Krooninen sairaus

tiivistelmä

Miesten asuvat Fidži ja juominen kava on alhainen esiintyvyys eturauhassyövän (PCA). Kuitenkin PCA ilmaantuvuus keskuudessa Fidzi miestä, jotka olivat siirtyneet Australia, kasvoivat 5,1-kertaiseksi. Siksi tarkasteltiin mahdollisia vaikutuksia kava root tiivisteet ja sen aktiivisia komponentteja (kavalactones ja flavokawains) päälle PCa kasvuun ja androgeenireseptorin (AR) lauseke. PCa solulinjoja (LNCaP, LAPC-4, 22Rv1, C4-2B, DU145 ja PC-3), jossa eri AR ilmaisun, ja transformoitu eturauhasen myofibroblastin solulinja (WPMY-1), käsiteltiin kaupallisella kava uute, kavalactones ( kawain, 5’6′-dehydrokawain, yangonin, methysticin) ja flavokawain B. ilmentäminen AR ja sen kohdegeenien (

PSA

ja

TMPRSS2

) tutkittiin. Kaksi novel potilaasta johdettujen PCa ksenograftimalleja korkealuokkaisesta PCa näytteet perustettu istuttamalla näytteet nude-hiiriin ja kulkee kasvain kappaletta läpi ihon alle nude-hiirissä, ja sitten käsiteltiin kava uutetta ja flavokawain B tutkia niiden vaikutuksia kasvaimen kasvuun, AR ilmaisun ja seerumin PSA-arvot. Kava uutetta ja flavokawain B tehokkaasti alassäädetty ilmentymistä sekä täyspitkän AR ja AR silmukointivariantit. Kava uutetta ja kavalactones kiihtyi AR proteiinien hajoaminen, kun taas flavokawain B estivät

AR

mRNA transkriptio kautta vähenee SP1 ilmaisun ja sitoutuminen SP1 AR promoottori. Kava juuriuutetta ja flavokawain B vähentää kasvaimen kasvua, AR ilmentyminen kasvaimen kudosten ja seerumin PSA potilaan johdettu PCa ksenograftimalleissa. Nämä tulokset viittaavat mahdolliseen käyttökelpoisuus turvallisen kava tuotteen tai sen aktiivisten komponenttien ehkäisyyn ja hoitoon kehittyneiden PCa suuntaamalla AR.

Citation: Li X, Liu Z, Xu X, Blair CA, Sun Z, Xie J, et al. (2012) Kava Komponentit vaimennussäätelevät ilmentäminen AR ja AR silmukointivariantit ja kasvun vähentämiseksi potilaasta peräisin Eturauhassyöpä hiirissä. PLoS ONE 7 (2): e31213. doi: 10,1371 /journal.pone.0031213

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 marraskuu 2011; Hyväksytty: 04 tammikuu 2012; Julkaistu: 09 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää CA129793 ja CA122558 (https://www.cancer.gov/)and American Institute for Cancer Research myöntää 41493 (https://www.aicr.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Aasian /Tyynenmeren miehiä, jotka kuluttavat vähän rasvaa ja kasvipohjaisia ​​ruokavalio on alhaisimpia kliinisen PCA maailmassa [1], [2]. Kuitenkin, kun Aasian miehet siirtyvät Yhdysvaltoihin, hinnat kliinisten PCa kasvaa [3]. Nämä havainnot sotkea sekä ympäristötekijät ja ruokailutottumukset (esim kulutus vähärasvainen ja kasvipohjaisia ​​ruokavalio) PCA kehittämiseen. Siksi yksi ehkäisy- ja hoito Eturauhassyövän on keskittynyt käytöstä luonnollisten ja synteettisten bioaktiivisten elintarvikkeiden ainesosien.

Kava (

Piper methysticum Forst

) on monivuotinen kasvi alkuperäiskansojen Tyynenmeren Islands. Kava root ja juurakosta käytetään valmistamaan käymättömät ja seremoniallinen juoman relaksoivasta vaikutuksia Tyynenmeren saarten tuhansia vuosia [4]. Epätavallisen alhainen ilmaantuvuus useiden syöpien, kuten keuhko- ja eturauhassyöpä, raportoidaan Tyynenmeren saarivaltiot huolimatta korkea osan tupakoitsijoista näissä populaatioissa [2], [5]. Lisäksi Steiner [6] ilmoitti, että Ikävakioitu syövän ilmaantuvuus kolmen korkeimman kava juominen maissa (Vanuatu, Fidži, ja Samoa) oli neljäsosa tai kolmasosa että ei-kava-juominen maissa, kuten New Seelanti ja Yhdysvallat (Havaiji ja Los Angeles), ja ei-kava-juominen Polynesians (Maoris). Ainutlaatuisen, näiden kolmen kava juominen maissa enemmän miehiä juo kava ja savua kuin tehdä naisille, mutta on pienempi syövän miehillä kuin naisilla [6]. Lisäksi Cancer neuvoston Cancer New South Wales (NSW) Maahanmuuttajat 1991-2001 raportissa todetaan [7], että PCA esiintyvyys Fidzi miehiä, jotka muuttivat ja asuivat NSW, Australia, kasvoi 5,1 kertaa verrattuna asuvien Fidži . Tämä raportti on saanut meidät tutkimaan mahdollisia hyötyjä kava tiivisteet ja sen aktiiviset komponentit PCA ehkäisyyn.

Me raportoimme ensimmäistä kertaa, että kaupallinen kava otteen ja sen aktiivisia komponentteja (kavalactones ja flavokawain B) alas- säädellä AR ilme. Ehtyminen AR proteiinin tapahtui kahdella eri mekanismilla: 1) tehostettu AR proteiinien hajoaminen, ja 2) alennetaan spesifisyys proteiini 1 (SP1) -välitteisen AR transkriptio. Kava otteen ja flavokawain B hiirten käsittely potilaasta johdettujen ksenografteissa vähensi kasvainten kasvua ja ilmentymistä AR ja sen kohdegeenien kasvainkudoksissa, ja alensi seerumin PSA-arvot.

Methods

Ethics lausunto

käyttö hiiriä ja niiden hoito tässä tutkimuksessa oli nimenomaan hyväksynyt University of California, Irvine Institutional Animal Care ja Käytä komitean (IACUC; protokolla numero 2007-2741).

Solulinjat, yhdisteet ja reagenssit

LNCaP, LAPC4, 22Rv1, PC3, DU145, ja WPMY-1-solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA), ja C4-2B solulinja oli peräisin Urocor Inc. (Oklahoma City, OK). Nämä solut viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Kaikkia solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa olivat 20 kohtia kuluessa. Solulinjat testattiin ja todistaa oikeaksi ATCC tai Urocor Inc. Kaikki solulinjat testattiin myös tunnettujen lajien mykoplasmakontaminaation käyttäen kittiä LONZA Inc. (Walkersville, MD). Puhdasta kawain, 5 ’, 6’-dehydrokawain, yangonin, methysticin, ja flavokawain B (99%) eristettiin kava uutteista LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Kava juuriuutetta pitoisuudessa 150 mg /ml kavalactones 50% etanolilla saatiin Gaia yrtit (Brevard, NC). Vasta-aineita AR ja tubuliinin olivat Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). PSA ja Sp1 vasta ostettiin Thermo Scientific (Fremont, CA). 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) oli yhtiöltä Sigma. RNAzol B ostettiin Tel-Test (Friendswood, TX.). Käänteistranskriptioprosessi System Kit ja oli Promegalta (Mandison, WI). Kvantitatiivinen RT-PCR kit oli Bio-Rad (Hercules, CA).

mittaus kavalactones ja flavokawains että kava juuriuutetta

kava uute laimennettiin 400 kertaa asetonitriilissä, ja sitten se suodatetaan 0,45 um: liuottimenkestäviä suodattimet ja säilytettiin -80 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka. Kromatografia suoritettiin koskevasta ACQUITY Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) järjestelmä (Waters Corp., Milford, MA, USA) automaattisella sampleri 8 ° C: ssa. Yhdisteiden erottamiseksi suoritettiin 50 ° C: ssa käyttäen Waters ACQUITY UPLC ®BEH C18 1,7 um (2,1 x 50 mm) pylvästä gradienttieluutio: (A) vesi: asetonitriili: etikkahappo (97.8:2:0.2 v /v /v), ja (B) asetonitriili: etikkahappo 99.8:0.2 (v /v) liikkuvana faasina.

eluutio-ohjelma oli seuraava: 10% B (alkuperäinen), 90% B (1,0 min), 90% B (2,0 min), 10% B (2,05 min) ja 10% (3 min). Virtausnopeus oli 0,3 ml /min ja injektiotilavuus oli 10 ui. UPLC kytkettiin Micromass Quattro Micro nestekromatografia-massaspektrometria (LC /MS /MS) kolmoiskvadrupoli massa- spektrometriä (Mass Range: 2~2000 m /z) sähkösumutusionisaatiota (ESI) käyttöliittymän, positiivinen toiminto. Instrumentti toimi positiivisessa ionin tilassa ESI jännitteellä 3,8 kV ja desolvation kaasun virtaus 700 l /h. Argon käytettiin törmäyksen indusoitu dissosiaatio kaasun paineessa 7,1

e-3 mbar valitun reaktion seuranta siirtymisen flavokawain A m /z 315 m /z 181, flavokawain B 284 181, kawain ja 231 115, 5 ’, 6’-dehydrokawain 229 131, mythysticin 275 159, Yangonin 259 161.

MTT-määritys

Solut maljattiin tiheydellä 2 × 10

4 per kuoppa 24-kuoppaviljelylevyillä 24 tuntia, ja sen jälkeen käsiteltiin kuten kuvioissa. Hoidon jälkeen 72 tuntia, 1 mg /ml MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan 2 tuntia, ja absorbanssi määritettiin 570 nm: ssä. Annos-vastekäyrät kasvun estäminen muodostettiin prosenttiosuutena vehikkelillä hoidettuihin kontrolleihin.

Western blot-analyysi

Kirkastettu proteiinilysaattien (20-100 ug) denaturoitiin ja ratkaista 8-16 % SDS-PAGE. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille, ja tutkittiin mainituilla vasta-aineilla ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssidetektiojärjestelmää.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-monistuksella reaktioita

AR

, prostataspesifisen antigeenin (

PSA

) ja transmembraaniaktivaattori proteaasi, seriini 2 (

TMPRSS2

) mRNA-tasot suoritettiin käyttäen MyiQ järjestelmän (Bio-Rad), kuten aiemmin on kuvattu [8], [9]. Sekvenssit alukkeiden

AR

,

PSA

ja

TMPRSS2

ovat saatavilla pyynnöstä. Tiedot analysoitiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmä, jossa Ct on syklin numero, josta fluoresenssi ensin ylittää kynnysarvon. Ct-arvot kutakin näytettä, joka saadaan vähentämällä arvot beeta-aktiini Ct päässä kohdegeenin Ct-arvo. Vaihtelu

beta aktiini

Ct-arvot on 0,5 eri näytteitä. Yhden syklin ero Ct-arvo edustaa 2-kertainen ero mRNA: n tasoon. Erityisyys tuloksena PCR-tuotteiden varmistettiin sulamiskäyrillä ja agaroosigeelillä.

Transfektio, promoottorin aktiivisuus ja lusiferaasimäärityssysteamiä

PSA-Luc ja plARS-Luc plasmidit ovat ystävällisesti lahja Dr. Wang Longgui (New York University Cancer Institute). Ihmisen SP1 HA merkitty plasmidi ystävällisesti Macus Tien Kuo (University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). C4-2B ja LNCaP-solut ko-transfektoitiin PSA-Luc tai plARS-Luc ja Renilla lusiferaasiplasmidin pGL 4,71 (Promega) tai SP1-HA-plasmidin Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 48 tunnin kuluttua flavokawain B lisättiin kuten kolminkertainen Toistoja. Sitten solut kerättiin ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin kanssa Dual-Glo Luiferase koejärjestelmässä (Promega). Renilla luminesenssi käytettiin sisäisenä kontrollina solujen lukumäärän ja transfektion tehokkuutta. Suhteellinen suhde luminesenssin asianomaiset geenistä promoottorista Renillaa luminesenssi esitetty kuvioissa kuten promoottorin aktiivisuutta. Sillä Sp1 transfektiosta solut sato varten immunoblottaustestiä.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) [10]

LNCaP ja C4-2B solut silloitettu formaldehydillä. Proteiini /DNA-kompleksi hajotettiin ja 500-1500 bp fragmentit sonikoimalla. Yhtä suuret määrät proteiinia (4 mg) inkuboitiin SP1-vasta-aineen, tai hiiren anti-GFP-vasta-ainetta. Proteiini G Sepharose-helmiä (Sigma) käytettiin kaatamaan monimutkainen, mitä seurasi peseminen High Salt Wash Buffer, LiCl, ja TE puskurit). DNA-proteiini-immunosaostumissa eluoitiin helmistä ja DNA uutettiin ja puhdistettiin. Expand High-Fidelity PCR System (Roche) käytettiin sekvenssin monistamiseksi 248-487 nukleotidia AR 5′-UTR alue, joka sisältää kaksi SP1 sitovaa kohtaa. Primer sekvenssit ovat saatavilla pyynnöstä.

hoito potilaasta johdettujen PCa -tuumoriksenografti mallit

prostatektomia kudokset saatiin läpi IRB-hyväksytty protokolla UCI Medical Center. Pienet fragmentit histologisesti todistettu kasvain istutettiin 8 viikon ikäisiä urospuolisia sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä käyttäen sisälsivät kapselin alle xeongraft tekniikka [11]. Kasvaimet nimetty GM0308 ja RC0309 3 ja 13 hiiren kohtia vastaavasti, valittiin uudelleen istutettiin ihonalaiseen taskuun SCID hiirillä. Yksi viikko myöhemmin, kun kasvaimet kasvoivat noin 100 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti hoitoryhmiin. Sillä kava uute hoidossa, hiiriä ruokittiin standardin ruokavalio täydennettynä joko ajoneuvon hallintaan tai 6 g /kg kava uutetta ruokavaliossa. Sillä flavokawain B hoitoon, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti päivittäin ajoneuvon ohjaus (10% DMSO: ta, 20% etanolia ja 70% Cremophor) tai 200 mg flavokawain B /kilogramma hiiren ruumiinpainoa. Hoitoa jatkettiin päivästä 0 päivään 17 varten kava ote ja päivä 27 flavokawain B. Kasvaimen kasvua seurattiin sekä seerumin PSA ja paksuus tuumorin koon mittaus viikoittain. Paino ja ravinnon saannista kirjattiin kokeiden aikana. Lopussa kokeiden, kasvaimen kudokset punnittiin ja puolittaa mRNA eristämistä ja immunohistokemia värjäys, vastaavasti. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: 0,5236 × L

1 × (L

2)

2, jossa L

1 on pitkä akseli ja L

2 on lyhyt akseli kasvain. Seerumin PSA-pitoisuus määritettiin PSA entsyymi-immunosorbenttimääritys kit (Bio-Quant, San Diego, CA) sen jälkeen, kun pakkaus ohjeita.

immunohistokemia

Antigeeni palauttaa käyttämällä 0,05 M glysiini-HCL -puskuria, pH 3,5, joka sisälsi 0,01% (w /v) EDTA, 95 ° C: ssa 20 minuuttia ja värjättiin anti-ihmis-AR (1:100). Värjäys visualisoitiin diaminobenzadine käyttäen Cell and Tissue -värjäyspakkausta (R baareja, SD. Jokainen näyte laskettiin kahtena kappaleena. IC

50 s arvioitiin annos-vaste-käyrät.

kava juuriuutetta ja kavalactones vähentää ilmentymistä PSA ja TMPRSS2 kautta kiihtyvyys AR proteiinien hajoamista

Kuvio 3A osoittaa, että kava uute ja kavalactones (ts kawain, 5’6′-dehydrokawain, yangonin, ja methysticin) selvästi alas-säädellä mRNA ilmentymistä AR kohdegeenien (

PSA

ja

TMRSS2

), mutta ei mRNA ilmaus AR C4-2B soluissa. Kuva 3B ja C esittää, että sekä kava uutetta ja yksittäisten kavalactones vähentää AR ja PSA-proteiinin ilmentyminen samoin. Kasvua estävä vaikutus kavalactones korreloi huonosti niiden vaikutuksia AR proteiini alassäätöä. C4-2B soluja, androgeeni-riippumaton LNCaP johdannainen, olivat herkempiä AR alas säätelevä vaikutus kavalactones ja kava uutetta kuin olivat LNCaP.

(A). C4-2B-soluja käsiteltiin 0,1% DMSO: ta, kava juuriuutetta, dehydrokawain, kawain, yangonin ja methysticin 8 tuntia. mRNA-tasojen AR ja AR-kohdegeenien (

PSA

ja

TMPRSS2

) määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR. Baarit ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä määrällisiä toimenpiteitä. Kava juuriuutetta ja kavalactones merkittävästi vähentää mRNA ilmentymistä AR kohdegeenien (Student

t

testi, P 0,01) mutta ei AR (P 0,05). (B) ja (C). Proteiinin ilmentyminen AR ja PSA: LNCaP ja C4-2B soluissa, sen jälkeen osoitti hoitojen pitoisuutena niiden IC

50 s 16 tuntia analysoitiin Western blot. a-Tubulin havaittiin latauskontrollina. Edustava blot näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Y = yangonin; M = methysticin; D = 5’6; -dehydrokawain; K = kawain, KRE = kava juuriuutetta. (D). C4-2B-soluja esikäsiteltiin 10 ug /ml sykloheksimidiä 2 tuntia ja sitten täydennetty kava juuriuutetta tai 5’6; -dehydrokawain pitoisuutena niiden IC

50 s eri aikoja. Jälkikäsittelyä, AR proteiinin tasot analysoitiin Western-blottauksella ja puolittain määrällisesti densitometrialla mittaus. Edustava blot on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta.

tarkastellaan seuraavaksi vakautta AR proteiinin käsittelemällä soluja sykloheksimidin estää uuden proteiinin synteesiä. Kuva 3D osoittaa, että AR-proteiini osoittaa nopeutetussa hajoamista C4-2B soluissa käsitelty joko kava ote tai 5’6′-dehydrokawain, verrattuna sen vakautta ajoneuvon käsiteltyjä soluja. Klo 16 ja 24 tuntia hoidossa, kava uute ja 5’6′-dehydrokawain hoidot vähentävät AR proteiinin tasot noin 80% ja 70%, vastaavasti, kun taas AR proteiinin tason auton hallinnan vain laskevan noin 20% ja 37% , vastaavasti (kuvio 3D).

Flavokawain B alas-säätelee ilmentymistä AR ja sen kohdegeenien (PSA: n ja TMPRSS2: n) B

Flavokawain B on tehokkain aine inhiboimaan solujen kasvua kesken tutki bioaktiivisia komponentteja kava uutetta. Siksi tutkittiin vaikutusta flavokawain B AR ilme. Kuvio 4A osoittaa, että flavokawain B merkittävästi vähentää AR proteiinin ilmentymistä kaikissa AR ilmentämissolulinjat (LAPC4, C4-2B, WPMY-1, LNCaP ja 22Rv1). Mielenkiintoista, AR proteiinin taso WPMY-1-soluissa on herkin flavokawain B hoitoon. Koska WPMY-1 edustaa transformoitu eturauhasen myofibroblastin linjan [12], tämä tulos viittaa siihen flavokawain B voi olla uudenlaisen aineen kohdistaminen PCa strooman AR. Flavokawain B vähensi myös proteiinin tasot PSA (kuvio 4A). Kuvio 4B osoittaa, että flavokawain B estää ilmentymistä AR ja PSA proteiinien aiheuttama synteettisen androgeenin analoginen, R1881. Esikäsittely proteasomin estäjä, MG132, ei perinyt flavokawain B alassäädetty-AR-proteiinin taso (kuvio 4C). Toisin kuin kava uute ja kavalactones hoitoja, hoitoon LNCaP ja C4-2B soluja 5 ug /ml flavokawain B 4 ja 8 tuntia johti merkittävään vähenemiseen mRNA-tasojen on

AR

ja sen kohde- geenit

(PSA ja TMPRSS2) B (kuvio 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että flavokawain B-välitteistä AR alassäätöä on kautta transkription säätelyyn.

(A) kantavassa proteiinin ilmentymistä AR ja PSA jälkeen osoitti hoitojen 16 tuntia tai 5 ug /ml FKB varten osoitettuun ajaksi kertaa analysoitiin Western blot. a-Tubulin havaittiin latauskontrollina. Edustava blot näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) .Western blotting-analyysi osoittaa, että FKB pienentää sekä konstitutiivista ja synteettisen androgeenin, R1881, stimuloi AR ja PSA ilmaisun LNCaP solussa. LNCaP-soluja viljeltiin puuhiilellä puhdistettua FBS: ia. FKB ja R1881 ilmoitetuilla pitoisuuksilla käsiteltyjä soluja 16 tuntia. α tubuliinin havaittiin latauskontrollina. Edustava blot näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C). Proteasomin estäjä, MG132, ei vaikuta FKB välittämää alas-säätely AR proteiinin ilmentymisen. LNCaP-soluja käsiteltiin MG132: ssa 2 tuntia ja sitten lisättiin FKB vielä 16 tunnin ajan. a-Tubulin havaittiin latauskontrollina. Edustava blot näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D). LNCaP ja C4-2B soluja käsiteltiin 5 ug /ml FKB 4 ja 8 tuntia. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin analysoida mRNA: n ilmentymisen AR: n ja AR-kohdegeenien (

PSA

ja

TMPRSS2

). Palkit ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. FKB merkittävästi vähentää mRNA ilmentymistä AR kohdegeenien (Student

t

testi, P 0,01).

transkriptiossa tukahduttaminen AR mukaan flavokawain B edellyttää ilmentymistä transkriptiotekijä SP1

tutkimme seuraavaksi mahdollisia mekanismi flavokawain B välittämän AR transkriptio. SP1 otaksuttu transkriptiotekijä AR sääntelyä. Sp1 sitoutuu suoraan GC-box AR promoottori kautta sinkki sormen proteiini motiivi [13], [14]. Siksi AR promoottori lusiferaasireportterista joka sisältää neljä SP1 sitoutumiskohtia käytettiin määrityksessä AR promoottorin aktiivisuutta PCA solulinjoissa. Kuvio 5A osoittaa, että flavokawain B hoitoja selvästi vähentää AR-promoottorin aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. Väheneminen AR promoottorin aktiivisuuden flavokawain B liittyi vähentäminen SP1 proteiinin tasot (kuvio 5B). Näin ollen, ChIP-analyysi paljasti, että flavokawain B hoitoon C4-2B ja LNCaP-soluissa merkittävästi inhiboi SP1 AR promoottorisekvenssit (kuvio 5C). Sen tutkimiseksi, onko SP1 vaaditaan flavokawain B-välitteistä AR alassäätöä, C4-2B solut transfektoitiin ohimenevästi SP1 ja sitten käsiteltiin flavokawain B. Kuvassa 5D että yliekspressio SP1 lisääntynyt AR proteiinin tasot ja vaimensi flavokawain B aiheuttama AR alassäätöä. Yhdessä tuloksemme osoittavat selvästi, että flavokawain B pienenee SP1-proteiinin ilmentymisen, mikä johtaa AR transkription säätely alaspäin.

(A) .C4-2B solut ko-transfektoitiin PSA-Luc tai plARS-Luc, yhdessä Renilla lusiferaasiplasmidin pGL 4,71 ja Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin. FKB merkittävästi vähentää promoottorin toimintaa

AR

ja

PSA

geenejä (Student

t

testi, P 0,01). Palkit ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) .Western blotting-analyysi SP1 proteiinin ilmentymisen. Edustava blot näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. α tubuliinin havaittiin latauskontrollina. (C). ChIP analyysi sitoutumisen SP1 AR promoottorisekvenssin käy ilmi, että 16 tunnin FKB käsittely johtaa merkittävään vähenemiseen sitoutumisen SP1 AR-promoottorin sekvenssin, joka sisältää kaksi SP1 sitovaa kohtaa. Hiiren IgG: tä käytettiin nollakoe. (D). N yli-ilmentyminen SP1 C4-2B soluissa vaimentaa FKB aiheuttama AR proteiinin alassäätöä. 48 tunnin kuluttua on SP1-HA-plasmidin transfektion C4-2B soluja käsiteltiin FKB 16 tuntia. SP1 AR proteiinin tasot tutkittiin. Edustava blot näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. α tubuliinin havaittiin latauskontrollina.

Kavalactones ja flavokawain B yhdistelmä johtaa parannettu estävä vaikutus kasvuun C4-2B solujen ja ekspressioon AR proteiinin

Kuva 6A ja B osoittavat, että 7,5 ug /ml yangonin ja 1 ug /ml flavokawain B yksin inhiboi kasvua C4-2B-solujen 15% ja 20%, vastaavasti, kun taas niiden yhdistelmä vähensi kasvua yli 70%. Samoin, 5’6′-dehydrokawain annoksella 7,5 ug /ml vähensi kasvua C4-2B solujen vähemmän kuin 5%, kun taas sen yhdessä 1 ug /ml flavokwain B esti kasvua noin 60%. Yhdenmukainen tämän seurauksena, flavokawain B yhdessä muiden kavalactones (ts kawain ja methysticin) johti myös synergistinen inhiboiva vaikutus kasvuun C4-2B-solujen (kuvio 6C ja D). Lisäksi yhdistelmä 5’6′-dehydrokawain tai yagonin kanssa flavokawain B hoitoja johti parannettu säätely alaspäin AR proteiinin ilmentymistä sekä C4-2B ja 22Rv1 soluja (kuvio 6 E ja F). Erityisesti, 22Rv1 harbours AR silmukoivat, jonka molekyylipaino on noin 80 kD [15]. Flavokawain B ja 5’6′-dehydrokawain ovat tehokkaampia ekspression vähentämiseen AR silmukoivat kuin AR täyspitkän (kuvio 6F). Nämä tulokset osoittavat, että kavalactones ja flavokawain B toimivat synergistisesti tai additiivisesti estävän kasvua Eturauhassyövän soluja ja alas-säädellä proteiinin ilmentymistä AR ja AR silmukointivariantin.

kasvua estävä of FKB ja yagonin (A), tai 5’6; -dehydrokawain (B), tai kawain (C), tai methysticin (D) yksinään ja yhdistelmänä on C4-2B soluissa. Jokainen piste on keskiarvo neljästä riippumattomasta kokeesta; baareja, SD. Jokainen näyte laskettiin kahtena kappaleena. IC

50 s arvioitiin annos-vaste käyrät, IC

50 s ja yhdistelmät ovat huomattavasti alhaisemmat kuin hoitoja yksin (Student

t

testi, P 0,01). (E) ja (F) Western blotting -analyysi ekspression täyspitkän AR (110 kDa), AR silmukointivariantin (83 kDa), ja PSA: C4-2B ja 22Rv1 soluja, vastaavasti. Edustava blot näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. α tubuliinin havaittiin latauskontrollina.

kava purkaa ja flavokawain B vähentää kasvua potilaasta johdettujen PCa ksenograftien SCID-hiirissä, AR ilmentyminen kasvaimen kudoksissa ja seerumin PSA tasot

määrittämiseksi

in vivo

anti-PCa vaikutus kava uutetta ja flavokawain B kehitimme kaksi kliinisesti merkittäviä, potilaasta peräisin PCa ksenograftimalleja, GM0308 ja RC0309. GM0308 potilaasta johdettujen PCa xengrafts linja oli peräisin korkealaatuisesta (Gleason summa = 5 + 5) PCa eturauhasen näyte saadaan potilaalta, joka oli aiemmin hoidettu androgeenien puute hoitoa (ADT), dosetakselia ja karboplatiinia, ja etoposidin plus sisplatiinia. Ksenograftikudoksista kasvaimen kasvun perustettiin alun perin käyttäen sisälsivät kapselin alle ksenografti tekniikkaa, ja sitten läpi ihonalaisen kasvaimen kappaletta. RC0309 linja oli peräisin korkealaatuisesta (Gleason summa = 5 + 4) PCa eturauhasen näyte saadaan potilaalta, jolla ei ollut aikaisempi hoito. Nämä ihmisen syövän ksenografteissa uskollisesti säilyttää histopatologinen piirteet alkuperäisen kliinisestä näytteestä. Molemmat linjat erittävät PSA vastaanottavaan hiiren seerumia (kuvio 6A). GM0308 se ilmentää katkaistun AR noin 80 kDa, ilman missensemutaatioita eksoneissa 3, 4 tai 5 (tuloksia ei esitetty). Sen sijaan, RC0309 pitää täyspitkän AR (tuloksia ei ole esitetty).

Hiiret, GM0308 kasvaimia kanavan 3 käsiteltiin ajoneuvon ohjaus- tai 200 mg /kg flavokawain B päivittäin IP injektiona 28 päivää. Kuvio 6A esittää progressiivisen -tuumoriksenografti kasvun ja seerumin PSA nousu koko tutkimuksen ajoneuvojen kontrolliryhmään. Flavokawain B hoito, johti kuitenkin vähentynyt kasvaimen kasvunopeus verrattuna kontrolliryhmään koko tutkimuksen ajan (kuvio 7A). Märkä kasvain painoja tai seerumin PSA-ohjaus ja flavokawain B-hoidetussa ryhmässä kirjattiin lopussa hoidossa ovat 0,43 ± 0,27 g ja 0,097 ± 0,048 g, tai 66,6 ± 12,8 ng /ml ja 18,4 ± 4,8 ng /ml, vastaavasti ( keskiarvo ± SD, n = 13 valvontaa ja n = 6 FKB hoitoryhmissä; P 0,001, Studentin t-testi). Flavokawain B käsittely heikennetty kasvaimen kasvua 77,3% ja laski seerumin PSA-tasojen 68% lopussa hoidon.

(A) ja (B). Hiiret joissa potilaasta peräisin PCa kasvaimia jaettiin satunnaisesti tutkimus- ja kontrolliryhmiin samanlaisia ​​ennen hoitoa seerumin PSA-tasot kussakin ryhmässä. Tuumoritilavuudet ja seerumin PSA rekisteröitiin ja esitetään keskiarvona ± SD. Märkäpaino kasvaimia on esitetty keskiarvona kasvainten yksittäisistä hiiren kussakin ryhmässä. Bars, tarkoittaa ± SD. Kasvaimen tilavuudet (toistuva-toimet varianssianalyysi (ANOVA), p 0,01) ja kasvaimen painot (Student

t

testi, P 0,01) ja FKB ja KRE hoidettujen hiirten olivat merkittävästi alhaisemmat kuin ajoneuvon kontrolli käsitellyissä hiirissä. (C). Immunohistologia värjäytymistä AR ilmaisun kasvainkudoksissa. Ohjaus immunovärjäyksellä suoritettiin IgG isotyyppiä yksin Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä ja valokuvattiin käyttäen valomikroskoopilla. Alkuperäinen suurennus: × 200. (D). AR positiiviset solut laskettiin 12 kentästä kussakin ryhmässä. Prosenttiosuus AR-positiivisten solujen laskettiin ja esitetään keskiarvona ± SD (vasemmalla kaksi paneelia). MRNA tasot

AR

,

PSA

ja

TMPRSS2

kasvainkudoksissa vehikkeliä tai FKB analysoitiin RT reaaliaikainen PCR (oikealla paneeli). Bars, tarkoittaa ± SD. Prosenttiosuudet AR positiiviset solut ovat merkittävästi alhaisemmat KRE ja FKB hoidettujen ryhmien kuin ajoneuvon ohjaus testiryhmään (Student

t

testi, P 0,01). MRNA tasot

AR

,

PSA

ja

TMPRSS2

on pienempi KRE ja FKB hoidettujen ryhmien kuin kontrolliryhmissä (Student

t

testi, P 0,01).

Hiiret, RC0309 kasvaimia passage 13 syötettiin ruoan täydennetty ajoneuvon hallintaan tai 6 g /kg, kava uute 18 päivää. Samoin kava juuriuutetta lisäravinteen johti merkittävään lasku kasvuvauhti kasvainten verrattuna ajoneuvon ohjaus (kuvio 7B, ANOVA, P 0,01). Märkä kasvain painot olivat 1,83 ± 0,79 g kontrolliryhmässä ja 0,73 ± 0,34 g vuonna kava juuriuutetta ryhmä (kuvio 7B; n = 5, keskiarvo ± SD; P 0,05, Studentin t-testi). (B). (C).