Krooninen sairaus

tiivistelmä

All-trans retinoiinihappo (ATRA) on laajalti tutkittu hoitoja moniin syöpiin kuten eturauhassyöpä .

HOXB13

, vaiennetaan in androgeenireseptorin-negatiivinen (AR

-) eturauhassyövän solut, on rooli AR

– eturauhasen syöpäsolun kasvua pidätys. Tässä tutkimuksessa pyritään valaista niitä, jotka ovat mukana leviämisen estäminen AR

– syöpäsolujen laukaisi ATRA. Huomasimme, että ATRA kykeni indusoimaan kasvun pysähtymisen ja lisätä

HOXB13

ilmaisun AR

– syöpäsolujen. Sekä EZH2 ja DNMT3b osallistui tukahduttamista

HOXB13

ilmaisun epigeneettisestä järjestelyihin DNA ja histoni metylaatio muutoksia. Erityisesti EZH2 palvelukseen DNMT3b osoitteeseen

HOXB13

promoottori muodostaa sorron monimutkainen. Lisäksi ATRA voisi säädellä lisäävästi

HOXB13

vähenemisen kautta EZH2 ja DNMT3b ilmaisuja ja vähentämällä niiden vuorovaikutusta

HOXB13

promoottori. Samanaikaisesti metylointi taso

HOXB13

promoottori väheni, kun hoitoon ATRA. Tämän tutkimuksen tulokset liitetty uusi vaikutus ATRA inhibitioon kasvun AR

– resistentti ihmisen eturauhasen syöpäsolujen merkittävissä

HOXB13

ilmentymisen seurauksena epigenetic muutoksia.

lainaus: Liu Z, Ren G, Shangguan C, Guo L, Dong Z, Li Y et ai. (2012) ATRA estää proliferaatiota ja DU145 syöpäsolujen kautta vähentäminen metylointi taso HOXB13 Gene. PLoS ONE 7 (7): e40943. doi: 10,1371 /journal.pone.0040943

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 13 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (30971613, 31071149, 91019011, 30800557), ja The perustutkimus rahastoja Keski yliopistot (09ZDQD01). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin pahanlaatuinen kasvain miehillä Euroopassa, Pohjois-Amerikassa ja useissa Afrikkalainen maissa [1], [2]. Ilmaantuvuus eturauhasen syöpä on seurausta esimerkiksi väestön ikääntymisen maailmanlaajuisesti [3]. Tällä hetkellä tavanomaisista hoidoista, kuten leikkauksen ja hormonihoito usein ei saavutettaisi tyydyttävää vaikutusta. Lisäksi syöpäsolut voivat hankkia hormoni ja lääkkeille vastustuskykyiset ominaisuudet näissä hoito jännitykset [4]. Toistaiseksi pyrkimyksiä voittaa tämän pahanlaatuinen sairaus on saavutettu vähän menestystä [5]. Niinpä tutkijat, joilla pyritään kehittämään uusia ja tehokkaampia terapeuttisia strategioita eturauhassyövän jää avoimeksi mahdollisuuden.

HOXB13

geeni kuuluu suuri homeobox superperheen, joista monet ovat transkriptiotekijöitä, jotka säännellä aksiaalinen alueellinen erittely alkionkehityksen aikana [6], [7]. Limited ilmaus

HOXB13

havaittiin kaudaalisessa laajuus selkäytimen urogenitaalisinuksesta, ja paksusuolen ja peräsuolen solujen androgeenin riippumattomalla tavalla; mutta se ilmaistaan ​​eturauhasen hämmästyttävällä kudosspesifisyyttä säilyttämään normaalia fysiologista toimintaa ja aiheuttaa terminaalin erilaistumista [8], [9].

HOXB13

vaimentuu in androgeenireseptorin-negatiivinen (AR

-) syöpäsolujen. Jung

et al

. [5] osoitti, että ektooppinen ilmentyminen

HOXB13

Eturauhassyöpätutkimuksessa solulinja indusoi G1 solusyklin pidätyksen kautta negatiiviseen säätelyyn T-solutekijä–4, mutta ei johtanut muutokseen apoptoottisen hintaan. Yliekspressio

HOXB13

AR

– syöpäsolujen johtanut merkittävään solujen kasvun esto [10]. Kuitenkin mekanismi taustalla geenien ei ole täysin ymmärretty. Viime aikoina olemme tutkineet toimintoja Polycomb (PCG) proteiineja ja niiden epigeneettiset toimia vaiennettu

HOXB13

eturauhassyöpäsoluissa, ja totesi, että siellä oli ylikuulumisen välillä histoni asetylaatio ja jäsenten PcG proteiinien tukahduttaa

HOXB13

ilmaisun [11]. Tässä tutkimuksessa olemme lisätodisteita että DNA metyylitransferaaseja (DNMTs) ja PcG proteiineja synergisesti estivät

HOXB13

promoottorin aktiivisuutta.

All-trans retinoiinihappo (ATRA), A-vitamiini metaboliitin, näytelmiä keskeinen rooli kehityksessä säätelemällä solujen prosessit, kuten proliferaatiota, erilaistumista ja muuttoliike [12]. ATRA toteuttaa vaikutuksensa sitoutumalla erityisiä tumareseptorisuperperheen, The retinoiinihapporeseptorien (RAR). RAR-reseptoreja muodostavat heterodimeerin retinoidi X-reseptorin [13]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että hoito leukemiasolujen kanssa ATRA johti apoptoosin, oletettavasti toissijainen erilaistumisprosessia [14], [15]. Koska ATRA voi korjata poikkeava solujen kasvua ja aiheuttaa apoptoosin, se on laajalti tutkittu prekliinisissä ja kliinisissä kokeissa hoitoon monia syöpätyyppejä, mukaan lukien varhainen mahasyövän ja eturauhassyövän [16], [17]. AR

– ja lääkkeille resistentti DU145 eturauhasen syöpäsoluja, ATRA osoitettiin lisäävän solujen herkkyys syöpälääkettä dosetakseli; kuitenkin mekanismeja miten ATRA yksin indusoi solujen kasvun pysähtymisen edelleen epäselviä [18].

PcG proteiinit ovat maailmanlaajuisia repressors geeniekspression muodostamalla Polycomb tukahduttavia kompleksi (PRC), kuten PRC1 ja PRC2 [19]. Useat PcG proteiinit ovat sekaantuneet kasvaimia synnyttävän toimintaan [20]. On ollut merkkejä siitä, että PcG repressorin aktiivisuus kasvoi eturauhassyövän etenemisen [21]. Lisäksi jotkut

PcG

geenituotteita todettiin myös vaaditaan vakaa vaiennettaisi

Hox

geenien koko

Drosophila

kehitys [22]. Enhancer of Zeste homologia 2 (EZH2), katalyyttinen alayksikköä PRC2, hallussaan histoni metyylitransferaasin aktiivisuus histonin 3 lysiinin 27 trimethylation (H3K27me3), jossa vahvistetaan vahva tukahduttava signaalin geenien ilmentymisen [19]. Kävi ilmi, että kohdunulkoinen yliekspressio

EZH2

paitsi stimuloi soluproliferaatiota, mutta myös edistänyt ankkurista riippumaton kasvu ja solujen invaasiota

in vitro

[20]. Sen sijaan, ehtyminen

EZH2

pienet häiritsevät RNA: t (siRNA: t) inhiboivat soluproliferaatiota ja indusoi apoptoosia eturauhasen, rinnan, ja paksusuolen syövän soluja [23], [24], [25].

metylointi DNA on merkittävä epigeneettiset muutos, joka vaikuttaa geenin transkriptio. DNA: n metylaatio nisäkässoluissa on perustettu ja ylläpitää DNMTs. Metylaatio aloitetaan erittäin homologisia DNMT3a ja DNMT3b, ja heritably levittävät DNMT1 [26]. Näistä kolme entsyymiä, säätelyä

DNMT3b

on ominaista monien syöpäsolujen ja DNMT3b voi olla syy rooli tuumorigeneesissä [27]. Tutkimukset hiirimallissa osoitti, että yli-ilmentyminen

DNMT3b

, mutta ei

DNMT3a

, edistetään paksusuolen tuumorigeneesiä

ApcMin /+

hiirillä [28]. Aikaisempi tutkimus osoitti, että ilmentyminen

HOXB13

kontrolloitiin metylointi riippuvaisella tavalla ja sen metylointi korreloi positiivisesti kasvaimen ja pienten suonten hyökkäys [29]. Paksusuolen syöpäsoluja,

HOXB13

, koska tavoitteeksi DNMT3b, metyloitiin ylävirran CpG-saarekkeen, ja toimi tuumorisuppressori ensisijainen Kolorektaalituumorien [26].

Koska DNMT3b tekee ei ole DNA: ta sitovia domeeneja, joita se tarvitsee transkriptio kofaktoreita vuorovaikutuksessa spesifisen geenin sekvenssit [30]. On tunnettua, että monet jäsenet PcG, kuten EZH2, hallussaan sitovat verkkotunnuksia

HOXB13

promoottori, ja ne tukahduttaa

HOXB13

ilmaisun histoni metylaatio [31]. Merkittävää on, EZH2 on ollut mukana olevan keskeisessä asemassa välittämisessä sekä histoni metylaatio ja DNA: n metylaatio on

HOXB13

geeni joissakin syöpäsoluissa [21], [32]. Lisäksi olemme aiemmin raportoitu, että YY1 ja histonideasetylaasi 4 (HDAC4) vaikuttaa eturauhasen syöpäsolun kasvua tukahduttaa

HOXB13

transkription kautta histonimodifikaation [11]. Nämä käytettävissä olevat tiedot kiehtoi meitä spekuloida, että EZH2 voisivat rekrytoida DNMT3b osoitteeseen

HOXB13

promoottori tukahduttaa sen ilmaisun erityisesti epigenetic muutoksia.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli valottaa mekanismeja osallistuvat proliferaation esto in AR

– syöpäsolujen laukaisi ATRA. Tuloksemme paljasti, että ATRA esti kasvua DU145 eturauhasen syöpäsolujen kautta upregulating

HOXB13

ilmentymistä vähentämällä metylointi tasolla. Tämä saavutettiin ATRA heikentää toiminnan EZH2 ja DNMT3b, jotka ovat vastuussa metyloinnin

HOXB13

promoottori. Tiedot purkaa Tämän tutkimuksen voidaan saada hyödyllistä vihjeitä uusien terapeuttisten strategioiden AR

– eturauhassyöpä, joissa käytetään ATRA ja epigeneettiset määritteet.

Tulokset

HOXB13 oli mukana in ATRA aiheuttama DU145 Cell Growth pidätys

ATRA oli raportoitu pystyvän aiheuttamaan soluissa kasvun pysähtymisen, mutta mekanismi ei ole täysin selvä. Yliekspressio HOXB13 AR

– eturauhassyövän solut voivat myös johtaa merkittävään solujen kasvun esto. Selventää, HOXB13 on rooli ATRA aiheuttama kasvun pysähtymistä eturauhassyöpäsoluissa, me testattiin ensin solujen suhteellisen eloonjäämisaste, kun hoito ATRA. DU145 solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia ATRA (20-120 uM) 24, 48 ja 72 tuntia. Osoituksena kuvassa. 1A ja 1B, ATRA todellakin indusoi solujen kasvua pidätyksen DU145-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Korkea sytotoksisuus havaittiin 72 tuntia. Samaan aikaan sekä HOXB13 mRNA ja proteiini tasot olivat koholla DU145 soluissa upon ATRA hoitoon (Fig. 1 C). Olemme edelleen todentaa vaikutus ATRA toisessa AR

– eturauhassyöpä-solulinjaa PC-3, ja havaitsimme samanlaisia ​​annoksesta riippuva vaikutus ATRA solujen kasvun pysähtymisen, kuten kävi ilmi, MTT: n määritykset (Fig. S1). Samaan aikaan sekä HOXB13 mRNA ja proteiini-tasot kohonneet myös upon ATRA hoitoon (Kuva. S2).

(A) annos-riippuvaista vaikutusta ATRA on DU145 solujen kasvuun pidätys. DU145-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla ATRA: ssa 72 tuntia. *

P

0,05, **

P

0,01 (n = 6). (B) ajan kuluessa kasvun pysähtymisen vaikutus ATRA in DU145 soluissa. *

P

0,05, **

P

0,01 (n = 6). (C) ATRA kasvoi HOXB13 ilmentymistä DU145 soluissa. DU145-soluja käsiteltiin 80 uM ATRA: ssa 72 tuntia. Kokonais-RNA uutettiin RT-PCR: llä (

uppe

r), ja koko solulysaatit valmistettiin western-blottauksella (

pienempi

). (D) ATRA aiheuttama DU145 solujen kasvun pysähtymisen osittain päinvastaiseksi tukahduttaminen HOXB13 ilmaisua. Solun kasvu voimakas mitattiin MTT määrityksissä. *

P

0,05, **

P

0,01 (n = 6).

Seuraavaksi testata roolia HOXB13 vuonna ATRA- välitteistä DU145 solujen kasvun pysähtymisen, me transfektoitiin lyhytaikaisesti

HOXB13

siRNA plasmidin DU145 soluihin käsitelty ATRA. Rakentaminen ja häiritsevä tehokkuutta HOXB13 siRNA kuvattiin edellisessä raportissa [11]. Huomasimme, että knockdovvn HOXB13 siRNA ilmeisesti päinvastainen solujen kasvun pysähtymisen indusoi ATRA (Fig. 1 D). Tämä sekaantunut että ATRA aiheuttama DU145 solujen kasvun pysähtymisen liittyi, ainakin osittain, jossa ilmaus HOXB13.

DNMT3b Osallistui HOXB13 Transkription repressio

HOXB13

geeni on hiljennetty AR

– syöpäsolujen ja yliekspressio HOXB13 AR

– syöpäsolujen johtanut merkittävään solujen kasvun esto [10]. Sitten tutkittiin molekyyli tapahtumia, jotka ovat mukana

HOXB13

geenien AR

– syöpäsolujen. Promoottori on

HOXB13

on usein raportoitu hypermetyloitunut erilaisten syöpien [33]. Selventää, hiljentäminen on

HOXB13

geeni välittyy DNA hypermetylaation AR

– eturauhassyövän solut, arvioimme metylaatiostatuksen

HOXB13

promoottori käyttämällä bisulfiitti-sekvensointi PCR (BSP), ja huomasimme, että

HOXB13

promoottori tiiviimmin metyloitavaa DU145 soluissa verrattuna, että nöyrä pahanlaatuisten LNCaP (Fig. 2A, B).

BSP määritykset osoitti metylaatio CpG-saarekkeiden klo HOXB13 promoottori erittäin pahanlaatuisten DU145 soluja (A) ja nöyrä pahanlaatuisten LNCaP (B). (C) HOXB13 on yliaktiivista DU145-soluissa, jotka oli transfektoitu DNMT3b siRNA plasmidi, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA vektori. (D) BSP määritykset osoittivat alennettua metylaatio tasoa HOXB13 promoottorin DU145 transfektoiduissa soluissa DNMT3b siRNA (

alempi

), verrattuna ohjaus siRNA (

ylempi

).

Koska DNA metyylitransferaasi DNMT3b on tärkeä rooli metylaation syöpään liittyvien geenien ja

HOXB13

raportoitiin olevan kohdegeenin on DNMT3b perus-peräsuolen kasvaimissa [26], [27], me arveltu, että DNMT3b voi myös olla mukana

HOXB13

transkription sortoa DU145 soluissa. Voit tarkistaa tämän oletuksen, me tippuu alas DNMT3b lauseke tietyn siRNA, ja huomasimme, että HOXB13 ilmentyminen ilmeisesti lisääntyi DU145 soluissa ja häiritsevän tehokkuutta DNMT3b siRNA näytettiin (kuvio. 2C). Tulokset BSP määritysten osoitti, että metylaatio taso

HOXB13

promoottorin DU145 väheni sen jälkeen, kun pudotus endogeenisen DNMT3b (Fig. 2D, alempi), verrattuna kontrolliin solut (Fig. 2D ylempi). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DNA: n metylaatio muutos välittyy DNMT3b vastasi vaiennettaisi

HOXB13

in DU145 soluissa.

PCG Proteiinit EZH2 ja BMI1 Osallistui HOXB13 Transkription repressio

Seuraavaksi tarkoituksena on määritellä transkriptiotekijä (t), jotka voivat osallistua sääntelyn

HOXB13

geeni. PCG proteiinien on raportoitu olevan rooli etenemisessä eturauhas- ja rintasyövistä, sekä hiljentäminen

HOXs

[3], [21], [34], [35]. Ensin määritetään, että ilmaukset PcG proteiinien EZH2 ja BMI1 olivat merkittävästi korkeammat erittäin pahanlaatuisten DU145 soluissa kuin nöyrä pahanlaatuisten LNCaP, ja niiden ilmaisuja negatiivisesti korreloi HOXB13 ilmaisua, kuten paljasti RT-PCR ja western-blottauksella (kuvio. 3A, B).

mRNA: ta (A) ja proteiini (B) tasot BMI1, EZH2 ja HOXB13 eri maligniteetti eturauhasen syöpäsoluja, LNCap ja DU145. (C) mRNA tasot HOXB13 ja EZH2 in DU145 transfektoiduissa soluissa EZH2 siRNA plasmidilla. (D) mRNA tasot HOXB13 ja BMI1 in DU145 transfektoiduissa soluissa BMI1 siRNA plasmidilla. (E) proteiini tasot HOXB13 ja EZH2 in DU145 transfektoiduissa soluissa EZH2 siRNA plasmidilla. (F) proteiini tasot HOXB13 ja BMI1 in DU145 transfektoiduissa soluissa BMI1 siRNA plasmidilla.

edelleen selventämään, EZH2 ja BMI1 osallistunut

HOXB13

transkription sorto DU145 eturauhassyövän solut, rakensimme EZH2 siRNA ja BMI1 siRNA plasmidit ja transfektoitiin ne DU145-soluissa, vastaavasti. Havaitsimme, että molemmat HOXB13 mRNA (Fig. 3C, E) ja proteiini (Fig. 3d, F) tasot voimistunut kun EZH2 ja BMI1 olivat tippuu alas. Inhiboiva tehokkuus Näiden siRNA plasmidien endogeenisten EZH2 ja BMI1 mRNA ja proteiini tasot olivat (3C, D ja E, F). Nämä tulokset osoittivat, että EZH2 ja BMI1 voi tukahduttaa HOXB13 ilmaisun välittämällä histoni metylointi muutos.

DNMT3b rekrytoitiin HOXB13 promoottori EZH2

Toisena repressors transkription, DNMTs ei ole omaa kanoninen DNA sitovia alueita ja ne ovat yleensä rekrytoidaan erityisten chromatin alueiden transkriptiotekijät [26], [30]. Merkittävää on, EZH2 on raportoitu avainasemassa välittämisessä sekä histoni metylaatio ja DNA: n metylaatio on

HOXB13

geeni joissakin syöpäsoluissa [21], [32]. Sitten halusimme selvittää EZH2 värvää DNMT3b osoitteeseen

HOXB13

promoottori. Suoritimme ChIP määrityksiä muutosten havaitsemiseksi yhdistys EZH2 kolmella määritellyn alueen (P1-P3) ja

HOXB13

promoottori kun knockdown endogeenisen EZH2. Kaukana ylävirtaan P4 alue valittiin negatiivinen kontrolli (Fig. 4A). Siru Tulokset osoittivat, että runsaasti EZH2 P1-P3

HOXB13

promoottori aleni kun omien EZH2 tukahdutettiin

EZH2

siRNA DU145 soluissa. Samanaikaisesti H3K27me3 taso liittyy EZH2 toiminto P1-P3 ilmeisesti pienentää (Fig. 4B).

(A) Kaavio 5′-fl anking alueella HOXB13 geenistä. P1, P2 ja P3 tarkoittavat kolmea promoottorialueet HOXB13 geenin analysoidaan ChIP määrityksissä, ja P4 on distaalinen negatiivinen kontrolli. (B) pelimerkin määritykset DU145 transfektoiduissa soluissa EZH2 siRNA ja immunosaostettiin anti-EZH2 vasta-aine ja anti-H3K27me3-vasta vastaavasti. (C) CoIP määritykset havaitsemiseksi yhdistys DNMT3b kanssa EZH2 in DU145 soluissa. Solun tuma-uutteet valmistettiin ja saostettiin anti-EZH2 tai anti-DNMT3b vasta-ainetta, ja havaitaan immunoblottauksella anti-DNMT3b tai anti-EZH2-vasta-ainetta. (D) ChIP määritykset suoritettiin DU145-soluissa, jotka on transfektoitu EZH2 siRNA ja DNA immunosaostettiin anti-DNMT3b vasta-aine. Määrät saostunut DNA määritettiin PCR: llä.

Lisäksi, CoIP testeissä, joissa DU145 solu-uutteiden paljasti, että kompleksit immunosaostettiin anti-DNMT3b tai anti-EZH2-vasta-aineita, ja voitiin havaita immunoblottauksella anti -EZH2 tai anti-DNMT3b vasta-aineita, vastaavasti (Fig. 4C), mikä viittaa siihen, että DNMT3b ja EZH2 oli läsnä samassa monimutkainen. Meidän sirudata kuvassa. 4D osoittivat lisäksi, että runsaasti DNMT3b kolmella promoottorialueissa (P1-P3) pienennettiin kun knockdown endogeenisen EZH2. Nämä tulokset siis esittänyt todisteita siitä DNMT3b rekrytoitiin

HOXB13

promoottori EZH2.

ATRA Heikentynyt EZH2 ja DNMT3b Expression ja Heikentynyt niiden vuorovaikutukset HOXB13 Promoottori

Olemme osoittaneet yläpuolella HOXB13 säädeltiin vähentävästi mukaan EZH2 ja DNMT3b, ja ATRA hoito johti korotus

HOXB13

ilmentymistä DU145 soluissa. Voit tarkistaa meidän oletetaan, että ATRA voivat helpottaa HOXB13 itseilmaisu haittaavat kielteiset sääntelyn vaikutuksia EZH2 ja DNMT3b on HOXB13, tarkastelimme EZH2 ja DNMT3b ilmaisun DU145 soluissa käsitelty 80 uM ATRA, ja 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5 -aza-dc) käytettiin demetylaation ohjaus. Tulokset osoittivat, että ilmauksia sekä EZH2 ja DNMT3b oli vaimentua, kun ATRA hoitoa sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoilla (Fig. 5A, B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin samalla selvittää käyttäen toista AR

– pahanlaatuisen eturauhassyövän solulinja PC-3 (Fig. S2).

hoito 80 uM ATRA voimistunut HOXB13 ja vaimentua EZH2 ja DNMT3b ilmaisuja mRNA-tasolla (A) ja proteiini taso (B) DU145 soluissa. 5-atsa-dc käytettiin positiivisena demetylaation valvontaa. Ohjaus 1 oli isopyknisellä absoluuttista etanolia ja ohjaus 2 oli isopyknisellä etikkahappoa (C) ATRA heikentynyt siteet sekä EZH2 ja DNMT3b, ja vähensi H3K27me3 tasolla HOXB13 promoottori. ChIP määritykset suoritettiin DU145 soluissa, joita käsiteltiin 80 uM ATRA ja immunosaostettiin anti-H3K27me3, anti-DNMT3b tai anti-EZH2-vasta-ainetta. Määrät saostetaan endogeenisen HOXB13 promoottori-DNA määritettiin PCR: llä. (D) BSP määritykset osoittivat alennettua metyloinnin HOXB13 promoottorin DU145 soluissa hoidon jälkeen kun 80 uM ATRA, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

ChIP analyysit osoittivat lisäksi, että siteet endogeenisen EZH2 ja DNMT3b on

HOXB13

promoottori väheni jälkeen ATRA hoidon, ja välin H3K27me3 tasolle P1-P3 alueilla ilmeisesti väheni (kuvio. 5C).

Lisäksi BSP määritykset paljastivat, että hoito ATRA johti vähentämisessä metylaation tason CpG-saarekkeiden on

HOXB13

promoottorin toisin kuin käsittelemättömän DU145-soluissa (kuvio. 5D). Ilmeisesti EZH2 palvelukseen DNMT3b osoitteeseen

HOXB13

promoottori ja laukaisi geenin hiljaisuus indusoimalla H3K27me3 ja lisäämällä metylaation CpG-saarekkeiden. Samaan aikaan sekä DNA: n metylaation ja H3K27me3 on

HOXB13

promoottori voitiin vähentää ATRA.

Keskustelu

ATRA olennainen rooli kehityksessä säätelemällä solujen eri prosessien ja se on laajalti tutkittu prekliinisissä ja kliinisissä kokeissa aineena hoidettaessa monia syöpätyyppejä, mukaan lukien varhainen mahasyövän ja eturauhassyövän [16], [17]. Myös HOXB13 osoitettiin olla mukana kasvun pysähtymisen AR

– eturauhasen [10], peräsuolen syöpä [26] ja munuaissyövän [29]. Näiden tavoitteiden mukaisesti aiemmin ilmoittanut Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että ATRA kykeni indusoimaan kasvun pysähtymisen kahden AR

– syöpäsolujen DU145 ja PC-3 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1A ja kuvio. S1) , ja tämä vaikutus oli osittain saavutettu edistämällä HOXB13 mRNA ja proteiini tuotantoa (Fig. 1 C ja S2, S3). Päinvastoin, tuoreessa raportissa kuvataan, että knockdown endogeenisen HOXB13 RNA häiriöitä ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa liittyi alennettu soluproliferaatioon [36]. Nämä ristiriitaiset kuvaukset voivat olla seurausta ilmeinen ero munasarjojen ja muiden elinten, koska HOXB13 on ilmaisemattoman normaalissa munasarjassa [36], kun se ilmentyy korkealla tasolla normaalissa eturauhasessa ja munuaisissa [5], [29]. Kuitenkin tiedot tässä raportissa esitetyt todistaa, että ATRA hoito esti kasvua DU145 eturauhassyövän solut, mekanismilla, mukana säätelyä HOXB13 vähentämällä metylaatio tasolla geenin promoottori.

DNA metylaatio katalysoivat ja ylläpitämä DNMTs. Tietyt DNMTs ilmaistuna suhteellisen alhaisella tasolla somaattisten solujen, usein yläreguloituja syöpäsoluja. Gain-of-function tutkimukset osoittivat, että DNMT3b mutta ei DNMT3a edistetään paksusuolen tuumorigeneesiä APC

Min /+ indusoimalla

de novo

metylaatio useiden geenien kätkeminen CpG-saarekkeiden [26]. Myös viitteitä siitä, että ehtyminen DNMT3b lisännyt apoptoosin korko ja vähentää kulkeutumista PC-3 syöpäsolujen [37]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että HOXB13 ilmentyminen vaiennettu vuonna DU145 (Fig. S4), ja BSP määritykset paljastivat, että sen hiljaisuutta voi liittyä hypermetylaatiota geenin promoottorin (Fig. 2A). Kerrottiin, että

HOXB13

geeni oli tavoite DNMT3b paksusuolen syöpäsoluissa [26]. Siksi tulee tärkeää ymmärtää toimintaa DNMT3b vuonna vaiennettu

HOXB13

geeni DU145 eturauhasen syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että DNMT3b voivat säännellä

HOXB13

transkription läpi muuttamalla DNA: n metylaation muunnos geenin promoottori, vaikka knockdovvn DNMT3b ei vähentänyt metylaation CpG

HOXB13

promoottorin odotettua (Fig. 2C, D). Ilmeisesti muut mekanismit voivat olla taustalla DNMT3b-välitteisen

HOXB13

tukahduttaminen.

Erityisesti, normaali ja poikkeava metylaation saattaa välittää kromatiinin proteiinit ohjaavat DNA metyylitransferaaseja niiden kohdegeenien [38] . Viimeksi PCG proteiini EZH2 ilmoitettiin palkata DNA metyylitransferaasien, erityisesti DNMT1 ja DNMT3b, toteuttaa hiljentäminen

MYT1

ja

WNT1

loci kautta DNA: n metylaatio [21], [32 ]. Yliekspressio EZH2 esiintyy yleensä monipuolinen maligniteetteja, mukaan lukien eturauhas-, rinta- ja maksan syövät, erityisesti kehittyneissä tapauksissa [39]. Varambally

et al

[40] todetaan, että sääntelemätön ilmentyminen EZH2 voi olla syynä eturauhassyövän etenemistä, samoin kuin on merkki, joka erottaa veltto eturauhassyöpä niiltä vaarassa tappavia etenemisen. Tuloksemme ehdotti, että PCGS osallistunut eturauhassyövän kehitykseen. Olemme osoittaneet, että ilmentyminen EZH2 ja BMI1 oli paljon suurempi DU145-soluissa kuin LNCap-soluissa (kuvio. 3A, B). Enemmän kiinnostavaa, huomasimme, että PCGS tukahdutettiin HOXB13 ilmentymistä DU145 soluissa. RT-PCR ja Western blotting määritykset osoittivat, että HOXB13 ilmentyminen säädeltiin kun EZH2 ja BMI1 olivat tippuu alas (Fig. 3C, D, E ja F). Lisäksi meidän ChIP määritykset paljastivat, että EZH2 kykeni suoraan sitoa kiinni

HOXB13

promoottorin (Fig. 4B), ja tämä voi olla vaiennettu mekanismi

HOXB13

on DU145 pahanlaatuisen eturauhassyövän soluja.

on ehdotettu, että EZH2 tukahduttaa kohdegeenien transkription pääasiassa kaksi eri mekanismia. Ensimmäiseen sisältyy sitoutuminen EZH2 ja kohdegeenin promoottorin indusoimiseksi H3K27me3 muutos, mikä vähentää promoottorin toimintaa [39], [41]. Toinen mekanismi ehdottaa, että EZH2 rekrytoi yhteistyössä repressori tai monimutkaisia, kuten DNMT1 ja DNMT3b, promoottori ja tämän yhteistyön repressori joko vaikuttaa kielteisesti muita tekijöitä, jotka ovat läsnä, tai muuttaa paikallisen kromatiinirakenteeseen helpottamiseksi tukahduttaminen [30], [35]. Ilmeisesti Tämän tutkimuksen tulokset ovat yleisesti ottaen yhtä mieltä molemmat kaksi mallia. Erityisesti, meidän tiedot osoittavat, että EZH2 pystyi sitoutua suoraan

HOXB13

promoottorin indusoimiseksi H3K27me3 muutos (Fig. 4B). Samalla meidän tiedot on myös ehdotettu, että EZH2 voi rekrytoida DNMT3b on

HOXB13

promoottori vaikuttaa promoottorin metylaatiostatus ja siten tukahduttaa geenin transkriptiota (Fig. 4C, D). Nämä tulokset tarjoavat lisänäyttöä varten ylikuulumisen kahden erillisen epigeneettiset mekanismit geenissä hiljaisuus.

ATRA käytetään yleensä yhdessä muiden lääkkeiden, kuten doketakselin, TSA ja tsoledronihapon eturauhassyövän hoidossa [18], [42], [43], mutta molekyylimekanismi ATRA toiminta on epäselvä. Se, että EZH2 rekrytoi DNMT3b että

HOXB13

promoottori tukahduttaa geenin ilmentymisen, ja että hoito ATRA tuloksia ylössäätely HOXB13 ilmaisun, kiehtoi meitä ehdottaa hypoteesia, että ATRA voisi upregulate HOXB13 vähenemisen kautta metylaatio taso geenin aiheuttama EZH2 ja DNMT3b. Tämän tutkimuksen tulokset validoitu että ilmaukset

EZH2

ja

DNMT3b

pienenivät jälkeen ATRA kohtelu sekä DU145 ja PC-3-solulinjojen (Kuvio 5A, B ja Fig. S2, S3 ). Myös siteet EZH2 ja DNMT3b päälle

HOXB13

promoottori ja H3K27me3 taso jolloin vähenivät DU145 soluissa käsiteltiin ATRA (Fig. 5C). Mielenkiintoista, BSP määritykset paljastivat, että DNA metylaatio taso

HOXB13

promoottori pieneni myös DU145 soluissa upon ATRA hoitoon (Kuva. 5D).

On kolme

RAR

geenejä, eli

RARa, β

ja

γ

soluissa, ja ne ovat kaikki tarvittavat ATRA toimintoa. Koska

RARβ

vaimentuu vuonna DU145 solujen herkkyys on DU145 solujen ATRA on pienempi kuin LNCaP [44]. Samalla olemme myös tutkittiin, mikä vaikutus ATRA 293 ja 293T-soluissa, kaksi normaalia ihmisen sikiön munuaisen solulinjoissa. Kuten odotettua, herkkyys näiden solujen ATRA oli korkeampi kuin DU145-soluissa (kuvio. S5a). Huomattavasti, hoito AR

– eturauhassyövän solut ATRA ei muuttanut ilmentymiä HOXB13, EZH2 ja DNMT3b mRNA tasolla (Kuva. S5B), syytetään eri mekanismin ATRA toimia tässä nimenomaisessa solussa tausta. Oletettavasti epigeneettiset muutokset välittyvät ATRA kuvattu tässä raportissa voidaan todennäköisesti rajoittaa tietyille syöpäsolutyyppien kuten AR

– eturauhassyövän solut, koska ei ole ollut raportteja ATRA välittämää epigeneettiset muutokset normaaleissa soluissa tasalla. Vastaavasti mitä pahanlaatuinen ja lääkkeille vastustuskykyiset PC-3-solut osoittivat vielä suurempi herkkyys ATRA kuin DU145 soluja (Kuva. S1).

Edellisen raportin unraveled että alentunut DNMT3b ilmaus johti hypometylaatio

retinoblastooma (Rb) B,

RARβ

, ja

adenomatoottisen polypoosin coli (APC) B-geenin promoottorit [37]. Oletettavasti downregulation DNMT3b voi osittain voimistaa herkkyys DU145 solujen ATRA, ja tämä saattaa luoda positiivista välillä ATRA hoitoa ja downregulation DNMT3b helpottaa HOXB13 ilmaisua, ja siten aiheuttaa kasvua pidätys DU145 soluja. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ATRA pystyi upregulate ilmentymisen HOXB13 ja aiheuttaa DU145-solujen kasvun pysähtymisen seurauksena alennetun metylaation tason

HOXB13

. Tämä herättää kysymyksen siitä, onko välisen yhteisvaikutuksen ATRA ja DNMTs inhibiittorit, esim. 5-atsa-dc, on olemassa. Tulokset meidän MTT ja reaaliaikainen PCR-kokeet tukevat tätä oletusta, koska samanaikaista hoitoa sekä ATRA ja 5-atsa-DC osoitti paljon vahvempia estäviä vaikutuksia ja DU145-soluja kuin molempien lääkkeiden yksinään (Fig. S6). Samaan aikaan ilmentyminen HOXB13 oli voimistunut, mutta sekä EZH2 ja DNMT3b olivat vaimentua merkittävästi, kun hoitoon kahden lääkkeen (Fig. S7).

Kaikkiaan tiedot Tässä raportissa esitetyt tukea toimiva malli, jossa HOXB13 , EZH2 ja DNMT3b osallistuvat ATRA aiheuttaman solukasvun pysähtymisen DU145 soluissa (Kuva. 6). Erityisesti ATRA estää leviämisen DU145 syöpäsolujen vähentämällä metylaatio tasoa

HOXB13

promoottori indusoi EZH2 ja DNMT3b. Perspektiivisesti, tiedoissa esiintyy tässä tutkimuksessa voidaan saada hyödyllistä johtolankoja uusien terapeuttisten strategioiden AR

– eturauhassyöpä, joissa käytetään ATRA ja epigeneettiset määritteet.

EZH2 suoraan sitoo päälle HOXB13 promoottori ja indusoi trimethylation of H3K27 tukahduttaa HOXB13 ilmaisua. DNMT3b rekrytoimista HOXB13 promoottori EZH2 aiheuttavan DNA hypermetylaation johtaa edelleen tukahduttaminen geenin. Samaan aikaan, ATRA tukahduttaa EZH2 ja DNMT3b ilmaisun, ja heikentää niiden sitova HOXB13 promoottorin vähentää metylaation tason HOXB13 promoottorin, jolloin aktivointi HOXB13, mikä puolestaan ​​estää niiden kasvun DU145-soluissa. Lisäksi tukahduttaminen DNMT3b myös ylössäätelee

RARβ

ilmaisua, mikä voi parantaa herkkyys on DU145 solujen ATRA. Hoito, jossa yhdistetään molempien ATRA ja 5-atsa-dc aikaansaa tehostetun vaikutuksista HOXB13 kiihdytyssäätely ja estyminen kasvun DU145 solujen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

DU145, PC-3, LNCap, 293 ja 293T-solut ostettiin Institute of Cell Biology (Shanghai, Kiina).