tiivisteet ja muut asetukset kuten edellä käytettiin. Muodostumiseen, kasvua, erilaistumista ja morfogeneesiä kasvaimen organoids, sekä muodostumista monisoluisten rakenteita yhden valuuttalisiin seurattiin ajan 14 päivää, jonka jälkeen kuvantaminen suoritetaan. FAK 3D rinnakkaisviljelmätilanteessa oli sama kuin LIVE asetusta lisäämällä fokaalisen adheesion kinaasin (FAK) estäjät Y11 ja PF-573228 ostetaan Tocris Bioscience. Kolme olosuhteet olivat: DMSO ohjaus (0,01%), 5

μ

M pitoisuus Y11 ja 5

μ

M pitoisuus PF-573228.

Monikanavainen 3D konfokaali digitaalinen kuvat on hankittu, jossa kasvainsolut ja valuuttalisiin oli kuvattu erikseen. Molemmat solutyypit esitetään jäljempänä eri (false) värikanavaa: punainen kasvainsolujen ja vihreä valuuttalisien. IF ja LIVE kuvadatan hankittiin Zeiss Axiovert-200M mikroskooppi, jossa on Yokogawa CSU22 spinning-levy konfokaali yksikkö käyttäen Zeiss Plan-Neofluar 20 × tavoite (numeerinen aukko 0,17). IF kuvadata koostuu 8 pinoja kuvia niin kauan kuin LIVE kuvadatan koostuvat 12 kasana kuvia. Jokainen kuva on ulottuvuus 512 x 672 pikseliä ja kuvien määrä yhdessä pinossa vaihtelee 9: stä 22 Sillä kaikki kuvat molemmista aineistoja, yksi pikseli ≈ 0,5

μ

m sisällä kuvan ja etäisyys vierekkäisten kuvien pinossa on 10

μ

m. FAK kuvatiedot hankittiin samalla mikroskoopilla asetuksia käyttäen Zeiss Plan-Neofluar 5 x tavoite (numeerinen aukko 0,16) ja koostuvat 24 kasana kuvia (8 kunkin kunnossa). Yksi pikseli ≈ 2,5

μ

m sisällä kuvan ja etäisyys vierekkäisten kuvien pinon on 40

μ

m. Jokainen kuva on ulottuvuus 512 x 672 pikseliä ja kuvien määrä yhdessä pinossa on 18.

riippumaton, niin monimutkaisia ​​2D kuvadatan sarja (BBBC003v1) järjestetty Broad Bioimage Benchmark Collection [32] on myös käytetään segmentointia validointi. Aineisto koostuu 15 kuvaa yhden monisoluisten hiiren alkioiden, joista kukin on 640 x 480 pikselin harmaasävy kuva otettua ero häiriöitä kontrasti mikroskopia ja jossa on hiottu totuus segmentointia koko alkion rakennetta. Olemme lisäksi harkita segmentointi suorituskykyä 2D vaihekontrasti ”Melanooma” ja ”Tscratch” kuvadatan (BBBC019), myös laajojen Bioimage Benchmark Collection. Melanooma kuvadata koostuvat 20 kuvaa kullakin on mitta 1024 1280 pikseliä, kun Tscratch kuvadatan koostuvat 24 kuvaa jokaisella on ulottuvuus 1028 × 1384 pikseliä. Molemmat aineistoja ovat ”haavan paranemista” kokeilee kentällä totuus segmentointeja myös.

segmentointi menetelmän

Sisällä Markov satunnaiskentän (MRF) puitteissa, kunkin pikselin digitaalisen kuvan annetaan label joidenkin ennalta asetettu (klassisesti ’etualalla ”ja” tausta ”varten segmentointi). Huomaamme merkinnöissä joka optimoi vastaava energia toimii niin, että etiketti kunkin pikselin vastaa havaittua pikselin arvoa ja siten, että siellä on ”tasainen” merkintöjä koko kuva. Jokaista pikseli

i

digitaalisessa kuvan, anna

X

i

ja

Z

i

olla satunnaismuuttujat pikselin etiketti (havaitsematon) ja pikselin intensiteetti (havaittu) vastaavasti. Olkoon kokoelma satunnaismuuttujia kaikkien pikselien on ehdollinen riippumattomuus kuvaaja esitetään kuvassa 1. Tällöin kokoelma satunnaismuuttujia on ehdollinen MRF vastaavien energiafunktio (1) pikseleitä

i

ja vierekkäisten kuvapisteiden (

i

,

j

) tunnisteilla

l

ja

k

, ja jossa

I

on osoitinmuuttujan, ( 2)

Huomaamme pienin energiamerkintöjä (segmentointi) B

unaari potentiaalit

u

i

;

l

määritellään olevan (3), jossa

z

i

on havaittu pikseliarvo ja π

l

on todennäköisyys tiheys vastaava funktio merkitä

l

. Pareittain potentiaalit

w

ij

;

lk

määritellään olevan (4), jossa

z

i

ja

z

j

ovat havaitut pikseliarvot,

λ

0,

λ

1 ja

β

ovat parametreja voidaan asettaa, ja dist (

i

,

j

) on etäisyys pikselien

i

ja

j

. Huomaa, että etäisyys voi olla erilainen naapuripikseleistä sisällä kuvan verrattuna naapuripikseleistä kuvien välillä tarkkuudesta riippuen kuvadatan kussakin ulottuvuus.

kärkipisteet ja reunoja ehdollisen itsenäisyyden kuvaajan koodaavat ehdollisen itsenäisyyden ominaisuudet vastaavan joukko satunnaisia ​​muuttujia. Vuonna ehdollinen MRF kuvaaja (kuvio 1), joka reuna vastaa joko unaari (

X

i

,

Z

i

) tai pareittain (

X

i

,

X

⋅) potentiaalia vastaavaan energiafunktio Eq (1). Kuvio 1 esittää 6-naapuri ehdollinen MRF (6 pareittain potentiaalit kunkin pikselin), jota käytämme meidän 3D segmentointimenetelmää. Jokainen pikseli on 4 naapureita kuvan sisällä ja 2 naapurit kuvien välillä 3D-pinon, jossa on vähemmän naapureita pikseleitä rajoilla pinon.

unaari ja pareittain potentiaalit luoda vastaavuus ja ”sileys” on yleinen pikselin merkinnät vastaavasti. Parametrit

λ

0,

λ

1 ja

β

määrän määrittämiseksi vaikutus, että pareittain potentiaalit ovat vuosien unaarinen potentiaalit minimointia energia-toiminto (1). Kompromissien on, että vaadimme leimaamisen ”sileä” vierekkäisellä segmentoidut alueet (viereiset pikseliä on sama merkki), mutta haluavat myös säilyttää epäjatkuvuuksia läsnä kuva (S1 Kuva). Muoto unaarinen ja pareittain mahdollisuuksia on standardi MRF segmentointia ongelma [33]. Mahdollisuudet täyttävät Saharan modulaarisuus ehto, joka taataan, että vähintään energian ratkaisu binary etiketti asia ja mahdollistaa approksimaatio vähimmäisenergia ratkaisu usean etiketin tapauksessa [34].

Jotta asettaa unaarinen potentiaalien Eq (3) vaadimme tiheysfunktio π

l

yli pikseliarvojen vastaavat kukin tarra

l

. Standardi tapa on palkata ”interaktiivinen segmentointia” -menettelyn ja on käyttäjän manuaalisesti ”siemenet” alueiden kuva kunkin tarran [33]. Sitten empiirinen jakaumat ympätty alueita käytetään laskettaessa unary potentiaaleja. Sen sijaan, että käsin kylvö kuvan, me asentaa muuttujan Gaussin seos malli kolmen komponentin tiheyteen havaitun pikseliarvojen punainen ja vihreä kanavia erikseen. Tiheydet käytetään segmentointia etiketit sitten kaksimuuttujainen seokset yhden muuttujan komponenttien hankittu kussakin värikanavan (kuvio 2).

Kolme etiketit ovat: ”In focus” kasvainsolujen seoksella ”epätarkka ”valuuttalisiin ja” tausta ”muissa mitta (punainen),” terävä ”valuuttalisiin seoksella” epätarkka ”kasvainsolujen ja” tausta ”muissa mitta (vihreä) ja sekoitus” epätarkka ” ja ”tausta” molempiin suuntiin (katkoviiva).

parametrit

λ

0,

λ

1 ja

β

asetetaan perustuvat jakaumat unaarinen potentiaalien tasapainottaa kompromisseja kirjeenvaihto ja tasaisuuden että segmentointi lähdön. Vaikka on olemassa menetelmiä oppimisen näitä parametreja käyttäen koulutus joukko kentällä totuus leimatun kuvadatan, nämä menetelmät ovat erittäin laskennallisesti kalliita, joten ei useinkaan käytännössä hyödyntää [35]. Lisäksi maa totuus merkinnät on harvoin saatavilla useimmissa sovelluksissa. Kunkin pinon kuvien me setandso että unaarinen ja pareittain potentiaalit jakavat samaa luokkaa. Arvo

β

asetetaan manuaalisesti ehdokasta pino kuvien ja samaa arvoa käytetään kaikkien muiden pinot samassa kokeessa.

Koska esikäsittelyvaiheissa, käytämme paikallinen entropia suodatin [9] määrällisesti paikallisen koostumus (sisäänrakennettu toiminto entropyfilt MATLAB Image Processing Toolbox). Paikallinen entropia suodinta käytetään sekä punainen ja vihreä kanavia erikseen. Raaka harmaasävykuvia ovat alas-näytteitä 8-bittinen, jotta jokainen pikseli vastaa suoraan intensiteetti arvon joukossa {0, 1, …, 255}. Kunkin pikselin

i

, paikallinen entropia suodatettu arvo iswhere

p

j

on osuus pikselien naapurustossa joka on yhtäläiset intensiteetti pikselin

j

. Naapurustossa kunkin pikselin

i

on 9 x 9 neliön keskitetty pikselin

i

inclusive symmetrinen padding noin rajalla kuvan.

3D segmentointi menetelmä on yhteenvetona seuraavat vaiheet (kuvio 3):

Process 3D pino kuvia käytetään paikallista entropiaa suodatin punaista (kasvainsoluja) ja vihreät (valuuttalisiin) kanavia erikseen,

Fit univariate Gaussian seoksen malleja suodatettuja pikseliarvojen punainen (kasvainsoluja) ja vihreät (valuuttalisiin) kanavia erikseen,

Yhdistä seos tiheydet (kuvio 2) ja laskea unaarinen ja pareittain potentiaalit,

Etsi pienin energiamerkinnän.

Konfokaalimikroskopia käytetään kuva 3D yhdessä viljelemisen malleissa tuloksena on 3D-pino kuvia. 3D-segmentointi on menetelty 3D pino aiheuttamaa 3D segmentointi tuotoksen.

Toteutimme segmentointimenetelmää MATLAB ja käyttää

α

-expansion algoritmi löytää vähintään energiamerkinnät [34, 36, 37].

Validation menetelmä

ei yksittäinen työkalu on käytettävissä suorittamaan tarvittava segmentointi minkä tahansa tietojoukon. Kullakin menetelmällä on omat etunsa ja haittansa, ja on usein räätälöity tiettyjä sovelluksia, kuten käyttämällä ennen muototietoihin segmentoitaessa yksittäisiä soluja tai soluytimet [25-27]. Vaikka monia kehittyneitä segmentointi menetelmiä on olemassa, emme ole tietoisia mistään joka sopisi soveltaa 3D-pinon kuvadatan meidän monimutkaisia ​​3D soluviljelymalli. Siksi vertailua varten, käytämme useita standardin segmentointi menetelmiä, joita voidaan pitää ”rakentaa” meidän MRF lähestymistapaan:

intOtsu käyttäminen Otsu menetelmällä [38] kynnys punaisen ja vihreän intensiteetti kanavia erikseen ja yhdistämällä tarrat jotta ”kasvainsolu” tai ”CAF” ylikirjoittaa ”tausta”, tai jos pikseli on merkitty sekä ”kasvainsolu” ja ”CAF” se satunnaistettiin yksi niistä tarroja.

entOtsu Otsun menetelmää kynnys paikalliseen entropian suodatetaan punainen ja vihreä kanavia erikseen ja yhdistämällä tarrat käyttämällä samaa menettelyä kuin edellä.

seoksia kynnystykseen paikallisen entropian suodatettu kuvien bivariate seosta tiheydet (kuvio 2).

MRF menetelmä esitetään tässä paperissa.

Otsu menetelmä löytää maailmanlaajuinen kynnys, joka maksimoi muun luokan varianssi tuloksena ryhmiä ja on laajalti käytetty tekniikka perus greyscale kuvan segmentointia [ ,,,0],9]. Seosta mallit ovat itse myös laajalti käytetty monissa kuvan segmentointia sovelluksia [39]. Koska bivariate seoksia käytetään laskemiseen unaarinen potentiaalit meidän MRF pohjainen segmentointi menetelmän ”seoksia” menetelmä vastaa MRF menetelmä esitetään tässä paperi

λ

0 =

λ

1 = 0.

ulostulo neljän segmentointimenetelmät verrataan maahan totuus tarrat yleistä makro F

1-pisteet, harmonisen keskiarvon luokittelun tarkkuutta ja muistuttaa [40]. Siksi F

1-pisteet = 1 täydellinen merkintöjä. IF ja LIVE kuvadatan sekä itsenäisen hiiren alkion kuvadatan käytetään validointi.

Tulokset ja keskustelu

Esitämme joukon tuloksia, jotta keskustella hyödyt MRF tekniikkaan perustuva menetelmä meidän erityisen monimutkaisten biologisten sovellus, erityisesti monikanavaisten 3D-kuvadatan suuret etäisyydet kuvia pinossa. Käyttämällä 3D-segmentointi lähtö, on mahdollista tutkia, jos kasvainsolujen valuuttalisiin ovat muodostavat solu-solu-kontaktien tai fyysisesti erotetaan 3D-yhteisviljelmässä malli, joka on tärkeä vaikutusta kasvaimen biologiaan. Olemme lisäksi osoitettava hyödyllisyyttä paikallisen entropian suodatin ja että MRF lähestymistapa saa tarkimmat segmentointi tuloksia. Koodi meidän segmentointi menetelmän, kuvadatan ja maa totuus etiketit ovat säädetty oheismateriaalina (S1, S2 ja S3 Files).

segmentointi lähtö ehdottaa fyysinen kontakti monisoluisten kasvain ja CAF rakenteet

ulostulo 3D-segmentointi menetelmää voidaan käyttää tutkia, monisoluisten kasvain organoids ja CAF rakenteet ovat suorassa kosketuksessa.

Käyttämällä konfokaalimikroskopia kuvan 3D soluviljelmissä johtaa 3D-pino kuvia, jotka vastaavat että sarja yhdensuuntaisia ​​polttotasojen. Enintään intensiteetin projektio saadaan ulkonevat enimmäisvoimakkuudesta pikseliarvot osaksi (

x

,

y

) tasossa. Vaikka merkittävä määrä tietoja voidaan menettää, mahdollisen 2D kuva-analyysi on paljon kehittyneempi ja vähemmän laskennallisesti kalliita kuin ottaen koko 3D-pinon kuvia. Näistä syistä nykyinen kuva-analyysi puitteet 3D soluviljelymalleissa eturauhassyövän perustuvat enimmäisvoimakkuutta ennusteisiin [41, 42]. Vaikka enimmäisvoimakkuutta ennusteet voivat soveltua analysoida monokulttuurin malleja tietyissä sovelluksissa, ne eivät sovellu käytettäviksi monimutkaisempia organotypic malleja kuten co-kulttuuri malleja. Koska kaikki rakenteelliset tiedot heijastetaan (

x

,

y

) kone, ei olisi mahdollista määritellä, kasvain organoids ja valuuttalisiin ovat suorassa kosketuksessa tai fyysisesti erillään käyttämällä 2D analyysi .

Kuva 4 (a) esittää enimmäisintensiteetillä projektio sekä punainen ja vihreä kanavia (false väri) on esimerkki 3D pino. On edelleen epäselvää, Keski kasvain ja CAF rakenteet ovat suoraan yhteydessä. CAF rakenteet näyttävät sijaita kasvain rakenteeseen (sininen nuoli), joka on biologisesti merkityksetön. Kliinisissä kasvain näytteissä, fibroblastit eivät tyypillisesti sisällä kasvain organoids, mutta tyypillisesti vain surround epiteelin (kasvain) aggregaatit. Vain satunnaisesti, valuuttalisiin voi joutua kosketuksiin kasvainsolujen pinnalla kasvaimen rakenteita.

(a) maksimi-intensiteetin projektio edustavan 3D pino. (B) – (d) eri näkökulmia vastaavaan 3D segmentointi ulostulo käyttämällä MRF perustuvan menetelmän. Sininen nuoli osoittaa missä valuuttalisiin näyttävät olevan sisällä kasvain organoidikappaleen että maksimi-intensiteetin projektio, mutta voidaan nähdä olevan ulkona 3D segmentointi lähdön. Katso S1 Video video 3D segmentointia lähdön.

3D segmentointi kasvainsolujen (punainen) ja valuuttalisiin (vihreä) on esitetty kuviossa 4 (b) ja 4 (d). Segmentointi lähtö korostetaan erityisesti niille segmentoitu vastaavia alueita CAF rakenteita, jotka ovat suorassa kosketuksessa segmentoitujen alueiden vastaavat monisoluisten kasvain rakenteeseen. Erityisesti valuuttalisiin joka näytti sisäpuolella kasvain rakenne maksimi-intensiteetin projektio (kuvio 4 (a)) voidaan nyt nähdä olevan ulkona, mutta joutuessaan molemmin puolin Keski kasvaimen organoidikappaleen (sininen nuoli). S1 Video tarjoaa lisää näkökulmia 3D segmentointia.

3d renderoidut segmentointi lähtö (kuvio 4 (b) ja 4 (d)) näyttää pikemminkin ”kulmikasta”, varsinkin

z

jossa kasvain organoidikappaleen on ”flat top”. Tämä on ominaisuus kuvadatan ja johtuu suhteellisesta niukkuus olevien tietojen

z

. Se ei olisi asianmukaista yleistää tekee siten, että kasvain organoids näyttää enemmän pyöreän palloset ”3D koska se mahdollisesti sekoitti merkittäviä rakenteellisia tietoja, ja se ei tue resoluutiota kuvadatan.

on mahdollista itse tunnistaa, jos ja joka segmentoida CAF alueet ovat suorassa kosketuksessa segmentoitu kasvain organoids visualisointiin edellyttäen meidän 3D segmentointia ulostulo. Osoittaakseen proof of concept of automaattisesti määrällisesti kasvain-strooman kosketukseen segmentointi tuotos, pidämme FAK kuvadatan (S2 Kuva). Meidän MRF segmentointi, katsomme, että kosketus ”kasvainsolujen” ja ”valuuttalisiin ’segmentoidut alueet antavat arvion kasvaimeen strooman kontakti mallissa.

Kuvio 5 esittää sirontakuvaajiin kokonaisvolyymista , kokonaispinta-ala ja kokonaiskosketusajan varten segmentoitua ”kasvainsolut” ja ”valuuttalisiin” alueiden FAK kuvadatan. Kokonaistilavuus on kokonaislukumäärä merkitty pikseleitä, kokonaispinta-ala on kokonaislukumäärä merkitty pikselien vieressä pikselin toisella etiketillä ja kokonaiskosketusajan on kokonaismäärä merkitty ”kasvainsolujen” ja ”valuuttalisiin” pikseleitä, jotka ovat vierekkäin. Kokonaistilavuus ja kokonaispinta-ala sekä kasvaimen organoids ja CAF rakenteet ovat yleensä pienempiä, kun FAK inhibition (kuvio 5 (a) ja 5 (b)), ja tämä vastaa aikaisempia tutkimuksia [29]. DMSO ohjaus näyttää perustason kasvaimeen stroman kontakti (kuvio 5 (c)) ja FAK inhibiittorit selvästi häiritä tätä yhteyttä. Kun estäjä Y11, näyttää olevan vähemmän kontakti keskimäärin kuitenkin kontakti on myös vaihtelevampi. On kaksi kuvapinot joilla on korkeammat kokonaistilavuus, pinta-ala ja yhteystiedot erityisesti (merkitty sinisellä tähdellä S2 kuvassa). On selvää, että PF-573228 estää kasvaimen organoidikappaleen kasvua (kuvio 5 (a) ja 5 (b)) ja siten on olemassa muutamia fyysisiä yhteyksiä kahden solutyyppien (kuvio 5 (c)). Kruskal-Wallisin testi suoritettiin yhteensä yhteystiedot (kuvio 5 (c)) ja nollahypoteesin että eri näytteet ovat kaikki toteutukset saman jakelun hylättiin (p-arvo = 2,6 × 10

-4). Vastaavat pareittain vertailut suoritettiin käyttäen Mann-Whitney

U

testi.