Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer-kives (CT) geenit ilmentyvät erilaisissa syövissä, mutta ei normaaleissa kudoksissa muita kuin soluissa ituradan. Vaikka DNA demetylaation promoottori-proksimaalisen CpG: t CT geenien liittyy niiden ilmentyminen syövässä, johtavien mekanismien demetylaation ei tunneta. Selvittämiseksi tällaisia ​​mekanismeja päätimme tutkia Caco-2 peräsuolen syövän solulinja aikana sen spontaanin erilaistumisen

in vitro

, kun löysimme CT geenejä, erityisesti

PAGE2, 2B

ja

Spanx-B

, on säädelty tämän prosessin aikana. Näiden solujen erilaistumisen johti mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtymistä (MET) on osoituksena voitto epiteelin markkerit CDX2, Claudin-4 ja E-kadheriinin ja menetystä mesenkymaalisten markkereita vimentiinin, fibronektiinin-1 ja Transgelin. PAGE2 ja SPAN-X ylössäätöä oli mukana TEN-yksitoista translokaatio-2 (TET2) ilmaisun ja sytosiini 5-hydroxymethylation sekä disassociation heterochromatin proteiinia 1 ja Polycomb tukahduttavaa monimutkainen 2-proteiinin EZH2 päässä promoottori-proksimaalisesta alueet näistä geeneistä. Käänteinen erilaistuminen johti alas-säätely

PAGE2, 2B

ja

Spanx-B

, ja induktio epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) markkereita, osoittaa dynaaminen luonne CT geenisäätelyn tässä mallissa.

Citation: Yilmaz-Ozcan S, Sade A, Kucukkaraduman B, Kaygusuz Y, Senses KM, Banerjee S et al. (2014) Epigeneettiset mekanismeista Dynamic Expression of Cancer-Kivesten Genes,

PAGE2

,

2B

ja

Spanx-B

aikana mesenkyymikasvaimia-to-epiteelikasvaimet Transition. PLoS ONE 9 (9): e107905. doi: 10,1371 /journal.pone.0107905

Editor: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 17, 2014; Hyväksytty: 22 elokuu 2014; Julkaistu: 17 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Yilmaz-Ozcan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat apurahan nr. 112S023 tieteellisestä ja teknologiaministeriön neuvoston Turkin (TUBITAK) ja AOG, a Nuori tutkija palkinnon Turkin Academy of Sciences SB, ja TUBITAK-BIDEP apurahoja SYO ja BK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cancer-kives (CT) tai syöpä-ituradan geenit ilmentyvät tuumoreissa peräisin eri kudoksista, sekä normaalissa ituradan ja trofoblastisolut, mutta ovat yleensä hiljaa muissa normaaleissa kudoksissa aikuisen [1] – [3]. Yli 100 erilaista CT geenejä voidaan ryhmitellä homologian perheille [2]. Puutteesta huolimatta sekvenssin samankaltaisuuden CT-geenien eri perheiden uudelleen ilmaus kaikkien CT geenien kasvaimia on liittynyt demetylaation CpG tähteiden niiden promoottori-proksimaalinen alueilla [4]. Tämä yhteinen mekanismi ilmaisun sääntely on todennäköisesti syy niiden napakoordinaattilausekkeet syövässä [5] – [7]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jonka avulla DNA: n demetylaation tapahtuu CT-geenin promoottori-proksimaalisen alueen syövissä on tuntematon. CT geenit näyttävät enimmäkseen heterogeenisen ilmentämiskuviota kasvaimissa [8] – [10]; Vastakohtana ilmentymistä kiveksissä, joka on rajattu ja hallittu [11]. Tutkimus, jossa varsi kaltaiset ja ei-kantasolujen kaltaisia ​​soluja rintasyöpään valikoivasti tapettiin, paljasti, että CT geeniekspressiota on yleensä piirre eriytetympää, ei-kantasolut [12]. Samoin melanooman alaryhmä solujen enemmän epiteelin ominaisuuksia ilmaista CT geenejä, kun solut mesenkymaalisten ominaisuuksia ei [13]. Mielenkiintoista, melanooma solut voivat vaihtaa näiden kahden luokan

in vivo

, mikä viittaa siihen, että kasvaimen heterogeenisyys, jotka on määritelty CT geenien ilmentyminen, voisi edustaa siirtymävaihe samanlainen vaihtaa epiteelin ja mesenkymaaliset fenotyyppejä. Todellakin, mesenkymaaliset-to-epiteelin siirtymistä (MET) on liitetty induktion CT-geenin ilmentymisen [14]. Määritellä mekanismeja säätelevät CT geenien ilmentyminen syövän aikana MET, päätimme tutkia Caco-2 spontaanin erilaistumisen malli, joka osoittaa piirteitä MET ja EMT erilaistumisen aikana ja de-erilaistumista, vastaavasti. Tuloksemme osoittavat, että dynaaminen sääntely kaksi CT geenejä,

sivu

ja

Spanx-B

tässä mallissa järjestelmä, kuuluu korjauksilla Polycomb tukahduttavia monimutkaisten 2 (PRC2) ja heterochromatin proteiini 1 ( HP1) käyttöaste niiden promoottori-proksimaalinen alueilla, joilla yhtäpitäviä muutoksia TET ilmaisun ja sytosiini hydroxymethylation (HMC) tasot.

Methods

Solulinjat, erilaistumisen induktion ja de-eriyttäminen

Caco-2 solulinja saatiin SAP Enstitusu (Ankara, Turkki). HCT116 (peräsuolen) ja Mahlavu (hepatosellulaarinen) syöpäsolun linjat saatiin LGC Standards, Middlesex, Iso-Britannia. Keuhkojen syövän solulinja (SK-LC-17) oli peräisin Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY, Yhdysvallat. Caco-2-soluja kasvatettiin EMEM: ssä, ja muut RPMI, jota oli täydennetty 20% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia ja 1 mM natriumpyruvaattia. Kaikki soluviljelyalustoja ja täydennykset ostettiin Biochrom AG, Berliini, Saksa. Ensimmäisenä päivänä solut saavuttivat konfluenssin nimettiin päivänä 0. Soluja kasvatetaan rinnakkain viljelmiä käytettiin määrittämään fenotyyppisiä muutoksia päivinä 0, 5, 10, 20 ja 30, post-yhtymäkohta. Lisätoimenpiteitä erilaistumisen soluille käytettiin tässä tutkimuksessa on raportoitu muualla [15]. Aiheuttavan erilaistamattomuuden, solut 20. päivänä erilaistumisen irrotettiin ja maljattiin uudelleen noin 50% konfluenssiin ja RNA ja proteiini kerättiin 5 päivää seuraavan jatkomaljausta.

In silico

analyysi CT ja EMT geenien ilmentyminen

Expression sisältämien tietojen GSE1614 [16] oli GC-RMA normalisoidaan käyttäen GeneSpring v. 11.0. CT-geenin ilmentyminen analysoitiin Yhteensä 31 probesets vuonna vastaa 23 CT geenejä 7 perheiden (kuva S2). Tulkinta on tuotettu kokonaisuus lista koostuu EMT liittyvien geenien määrittelemien Loboda et al. [17], kolmella eri ajankohtina. Geenejä validointi valittiin joukosta ne, joille merkittäviä eroja ilmaisun (p 0,05) havaittiin yksisuuntainen ANOVA testi ja Bonferroni FWER korjaus, kun lisääntyviä soluja verrattiin päivänä 15.

kvantitatiivinen RT- PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Ambion, Foster City, CA, USA) ja käsiteltiin DNaasi I: llä (Ambion, Foster City, CA, USA). 200 ng RNA käänteiskopioitiin käyttämällä Palauta-Aid ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi Kit (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen ABI 7500 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Kaikki reaktiot suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti. TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) käytettiin seuraavasti: GAPDH (4352934E), spanx-B (Hs02387419_gH), PAGE2 ja 2B (Hs03805505_mH), GAGE ​​(Hs00275620_m1), SSX4 (Hs023441531_m1), NY-ESO-1 (Hs00265824_m1) ja MAGE-A3 (Hs00366532_m1). SYBR Green master sekoita ROX viitaten väriaine (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) käytettiin määrittämään

CDH1, CDX2, CLDN4, VIM, FN1

ja

TAGLN

lauseke (taulukko S1) . Pyöräily olosuhteet näiden määritysten olivat 50 ° C 2 min., 95 ° C: ssa 10 min., Jonka jälkeen 40 sykliä 94 ° C 15 s., 60-65 ° C: ssa 1 min. Suhteellinen ekspressio laskettiin ΔΔCt menetelmällä [18]. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena, ja kaikki kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa.

Promoottori metylointianalyysi

Genominen DNA eristettiin proteinaasi K hoidon jälkeen fenoli-kloroformilla uuttamalla protokollaa. Bisulfiitti hoito 200 ng genomista DNA: ta suoritettiin käyttäen Zymo DNA Metylointi Gold Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfiitti muunnetun DNA säilytettiin -20 ° C: ssa ja käytettiin PCR: llä 2 kuukautta. Kaksi kierrosta DNA-monistus tehtiin käyttämällä One Taq Hot Start DNA-polymeraasia (New England Bioscience /NEB, Ipswich, MA, USA) käyttäen Perkin Elmer 9700 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa S1. PCR-tuotteet geelillä eristettiin käyttäen QIAGEN gel (Qiagen, Hilden, Saksa) ja kloonattiin pCR2.1: een (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Plasmidi-DNA puhdistettiin käyttäen QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) vähintään kymmenestä klooneja, ja sekvenssi analysoitiin IONTEK (Istanbul, Turkki).

5-hydroksimetyyliksytosiini analyysi

Caco-2 genomista DNA (gDNA) leikattiin sauvasonikointia (30 sek. päällä, 30 s. pois, 5 sykliä) saamiseksi 200-600 bp. fragmentit arvioitiin 1% agaroosigeelillä elektroforeettinen analyysi. Immunosaostus suoritettiin käyttäen hMEDIP kit (Abcam, Cambridge, UK) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 5 pg valvonnan DNA oli lisätty 500 ng gDNA käyttää sisäisenä kontrollina. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit pakki sisällytettiin kaikissa kokeissa. 2 ui eluoitua DNA: ta käytettiin templaattina kvantitatiivista RT-PCR: llä käyttäen 2 x SYBR Green master-seosta, ROX viitaten väriainetta (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) alukkeilla taulukoissa S1 ja S2. Primer tehokkuus kontrolloitiin. Sykliolosuhteet olivat 50 ° C 2 min., 95 ° C: ssa 10 min. jota seurasi 40 sykliä 94 ° C 15 s., 60 ° C 1 min. Jaettu genomista DNA sisältyi kvantitatiivinen RT-PCR laskemiseen% tuloon.

Immunofluoresenssimikroskopia

Solut kiinnitetään lasiin dioja sentrifugoimalla käyttämällä Shandon CytoSpin3 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) oli heti vahvistettu 2% formaldehydi /PBS-liuoksessa huoneenlämpötilassa 15 min. Kiinnitetyt solut läpäiseviksi 0,2% Triton X-PBS: ssä 10 min. minkä jälkeen salvattiin 1% BSA: ta 0,1% PBS-Tween: ssa 1 tunti. Inkubaatioista primaarisen vasta-aineen, joka oli laimennettu 1:50, suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Sekundaarinen vasta-aine lisättiin 1:200, pesun jälkeen 0,1% PBS-Tween 5 min. 3 kertaa, ja niitä inkuboitiin solujen kanssa 45 minuutin ajan. huoneenlämmössä (katso taulukko S3 täydellistä vasta-luettelo). Stained näytteet asentaa kiinnitysväliaine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), joka sisältää DAPI ratkaisu. Solulinjat käytettiin positiivisina verrokkeina olivat Mahlavu (PAGE-2, 2B ja SPANXB), MDA-MB 231 (VIM), MCF-7 (TAGLN) ja SW620 (CDX2, FN1). Negatiiviset kontrollit olivat yhdistelmät ensisijaisen vasta-aineiden un liittyviä sekundäärisiä vasta-aineita. Kaikki kuvat saatiin käyttämällä AxioCam MRC5 kuvien ottamista laite (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

Western-analyysi

Solulysaatteja (uutetaan RIPA-puskuri) eroteltiin 4-12% Novex Bis tris SDS-geeleissä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) siirrettiin Immobilon-PSQ kalvoja (Millipore Corp. Bedford, MA, USA), jossa on Invitrogen western blotting-järjestelmä (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA). Seuraavat estää 5% maitojauhetta 0,02% PBS-T, blotteja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-laimennokset olivat 1:1000 varten CDX2, fibronektiiniä, vimentiinistä ja transgelin, 1:2500 varten β-aktiini ja 1:100 varten Spanx-B ja PAGE-2, 2B vasta-aineita. HRP konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, UK): tä käytettiin 1:5000 laimennus- ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Signaalit havaittiin käyttämällä ECL luminesenssi määritystä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Kromatiini immunosaostus

Kromatiini immunosaostus (ChIP) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, formaldehydi silloitettu solun ainesosien saostettiin proten-A-sefaroosi helmiä kytketty vasta-aineita EZH2, HP-1 tai H3K27m3 (Abcam, Cambridge, UK), samoin kuin isotyyppispesifisessä ohjaus. Saostettu DNA monistettiin käyttämällä spesifisiä alukkeita

PAGE2

,

-2

tai

spanx-B

promoottorisekvenssit (taulukot S1 ja S2), seuraavat de-silloittumisen.

tulokset

CT geeniekspression aikana Caco-2 spontaanin erilaistumisen (Caco-2 SD) B

erilaistumaton peräsuolen syövän solulinja Caco-2 läpikäy enterocytic erilaistuminen saavuttaessaan yhtymäkohta

in vitro

[19], [20]. Asteittainen eriyttäminen on havaittu jopa 30 vuorokauden kuluttua yhtymäkohta osoituksena säätely ylöspäin eri erilaistumisen liittyvien geenien kuten sakkaroosi-isomaltaasin, alkalinen fosfataasi ja carcinoembryogenic antigeeni (CEA), (kuva S1) [15].

in silico

analyysiin CT geeniekspression määrittelemien 31 probesets on GSE1614 aineisto, joka sisältää geenin ilmentymisen tiedot Caco-2 SD malli saadaan erilaistumisen aikana (lisääntyvissä (2

nd päivä), post-lisääntymistä-erilaistumaton (8

päivänä), ja post-lisääntymistä erilaistunut (15

päivänä)) [16], paljasti vaatimaton ylössäätöä lähes kaikkien CT geenit erilaistumisen aikana (kuva S2). Päätimme vahvistaa muutoksen ilmaisun kuusi CT geenin /geeniperheistä kvantitatiivisen RT-PCR erottamaan Caco-2-solujen

in vitro

.

GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1

ja

SSX4

transkriptit olivat havaittavissa ensimmäisenä päivänä yhtymäkohdassa, sekä myöhempinä ajankohtina (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin merkittävä säätely ylöspäin

PAGE2

(

2 ja 2B

), ja

Spanx-B

geenit oli ilmeistä (kuvio 1).

suhteellinen mRNA ilmentymistä CT geenien (

PAGE2

,

2B

ja

SPANXB

) (A), epiteelin geenit (

E-kadheriinin (CDH1)

,

klaudiini 4 (CLDN4) B,

CDX2

) (B), ja mesenkymaaliset geenit (

fibronektiiniä 1 (FN1), vimentiinistä (VIM) B,

transgelin (TAGLN) B) (C) määritettynä kvantitatiivinen PCR päivinä 0, 10, 20 ja 30 post-yhtymäkohta. Tulokset edustavat keskiarvoa kahdesta kokeesta. Muutos ekspressiotasot kaikkien geenien välillä päivinä 0 ja 30 on tilastollisesti merkitsevä (P 0,0001, jonka kaksisuuntainen ANOVA Tukeyn post hoc testi).

PAGE2

ja

Spanx-B

ilmentymisen follow vastataan Caco-2 SD malli

Spontaani erilaistumista Caco-2

in vitro

on raportoitu aiheuttavan MET [21], [22 ]. Voit selvittää, tämä tapahtui rinnan säätely ylöspäin

PAGE2

ja

Spanx-B

, olemme analysoineet GSE1614 aineisto varten geenien edustavat EMT kolorektaalisyövässä [17], ja valittu 6 geenien validoitu mallimme. Analyysi mRNA ja proteiinin ilmentymistä näiden paljasti lasku mesenkymaaliset geeneistä (

vimentiinista, fibronektiiniä 1

ja

transgelin

) ja samanaikainen kasvu ilmentymisen epiteelin geenien (

CDX2, klaudiini -4

ja

E-kadheriinin

) kun solut eriytetty, joka osoittaa, että kasvu CT geeniekspression tapahtuu samanaikaisesti MET tässä mallissa (kuvio 1 kuva S3).

PAGE2, Spanx-B ja EMT geeniekspression

in situ

tutkia jos muutoksia proteiinien ilmentyminen CT ja EMT geenejä esiintyi samanaikaisesti samassa soluissa, suoritimme kaksinkertainen immunofluoresenssivärjäyksen aikana erilaistumista. Asteittainen menetys mesenkymaalisten markkereita havaittiin soluja eriytetty, joiden samanaikainen kasvu epiteelin geenien ja CT geenejä. Spanx-B ja PAGE-2 olivat usein koekspressoitiin epiteelin merkki CDX2 samoissa soluissa mutta lähes koskaan kanssa VIM tai FN1 (kuviot 2, 3 ja kuviot S4, S5, S6, S7).

immunofluoresenssivärjäyksellä erilaistumaan Caco-2-solut DAPI counterstaining paljastaa asteittainen nostaminen ydin- Spanx-B (vihreä) ja samanaikainen väheneminen sytoplasman vimentiinista lauseke (punainen); (20-kertainen suurennus) (A). Alle 1% Spanx-B-positiiviset solut osoittivat värjäyksen varten vimentiinista päivänä 0 (B).

immunofluoresenssivärjäyksellä erilaistumaan Caco-2-solut DAPI counterstaining paljastaa päällekkäisiä Spanx-B (Alexa Fluor 488 : vihreä) ja CDX2 (Alexa Fluor 568: punainen) ilmaisu; (20-kertainen suurennus) (A). Yli 60 80% soluista kaksinumeroisin merkintöjä kun analysoitu kvantitatiivisesti (B).

PAGE2 ja Spanx-B ilmaisu korreloi lisääntynyt HMC ja kymmenen-yksitoista translokaatio metyylisytosiini dioxygenase (TET) ylöspäin -regulation

Expression kaikkien CT-geenien tutkittu toistaiseksi myös

PAGE2

ja

Spanx-B

on liittynyt demetylaatiota CpG tähteiden alueiden lähelle transkription alusta site [1], [2], [23] – [26]. Tällä rivillä, sekä

PAGE2

ja

Spanx-B

voi olla säädelty 5-atsa 2′-deoksisytidiini käsittely (kuvio S8). Kuitenkin, bisulfiitti sekvensointi promoottori-proksimaalisen alueen sekä

PAGE2

ja

spanx-B

ei paljastanut eroja eri vaiheissa Caco-2 SD (kuvio 4). Kuten bisulfiitti sekvensointi ei pysty erottamaan metyyli sytosiini (MC) HMC, kysyimme, onko muutos CT geenien ilmentyminen voi liittyä muuttuneisiin HMC /mC suhdeluvut niiden promoottorien. Itse asiassa, kromatiinin immunosaostus (ChIP), jonka HMC spesifistä vasta-ainetta paljasti, kasvusta HMC erilaistumisen aikana sekä

PAGE2

ja

spanx-B2

promoottorit (kuvio 5). Me seuraavaksi kysytään kasvu HMC liittyi kasvua TET1, -2, ja -3 lauseketta nämä proteiinit ovat vastuussa muuntaa MC HMC [27], [28]. Itse asiassa kasvu HMC on

PAGE2

ja

Spanx-B2

promoottorit korreloivat ylös-säätely

TET2

mRNA ilmaisun yhdessä pientä nousua

TET1

ja

3

(kuvio 6A). Double immunofluoresenssivärjäyksen paljasti, että suurin osa soluista, jotka ilmentävät PAGE2 tai spanx-B olivat positiivisia TET2 värjäystä; mikä osoittaa näiden kahden tapahtuman tapahtui samoissa soluissa (kuvio 7). Sen vuoksi on todennäköistä, että kasvu TET2 ilmentyminen aiheuttaa kasvavia HMC näiden geenien. Mielenkiintoista on, vain alhaisen molekyylipainon käännös tuotteen (-25 kD) on TET2 on lisääntynyt erottamaan solut, kun ei ole selvää eroa tasojen täyspitkän TET2 proteiini havaittiin (kuvio 6B 0,001, 0,02, ja 0,001 EZH2; 0,003, 0,001, ja 0,0001 H3K27m3; ja 0,001, 0,001, ja 0,001, sillä HP1, vastaavasti.

PAGE2

ja

Spanx-B

ylössäätöä peruutetaan aikana EMT

arveltu, että jos epigeneettiset muutokset taustalla CT geeniekspression tapahtui rinnakkain MET, että tämä prosessi voi olla päinvastainen, jos solut tuli EMT. Tämän hypoteesin testaamiseksi, eriytettyä Caco-2 solut irrotettiin ja niiden annettiin lisääntyä 5 päivää. Tämä on johtanut niiden nopeaan dedifferentiaation osoituksena alas-säätely SI. De-erilaistuneita soluja alassäädetty

PAGE2

ja

Spanx-B

sekä

CDX

, koska ne säädelty

TAGLN

, vuonna sopusoinnussa meneillään EMT (kuva 9). Vaikka transkriptio kaikilla kolmella

TET

geenien laski de-erilaistumisen (kuvio 9), emme havaita vähenemistä HMC tänä aikana (tuloksia ei ole esitetty). Me siis päätellä, että säätely ylöspäin CT-geenin ilmentyminen on palautuva tässä mallissa.

De-erilaistumisen aiheuttama kasvu ei-konfluentteja olosuhteissa osoittaa vähentynyt

sakkaroosi isomaltaasipuutos

(SI ) mRNA-tasot (A), johtaa alas-säätely

CDX2

,

PAGE2, 2B

ja

Spanx-B

, joilla on samanaikaisia ​​säätely ylöspäin

TGLN

(B).

TET1

ja

-2

mRNA myös alassäädetty aikana dedifferentiaation (C).

Keskustelu

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CT geenin ilmentymisen korreloi epiteelin sijaan mesenkymaalisten fenotyyppi, ja osoitti säätely ylöspäin CT geenien aikana MET [12], [14]. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, jossa kuvataan muutokset useissa epigeneettisellä mekanismeja promoottorit kahden CT geenien aikana MET kaltainen eriyttäminen yhtäpitävä dynaaminen muutos geenien ilmentyminen. Koska bisulfiitti sekvensointi

PAGE2

ja

Spanx-B

promoottorit paljasti mitään muutosta kun erilaistumista, lisääntynyt HMC on ehdottomasti liity metyloituja CpG jäämiä. Tämä on linjassa sen kanssa, että TET entsyymit vastaavat muuntamiseksi 5-metyyli sytosiini 5-hydroksimetyyliksytosiini [27], [28]. Muuntaminen HMC MC on huomattavasti monimutkaisempi prosessi ja ehkä tapahdu samanlaisia ​​kinetiikkaa [32], [33]. Tämä on todennäköisesti syy, miksi emme tarkkailla muutosta HMC aikana 5 päivää dedifferentiaation prosessi Caco-2-soluja laskusta huolimatta havaittiin globaalissa TET tasolla. Meidän havainto, että

PAGE2

,

Spanx-B

ja

TET2

induktio on palautuva on samankaltainen toisen tutkimuksen alkion kantasoluja, jossa C-vitamiini on osoitettu aiheuttavan TET2 ilmaisua, mikä puolestaan ​​johti säätely ylöspäin CT geenejä. Molemmat tapahtumat korjaantuivat Vitamin C peruuttaminen [34].

Vaikka hydroxymethylation sisällä geenipromoottorit on raportoitu vähentävän erilaistumisen aikana normaalien solujen, tuore tutkimus osoitti, että noin 20% kaikista muutettu sytosiineista useimmissa CT-geenien ihmisen aivoissa, jos niitä ei ilmaista, koostua HMC [35]. Up-regulation TET2 ilmaisun syövässä on liittynyt MET [36], [37]; ja siksi, eriytetympää tilassa [30]. Samanlainen käänteinen korrelaatio EZH2 ja CT /TET2 ilmaisun me raportoimme täällä, toiset ovat osoittaneet EZH2 ja TET entsyymejä tukahduttaa ja indusoida erilaistumista hermosolujen esiasteita, vastaavasti [38]. CT geenit ovat säädelty alkuvaiheissa kehityksen ihmisen alkion, mutta pienenee kudoksia eriyttää edelleen [39]. Aikuisten paksusuolen kudos ei näytä PAGE2 tai spanx-B ilmentyminen (dataa ei esitetty), oli Caco-2-solujen kykyä erottaa edelleen, molemmat geenit olisi ollut alassäädetty kokonaan. Toisaalta se, että emme voineet osoittaa ylös-säätely

GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1

tai

SSX4

ilmaus tässä malli voisi olla, koska nämä geenit ilmaistaan ​​aiemmissa vaiheissa erilaistumista. Uskomme, että tämä koska Spanx-B ilmentyminen on pääasiassa jälkeisessä meioottisiin solujen kiveksissä (eli spermatosyyteiksi, spermatids tai sperma), kun taas GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1 tai SSX ilme on ensisijaisesti spermatogonioista [11] .

tiedot ja että useiden muiden osoittavat, että syöpäsolut ilmentävät CT geenejä on pikemminkin epiteelin sijaan mesenkymaaliset fenotyyppi. Ehdotamme, että CT-geenien

PAGE2

ja

Spanx-B

indusoituvat ikkunan erilaistumisen joka korreloi säätely ylöspäin epiteelin merkkiaineiden erilaistumista. Caco-2 SD malli on mahdollistanut tarkkailla aktiivisesti muuttuvassa epigeneettiset maisema sisällä promoottorit näiden CT geeneistä. Kuitenkin, kuten CT geenien ilmentyminen kasvaimissa on läheisesti liittyneet metylaatiotilaa niiden promoottorin, prosessi, joka johtaa CT geenin induktion i

n vivo

saattaa lopulta johtaa ”kiinnitys” on epigeneettiset valtio, joka olisi puolestaan ​​johtaa CpG metylaatio. Silti kautta dynaaminen MET kasvaimissa [40], on mahdollista, että jopa tämä saattaa muuttua vuosien taudinkulku.

From kliininen näkökulma, tietoja meidän lab sekä muilta osoittavat, että osa- ryhmittely kasvaimia perustuu geeniekspressioprofiilien voi selvästi tunnistaa soluja, joilla on erilaiset kemiallis-herkkyys profiilit [12], [41], [42]. Tällä rivillä, me ennustaa tulevaa tutkimukset paljastavat selvästi huumeiden herkkyys profiileja ja peräsuolen syövän alatyyppiä mahdollisesti määritelty

PAGE2

ja

Spanx-B

ilmaus, jota varten Caco-2 SD malli voisi käyttää.

tukeminen Information

Kuva S1.

Post-yhtymäkohta erilaistuminen Caco-2

in vitro

. Up-regulation

sakkaroosi-isomaltaasin

(A), ja syöpä -antigeeni (CEA) (B) soluissa kerättiin ilmoitetuilla vuorokautta yhtymäkohta (DPC) määritettynä kvantitatiivisen RT-PCR, ja Western-analyysi, vastaavasti . Alkalisen fosfataasin ilmentyminen on myös voimistunut määritettynä immunohistokemialla paljastamalla erilaistumista (C). Muut toimenpiteet erilaistumisen soluille käytettiin tässä tutkimuksessa on raportoitu aiemmin (ref. 17). * P 0,001 (ANOVA kanssa Tukeyn post hoc testi).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0107905.s001

(DOCX) B Kuva S2.

Up-regulation CT geeniekspression aikana Caco-2 spontaanin erilaistumisen

in vitro

. Lämmön kartta Yhteensä 31 probesets sisään GSE1614 vastaa 23 CT geenien 7 perheitä. Verrattuna lisääntyvien solujen, geenien ilmentyminen vähitellen lisääntyy klo yhtymäkohdassa (8

päivänä) ja edelleen aikana jälkeisen yhtymäkohta eriyttäminen (15

päivänä).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0107905. S002

(DOCX) B Kuva S3.

Western-analyysi differentiaalisesti ilmentyvien geenien aikana Caco-2 SD. Lisääntyi asteittain Spanx-B ja CDX2 rinnakkain vähenemiseen ilmaus FN, VIM ja TGLN jopa päivä 30 post-yhtymäkohta. Tulokset 3 riippumatonta eriyttäminen kokeet osoittaneet.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0107905.s003

(DOCX) B Kuva S4.

Spanx-B ja fibronektiinin ilmaisun rajoitetussa päällekkäisyyttä erottamaan Caco-2-soluilla. Immunofluoresenssivärjäyksellä erilaistumaan Caco-2-solut DAPI counterstaining paljastaa asteittainen nostaminen ydin- Spanx-B (Alexa Fluor 488: vihreä) ja samanaikainen väheneminen sytoplasman fibronektiinin lauseke (Alexa Fluor 568: punainen); (20-kertainen suurennus) (A). Alle 10% soluja, jotka ilmentävät spanx-B värjättiin fibronektiinin päivänä 0 (B).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0107905.s004

(DOCX)

Kuva S5.

PAGE2, 2B ja vimentiinistä ilme ovat toisensa poissulkevia erottamaan Caco-2-soluilla. Immunofluoresenssivärjäyksellä erilaistumaan Caco-2-solut DAPI counterstaining paljastaa asteittainen nostaminen ydin- PAGE2, 2B (Alexa Fluor 488: vihreä) ja samanaikainen väheneminen sytoplasman vimentiinista lauseke (Alexa Fluor 568: punainen); (20-kertainen suurennus) (A). Alle 10% soluista osoitti kaksinkertainen fluoresenssia kun värjäämällä analysoitiin kvantitatiivisesti päivänä 0. myöhempinä ajankohtina, yksikään solut osoittivat kaksinkertainen värjäytymistä (B).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0107905.s005

(DOCX) B Kuva S6.

PAGE2, 2B ja fibronektiinin ilme ovat toisensa poissulkevia erottamaan Caco-2-soluilla. Immunofluoresenssivärjäyksellä erilaistumaan Caco-2-solut DAPI counterstaining paljastaa asteittainen nostaminen ydin- PAGE2, 2B (Alexa Fluor 488: vihreä) ja samanaikainen väheneminen sytoplasman fibronektiinin lauseke (Alexa Fluor 568: punainen); (20-kertainen suurennus) (A). Alle 15% soluista osoitti kaksinkertainen fluoresenssia kun värjäämällä analysoitiin kvantitatiivisesti päivänä 0 (B).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0107905.s006

(DOCX) B Kuva S7.

Nuclear kolokalisaation CDX2 ja PAGE2, 2B erottamaan Caco-2-soluilla. Immunofluoresenssivärjäyksellä erilaistumaan Caco-2-solut DAPI counterstaining paljastaa päällekkäisiä PAGE2.