Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Epigeneettiset ja geneettinen muutos on merkittävä rooli kehittämiseen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC). Tupakan kulutus (tupakointi /pureskelua) ja ihmisen papilloomaviruksen (HPV) liittyvät myös kasvua riskiä HNSCC. Promoottori hypermetylaatiota tuumorisuppressiogeeneksi geenien liittyy transkription inaktivointi ja menetys geenin ilmentymisen. Olemme tutkineet epigeneettiset muutos (promoottori metylaation kasvaimeen liittyvien geenien /loci) kasvainkudoksissa yhteydessä geneettinen muutos, virusinfektio, ja tupakan altistuksen ja selviytymisen tila.

Menetelmät

Tutkimus mukana 116 kudosnäytteet (71 kasvain ja 45 normaaleissa kudoksissa) Koillis Intian väestöstä. Metylaatiospesifisen polymeraasiketjureaktio (MSP) käytettiin määrittämään metylaatiostatuksen 10 kasvaimeen liittyvien geenien /loci (

p16

,

DAPK

,

RASSF1

,

BRAC1

,

GSTP1

,

ECAD

,

MLH1

,

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

). Polymorfismia

CYP1A1

,

GST

(

M1

T1

),

XRCC1

ja

XRCC2

geenit tutkittiin käyttämällä polymeraasiketjureaktiota-restriktiofragmenttipituuspolymorfismin (PCR-RFLP) ja multiplex-PCR vastaavasti.

Keskeiset havainnot

valvomaton hierarkkinen klusterointi analyysi perustuu metylaatiokuvion nimennyt kaksi kasvain klustereita, jotka merkittävästi poikkeavat CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP), tupakka,

GSTM1

,

CYP1A1

, HPV ja selviytymisen tila. Analysoimalla metylaatio geenien /loci yksilöllisesti, olemme löytäneet merkittävän korkeammat metyloinnin

DAPK

,

RASSF1

,

p16

ja

MINT31

geenejä (

P =

0,031, 0,013, 0,031 ja 0,015 vastaavasti) HPV (+) tapauksessa verrattuna HPV (-). Lisäksi CIMP korkea ja Cluster-1 ominaisuus myös yhteydessä huonoon säilymiseen.

Johtopäätökset

Promoottori metylaatio profiilit heijastavat korrelaatio tupakkaa, HPV, selviytymisen tila ja geneettinen muutos ja voivat toimia merkkiaineena määrittää alatyyppejä ja potilaan lopputulokseen HNSCC.

Citation: Choudhuryn JH, Ghosh SK (2015) Promoottori hypermetylaation Profilointi Tunnistaa alatyypeistä Pään ja kaulan syövän kanssa Distinct Viral, ympäristö-, geneettiset ja Survival ominaisuudet. PLoS ONE 10 (6): e0129808. doi: 10,1371 /journal.pone.0129808

Academic Editor: Dajun Deng, Pekingin yliopiston Cancer sairaalan ja Institute, Kiina

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 13 toukokuu 2015; Julkaistu: 22 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Choudhuryn, Ghosh. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

maailmanlaajuisesti pään ja kaulan alueen syöpä on viides yleisin syöpä ja kattaa yli 550000 uutta tapausta vuosittain [1]. Kulutusten tupakan (tupakointi ja pureskelua), alkoholi ja HPV-infektio ovat tunnettuja riskitekijöitä kohti kehittymistä ja etenemistä pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [2, 3]. Intiassa HNSCC on syvällinen tupakointi, betelpähkinöiden mälli ja tupakka pureskelua profiilin ja suhteellisen huono selviytyminen [4-6]. Kuitenkin HPV positiivinen (+) HNSCC oli selvä riskiprofiili ja liittyy parempaan selviytymisen verrattuna HPV negatiivinen (-) HNSCC [7]. Geneettinen muutos kuten mutaatioita ja geneettisten polymorfismien myös keskeinen mekanismi HNSCC [8-11]. Lisäksi, epigeneettinen muokkaus (vaihtelu geeniekspression vaikuttamatta primaarisen sekvenssin DNA: n) voidaan muuttaa ekspression avaimen kasvaimeen liittyviä geenejä ja näin ollen pidetään olennaisena pelaaja kehittää erilaisia ​​syöpiä [12-14].

hypermetylaatiota CpG saaria promoottorialue geenien (osallistuvien solukierron säätelyssä, apoptoosin, DNA-vaurioiden korjaus ja vieroitus koulutusjakson) liittyvät syövän etenemiseen ja kehitykseen. Näin ollen poikkeava metylaatio CpG-saarekkeiden on yksi epigeneettisiä muutoksia lupaava valtavan potentiaalin molekyyli- biomarkkeri ennustamiseksi ja havaitsemiseksi erilaisia ​​syöpiä [15, 16]. CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) liittyvät kasvaimet ovat erillinen ryhmä määritellään CpG-rikas promoottori hypermetylaation useita geenejä ja on selkeä epidemiologian ja molekyylitason ominaisuudet [17-20]. Käsite CIMP ehdotettiin ensimmäisen peräsuolen syövän molekyyli merkki [21], myöhemmin se tutkittiin myös muissa elimissä. Kuitenkin rooli CIMP väylän tumorgenesis on HNSCC on vielä tuntematon. Suurimmat kohdata opiskelusta ja tutkimalla CIMP liittyvien kasvainten on määritellä erityisiä metyloidut loci että olisi käytettävä CIMP paneeli. Poikkeava metylaatio normaalisti metyloitumattoman CpG-saarekkeiden liittyy transkription inaktivointi ja siten menetys geenin ilmentymisen. Viimeaikaiset tutkimukset suoritettiin eri kasvaimeen liittyvien geenien myös osoittanut ero metylaatiokuvion in HNSCC [22-26]. Arvioida ja näytön CIMP tilan syöpien, Park etal [27] ehdotti paneeli geenien koostuu

p16 /CDKN2A

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

ja

MLH1

(viitataan klassiseksi CIMP paneeli) kantavassa taajuudet hypermetylaation paneelissa kuuden geenin (

ECAD

,

p16

,

DAPK

,

MGMT

,

RASSF1

ja

TIMP-3

) havaittiin erittäin suuri pään ja kaulan alueen syöpä. [28] Toisessa tutkimuksessa, poikkeava metylaatio

MINT1

ja

MINT31

havaittiin liittyvän huonoon ennusteeseen [29]. Aikaisemmat tutkimukset kertoi myös, että

p16

ja

DAPK

poikkeava metylaatio oli yhteydessä huonoon ennusteeseen suusyöpä [30, 31]. Siksi ehdotimme CIMP paneeli seitsemän geenien, mukaan lukien;

DAPK

(kuolemaan liittyvä proteiinikinaasi),

RASSF1

(Ras yhdistys domain perhe-1),

BRCA1

(rintasyöpä 1),

MLH1

(mutL- homologia 1),

p16

(sykliiniriippuvainen estäjä 2A),

ECAD

(epiteelin kadheriinin),

GSTP1

(glutationi S-transferaasi pi-1 ), ja kolme metyloituja loci kuten

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

(metyloitu kasvaimen 1, 2 ja 31 vastaavasti). Viimeaikaiset epigeneettiset tutkimukset eri syöpiä lähinnä monigeenisiin lähestymistapaan, yhdistysten HPV-infektio ja clinicpathological datan ja geneettisiin muutoksiin [32-34]. HPV onkoproteiineja E6 ja E7 tiedetään liittyvän genomin epästabiilisuuden inaktivoimalla p53 ja Rb-tuumorisuppressorin proteiineja solusyklin reitin [35], tämän lisäksi HPV moduloi myös poikkeava DNA: n metylaatio isännän genomin [36] ja aiheuttaa syöpää prosesseja. Viime vuosina monet tutkimukset oli suoritettu selittämään yhdistys HNSCC kanssa vuorottelu xenobiotic ja DNA korjaukseen liittyvän reitin geenit sekä geenien geeni ja geeni-ympäristö vuorovaikutus [37, 38]. Tahara et al. [39] osoitti geneettiset tekijät, jotka liittyvät DNA: n korjautumista tai xenobiotic reittejä voi olla rooli CpG-saarekkeen hypermetylaation liittyvät mahasyövän. Kuitenkin, ei ollut tällaista tutkimuksissa keskitytään promoottorin metylaation profiilin HNSCC yhdistelmä geneettisiä riskitekijöitä liittyvät ksenobioottien ja DNA korjaukseen liittyvän reitin. Niinpä vaihtelu promoottori hypermetylaation rakenteessa HNSCC perustuu tapoihin, geneettinen muutos ja HPV-infektio on edelleen epäselvä.

Ymmärtää taustalla olevien mekanismien erot malleja kasvainspesifisten hypermetylaation, olemme analysoineet poikkeava promoottori metylointi profiili of HNSCC seitsemällä tärkeä kasvaimeen liittyviä reitin geenit mukaan lukien

DAPK

,

RASSF1

(apoptoosireitin),

BRCA1

,

MLH1

(DNA: n korjaukseen reitti),

p16

(solukierron reitti),

ECAD

(solu-soluadheesion),

GSTP1

(Xenobiotic reitti) ja kolme metyloitu loci (

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

) korkean syövän ilmaantuvuus alue Koillis-Intia. Parhaan tietomme mukaan olemme ensimmäinen tutkia; korrelaatio CIMP ominaisuuksien geneettisen (polymorfismia

GSTM1

,

GSTT1

,

CYP1A1

,

XRCC1

ja

XRCC2

geenit ) ja ympäristötekijät (tupakointi, betelpähkinät mälli ja tupakka pureskelua) sekä HPV ja selviytymisen tila HNSCC potilaista. Lisäksi teimme hierarkkinen klusterianalyysin tunnistaa erillisiä osajoukot HNSCC perustuu promoottori metylointi profiilin.

Materiaalit ja menetelmät

Kokoelma HNSCC kudosten

Tässä tutkimuksessa, tutkimme 116 kudosnäytteet, mukaan lukien 71 kasvain näytteitä HNSCC ja 45 viereisten normaaleissa kudoksissa, kerätty eri sairaaloista Koillis Intian 2009-2013. Potilaat antoivat kirjallinen lupa ennen keräämistä näytteistä. Basic demografiset tiedot, kuten ikä, sukupuoli, tupakka (tupakointi /pureskelua) kulutus, ruokatottumukset jne kerättiin yhdenmukaisella lomakkeella.

Ethics lausunto

Collection, suostumuslomakkeesta ja analysointi kudosnäytteiden hyväksyttiin institutionaalisten eettisen komitean (IEC), Assam University, Silchar, Assam, Intia.

DNA: n eristämiseksi

Perimän DNA uutettiin biopsianäytteissä, kirurgisesti poistettu syöpä kudoksiin, ja viereisten normaaleissa kudoksissa tavallisilla fenoli /kloroformiuutolla protokollaa ja myös Bioline Eristä Genominen DNA MINIKIT (Bioline, UK) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutettu DNA liuotettiin sitten TE (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA), puskuria ja säilytettiin -80 ° C: ssa lisäanalyysiä varten. [40]

HPV havaitseminen

kudosnäytteiden seulottiin käyttämällä joukkoa konsensusalukkeilla My9 /My11 vahvistamiseksi HPV L1-geenin fragmentteja, jotka voivat tunnistaa riskialttiit kannoista HPV [32]. Monistus suoritettiin 20 ul reaktioseosten sisältää 2X Biomix (Bioline, UK), eteen ja taakse alukkeita, 2 ui näytettä ja nukleaasin vapaata vettä. PCR-reaktioseos saatettiin alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 35 sykliä 94 ° C: ssa 45 s, 47 ° C 1 min ja 72 ° C 1 min. Lopullinen pidennys suoritettiin 72 ° C: ssa 10 min. Kaikki mahdolliset varotoimenpiteet, myös negatiiviset kontrollit, joilla pyritään minimoimaan ristikontaminaation. PCR-tuotteet havaittiin 2% agaroosigeelissä etidiumbromidivärjäyksellä.

Genetic polymorfismia karsinogeeni metaboloivien (

GSTM1

,

GSTT1

ja

CYP1A1

) ja DNA korjaus (

XRCC1

ja

XRCC2

) geenien

polymorfismia

CYP1A1

(T3801C),

XRCC1

( Arg399Gln) ja

XRCC2

(Arg188His) geenit analysoitiin polymeraasiketjureaktiolla-restriktiofragmenttipituuspolymorfismin (PCR-RFLP) -menetelmää. Polymorfisen on

CYP1A1

,

XRCC1

ja

XRCC2

monistettiin käyttämällä julkaistiin eteen- ja taaksepäin alukkeiden [37, 41] 20 pl PCR-reaktioissa. Jokainen PCR-reaktioseos sisältää 10-100 ng genomista DNA: ta, 20 pmol kutakin aluketta, 10X reaktiopuskuria, dNTP-seosta,

Pfu

DNA-polymeraasia, MgCl

2 ja nukleaasin vapaan veden (NFW). PCR-reaktioseos oli asetettu kanssa alkudenaturaatio 94

° C: ssa 5 min, jota seurasi 35 sykliä 94

° C: denaturaatio 45 s, 62

° C /58

° C /60

° C: ssa (

CYP1A1

,

XRCC1

ja

XRCC2

vastaavasti) varten 45s varten alukkeen ja pidennys 72

° C: ssa 1 min. Lopullinen pidennys suoritettiin 72

° C: ssa 10 minuutin ajan. PCR-tuotteiden

CYP1A1

,

XRCC1

ja

XRCC2

pilkottiin erikseen restriktioentsyymillä

MSP1

,

HpaII

ja

HphI

entsyymejä (New England BioLabs, USA), vastaavasti. Pilkontatuotteet sitten eroteltiin 3% agaroosigeelillä arvioimaan koko PCR-RFLP tuotteita [37]. Genotyypitys

GSTM1

ja

GSTT1

tehtiin multiplex PCR: llä käyttämällä

CYP1A1

geenin sisäisenä kontrollina, kokonaistilavuudessa 10 ui reaktioseosta 2X Biomix (Bioline, UK) ja 10 pmol kutakin eteenpäin (F) ja taaksepäin (R) alukkeet (S2 taulukko). PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelissä värjätty etidiumbromidilla.

Järjestäjä hypermetylaation analysointi ja arviointi CIMP-aseman

Promoottori metylaatiostatuksen kasvaimeen liittyvien geenien (

RASSF1

,

DAPK

,

ECAD

,

BRCA1

,

MLH1

,

p16

ja

GSTP1

) ja kolme metyloitu loci (

MINT1

,

MINT2

, ja

MINT31

) analysoitiin metylaatiospesifisen PCR (MSP) alukkeet (S2 taulukko). MSP-määritys, DNA-näytteille tehtiin modifiointia käyttäen Imprint1 DNA Modification Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), seuraavia ohjeita, kuten on kuvattu valmistajan [18]. Tässä menettelyssä DNA denaturointi- ja bisulfiittimodifikaatio suoritetaan samanaikaisesti. Bisulfiitti reagoi yksijuosteisen DNA deaminate sytosiini (C) ja muuntaa metyloitumattoman sytosiinin (C) ja urasiilin (U) ja jättää 5-metyyli sytosiini ennallaan ja syntyy erilaisia ​​sekvenssejä metyloidulle ja metyloitumaton DNA. Sitten olemme käyttäneet kahta erilaista alukkeet kunkin geenin, joka on yksi tietty joukko alukkeita metyloitua DNA: ta ja toinen unmetyhlated DNA. Käytimme myös DNA: perifeerisen veren lymfosyytit terveiden yksilöiden ilman HPV-infektio, negatiivisena kontrollina, ja DNA: ta perifeerisen veren lymfosyyttejä käsiteltiin SSSI methyltranferase käytettiin positiivisena kontrollina (metyloidulle DNA). Kaikki PCR-reaktio suoritettiin gradientilla lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Inc., CA, USA), ja monistetut tuotteet metyloidulle ja metyloimattomien DNA ajettiin rinnakkain agaroosigeelillä vertailua varten. Tässä tutkimuksessa CIMP paneeli luokiteltiin kolmeen ryhmään: CIMP-korkea (vähintään 5 geenien /loci metyloitu 10), CIMP-matala (vähemmän 5/10 geenit /loci metyloitu), ja CIMP-negatiivinen (0/10 geenit /loci metyloitu). Tämä luokittelu tehtiin pohjalta kriteerien aiemmin käytetty CIMP asema muissa tyyppisten kasvainten [19, 42]. Metylointi indeksi (MI) laskettiin myös kunkin tapauksen kautta jakamalla määrä Metyloidut geenien /lokuksiin kokonaismäärä geenin /loci tutkittavana.

Survival analyysi

Survival laskettiin kuukausina alusta hoidon kuukauden deathusing Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrien SPSS-ohjelmiston, versio 18 (Windows). Kuolemista johtuu taudeista /komplikaatio muu kuin syöpä karkotettiin tutkimuksesta. Yhdistyksen eri ominaisuuksien (HPV, CIMP ja klusteri) ja kuolemantapauksessa analysoitiin käyttäen Log-rank (Mantel-Cox) testejä.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS ohjelmistoversio 18 ja kaksipuolisen

P

-arvo 0,05 (kaksisuuntainen) pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Käytimme Wilcoxonin-summa testi verrata promoottori metylaatiotasoilla of HNSCC kasvain näytteet ja normaali näytteet, jotka sallivat vertailun kahden ryhmän riippumattomien näytteiden [43]. Merkittävä arvot oikaistiin lisäksi useiden testausta Bonferroni menetelmällä (

P

-arvo kerrottuna vertailujen määrä). Myös vahvistaa yhdistyksen eri tekijöiden ja CIMP in HNSCC riskiä, ​​

P

-arvot laskettiin säätämisen jälkeen sekoittavat tekijät, kuten ikä, sukupuoli, HPV, tupakointi, betel-mälli ja tupakan pureskelu tila tarvittaessa. Testi lineaarisen trendin tehtiin myös useita järjestysluku CIMP tila. Valvomatta hierarkkinen klusterointi tehtiin käyttäen JMP 12 ohjelmistopaketti SAS, joka tunnistaa alaryhmiä joukossa HNSCC potilaiden perustuu promoottori metylaatio taajuudella.

Tulokset

Ominaisuudet potilaiden

kliinis tiedot 71 tutkittu HNSCC potilaalla on koottu taulukkoon 1, käsitti 51 (71,8%) mies- ja 20 (28,2%) naisilla, joiden ikä valikoima 23-86 vuotta (77,5% kuuluu ikäryhmään 45-86). Niistä 71 HNSCC potilaita; 38 (53,5%) suun syöpä (mukaan lukien posken, kielen tyveen, kielen, gingivam, ja suun limakalvo) 16 (22,6%) oli kurkunpään syöpä, 8 (11,2%) oli nielun syöpä ja 9 (12,7%) oli muita syöpä tyyppejä pään ja kaulan alueella. Mukaan TMN luokitusta, suurimmalla osalla potilaista oli pitkälle (III /IV) (67,3%) diagnoosi. Niistä HNSCC potilaille, tupakoitsijoita, betelpähkinöiden mälli chewers ja tupakan chewers olivat 71,8%, 66,2% ja 74,6% vastaavasti.

Taajuuksia promoottorin hypermetylaatio Tuumorinäytteissä of HNSCC potilaiden ja normaaleissa kudoksissa

Promoottori hypermetylaation tilan

p16

,

DAPK

,

GSTP1

,

RASSF1

,

BRCA1

,

ECAD

,

MLH1

,

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

geenien 71 HNSCC ja 45 normaalien kudosten näytteiden esitetty taulukossa 2 . Kasvain kudokset oli paljon suurempi geenit /loci hypermetylaation taajuus verrattuna normaaliin kudosnäytteet (32,4% vs. 13,3% ja

p16

, 29,6% vs. 11,1% ja

DAPK

, 18,3% vs . 8,9%

BARC1

, 31% vs. 15,6% ja

GSTP1

, 32,4% vs. 8,9%

ECAD

, 50,7% vs. 22,2% for

RASSF1

, 5,6% vs. 2,2%

MLH1

, 43,7% vs. 13,3% ja

MINT1

, 52,1% vs. 11,1% ja

MINT2

ja 46,5% vs. 17,8% ja

MINT31

). Kuitenkin merkittävästi korkea hypermetylaation havaittiin

p16

,

DAPK

,

ECAD

,

RASSF1

,

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

(

P

= 0,02, 0,02, 0,04, 0,02, 0,01, 0,01 ja 0,01 vastaavasti) on HNSCC kudoksissa verrattuna normaaliin kudosnäytteiden . Metylointi indeksi (MI) (lukumäärän suhde metyloituneiden promoottoreita ja kokonaismäärä promoottoreita tutkitaan) vaihteli 0-0,9 71 potilasta. Niistä 71 HNSCC potilaat 14 (19,7%) oli 0 (nolla) MI, 33 (46,5%) oli MI 0,1-0,5 ja 24 (33,8%) potilaista oli MI of 0,6-0,9. HNSCC potilaalla on erilaisia ​​tapoja ja geneettiset profiilit todettiin näytteille ero metylaatio indeksi (MI). Mean MI tupakan chewers /tupakoitsijat oli korkeampi kuin ei chewers /tupakoitsijoita. Samoin potilailla, joilla on

GSTM1

null,

CYP1A1

CC genotyyppi ja HPV (+) esitetään myös korkeampi metylaatio indeksi (kuvio 1).

Jokainen rasiakuvaaja edustaa ero metylaatio index (MI) tupakoitsijoiden /chewers ja tupakoimattomien /chewers tai villi genotyypin vs. variantin genotyypin tai HPV (+) vs. HPV (-) HNSCC potilailla.

Promoottori metylaatiostatuksen HPV positiivinen (+) ja HPV negatiivinen (-) HNSCC

tutkimuksessa HPV havaittiin 37 ulos 71 tapausta (52.11%) käyttäen konsensusalukkeilla. Korrelaatio metylaation kasvaimeen liittyvien geenien ja HPV oli yhteenveto taulukossa 3. Tulokset osoittavat, että promoottori metyloinnin

DAPK

,

RASSF1

,

p16

ja

MINT31

olivat merkittävästi suuremmat HPV positiivinen (+) HNSCC potilaista verrattuna HPV negatiivinen (-) potilasta (

P

= 0,031, 0,013, 0,031 ja 0,015) (kuvio 2B). Erittäin merkittävää yhteyttä välillä havaittiin HPV-positiivinen (+) kasvaimet ja CIMP-korkea ryhmä (

P

= 0,028). Kuitenkin, ei ole korrelaatiota CIMP-matala ja HPV (+) HNSCC (

P

= 0,477), verrattuna HPV (-) HNSCC kasvaimia.

(A) Kaplan-Meier- selviytyminen koealojen: (i) HPV (+) HNSCC kasvaimia, joilla on paremmat selviytymisen verrattuna HPV (-) kasvaimia. (Ii) CIMP-korkea ryhmä HNSCC kasvainten osoittaa huonompi eloonjäämisen verrattuna muihin. (Iii) kaksi epigeneettisellä klusteri osoitti myös ero selviytymisen cluster-1 oli huono selviytymisen. (B) tiheys promoottorin metylaation 10 kasvaimeen liittyvien geenien /loci HPV (+) ja HPV (-) HNSCC [* P 0,05 (Mantel-Cox Log-rank)]. (C) Metylointi indeksi (MI) kolmessa CIMP-ryhmää HNSCC kasvaimia.

CIMP vuonna HNSCC tuumorikudoksissa

Tässä tutkimuksessa CIMP asema luokiteltiin CIMP -korkea (viisi tai enemmän metyloitu geenejä), CIMP-matala (vähemmän kuin viisi metyloitu geenit) ja CIMP-negatiivinen (ei metyloitu geenejä). Niistä 71 HNSCC näytteet, 39,4% (28/71) oli CIMP korkea, 42,3% (30/71) oli CIMP-alhainen ja 18,3% (13/71) oli CIMP-negatiivisia.

Korrelaatio ympäristötekijät ja CIMP

Kun olemme analysoineet ympäristötekijöihin kuten tupakointi, betelpähkinöiden mälli pureskelua ja CIMP ja löytänyt tupakointi ja tupakan pureskelu oli vahva korrelaatio CIMP-korkea (

P

= 0,008 ja 0,034) kuin CIMP-negatiivinen. Kuitenkin betel mälli pureskelu ei ollut merkittävää korrelaatiota CIMP-markkereita. Myös ollut löytänyt mitään merkittäviä eroja CIMP-low Vs CIMP-negatiivisia ja CIMP-korkea vs CIMP-alhainen suhteessa tupakoinnin tai pureskeltavaksi (taulukko 4).

korrelaatio geneettisten tekijöiden ja CIMP

myös korreloida geneettisen muuttamisen tiedot karsinogeeni metaboloivien (

GSTM1

,

GSTT1

ja

CYP1A1

) ja DNA korjaus (

XRCC1

ja

XRCC2

) geenien kanssa CIMP paneeliaineisto. CIMP-korkea kasvaimet olivat merkittävästi korkeammat taajuus

GSTM1

null, verrattuna CIMP-matala ja CIMP-syöpäkasvain (

P

= 0,004 ja 0,023 vastaavasti). Kuitenkin, ei ollut merkittävää korrelaatiota

GSTT1

(nolla),

CYP1A1

(T3801C),

XRCC1

(Arg /Gin) ja

XRCC2

(Arg /His) variantti genotyypit ja eri CIMP markkereita (taulukko 4).

Survival korreloi CIMP ja HPV

Survival tutkittiin suhteessa CIMP markkereita käyttäen Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrien (kuvio 2A). Analyysi paljasti, että yleinen mediaani elinaika 47 potilasta 71 oli 15 kuukautta [95% CI = 10,97-19,03], ja mediaani eloonjäämisaika in CIMP-korkea, CIMP-matala ja CIMP-negatiiviset olivat 11 kuukautta [95% CI = 7,71-14,28] 18 kuukautta [95% CI = 13,73-22,26] ja 19 kuukautta [95% CI = 5,14-32,85], tässä järjestyksessä (

P

trendi

= 0,011). Jälleen Keskimääräinen elinaika varten Cluster-1 ja Cluster-2 ominainen olivat 13 ja 18 kuukauden vastaavasti (

P

= 0,026) (S1 taulukko). CIMP korkea ja Cluster-1 oli merkitsevästi yhteydessä huonoon säilymiseen potilaiden kanssa HNSCC. Katsovat, elinaika HPV (+) HNSCC potilailla oli parempi (17 kuukautta) kuin HPV (-) HNSCC potilaat (13 kuukautta) (

P

= 0,041).

Tunnistetut kasvain klustereita ja korrelaatio ympäristö-, geneettiset ja epigeneettiset ominaisuuksiin

Tässä tutkimuksessa, suoritimme valvomatta hierarkkinen klusterointi ja tunnistettu kaksi luokkaa tai alaryhmää, joka perustuu promoottori metylaatio tietoa kasvaimen näytteistä (kuvio 3). Olimme rakennettu hierarkkinen klustereita seitsemällä geenejä /loci, kun säädön jälkeen seitsemän geeniä /loci kymmenestä havaittu merkittävästi hypermetyloitunut. Kaksi tunnistettu klusterit oli selvä ympäristö-, geneettiset ja epigeneettiset ominaisuuksia ja on koottu taulukkoon 5. taajuus tupakoinnin (86,2%) ja tupakka-pureskelu (89,7%),

GSTM1

null (82,8%) ja

CYP1A1

(31.05%),

XRCC1

(27,6%) ja

XRCC2

(48,3%) variantti genotyyppejä oli suurempi Cluster-1 verrattuna Cluster-2. Kuitenkin vain tupakointi, tupakka pureskelua ja

GSTM1

null genotyyppi oli osoittanut tilastollisesti merkittävää vaihtelua joukossa klusterien (

P

= 0,048, 0,034 ja 0,002 vastaavasti). Myös taajuus HPV positiivinen (+) HNSCC kasvainten oli merkitsevästi suurempi (

P

= 0,009) in Cluster-1 verrattuna Cluster-2. CIMP-korkea ryhmässä (93,1%) on huomattavasti suurempi Cluster-1 (

P

0,001) verrattuna Cluster-2, kun taas, Cluster-2 ominaista CIMP-alhainen (66,7%) ja CIMP -negatiivinen ryhmät (30,9%).

eri tekijöitä heatmap edustivat värin vaihtelu: tupakka kuluttajille, HPV läsnäolo ja

GSTM1

null,

GSTT1

null (tumma punainen väri); tupakka kuin kuluttajien ja HPV puuttuminen

GSTM1

läsnä ja

GSTT1

läsnä (vaaleankeltainen väri). Sillä

CYP1A1

,

XRCC1

ja

XRCC2

tila: villityyppi (tummanpunainen); heterotsygoottinen (punainen) ja homotsygoottinen variantti alleeli (vaalean oranssi) ja CIMP tila: CIMP-korkea (tummanpunainen), CIMP-alhainen (punainen) ja CIMP-negatiivinen (vaalea väri).

keskustelu

kehittymistä ja etenemistä HNSCC on monivaiheinen prosessi moduloidun geneettisellä, epigeneettiset ja ympäristötekijät [2, 44, 45]. Tärkeimmät ympäristötekijät, kuten tupakoinnin ja pureskelua sekä HPV-infektio voi johtaa monenlaisia ​​geneettisiä ja epigeneettiset menettelyissä, jotka edistävät genomin epästabiilisuuden ja hyväksymään kasvainten kehittymiseen [3, 5, 9]. Promoottori hypermetylaation profiilia kasvaimeen liittyvien geenien odotettiin olevan ratkaiseva ja usein eri syöpiä. Monet epigeneettiset tapahtumat karsinogeenisia väyliä on tutkittu äskettäin ja paljasti havaitsemiseksi käytettävistä CpG-saarekkeen promoottori metylaatiokuvion ositusta riskiryhmiin eri syöpiä [15, 17, 18, 34]. Tämä auttaa varhaisten puhkeamista syöpä, ja ennustaa kliinisiä tuloksia. Sen vuoksi on välttämätöntä tutkia metylaatiostatuksen paneelin edustavien geenien HNSCC. Täällä, tässä tutkimuksessa olemme analysoineet poikkeava promoottori metylaatio profiilia HNSCC seitsemällä tärkeä kasvaimeen liittyvien reitin geenien (

p16

,

DAPK

,

GSTP1

,

ECAD

,

RASSF1

,

MLH1

ja

BRCA1

) ja kolme metyloitu loci (

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

) korkean syövän ilmaantuvuus alue Koillis-Intia. Tutkimuksessamme olemme myös korreloivat poikkeava metylaatiostatuksen potilaalla on geneettinen (polymorfismia

GSTM1

,

GSTT1

,

CYP1A1

,

XRCC1

ja

XRCC2

) ja ympäristötekijä (tupakointi, betelpähkinät mälli ja tupakan pureskelu) sekä Eloonjääntitulokset.

Löysimme huomattavasti korkeaa

p16

,

DAPK

,

ECAD

,

RASSF1

,

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

hypermetylaation in HNSCC kudoksissa verrattuna normaalin kudoksen näytteissä, mikä mahdollista osallistumista epigeneettisten muutos kohti kehittymistä ja etenemistä HNSCC. Nykyinen tutkimus kattoi laajasti ryhmä kasvaimeen liittyvän reitin geenit mukaan lukien

p16

(solusyklin kontrolli),

DAPK

,

RASSF1

(apoptoosin),

BRCA1

,

MLH1

(DNA korjaus),

ECAD

(solu-soluadheesion),

GSTP1

(karsinogeeni aineenvaihdunta),

MINT1

,

MINT2

ja

MINT31

(metyloitu loci kasvaimissa).

Useat aikaisemmat epigeneettisellä tutkimuksissa selvitetty olemassaolo HPV välittämän DNA-metylaation HNSCC [46, 47] . Tuoreessa tutkimuksessa Koillis Intia käyttäen paneelia 10 geenien, selitti rooli HPV ja tupakan synnyssä UADT syöpä [32]. Olemme kuitenkin analysoitiin edelleen hypermetylaation yksittäisten geenien /loci erikseen HPV (+) ja HPV (-) tapauksessa. Löysimme promoottori metyloinnin

DAPK

,

p

16,

RASSF1

ja

MINT31

merkitsevästi HPV (+) kasvain HNSCC. Näin ollen, HPV näytti olevan aiheuttava aine korjauksilla CpG-saarekkeen metylaation kasvaimen heikentävän geenien HNSCC. Yleisesti, HPV (+) HNSCC liittyy edullisemman selviytymisen [9], tutkimuksemme on myös tutkittu HPV (+) potilasta HNSCC oli parempi pysyvyys verrattuna HPV (-) potilailla, mikä mahdollinen tehtävä ennustetta.

monissa syöpätyyppejä, erityisesti kolorektaalisyöpä, CpG Island Methylator Fenotyyppikuvaus (CIMP) käytettiin tunnistamaan kliinisesti ja patologisesti asiaa subsets kasvaimia. Toyota et al. käyttöön CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) luokitella syöpää perusteella metylaatiostatuksen paneelin geenien [21]. Kolorektaalisyövässä, CIMP kasvaimia oli selvä epidemiologisten ominaisuuksien mikrosatelliittien epävakaus (MSI) profiilin BRAF mutaatioita ja selviytymistä, verrattuna ei-CIMP kasvaimia [48, 49]. CIMPs on raportoitu useita syöpiä, mukaan lukien ylemmän aerodigestive ruoansulatuskanavan (UADT) [32], suusyöpä [50], ja ruokatorven okasolusyöpä [51] ja rintasyövän [19]. Kuitenkin vain yksi tutkimus oli siellä HNSCC, jotka selittävät CIMP että alaryhmä HPV (+) kasvain HNSCC [33]. Hypermetylaation profiilia geenin promoottorit on monipuolinen kunkin syöpien ja myös havaitsemismenetelmä ja useita geenin valinta CIMP-paneeli vaihtelee tutkimuksissa. Perustuu hypermetylaation kuvio 10 kasvaimeen liittyvien geenien /loci, me luokitellaan HNSCC kolmeen ryhmään: CIMP-korkea, CIMP-matala ja CIMP-negatiivinen. Havaitsimme Tunnusomaista kasvaimen sisällä CIMP korkea ja CIMP-negatiivisia ryhmiä. Taajuudet tupakoinnin, tupakan pureskelu ja

GSTM1

null genotyyppejä potilaista oli merkitsevästi korkeampi CIMP-korkea ryhmissä verrattuna CIMP-negatiivinen. Geneettiset ja ympäristötekijät ominaisuudet voivat suoraan CIMP ominaisuuksiin HNSCC kasvaimia. Havaitsimme myös kaltevuus huono eloonjääntiaste CIMP-korkea kasvaimet verrattuna CIMP-negatiivinen ryhmä; osoittavat CIMP korkea voi olla ennustaja huono ennuste HNSCC Koillis Intian väestöstä. Se ei ehkä ole odottamatonta, että olemme löytäneet korrelaatiot CIMP korkea ja potilaiden huono tulos, jos verrataan meidän tiedot CIMP ja hengissä HNSCC muiden aikaisemmin kuvattujen syöpien [52, 53]. Syvällinen ymmärrys CIMP saattaa sallia suunnittelu parempaa hoitoa strategioita HNSCC.

Epigeneettiset klusterointi HNSCC potilaista tehtiin perustuu DNA: n metylaation profiileja kasvain kudosnäytteistä. Hierarkkinen klusterianalyysillä tunnistettu kaksi erillistä subsets, yksi alaryhmä HNSCC potilaalla on korkea taajuus tupakoinnin, tupakan märehtiä tavat,

GSTM1

null ja

CYP1A1

(CC) variantti genotyyppi. Klusteri-1 ominaista myös HPV (+) tapaukset, ja sisälsi CIMP korkea ryhmä, mikä mahdollinen korrelaatio DNA: n metylaation ja geneettiset ja ympäristötekijät HPV liittyviä HNSCC. Siten epigeneettiset ja yhdessä geneettinen muutos yhdistelmä ympäristötekijät voivat myös olla rooli osajoukko HNSCC. Aiemmissa tutkimuksessa löydettiin vahva vuorovaikutus karsinogeeniksi metabolisoivien geenien (

GSTM1

ja

GSTT1

) ja ympäristötekijöistä HNSCC [2]. Vuorovaikutus Phase-I (

CYP1A1

) ja Phase-II (

GSTM1

GSTT1

) tupakka karsinogeeneja metabolizing geenit voivat valaista kertyminen suurempaa määrää myrkyllisiä aineita kehossa että voisi olla pääosa kehittämisen aikana HNSCC. Lisäksi yksi meidän muiden tutkimuksessa selvitettiin vuorovaikutusta tupakan ja DNA korjaus (

XRCC1

ja

XRCC2

) geenipolymorfismien ja ylikuulumista näiden kahden DNA korjaavien geenien kohti herkkyyden HNSCC [37] . Tuoreessa tutkimuksessa Tahara et al. [39] havaittu yhdistyksen välillä

GSTM1

null genotyypin ja lisääntynyt alttius CpG hypermetylaation, mutta he löysivät alentuneen herkkyyden CpG hypermetylaatiota

DAPK

geenin

XRCC1

kodonissa 399 Gin