Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä (LC) ja sen eri alatyyppien kutsutaan yleisesti terapiassa kestävä syövän korkein sairastavuus maailmanlaajuisesti. Therapy vastus kasvaimen uskotaan liittyvän syövän kantasoluja (CSCS) sisällä kasvaimia. On ollut merkkejä siitä, että keuhkosyöpä on lisätä ja ylläpitää pieni väestö CSCS. Tutkimaan kysymystä perustimme paneeli 15 ensisijaisen keuhkosyövän solulinjoja (PLCCLs) 20 tuoreista primaarikasvainten käyttäen vankka seerumittomalla kulttuuri järjestelmä. Tämän jälkeen olemme keskittyneet tunnistamiseen keuhkojen CSCS tutkimalla näistä solulinjoista peräisin 4 edustava keuhkosyöpään alatyyppejä kuten pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), suuri karsinooma (LCC), levyepiteelisyöpä (SCC) ja adenokarsinooma (AC). Olemme tunnistaneet pieni populaatio soluja vahvasti positiivisia CD44 (CD44

korkea) ja valtaväestön joka oli joko heikosti positiivinen tai negatiivinen CD44 (CD44

low /-). Koekspressoimalla CD90 entisestään kavennetaan oletetun kantasolun väestön PLCCLs päässä SCLC ja LCC kuin sferoidiviljelmiä muodostavia soluja lähinnä tavataan CD44

highCD90

+ alaryhmästä. Lisäksi nämä CD44

highCD90

+ solut paljasti mesenkymaaliset morfologia, lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaalisten merkkiaineiden

N-kadheriinin

ja

vimentiinista

, lisääntynyt mRNA tasot alkion kantasoluilla liittyviä geenejä

Nanog

ja

Oct4

ja lisääntyneen resistenssin säteilytys verrattuna muihin osapopulaatioissa tutkittu, mikä viittaa CD44

highCD90

+ väestön hyvä ehdokas keuhkoissa CSCS. Molemmat CD44

highCD90

+ ja CD44

highCD90

– soluja PLCCL peräisin SCC muodostetaan pallosia, kun taas CD44

low /- solut ole tätä potentiaalia. Nämä tulokset osoittavat, että CD44

highCD90

+ väestöryhmästä voi edustaa CSCS vuonna SCLC ja LCC, kun taas SCC keuhkosyöpä alatyyppi, CSC potentiaaleja tavataan CD44

high alaryhmästä.

Citation: Wang P, Gao Q, Suo Z, Munthe E, Solberg S, Ma L, et al. (2013) tunnistaminen ja karakterisointi solujen syöpä Stem Cell Properties in Human Ensisijainen Keuhkosyöpä Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e57020. doi: 10,1371 /journal.pone.0057020

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 21. 2013 Julkaistu: 04 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Norja Research Council (SFI-CAST). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

”syöpä kantasolu” (CSC) teoria merkitsee hierarkkinen organisaatio kasvain, jossa CSCS edustaa kärkeen hierarkian. Samanlaisia ​​normaaliin kantasoluja, CSCS on kyky läpikäydä itseuudistumisen sekä epäsymmetrinen solunjakautumisen. Nämä keskeiset ominaisuudet mahdollistavat CSCS aloittaa ja ylläpitää kasvaimia. Lisäksi klassisen aikavälillä eli CSC erilaisia ​​termejä on käytetty hiljattain tieteellisessä kirjallisuudessa kuvaamaan perusominaisuuksiin CSCS kuten itsensä uudistaminen ja kasvaimen aloittamista /ylläpitää omaisuutta. Muun muassa ovat sellaiset termit kuin kasvain aloittamista solu (TIC), syöpä aloittamista solu (CIC) ja kasvaimen lisäys solun (TPC). Tässä raportissa käytämme CSC termiä kuvaamaan solut, jotka pystyivät aloittamaan ja ylläpitämään kasvainten muodostumista eläimissä ja pitkän aikavälin nesteviljelmä.

Nykyinen tutkimusten alalla syövän kantasolututkimuksen on myönnetty yhä enemmän todisteita olemassaolon ja tunnistaminen CSCS käyttää useita erityisiä biomarkkerit, kuten CD44, CD133: a ja CD90. Näillä merkeillä on laajasti hyväksytty eristämiseksi CSCS ihmisen hematologisia syöpäsairauksia [1], [2] sekä kiinteitä kasvaimia [3] – [11]. Lisäksi CSCS on todettu olevan enemmän resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa ja sädehoitoa kuin suuret väestön eriytetympää syöpäsoluja, mikä osoittaa, että CSCS voi jäädä jäljelle kasvainten hoidon jälkeen ja edistää syövän uusiutumista ja leviämisen. Siksi uudet hoidot kohdistaminen CSCS saattavat estää kasvaimen uusiutumisen ja pidentää elinaikaa potilaista. Epiteeli–mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä rooli alkion kehitykseen [12]. Se aiheuttaa epiteelisolujen menettää epiteelin käyttäytymistä, muuttamalla niiden morfologia ja solujen ominaisuudet muistuttavat mesenkymaalisten solujen [13]. EMT on ehdotettu vaikuttavan invasiivisen ja metastaattisen kasvun monien syöpien [14] – [17]. Tuore tutkimus osoitti, että kantasolun kaltaisia ​​soluja epiteelisyövissä jonka mesenkymaaliset fenotyyppi ilmaista merkkiaineita, jotka liittyvät EMT [15].

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa, ja on huono ennuste, jossa 5-vuoden eloonjäämisluvut noin 15%. Mukaan histologinen heterogeenisuus, keuhkosyövän on luokiteltu neljään suureen alatyyppiä: pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), levyepiteelisyöpä (SCC), suuri karsinooma (LCC) ja adenokarsinooma (AC). Tässä tutkimuksessa jälkeen ”Cancer Stem Cell” hypoteesi, olemme keskittyneet ja luonnehdinta CSCS edellä mainituilla alatyyppejä keuhkosyöpään.

solunpintamarkkeria CD133 on aikaisemmin todettu luotettavana merkkiaineena CSCS joissakin keuhkosyövän alatyyppejä [18]. Kuitenkin luotettavuutta markkeri kuin CSC markkerina keuhkosyöpä on hiljattain kiistetty [19]. Siksi olemme keskittyneet toinen merkki eli CD44, jota on ehdotettu luonnehtia CSCS rinta-, eturauhas-, pään ja kaulan, peräsuolen, haiman ja mahalaukun syövistä [3], [4], [9] – [11], [ ,,,0],20].

tässä tutkimuksessa olemme käytti ensisijaisen keuhkosyövän irrotettavat kudokset resektion aikana ja keskittynyt luomaan of PLCCLs vastaeristetyistä kasvaimia. Oletimme, että PLCCL voivat tarjota entistä edustava ja sopiva lähde syöpäsolut voidaan käyttää tunnistamiseen solujen tai solupopulaatioiden kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. Ensin onnistunut paneelin ensisijaisen keuhkosyövän solulinjat tuoreeltaan saatu yksilöiden suurten alatyyppejä keuhkosyöpään. Perustuu yksityiskohtaisiin fenotyyppiset ja funktionaalinen analyysi edustajan solulinjoja SCLC, LCC ja SCC tarjoamme näyttöä siitä, että CD44

korkea väestön hautoisi CSCS näissä syövän alatyyppejä. Lisäksi koekspressoimalla CD90 edelleen rajanneet väestöstä CSCS vuonna SCLC ja LCC. Kuva AC kuitenkin edelleen yhtä selkeä, ja tällä hetkellä meillä ei ole vakuuttavaa näyttöä siitä, että jompikumpi markkereita eli CD44 ja CD90, on ominaista CSCS tässä erityisesti syöpä alatyypin.

Materiaalit ja menetelmät

kokoelma kasvaimen yksilöitä ja perustamalla ensisijaisen keuhkosyövän solulinjat

tutkimus hyväksyi alueellisen eettisen komitean ja Institutional Review Board Oslon yliopistollisessa sairaalassa ja suoritettiin suuntaviivat Helsingin yleissopimus. Kun allekirjoitettu tietoon perustuva suostumus, ihmisen keuhkosyöpä kudoksia saatiin 20 primaarisessa keuhkosyöpä (ikäryhmä 55-81 vuotta), joille tehtiin lobectomy tai pneumonectomy Oslon yliopiston sairaalan heinäkuuta 2007 lokakuuhun 2009. Histologinen diagnoosi määritettiin perustuen mikroskooppisia piirteitä karsinoomasolut (taulukko 1).

Vasta saatu kasvainkudoksen (1-2 tuntia sen jälkeen, kun kirurginen poisto), pestiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, USA), joka sisältää penisilliiniä-streptomysiiniä (PS, penisilliini 100 U /ml ja streptomysiiniä 100 ug /ml; Lonza, Belgia). Verisuonia ja sidekudos poistettiin huolellisesti ja syöpä osa sitten jauhettiin pieniksi palasiksi alle 1 mm

3 käyttäen skalpelli, jonka jälkeen pesty RPMI-1640-elatusaineessa ja sentrifugoimalla 300 g: llä 5 minuutin ajan. Lopuksi solut suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi kollagenaasia II (Invitrogen, USA) pitoisuutena 200 U /ml ja pilkottiin 2-4 tunnin ajan 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa. Entsymaattinen digestio pysäytettiin, kun useimmat solut olivat yhden solujen suspension. Sen jälkeen pesu RPMI-1640 ja 3x sentrifugoimalla 300 g 5 minuuttia, solut siirrettiin standardi kudosviljelmässä päällystetyt pullot (Corning Life Sciences, USA) ja viljeltiin Defined keratinosyyttispesifisestä Serum Free Medium (DK-SFM), johon on L -glutamine (Invitrogen, USA), EGF 20 ng /ml, perus-FGF 10 ng /ml (PeproTech Inc., USA), 2% B27 (Invitrogen, USA), PS: n ja amfoterisiini B: tä (0,25 ug /ml; Invitrogen, USA). Viljelmät Kaikkien PLCCLs pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Viljelyalusta vaihdettiin joka 2-3 päivä. Solut siirrostettiin irtoamisen jälkeen, jossa TrypLE ™ Express (Invitrogen, USA), kun solut saavuttivat 80-90% konfluenssin. Kaikki tutkimukset suoritettiin viiden ensimmäisen kohtia perustettu PLCCLs.

eristäminen nukleiinihapon ja DNA-sormenjälkien määritys

luoda geneettinen sormenjälki kullekin uuden solulinjojen DNA-sormenjälkien määritys suoritettiin edustavilla PLCCLs (LC004, LC006, LC007 ja LC021) sekä uudelleen vakiintuneesta solulinjasta peräisin ksenografti- of LC021. Genominen DNA eristettiin Dulbeccon fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (DPBS, Invitrogen), pestiin solupelletit. Genomista kokonais-DNA: ta saatiin käyttämällä NucleoSpin Tissue Kit (Macherey-Nagel, Saksa) valmistajan protokollan. Identiteetti DNA määritettiin STR profiloinnin avulla Powerplex 16 System (Promega, Madison, WI). Tämä sarja vahvistaa 15 STR loci ja amelogenin sukupuolten tunnistus: Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, VWA, Amelogenin, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 ja D5S818. PCR-tuotteet olivat koko määritettiin MegaBACE 1000 (Applied Biosystems, USA) ohjelmiston avulla Fragment Profiler (GE Healthcare). Näitä sormenjälkiä verrattiin sitten DNA-sormenjäljen tietokantaan aiemmin määritettyyn keuhkosyövän solulinjat varmistaa niiden ainutlaatuisuus.

immunohistokemia

Ensisijainen viljellyt keuhkosyövän solulinjat upottaa parafiinilohkoihin by seuraavaa menetelmää: solut nestemäisen viljelmän irrotettiin ja pestiin DPBS: llä ja sen jälkeen sentrifugoitiin 300 g 5 minuuttia. Supernatantti poistettiin huolellisesti ennen 3 tippaa plasmaa ja 2 tippaa trombiinia lisättiin ja sekoitettiin putken pyörimisen. Puskuroituun formaliiniin (4%) lisättiin sen jälkeen, kun seos koaguloitui. Koaguloitu massa sijoitettiin sitten pellavapaperi ennen upotetaan parafiiniblokit standardimenetelmällä. Jotkin leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Osastoja parafiini lohkon, joka sisältää koolonisyöpäsolulinja CaCo-2: ta käytettiin positiivisena kontrollina CD133-vasta-aineen. Isotyyppikontrollivasta vasta samana pitoisuutena käytettiin negatiivisina kontrolleina. Kaikki valvonta toimi ja vasta reaktiivisuus tarkastettiin ennen kokeellisia sovelluksia vasta-aineita. Kukin värjätty jakso tarkasteli itsenäisesti kaksi patologia.

Eläinkokeet

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin ja suoritettiin suuntaviivojen mukaan Animal tutkimuseettiseltä University of Oslo. Nainen NOD /SCID-hiirten (NODSC-M-F /M-M Homozygous NOD /mrkBOMTac-Prkdcscid, Taconic, Tanska) ostettiin. Sen jälkeen pidetään karanteenissa yhden viikon seurannan steriilissä ympäristössä eläimen laitoksen Oslon yliopistollisessa sairaalassa, Rikshospitaletin 4-5 viikon ikäisiä NOD /SCID-hiiriä käytettiin kaikissa kokeissa. Arvioida tuumorigeenisyyteen vakiintuneiden PLCCLs, 3 x 10

6 solua kustakin solulinjasta keskeytetty DK-SFM istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen NOD /SCID-hiirten (3 hiirtä kussakin ryhmässä) enintään tilavuus 100 ui. Hiiret tarkastettiin kahdesti viikossa ja kasvaimen koko mitattiin liukumitalla. Hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat, kun kasvaimen koko saavutti halkaisija on 15 mm. Ksenografteja poistettiin sitten ja käytetään histologiseen analyysiin ja perustaminen nestemäisten soluviljelmissä. Serial ksenotransplantaatiolla transplantations suoritettiin LCC LC006 solulinja istuttamalla paloja ensisijaisen ksenograftissa subkutaanisesti toissijainen vastaanottajan NOD /SCID-hiiriin. Ksenografteissa peräisin kussakin kanavassa otettiin pois ja kiinnitettiin 4% puskuroituun formaliiniin histologista analyysiä varten.

Virtaussytometrianalyysi ja Fluoresenssi-Activated Cell Sorting (FACS) B

Virtaussytometria-analyysi suoritettiin PLCCLs at logaritminen kasvuvaiheessa. Solut ensin irrotetaan TrypLE ™ Express ja pestiin DPBS: llä. Resuspendoituneet solut laskettiin ja siirrettiin 75 mm polystyreeni pyöreäpohjaiseen koeputkeen (BD Falcon, USA) solukonsentraatioon 1 x 10

6 solua /ml, ja sen jälkeen värjättiin vasta-aineilla laimennoksina määräytyy edellinen titrauksella. Ihmisen immunoglobuliini värjäyspuskurilla (DPBS + 0,1% ihmisen seerumin albumiinia (Octapharman, Tukholma, Ruotsi)) ja 5 ui 10 mg /ml gammaglobuliinia (Gammagard, Baxter, UK) lisättiin soluihin estää FcR ja minimoida epäspesifinen sitoutuminen vasta-aineita. Fluorokromiin kytketty monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t), lisättiin koeputkiin on kyllästää pitoisuuksina, ja soluja inkuboitiin 20 minuuttia jäillä välttäen valaistuksessa. Seulonta markkereita suoritettiin paneelin mAb (tarkemmat tiedot taulukossa 2) neljällä PLCCLs edustavat kutakin keuhkosyöpä alatyyppiä. Solut värjättiin isotyypin mAb: t (BD Pharmingen, USA) toimi negatiivisena kontrollina. Eri populaatiot solut lajitellaan perustuu ilmauksia CD44 yksinään tai yhdessä CD90 käyttäen FACSAria II solulajittelijalla (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Flow tiedot hankittiin annetun FACSAria II tai LSR II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Tulokset analysoitiin BD FACSDiva ohjelmiston (versio 6.1.3). Elinkelpoisuus Lajiteltujen solujen rutiininomaisesti tarkistettu käyttäen trypaanisini (Invitrogen, USA) värjäystä ja yleensä oli 70%.

Soluproliferaatiomääritys

, FACS-lajiteltu CD44

high ja CD44

low /- solut tiheydellä 150 tai 500 solua per kuoppa maljattiin kolmena 200 ul DK-SFM kanssa täydentää pinnoitetulla 96-kuoppaisille levyille. Kuoppiin, jotka sisälsivät vain väliaine käytettiin tausta negatiivisena kontrollina. Solujen annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa yhden päivän ennen kuin niitä käytettiin proliferaatiomäärityksessä. Solujen lisääntyminen mitattiin aikana seuraavat 8 päivää käyttäen CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI) protokollan mukaisesti valmistajan antamia. Absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin Wallac Victor2 levylukijaa (Perkin Elmer, Waltham, MA). Kasvukäyrät vedettiin mukaan keskiarvon absorbanssi, jotka liittyvät taustalla.

2 ulotteinen (2D) yhden solun pesäkkeitä muodostavaa ja heterogeenisuus määritys

CD44high ja CD44

low /- soluja SCLC solulinjasta LC004 ja LCC solulinjaa LC006 lajiteltiin ja siirrostettiin yhden solun kohti pitkälle päällystetyn 96 astian levyillä, joissa 200 ui DK-SFM täydennetty EGF 20 ng /ml, perus-FGF 10 ng /ml, ja 2%: B27. Yhden solun pinnoitus vahvistanut faasikontrastimikroskoopissa (Nikon, Saksa). Viljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO 2: ssa kostutetussa inkubaattorissa. 2 viikon kuluttua useita positiivisia kuoppiin, jotka sisältävät pesäkkeet laskettiin ja morfologiset ominaisuudet pesäkkeitä arvioitiin. Tutkimiseksi itseuudistumisen ja erilaistumista yksittäisten solujen yhdyskunnat erityyppisten eli holoclones, meroclones ja paraclones, alistettiin peräkkäistä kertaa poimimalla ja uudelleen kylvö ne ensin 24-kuoppaisille, sitten 6-kuoppaisille levyille (Corning Life Science , USA), ja lopulta osaksi pulloihin (Corning Life Science, USA), missä ne entisestään. Colony kasvu 2D yksittäisen solun pesäkkeitä muodostavaa määrityksessä ja pitkän aikavälin nesteviljelmiä johdettu näistä pesäkkeistä havaittiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa (Nikon, Saksa).

2D pesäkkeiden muodostumisen tehokkuutta määrityksessä

FACS lajiteltu CD44

korkea, CD44

pieni /- ja CD44

highCD90

+ ja CD44

highCD90

– soluja solulinjoista SCLC LC004 ja LCC LC006 ympättiin kolmena verrokkina tiheydellä 200 solua kohti pitkälle pinnoitetulla 6 kuoppalevyn (Corning Life Science, USA), joka sisälsi 5 ml DK-SFM lisäyksin kuoppaa kohti. Lajitellut solut pidettiin viljelmässä 37 ° C: ssa 5% CO

2 kosteassa inkubaattorissa -10 päivää. Kun syntyy pesäkkeet olivat näkyviä ja sisälsi 100 solua, supernatantti imettiin pois ja kuopat huuhdottiin kahdesti DPBS: llä, kiinnitettiin 4% puskuroidussa formaliinissa 15 minuuttia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen värjäämällä kristallivioletilla vielä 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Huuhtelun jälkeen pois väriaine, siirtomaa määrä laskettiin ja pesäkkeiden muodostumisen tehokkuus (TAE), eli kuinka monta pesäkettä päällystetty solu, laskettiin ja verrattiin eri osapopulaatiosta.

Sferoidiviljelmiä muodostumisen määritys

FACS lajitellut solut ympättiin tiheydellä 100 solua kuoppaa kohti osaksi ultra low kiinnitys (ULA) 96-kuoppaisen levyn (Corning Incorporated), joka sisälsi 200 ui DK-SFM täydennysten ja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa, kunnes solut alkoivat muodostavat pallosia. Väliaine vaihdettiin joka 2. päivä varovasti poistamalla 50 ui ylemmän kerroksen keskitason ja korvaamalla se yhtä suurella tilavuudella tuoretta väliainetta. Kuopat tarkastetaan joka 2 päivää käyttäen faasikontrastimikroskoopin. Kun pallojen oli tarpeeksi iso (suurin osa solun pallosia olivat 200 pm), ne laskettiin ja valokuvattiin (Nikon, Saksa).

RNA ja reaaliaikainen PCR-analyysi

kokonais-RNA uutettiin 10

5 FACS lajitellut solut ja sen jälkeen käänteistranskriboitiin käyttäen Taqman Cell-to-CT kit (Applied Biosystems, USA) protokollan mukaisesti valmistajan antamia. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Taq-Man Gene Expression testausjärjestelmä (Applied Biosystems, USA) 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) mukaan valmistajan ohjeiden ja analysoitiin SDS 2.3 Software ( Applied Biosystems, USA). Jokainen näyte, joka ei sisällä templaattikontrollien, suoritettiin kahtena kappaleena. PCR-reaktio ilman templaattina toimi negatiivisena kontrollina. Lämpökäsittelyyn olosuhteet olivat 50 ° C 2 min ja 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 15 s 95 ° C: ssa, ja sen jälkeen 1 min 60 ° C: ssa. Ilmaisu tasot määritettiin seuraavien geeneistä

Nanog

(määritys ID 8S02387400_gl),

Oct4

(määritys ID Hs03005111_g1),

Sox2

(määritys ID Hs01053049_sl),

E-kadheriinin

(määritys ID Hs01023895_m1),

N-kadheriinin

(määritys ID Hs00169953_m1),

vimentiinista

(määritys ID Hs00958111_ml),

suuren liikkuvuuden ryhmä AT-hook 2 (HMGA2) B (määritys ID HS00171569_ml) ja

fosfoglyse- 1

(

PGK1-

) (määritys ID Hs99999906_m1). Ilmentyminen kohdegeenien liittyi ilmentymisen

PGK1

ja normalisoitiin lajittelemattoman ohjaus soluihin käyttäen ddCT menetelmää.

säteilyherkkyys määrityksessä

, FACS-lajiteltu solut ympättiin tiheydellä 500 solua kuoppaa kohti toistot pinnoitetulla 96 kuoppaisille levyille (Corning Incorporated), joka sisälsi 200 ui DK-SFM lisäyksin. 24 tunnin kuluttua tavanomaisten inkubaation solujen yksikerrosviljelyissä säteilytettiin huoneenlämpötilassa annoksilla 1Gy, 2Gy ja 4Gy, vastaavasti käyttäen Siemens Stabilipan X-ray yksikkö, toimi 200 kV, 20 mA, 0,5 mm Cu suodattamalla (Siemens , Saksa). Sitten solut viljeltiin säännöllisesti viljelyolosuhteet vielä 5 päivää väliaineen muutos välein 2 päivää. Vaikutus säteilyn eri solupopulaatioiden testattiin CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay kuten edellä on kuvattu. Vaikutus Säteilytyksen leviämisen annetaan inhibition suhteen ja laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: inhibition suhde = ((ei säteilytetty ohjaus ja absorbanssi – säteilytetty ja absorbanssi) /ei säteilytetty ohjaus ja absorbanssi) x 100%.

tulokset

1. Ensisijainen keuhkosyövän solulinjat

antavat perustan esillä olevassa tutkimuksessa, uusi, luotettava menetelmä kulttuurin keuhkosyövän solujen tuoreeltaan resektoitiin keuhkosyövän perustettiin (ks materiaali ja menetelmät). Viisitoista ensisijainen keuhkosyövän solulinjat onnistunut 20 keuhkosyöpään kudosten irrottamista. Näihin sisältyvät 7 ACS, 6 SCC, 1 LCC ja 1 SCLC (taulukko 1). Menestys-rate perustaa primääriviljelmien oli 75%. Suurin osa häiriöittä ensimmäinen osa tutkimusta, ennen kuin optimaalinen pitoisuudet kasvutekijöitä oli määritetty. DK-SFM teki tukea selektiivistä kasvua tyypillisten epiteelisolujen, selvästi kasvun estämiseksi yhdessä olemassa olevien fibroblasteissa. Tämä oli vastoin viljelmissä, jotka sisälsivät seerumia käytettiin alussa, jossa nopea liikakasvua fibroblastit tapahtunut (tuloksia ei ole esitetty). Yksikerrossoluissa tyypillinen epiteelin morfologia saatiin erittäin korkean puhtauden kunkin perustetun PLCCLs (kuvio 1). Ensisijainen solulinjoja pidetään näissä oloissa siirrostettiin useita sukupolvia pisin kulkua tähän mennessä yli 30 sukupolven ajan ilman mitään merkkejä kasvun laskuun.

. SCLC solulinja LC004; B. LCC solulinja LC006; C. AC solulinja LC007; D. SCC solulinja LC021. Kaikki edustavat kuvat olivat ensisijaisesti viljellyistä keuhkosyövän solulinjoja toisessa kulkua. Photomicrograph suurennos, × 200.

Jotta vakiintuneet solulinjat olivat ainutlaatuisia alkuperää eikä saastuttamia aiemmin vakiintuneet solulinjat [21], DNA käyttäen joukko erittäin polymorfisia mikrosatelliittimarkkerin kertyi osajoukosta solulinjat, jotka edustavat neljää eri keuhkosyöpään. Tulokset osoittivat, että neljä solulinjat olivat ainutlaatuisia ja jotka eivät liity (taulukko SI).

2. Fenotyyppiä PLCCLs ja vanhempien syöpä kudoksiin on samanlainen /ovat vertailukelpoisia ilmentämiseen P53, Ber-EP4 ja CD44

keskittyneet työmme neljään PLCCLs edustavat neljää keuhkosyöpä alatyyppiä: Tällä SCLC solulinjan LC004, LCC solulinja LC006, AC solulinja LC007 ja SCC solulinjan LC021. Valitusta edustaja PLCCLs valmistimme parafiiniblokit, ja kohdat näistä solulinjoista värjättiin H LCC solulinja LC006; AC solulinja LC007 ja SCC solulinjan LC021. Solut, jotka ovat peräisin neljästä alatyypeistä keuhkosyövän osoitti heterogeenisyys solu- ja ydin- morfologia. Solujen kumpaakin ensisijaisen solulinjan oli epiteelin morfologia. Photomicrograph suurennos, × 200. B. Analyysi ilmaus P53, Ber-EP4 ja CD44 on 4 ensisijainen solulinjojen ja niitä vastaavat arkistointia potilaiden kasvain kudoksiin. Kaikki ensisijainen solulinjoissa tutkittu osoitti diffuusia positiivista värjäytymistä varten P53 paitsi alkuperäisen SCC kudoksen solulinjan LC021. Epiteelikalvo antigeeni Ber-EP4 oli laajalti positiivinen kaikissa alkuperäisessä keuhkosyöpää kudoksia ja hajanainen positiivinen kaikissa ensisijaisen solulinjoissa. CD44 osoitti diffuusia positiivista värjäytymistä eri intensiteetin ensisijaisen solulinjoissa ja niitä vastaavat arkistointia potilaan syöpä kudoksiin paitsi heikosti positiivinen alkuperäisessä kasvain kudos AC solulinjan LC007. Palasia parafiiniblokit sisältää ihmisen seminoomasta ja rintasyöpä näyte käytettiin positiivisina kontrolleina vasta P53, Ber-EP4 ja CD44, vastaavasti. Photomicrograph suurennos, × 200.

Kasvain-soriproteiini P53 mutaatioiden on tunnusmerkki syöpä ja on yleensä säädellään ylöspäin [22]. Seuraavaksi me verrattuna ilmentymisen tasot P53 sarjaan osastoja arkistointia potilaiden kasvain kudosten ja vasta perustetun PLCCLs avulla IHC. Kaikki neljä PLCCLs osoitti diffuusia positiivista värjäytymistä varten P53. Samantyyppistä värjäytyminen havaittiin alkuperäisen potilaan syövän kudoksen kanssa lukuun ottamatta SCC vanhempien kudosten, joka oli negatiivinen P53 (kuvio 2B). Mielenkiintoista on, että solulinja on johdettu SCC (LC021) ilmaistuna P53. Ilmentymistasojen Ber-EP4 ja CD44 tutkittiin samalla tavalla. Arkistointia potilaiden kasvain kudosten ja niitä vastaavat PLCCLs osoittivat yleisesti ottaen myönteinen värjäytymistä yleiseurooppalaisen epiteelin marker Ber-EP4. Diffuusi positiivista värjäytymistä eri intensiteetin arkistointia potilaiden kasvain kudosten ja niitä vastaavat solulinjoja nähtiin CD44 värjäys, paitsi AC vanhempien kasvainkudoksen, joka oli heikosti positiivinen suurimman osan jaksossa tutkittiin (kuvio 2B, taulukko S2). Expression of CD133 että vanhempien tuumorikudoksissa tutkittiin myös IHC värjäystä. CD133 muotoutuneet vaihtelevampi malli, jossa kaikki vanhempien kasvaimet ovat negatiivisia, paitsi SCLC (LC004), jossa ilmentyminen eristetyissä tiloissa havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki PLCCLs johtaa vastaavista vanhempien syöpä kudoksia olivat kauttaaltaan negatiivisia CD133 ilmentymisen IHC värjäystä.

Yhdessä yhteenvetona kokeet viittaavat siihen, että PLCCLs alussa käytäviä (enintään 5) edustavat vanhempien kasvain kudoksen kaikki neljä syöpä alatyyppejä.

3. Primääriset viljelmät keuhkosyövän solut ovat niin tuumorigeenisia kuin vieraskudossiirteet

pahanlaatuinen potentiaalia PLCCLs tutkittiin koe-eläinmallissa. Tumorigeneesin määritys suoritettiin 5-6 viikon ikäisiä naaras NOD /SCID. Seitsemän PLCCLs testattiin alussa käytäviä ja kaikki pystyivät tuottamaan ksenografteissa 3 viikon kuluttua injektion. Neljä solulinjat SCLC LC004-P4, LCC LC006-P2, SCC LC021-P2 ja AC LC007-P3, valittiin lisätutkimuksiin, lisäys ihonalainen bulk kasvaimia 2/2, 3/3, 2/2 ja 2/2 eläimestä. Lisäksi pystyimme uudelleen käyttöön PLCCLs

in vitro

päässä ksenografteista otettu näistä eläimistä (Kuva S1). Lisäksi DNA-sormenjälkien oli hyödyllistä seurata yksittäisiä solulinjoja päässä ksenografteista of LC021 (taulukko S1 ja kuvio S1).

Näiden tulosten perusteella päätämme PLCCLs kanssa tuumorigeneesiä kapasiteetti immuunivajaissa hiirillä helposti ja toistettavasti tulla kaikilta neljä alatyyppiä keuhkosyövän ja etenevät

in vitro

nesteviljelmässä.

toissijainen ksenotransplantaatiolla suoritettiin istuttamalla ihon alle paloja ensisijaisen LCC ksenograftin (LC006) uusio- vastaanottaja . Ensisijainen vastaanottaja oli siirretty LC006 solujen paljastivat keuhkojen etäpesäke lisäksi ihonalainen kasvain. Kuitenkin seuraava järjestysnumero ksenotransplantaatiolla elinsiirtoihin, kasvaimet muodostettiin vain ihon alle. Kun morfologiset piirteet PLCCL ja sarja- ksenografteissa ja vanhempien kudosten verrattiin, ne näkyvät korkealla samankaltaisuus tukee havainto, että PLCCLs ja vieraskudossiirteet edustavat alkuperäisestä kasvaimesta.

4. Expression of CSC liittyy solun pinnalla on dynaaminen pitkän aikavälin kulttuuri PLCCLs

tunnistamiseksi alaryhmien oletetun keuhkosyövän kantasolujen ensisijaisen syöpäsolulinjoissa, tutkimme ilmaus laajan paneelin markkereita aikaisemmin kuvattu ekspressoituu differentiaalisesti erilaisia ​​ihmisen syövän kantasoluja. Tiedot kuudesta edustaja PLCCLs analysoitiin eri kohtia on esitetty taulukossa S3. Ilmaisu profiili paljasti muuttuva kuvio joitakin yhteisiä piirteitä. Kahdessa solulinjoissa (SCLC LC004 ja SCC LC021) testattiin toistuvasti fenotyyppi siirtynyt pitkäaikaishoidossa

in vitro

kulttuuri (taulukko S3). Jotkut markkereita (CD29, CD49b ja CD49f) on tasaisesti ilmentyy korkealla tasolla kaikissa kohdissa ja kaikissa solulinjoissa tutkittu, kun taas toiset, kuten CD44, CD166 ja CD142, osoitti suurempaa ilmentymistä myöhemmin verrattuna aikaisempaan kohtia. Vastakkainen havaittiin CD90 ja CD326 ilmaisua, jossa osuus positiivisten solujen vähentynyt yhä siirrostusjärjestysluku. Mielenkiintoista on, että erillisiä pieniä alapopulaatioiden ilmentävät CD117, CD184 ja CD15 oli läsnä kussakin testatuista solulinjoista. CD24 ja CD326 näytti vaihtelevan ilmentymisen tasolla eri PLCCLs. Ilmaisu on CD133 oli alhainen, mikä testattiin kahdella eri vasta-aineita ja vaihtelivat 0-2,4% vahvistaa saatujen tulosten IHC.

Näin ekspressiotaso ja taajuus CD44 ja /tai CD90 positiivinen sub -populations oli dynaaminen, paljastaa ero ilmentyminen antigeenien eri ajankohtina. Nämä erilliset aikana tapahtuneet muutokset pitkäaikaisen kulttuuri viitata joko mahdollinen valinta tiettyjen alaryhmien pitkäaikaiseen viljelyyn tai vastauksena

in vitro

viljelyolosuhteissa.

Kaiken kaikkiaan tuloksemme a. b. c. a. b.