Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on huono ennuste ja liittyy korkea psyykkisiin ongelmiin. Olemme osoittaneet, että beeta-adrenergisiin reseptoreihin (β-AR), jotka aktivoidaan stressi välittäjäaineiden, säädellä PDAC soluihin syklisen AMP: n (cAMP) -riippuvaista signalointi in vitro, että sosiaalinen stressi edistää PDAC etenemistä hiiren ksenografteissa ja γ-aminovoi- happo (GABA) estää nämä vastaukset in vitro ja in vivo. Tavoiteltu esto stressin aiheuttama säätelyreittejä voi poistaa mahdollisia kielteisiä vaikutuksia psyykkinen stressi kliiniseen tulokseen. Nykyinen tiedot osoittavat, että krooninen altistuminen PDAC solulinjojen Pancin-1 (aktivoivat pistemutaatiot K-ras) ja BXPC-3 (ei mutaatiot K-ras) in vitro stressiä välittäjäaine adrenaliini pitoisuutena (15 nM) aiemmin mitattuna hiirten seerumista uhkaa sosiaalinen stressi huomattavasti proliferaatio ja migraatio. Nämä vasteet olivat inhiboitui konsentraatiosta riippuvalla tavalla selekoksibin. Vaikutukset Selekoksibin yksin ja yhdessä γ-aminovoihappo (GABA) on etenemiseen ihonalainen hiiren ksenograftien solulinjasta (BXPC-3) useimmat reagoivat adrenaliinin Sitten tutkittiin läsnäollessa ja ilman sosiaalista stressiä. Syöpä stimuloivat tekijät (VEGF prostaglandiini E

2 [PGE

2]) ja cAMP: n tasot mitattiin immunomäärityksiä veressä ja ksenograftikudoksesta. Fosforylaatiota signalointi proteiineja ERK, CREB, Src, ja AKT arvioitiin ELISA-määritysten ja Western blotting. Expression of COX-2, 5-lipoksigenaasin ja p-5-LOX määritettiin semi-kvantitatiivinen Western blottauksella. Selekoksibi yksin esti merkittävästi ksenografti etenemistä ja laski systeemistä ja kasvaimen VEGF, PGE2, ja cAMP sekä fosforyloitu signalointi proteiineja stressin alttiina ja stressitön hiirillä. Nämä vasteet olivat merkitsevästi tehostaa yhteistyötä käsittelemällä GABA. Selekoksibi aiheuttama downregulation COX-2-proteiinin ja p-5-LOX myös tehostaa merkittävästi GABA molemmissa koeolosuhteissa. Meidän havainnot tunnistaa kohdennettua esto stressin aiheuttama reittejä pidetään lupaavana alue tehokkaampaa syövän intervention haimasyövän.

Citation: Al-Wadei HAN, Al-Wadei MH, Ullah MF, Schuller HM (2012) selekoksibi ja GABA yhteistyöhaluisesti Estä Progression haimasyövän in vitro ja in ksenograftimalleja Stress-Free ja Stress altistetut hiiret. PLoS ONE 7 (8): e43376. doi: 10,1371 /journal.pone.0043376

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2012; Julkaistu: 16 elokuu 2012

Copyright: © Al-Wadei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke sai taloudellista tukea avustuksina RC1CA144640 ja RO1CA042829 National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä aiheuttaa noin 13% kuolemista maailmanlaajuisesti ja on edelleen toiseksi suurin kuolinsyy Yhdysvalloissa, eli lähes joka neljäs kuolemista [1]. Tilastollisesti, haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat teollisuusmaissa ja on 5 vuoden elossaolo alle 5% [2], [3]. Se on yksi kaikkein tappavan neoplastiset sairaudet, koska se on yleensä oireeton, kunnes se on edennyt pitkälle, kun tehokkaita hoitoja ovat hyödytöntä. Tuolloin diagnoosi, useimmat haiman syövät ovat siis käyttökelvottoman ja metastasoituneen kaukaisiin elimiin. Lisäksi tämä maligniteetti on yleensä reagoimaton tavanomaisen radio-ja kemoterapia, jolloin kuolleisuus lähes 100% 6 kuukauden kuluessa diagnoosista [3]. Novel strategioita parantamiseen haimasyövän väliintulon vuoksi tarvitaan kiireellisesti.

Psykologinen stressi mahdollisena modulaattori syövän etenemisen on äskettäin tullut tärkeä uusi alue syöpätutkimuksessa [4] – [6]. Täten on osoitettu, että kasvu- ja etenemistä yleisin ihmisen syövissä, mukaan lukien adenokarsinooma mahan [7], paksusuolen [8], eturauhassyöpä [9], rintarauhasen [10], [11], munasarja [12] , keuhko [13], [14] ja haiman [15], [16], ovat merkittävästi stimuloidaan beeta-adrenergisen reseptorin (β-AR) signalointia vireille stressi välittäjäaineiden noradrenaliinin ja adrenaliinin. On myös osoitettu, että epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) reitti aktivoituu haiman syöpäsoluissa beeta-adrenergisen, PKA-riippuvainen transaktivaation EGFR [17]. Lisäksi, β-AR: tuotannon säätelemiseksi arakidonihapon (AA) haiman syöpäsoluissa [15], jolloin muodostuu syövän stimuloivaa AA metaboliitteja. Viimeaikaiset tutkimukset haimasyövän ksenografteissa solulinjoista BxPC-3 ja Panc-1 hiirissä alttiina sosiaalista stressiä, ovat lisäksi paljastaneet merkittäviä stressin aiheuttama kasvun stimulointi ksenograftien liittyvän aktivoitumisen useiden signaali- proteiinien, mukaan lukien ERK, CREB, Src, ja AKT [18], joista suurin osa on yli-ilmentynyt haimasyövän [19] – [21]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että psyykkinen stressi voi heikentää tehoa syövän interventiostrategioita. Tavoiteltu esto stressin aiheuttama signa- voi siten lieventää kielteisiä vaikutuksia stressiä kliiniseen tulokseen ja myös merkittävästi vähentämään haimasyövän kehittää yksilöillä on vaarassa, koska ennestään diabetes, haimatulehdus, tai krooninen tupakointi [22].

selektiivinen syklo-oksigenaasi 2 (COX-2) estäjä selekoksibin estää muodostumista Cox-2-välitteinen, syövän stimuloiva AA aineenvaihduntatuotteiden ja on osoittanut lupaavia prekliininen ja kliininen kasvaimen vastaisen aktiivisuuden erilaisissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien haiman syöpä [23] – [25]. Selekoksibi estää selektiivisesti COX-2 aktiivisuutta, mikä puolestaan ​​säätelee useita reittejä haimasyövän [26]. Vahvaa näyttöä lisäksi viittaa siihen, että COX-2 on myös tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen monet ei-haiman kasvaimia [27]. COX-2 ilmentyy erittäin monissa ihmisen syövissä ja syöpäsolulinjoissa, kuten paksusuoli- [28], mahan [29], squamous karsinooma pään ja kaulan [30], kohdunkaulan [31], ei-pienisoluisen keuhkosyövän [ ,,,0],32], rintojen [33], eturauhassyöpä [34], ja haimasyövän [35]. Toisaalta, gamma-aminovoihappo (GABA) toimii fysiologisen inhibiittorin β-adrenergisen cascade, vaikutus transdusoitu solunsisäisesti haimasyövän soluissa Ga

i-kytketty kiemurteleva GABA-B reseptorin, joka vähentää muodostuminen syklisen AMP (cAMP) estämällä adenylyylisyklaasi aktivointi [18], [36].

nykyisessä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia krooninen altistuminen stressiä välittäjäaine adrenaliinia pitoisuutena (15 nM ) aiemmin mitattuna meille seerumissa hiirten uhkaa sosiaalinen stressi [18] leviämistä ja kulkeutumista PDAC solulinjojen Pancin-1 ja BXPC-3 in vitro ja tutkia mahdollisia estovaikutus selekoksibin näistä vastauksista. Sitten käytimme vakiintunut menetelmä kokeellisen induktion krooninen sosiaalinen stressi, hallitseva psykologista stressiä ihmisille [37], hiirillä kuljettavat ksenografteissa solulinjasta (BXPC-3), joka oli eniten reagoivat adrenaliini in vitro, jotta tutkia mahdollisuuksia estäviä vaikutuksia selekoksibia ja GABA yksinään ja yhdistelmä ksenograftin etenemiseen stressitön ja stressi-altistuneet eläimet. Selekoksibi yksin osoittanut voimakasta syöpää estäviä vaikutuksia molemmissa näistä koeolosuhteissa, kun taas yhdistelmähoito GABA parantunut merkittävästi kaikissa tutkituissa ennaltaehkäiseviä tuloksia. Tämä tutkimus on vaikutuksia syövän etenemisen ja ehkäisyyn populaatioissa alle kroonisen psykologisen ahdistusta sosioekonomisia ja henkilökohtaisia ​​haasteita, joita pahenee entisestään, kun henkilö on diagnosoitu hengenvaarallinen sairaus kuten haimasyöpä.

materiaalit ja menetelmät

Culture of Cancer Cell Lines

todennettu (Radil, Columbia, MO), ihmisen haimasyövän solulinjoissa BXPC-3 (witout ras-mutaatioiden) ja Panc-1 (ilmaisee aktivoimalla pistemutaatiot K-ras) alun perin hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD) kasvatettiin RPMI-1640, jossa on 10% naudan sikiön seerumia ilman antibiootteja.

in vitro tutkimukset

A) solujen proliferaation MTT: llä.

kolorimetrinen 3- (4, 5-dimethyle tiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (Sigma) käytettiin aiemmin kuvattu [38] arvioida kasvua stimuloiva Jatkuvasta adrenaliinin altistumistapoihin ja estäviä vaikutuksia selekoksibin tämän vasteen Pancin-1 ja BXPC-3-soluissa in vitro. Lyhyesti, Panc-1 ja BxPC-3-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (50000 solua per kuoppa). Sitten soluja esikäsiteltiin 15 nM adrenaliinin 7 päivää (väliaine, joka sisältää adrenaliinia korvattiin 24 tunnin välein) tai viljeltiin 7 päivää ilman adrenaliinia. Selekoksibi (1 nM 100 uM) lisättiin sitten solut molemmissa hoitoryhmissä. Sen jälkeen 72 tunnin itämisaika, kaikki solut kerättiin.

B) arviointi solumigraation kolorimetrisellä määrityksellä.

Cell muuttoliike testit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [36] käyttäen 6-kuoppaista levyt suodatin insertit antaman kolorimetrisellä solumigraation iinianalyysikitissä (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA). Pancin-1 ja BxPC-3-soluja esikäsiteltiin 15 nM adrenaliinin 7 päivää (väliaine, joka sisältää adrenaliinia korvattiin 24 tunnin välein) kudosviljelmäpulloissa viljellyt ilman adrenaliinin 7 päivää. Soluja molemmissa hoitoryhmissä oli sitten ympättiin insertit ja Selekoksibia (1 nM 100 uM) 24 tunnin ajan. Vaeltavien solujen kykyä arvioitiin sitten seuraavan myyjän ohjeiston.

C) tilastollinen arviointi in vitro data.

Data (n = 5) sarakkeessa kuvaajat (Fig. 1) päässä solujen lisääntymisen ja solumigraatio määrityksissä läsnä ollessa ja puuttuessa kroonisen adrenaliinin hoidon arvioitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seuraa Dunn monivertailutestillä. Data (n = 5) päässä annos-vaste-kokeet (Fig. 2), jossa selekoksibi sovitettiin sigmoidinen annos-vaste-käyrät ja EY

50-arvot selekoksibin laskettiin epälineaarisella regressioanalyysillä käyttäen Prism GraphPad-ohjelmisto.

MTT määritykset (A) Pancin-1 (on aktivoivia pistemutaatiot K-ras) ja BXPC-3 (ilman ras-mutaatioiden) in vitro. Altistuminen 7 päivää adrenaliinin (15 nM) merkitsevästi (

p

0,001) lisäsivät elinkelpoisten solujen molemmissa solulinjoissa. Cox-2-inhibiittorin selekoksibia (1 uM) esti täysin tämän vastauksen adrenaliinin (

p

0,001), kun taas lisäksi vähentää (

p

0,001) lukumäärä eläviä soluja soluissa ei esikäsitellyt adrenaliinin. Vaikutukset samanlaisia ​​hoitoja solumigraatiota on esitetty kuviossa. B. Molemmissa solulinjoissa muuttoliike merkittävästi enemmän kannustanut krooninen adrenaliinia kuin solujen lisääntymistä. Selekoksibi merkitsevästi (

p

0,001) pienentää adrenaliinin aiheuttaman muuttoliikkeen mutta ei täysin estää tätä vastausta. BCPC-3-solut olivat hieman herkkiä adrenaliini molemmissa määrityksissä, mutta erot kahden solulinjan eivät olleet merkittäviä. Pylväät ovat keskiarvoja ja standardipoikkeamat 5 näytettä hoitoryhmässä.

annosvaste-käyrät selekoksibin Pancin-1 ja BXPC-3-solujen in vitro läsnä ja poissa ollessa esikäsittelyn 7 päivää adrenaliinin (15 nM). Kuviot A ja B esittävät solujen lisääntymisen vasteet MTT määrityksissä taas kuviot C ja D esittävät solujen vaeltamiseen vasteita. Vaikka molemmat soluvasteita oli samankaltainen kahdessa solulinjassa, EY

50-arvot selekoksibia kuvioissa. B, C ja D olivat merkitsevästi (

p

0,001) alempi soluissa esikäsitellyt 7 päivän adrenaliinin. Tietopisteet ovat keskiarvoja ja keskihajonnat (n = 5). EY

50-arvot ja käyrän sovitus vahvistettiin epälineaarinen regressioanalyysi varten sigmoidisten annoksesta vasteita.

In vivo tutkimukset

A) Animal koe.

kuuden viikon ikäisiä urospuolisia kateenkorvattomia nude-hiiret hankittiin Harlan Sprague Dawley. Eläin tutkimuspöytäkirja hyväksyi Tennesseen yliopistossa Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Hiiriä totutettu 1 viikon ja ylläpidetään laboratoriossamme eläinpalvelussa suuntaviivojen mukaisesti American Association of Laboratory Animal Care tavanomaisissa laboratorio-olosuhteissa, joissa lämpötila, kosteus, ja valo ohjataan, ja oli vapaa pääsy autoklavoidaan Purina jyrsijämuonaa ruoka ja autoklavoidaan vettä. Sen jälkeen 1 viikon totuttamistiedot, korvat hiiret merkittiin seurannan helpottamiseksi kunkin eläimen, joka sitten satunnaistettiin kuuteen hoitoryhmään (

n

= 20), jossa on 5 hiirtä häkkiä. Ennen tuumorisoluinokulaation, hiiret kolmessa psyykkinen stressi ryhmää altistettiin sosiaalista stressiä 4 viikon mukaisesti julkaistun menettelyn [37] muuttamalla ryhmän koostumusta kussakin häkissä kahdesti viikossa. BXPC-3-soluissa, jotka oli saavuttanut 75% yhteensulautumisesta kulttuuri sitten ihon alle istutettiin kylkeen alueella (3 x 10

6 0,2 ml: lla PBS, elinkelpoisuuden 95%) eläintä kustakin näistä ryhmistä. Sosiaalinen stressi jatkettiin näissä kolmessa ryhmässä vielä 30 päivää. Kolme muuta ryhmää hiiriä, jotka eivät ole altistuneet sosiaalista stressiä, ympättiin myös identtiset numerot haimasyövän BXPC-3-soluja. Yksi ryhmä kukin sosiaalisesta stressistä ja ei-sosiaalinen stressi populaatioiden hoidettiin vatsaontelonsisäisiä selekoksibin (Celebrex, Pfizer, 25 mg /kg ruumiinpainoa, 5 päivää /viikko 30 päivää). Lisäksi yksi ryhmä kutakin sosiaalisesta stressistä ja ei-sosiaalinen stressi populaatioiden käsiteltiin samanaikaisesti alkupuhdistuksella vatsaontelonsisäisiä selekoksibia (25 mg /kg, 5 päivää /viikko 30 päivää) ja sitten GABA (Sigma; 10 mg /kg 5 päivää /viikko 30 päivää) välittömästi sen jälkeen hiiren vastakkaisella puolella. Kaikki Eläimiä tarkkailtiin 30 päivää istuttamisen jälkeen syöpäsoluja. Kasvainten koot arvioitiin viikoittain digitaalisen paksuus, ja kaksi kohtisuorassa halkaisijan (pituus ja leveys) kunkin ksenografti mitattiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tuumorin tilavuus = (pituus /2) x (leveys

2). Paino eläinten seurattiin koko kokeen seurata niiden yleistä terveydentilasta ja GABA ja Selekoksibihoidon vaikutuksia. Lopussa 30 päivän tarkkailujakson aikana, eläimet lopetettiin CO

2 hengitettynä. Verinäytteet kerättiin määrittämiseksi välittäjäaineiden, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), ja prostaglandiini E

2 (PGE

2) seerumissa ja cAMP solun osa verta. Kasvaimet irrotettiin, jäädytettiin nestemäisessä typessä, ja niitä säilytettiin sitten -80 ° C: ssa jatkotutkimuksiin.

B) Immuunimääritys kvantitatiivisen analyysin toisen messenger cAMP, VEGF, PGE2, ja fosforyloitu signalointi proteiineja .

VEGF ja PGE

2 seerumin ja kasvaimen kudosnäytteitä ja cAMP solun osa veren ja kasvaimen kudokset näytteet analysoitiin immuunitestien valmistajan suosittelema (Enzo Life Sciences International). Lyhyesti, kitti mittaamiseksi cAMP käyttää polyklonaalista vasta-aineen sitoutumisen kilpailukykyisesti cAMP- standardeissa ja näytteissä. Kitti mittaamiseksi VEGF käyttää monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen VEGF immobilisoidaan mikrotiitterilevyn sitoa VEGF standardeissa tai näytteitä. PGE

2 Kit käyttää monoklonaalinen vasta-aine PGE

2 sitoa kilpailukykyisesti PGE

2 näytteiden ja standardien. Luettiin ELISA-lukijalla 405 nm cAMP, 450 nm PGE

2, ja 450 nm: ssä VEGF (

n

= 5 per hoitoryhmä). Havaitsemiseksi ja kvantitoimiseksi tasot p-ERK-1/2 treoniini 202 ja tyrosiinin 204, p-CREB seriinin 133 ja p-Akt on seriinitähde 473 (Invitrogen); ja kinaasiaktiivisuutta rekombinantti katalyyttisen domeenin p-Src (MBL International) suoritettiin kasvaimen kudosnäytteistä (

n

= 5 per hoitoryhmä) homogenoitiin RIPA-puskurilla ja proteaasi-inhibiittorit, kuten valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi luettiin ELISA-lukijalla 450 nm: ssä. Seerumin ja kasvaimen tasot stressin välittäjäaineiden noradrenaliinin ja adrenaliinin sekä GABA määritettiin ELISA-menetelmällä, kuten aikaisemmin on kuvattu [14], [18] seurata onnistuneen induktio psyykkinen stressi (tuloksia ei ole esitetty).

C) Semi-kvantitatiivinen analyysi COX-2, 5-lipoksigenaasin (5-LOX) ja p-5-LOX, ja ei-kvantitatiivinen visualisointi signalointia proteiinien western blottauksella.

kolme riippumatonta Western blotit suoritettiin kunkin vasta-aineen puolikvantitatiivinen arvio proteiinin ilmentymisen densitometrisesti AA–metaboloivia entsyymejä COX-2 ja p-5-LOX, käyttäen NIH Image J ohjelmisto. Lisäksi proteiini ilmentymä signalointimolekyylien kvantitoitiin ELISA-määrityksissä edellä visualisoitiin kuin määriä Western blotit. Lyhyesti, tuumorikudokset lyhyesti homogenisoitiin RIPA lyysipuskuria (Thermo Scientific), PMSF: ää, Na

3Vo

4, ja 1 mg /ml aprotiniinia, leupeptiiniä ja pepstatiinia. Jälkeen lämpödenaturaatio 100 ° C: ssa 5 min, yhtä suuret määrät proteiinia ajettiin elektroforeesilla käyttäen 12% Novex SDS-polyakryyliamidigeeleillä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille; Western-blotit suoritettiin tämän jälkeen käyttämällä inkuboitu yön yli 4 ° C: ssa seuraavat primaaristen vasta-aineiden: yhteensä ERK1 /2, p-ERK1 /2, p-CREB, AKT p-AKT, Src, p-Src, COX-2, 5- LOX, ja p-5-LOX (Cell Signaling). Yhteensä CREB ja aktiini ostettiin Millipore. Sekundäärisiä vasta-aineita inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Bändit visualisoitiin ECL (Pierce, Thermo Scientific).

D) tilastollinen analyysi in vivo tietojen.

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Instat ohjelmistoa (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Voit testata, jos vaihtelua sarake mediaanit kasvainten kuudessa hoitoryhmissä (

n

= 20) oli merkitsevästi suurempi kuin odotettua sattumalta nonparametric Kruskal-Wallis ANOVA suoritettiin datan kustakin 4 viikkoa injektion jälkeen syöpäsoluja. Erot valittujen parien hoitoryhmän lisäksi arvioinut nonparametric Mann-Whitneyn testi. Tilastollinen merkitys eroja ryhmien cAMP tasot (

n =

5), PGE

2 (

n =

5), ja VEGF (

n

= 5) veressä ja Ksenograftikudoksista ja p-ERK, p-CREB, p-Src, ja p-AKT kasvainkudoksessa (

n

= 5 per hoitoryhmä) arvioitiin ei-parametrinen Mann -Whitney testi. Tilastollinen merkitys erot neljän densitometristä lukemaa proteiinia bändi kolmelta riippumattomalta Western blotit varten puolikvantitatiivinen arviointi COX-2 ja p-5-LOX valmistettu kolmesta satunnaisesti valitusta ksenografteissa kohti hoitoryhmässä (

n

= 12) arvioitiin ei-parametrinen Mannin-Whitneyn testiä.

tulokset

krooninen altistuminen Adrenaliinia Lisäykset, ja selekoksibi Estää solun lisääntymis- ja Migration

Krooninen altistuminen Pancin -1 ja BxPC-3 solujen adrenaliinin merkittävästi (

p

0,0001) lisääntynyt solujen proliferaatio ja migraatio, jossa BXPC-3-solujen ollessa reagoiva adrenaliini molemmissa määrityksissä (Fig. 1). Solujen käsittelyä Selekoksibilla (1 uM) poisti täysin nämä vasteet molemmissa solulinjoissa (

p

0,001) (Kuva. 1). Selekoksibi (1 uM) myös merkitsevästi (

p

0,001) esti solujen lisääntymistä ja muuttoliike unpretraeted solut molemmista solulinjoista (kuvio. 1). Kuten esitetään annos-vaste käyrät (Fig. 2), selekoksibi esti solujen proliferaatio ja migraatio molemmissa solulinjoissa läsnä ja kroonisia adrenaliinia pre0treatment pitoisuusriippuvaisella tavalla. Lukumäärät elinkelpoisten ja siirtynyt solujen adrenaliinin esikäsitellyt solut molemmista solulinjoista olivat merkitsevästi (

p

0,001) suurempi kuin unpretreated soluissa lainkaan selekoksibi testatuissa pitoisuuksissa, jotka kuvaavat voimakas PDAC stimuloivat vaikutukset adrenaliinin (kuvio . 2). Samaan aikaan, EY

50-arvot selekoksibia olivat huomattavasti (

p

0,001) pienempi epinefriini esikäsitelty soluja molemmissa solulinjoissa kuin unpretreated solut (Fig. 2), mikä viittaa siihen, voimakas riippuvuus adrenaliinin muuttoliikkeelle COX-2-välitteisten arakidonihapon aineenvaihduntatuotteet.

modulaatio Vieraslajisiirteen volyymien Selekoksibi ja GABA Stress-alttiina ja painottomat hiiret

tilastollinen analyysi tietoja kaikista kuudesta hoitoryhmissä nonparametrisellä ANOVA tuotti pientä vaihtelua sarake tarkoittaa merkittävästi (

p

0,0001) odotettua suurempi sattumalta kussakin havaittu 4 viikon ajan. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [18], etenemisen ksenograftissa kasvua BxPC-3 haimasyöpä solulinja oli merkitsevästi (viikko 1:

p

0,006; viikkoa 2-4:

p

0,0001 Mann-Whitneyn testi) edistetään psyykkinen stressi koko tarkkailujakson aikana 4 viikon (Fig. 3). Hoito rasittamaton eläinten Selekoksibilla yksin merkittävästi (

p

0,0001) vähensi -ksenografti koot kaikkina aikavälein mitattuna. Lisäksi, selekoksibin yksinään vähensi ksenograftin koot stressiin alttiina hiiret pienemmät kuin käsittelemättömän, stressi-eläimissä (

p

0,001 kussakin 4 havaittu viikkoa). Hoito rasittamaton hiiriä selekoksibia yhdessä GABA parantanut edelleen kasvua estäviä vaikutuksia selekoksibia (viikko 1:

p

0,0376; viikkoa 2-4:

p

0,0001) . Samoin yhteistyö hoito GABA kasvoi myös syöpää estäviä vaikutuksia Selekoksibin jännitys-altistuvan ryhmän (

p

0,0001 viikoilla 1-4).

Eläimet altistettiin sosiaalinen stressi (SS) tai ei altistettu stressille (NS) läsnä ollessa ja puuttuessa selekoksibia (C) tai selekoksibia ja GABA (C + G) hoitoon. Ksenograftikudoksista volyymi lisääntyi merkitsevästi (

p

0,0001) sosiaalisen stressin. Tämä vaste estyi merkittävästi käsittelemällä selekoksibin yksinään (

p

0,001) tai selekoksibia ja GABA (

p

0,0001). Kaiken kaikkiaan erot kasvaintilavuudet olivat tilastollinen merkitsevyys (

p

0,001) välillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien ryhmiin. Valokuvat osoittavat edustavia esimerkkejä ksenograftien kussakin testiryhmässä.

modulaatio cAMP ja PGE2 seerumissa ja Tuumorikudoksen mukaan Selekoksibi ja GABA Stress-alttiina ja painottomat hiiret

Beta- adrenergiset agonistit aktivoivat AA: n haiman syöpäsoluissa, johtaa COX-2-välitteisen muodostumisen PGE2 [15]. Beeta-adrenergiset reseptorit [39] sekä PGE2-reseptoreihin [40] on kytketty stimuloivan G-proteiinin Gαs, joka lisää cAMP-tasoja aktivaation kautta adenylyylisyklaasin. Siksi mitataan cAMP: n solun osa veren ja kasvainkudoksen ja PGE2 seerumissa ja kasvainkudoksissa suhteen ELISA-menetelmällä. Tuloksemme osoittavat, että systeeminen cAMP-tasoja verinäytteistä ja kasvaimen kudokset olivat merkitsevästi (

p

0,001) lisäsi (2,8-kertainen veren ja 2,5-kertaiseksi kasvain kudoksissa) hiiret altistettiin stressille . Tämä stressi vastauksen verisolujen ja kasvainten oli merkitsevästi (

p

0,001) pienentää selekoksibihoidon yksinään, vaikutus entisestään (

p

0,001), jonka yhdessä GABA (Fig. 4A). Havaitut tasot PGE2 seerumissa ja kasvaimen kudokset seurasi samaa kaavaa, jolla on huomattava (

p

0,0001) kasvaa jännitys-altistuneet eläimet, vasteet merkittävästi (

p

0,001 ) vähennetty selekoksibin yksin ja edelleen väheni selekoksibiryhmässä /GABA yhdistelmä (Fig. 4B). Yhdistetty selekoksibi /GABA hoidon lisäksi merkittävästi (

p

0,001) laski systeemistä ja kasvainten cAMP tasot ja PGE2 painottomat hiirissä (Fig. 4A, 4B).

cAMP arvioitiin vuonna solu osa veressä ja Ksenograftikudoksista (A) ja tasot PGE

2 seerumissa ja Ksenograftikudoksista (B). Sosiaalinen stressi nostivat molemmat tekijät merkitsevästi (

p

0,001), vasteet merkittävästi (

p

0,001) pienentää selekoksibin. Yhdistetty selekoksibi /GABA merkittävästi (

p

0,001) parannettu estovaikutukset selekoksibia (

p

0,001) systeemisen ja kasvaimen cAMP tasot ja PGE2 stressitön ja sosiaalinen stressi -exposed hiirillä. Pylväät ovat keskiarvoja ja SD 5 satunnaisesti valittua näytettä hoitoryhmässä.

alassäätely Fosfory- Signaling Proteiinit Kasvain kudoksissa Selekoksibi ja GABA Stress-alttiina ja painottomat hiiret

aiemmin on osoitettu, että β-adrenergisen signalointi fosforyloi useita signalointia proteiinien ihmisen haimasyövän soluja in vitro, mukaan lukien CREB, ERK, Akt, ja Src [17], [38] ja että fosforyloitu muodot näiden proteiinien myös indusoituu haimasyöpä ksenografteissa stressin alttiina hiirissä [18]. Siksi visualisoida ilmentymistä fosforyloidun ja fosforyloimattoman muodot näiden proteiinien kasvainkudoksissa Western-blottauksella ja määritetään määrälliset muutoksia niiden fosforylaation tasojen suhteen ELISA-menetelmällä. Stressin aiheuttama (

p

0,0001) fosforylaatio kukin näistä tutkittiin signalointia proteiinien oli merkitsevästi (

p

0,0001) vähennetään käsittelemällä celcoxib yksin vaikutus merkittävästi (

p

0,0001) kasvoi lisäkäsittelyn GABA (Fig. 5 A-D). Lisäksi, yhdistettynä selekoksibihoidon ja GABA merkittävästi (

p

0,0001) vähentynyt ilmentyminen fosforyloidun muotojen kaikki tutkitut signalointia proteiinien hiirillä ei altistettu stressille (Fig. 5 A-D).

Western blotit (A ja B) havainnollistaa induktioon p-ERK, p-CREB, p-AKT ja p-Src sosiaalinen stressi ja estämällä näiden vasteet celcoxib yksin tai selekoksibia + GABA. Määrällinen arviointi näistä muutoksista proteiinitasolla määritettiin ELISA määrityksissä kuvassa C ja D. induktio kaikki tutkitut fosforyloidun proteiinien sosiaalinen stressi (SS) oli merkitsevä (

p

0,001). Esto nämä vasteet celcoxib yksin tai yhdistelmän Selekoksibin + GABA olivat merkitseviä (

p

0,001) kaikille fosforyloitu proteiineja. Sarakkeet kuvaajat (C ja D) ovat keskiarvoja ja SD määrällisten ELISA immunomäärityksiä viidestä satunnaisesti valitun ksenografteissa per hoitoryhmä.

modulaatio COX-2 ja 5-LOX kasvainkudoksessa by selekoksibi ja GABA Stress-alttiina ja painottomat hiiret

entsyymi COX-2 katalysoi muodostumista prostaglandiinien kuten PGE2 AA taas 5-LOX välittää metabolisen muuntaminen AA leukotrieenien [41]. Molemmat entsyymit ovat usein yli-ilmentynyt haimasyövän [42], ja fosforylaatio 5-LOX Ser-271 on edistää AA, prosessi katalysoivat useiden kinaasien, mukaan lukien PKA [43]. Siksi tutkittiin ekspressiotasoja COX-2, 5-LOX, ja p-5-LOX by semikvantitatiivinen Western-analyysi kuuden hoitoryhmissä meidän kokeen. Tuloksemme osoittavat, että stressi merkitsevästi (

p

0,0001) indusoi ilmentymisen COX-2 ja p-5-LOX (2,7-kertainen ja 2,9-kertainen, vastaavasti, Fig. 6A, 6B). Selekoksibi yksin merkittävästi (

p

0,001) pienensi stressin aiheuttama ylössäätely COX-2, on vaikutusta huomattavasti (

p

0,001) parantaa lisätty käsittelemällä GABA (kuvio . 6A, 6B). Lisäksi, yhdistetty selekoksibihoidon ja GABA merkittävästi (

p

0,0001) vaimentua ilmentymisen COX-2 (0,4-kertainen) ja p-5-LOX (0,5-kertainen) hiirillä ei altistettu stressille .

Western blot (A) on tyypillinen kolmesta itsenäisestä blotteja valmistettiin kolme satunnaisesti valittua ksenografteissa per hoitoryhmä. Semi-kvantitatiivinen densitometrian nauhojen kolmesta itsenäisestä Western blotit osoittivat merkittävää (

p

0,0001) kasvaa proteiiniekspressiossa sosiaalinen stressi. Nämä vasteet puolestaan ​​merkittävästi vähentää Selekoksibihoidon yksinään (

p

0,001) tai selekoksibia ja GABA (

p

0,0001). Sarakkeet kaavion (B) ovat keskiarvoja ja SD neljästä densitometristä lukemaa bandeittain oikaistuna aktiini itsenäisessä blotteja valmistettu kolmesta satunnaisesti valitun ksenografteissa per hoitoryhmä.

modulaatio VEGF seerumissa ja Tuumorikudoksen mukaan Selekoksibi ja GABA Stress-alttiina ja painottomat hiiret

VEGF on voimakkain ja erityisiä angiogeenisen kasvutekijän [44]. Sosiaalista stressiä merkittävästi (

p

0,001) lisäsi VEGF pitoisuudet sekä seerumin (1,8-kertainen) ja ksenograftit (1,7-kertainen) hiirten kuljettaa ksenograftien päässä BxPC-3 solulinja. Selekoksibi yksin merkittävästi (

p

0,001) pienensi vasteita vaikka yhdistelmä selekoksibihoidon /GABA esti täydellisesti stressin aiheuttama induktio VEGF seerumin ja kasvainkudoksessa (Fig. 7). Lisäksi selekoksibi plus GABA merkitsevästi (

p

0,001) pienentää VEGF perusvuoteen tasolla (

p

0,001) jännittämättömässä hiirissä (Fig. 7).

Sosiaalinen stressi merkitsevästi (

p

0,001) lisäsi VEGF pitoisuudet sekä seerumin ja ksenografteissa, vastaus vähentää merkittävästi selekoksibin (C,

p

0,001), kun taas selekoksibia ja GABA ( C + G) käsittely esti täydellisesti stressin aiheuttama induktio VEGF seerumin ja kasvainkudoksessa. Lisäksi selekoksibi plus GABA vähensi VEGF alle pohjapinta tasoilla hiirillä ei altistettu stressille (

p

0,001). Pylväät ovat keskiarvoja ja SD viiden satunnaisesti valitun näytettä hoitoryhmässä.

Keskustelu

tuotetut tiedot vitro ja vierassiirrekokeissa hiiri malleja ehdottaa, ensimmäistä kertaa, että krooninen altistuminen adrenaliinin psykologista stressiä merkittävästi edistää etenemistä PDAC kautta mekanismien johtuen ensisijaisesti COX-2 riippuvainen arakidonihapon aineenvaihduntatuotteet. Lisäksi meidän in vitro tunnistaa sekä, solujen lisääntymisen ja maahanmuuttoa mekanismit stressin aiheuttama PDAC etenemistä. Yhdessä meidän havaintojen mukaan selektiiviset COX-2-estäjä selekoksibi saattaa olla voimakas estävä vaikutus stressin aiheuttama etenemistä PDAC ja että yhdistelmä käsittely tämän aineen kanssa estävä välittäjäaine GABA voi merkittävästi parantaa hoitotuloksia puuttuessa ja läsnä psykologinen stressi.