Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MicroRNA (miRNA) on syntymässä alaluokka pienten ei-koodaavat RNA: t, joka säätelee geenien ilmentymistä ja on keskeinen rooli monien fysiologisten prosessien kuten syövän kehitystä. Viimeaikaiset raportit paljastivat rooli miRNA kuin ihanteellinen biomarkkereita ja terapeuttisten kohteiden vuoksi niiden kudos- tai tautikohtaisia ​​luonto. Pään ja kaulan alueen syöpä (HNC) on suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta ja sairastuvuutta sekä kurkunpään syöpä on korkein ilmaantuvuus sitä. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja kurkunpään syövän kehitykseen on vielä tunnettu ja erittäin herkkä biomarkkereita ja uusi lupaava hoito on tarpeen.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tutkitaan kurkunpään syöpä erityisiä miRNA, RNA 5 kurkunpään kirurgisista näytteistä kuten syövän ja ei-syöpä kudoksia hybridisoitiin mikrosirun kuljettaa 723 ihmisen miRNA. Saatu ilmennetty eri miRNA testattiin edelleen käyttämällä kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) 43 kurkunpään kudosnäytteitä, mukaan lukien syövät, noncancerous kollegansa, hyvänlaatuisia sairauksia ja precancerous dysplasiat. Merkittävät ilmaisullisella erot pareittain toistettiin miR-133b, miR-455-5p, ja miR-196a, joista miR-196a on lupaavin syövän biomarkkereiden kuin validoitu qRT-PCR analyysit vielä 84 kudosnäytteitä. Deep sekvensointi analyysi paljasti sekä määrällisiä että laadullisia poikkeama miR-196a isomiR ilmentymistä kurkunpään syöpä. In situ -hybridisaatio vahvisti kurkunpään syöpä ilmentäminen miR-196a sekä syövän ja syövän strooman solut. Lopuksi esto miR-196a torjua syövän solujen lisääntymistä sekä kurkunpään syövän peräisin olevat solut ja hiiren ksenograftimallissa.

Johtopäätökset /merkitys

Tutkimuksemme edellyttäen mahdollisuuksista että miR-196a voi olla hyvin hyötyä diagnosoinnissa ja hoidossa kurkunpään syöpä.

Citation: Saito K, Inagaki K, Kamimoto T, Ito Y, Sugita T, Nakajo S, et al. (2013) MicroRNA-196a Onko Otaksuttavat Diagnostic biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde Kurkunpään Cancer. PLoS ONE 8 (8): e71480. doi: 10,1371 /journal.pone.0071480

Editor: Valerie W. Hu, The George Washington University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 helmikuu 2013; Hyväksytty: 28 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 14 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Saito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Osa tämän työn tukivat Grant for Industrial Technology Research Uuden Energian ja Industrial Technology Development Organization (NEDO; https://www.nedo.go.jp/english/index.html). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Vaikka jotkut kirjoittajat työskentelee kaupallisten yhtiöiden (Y. Ito, T. Sugita, ja S. Nakajo by SRL, Inc., T. Ishikura, H. Hanaoka, ja T. Onozaki Life Technologies Japan), niillä ei ole kilpailevia intressejä tästä työstä. Nämä työsuhteet eivät muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Vuonna 2004 28260 uutta tapausta suuontelon ja nielun syövän ja 20260 uutta tapausta kurkunpään syöpä diagnosoitiin Yhdysvalloissa, johtaen 7230 ja 3830 kuolemantapausta, vastaavasti [1], [2]. Vaikka merkittäviä edistysaskeleita kirurgian ja sädehoidon viime vuosikymmeninä, 5 vuoden eloonjäämisluvut pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) potilaat ovat parantuneet vain hieman osittain johtuen suhteellisen suuren paikallisen uusiutumisen nopeudella. Tällä hetkellä Paikallista HNC käsitellään yhdistelmällä kirurgian ja säteilyä tai ilman kemoterapiaa, kun taas kukin hoitovaihtoehto johtaa tuhoisia seurauksia puheen ja nielemisvaikeuksia toiminto. Lisäksi kirurgisten pään ja kaulan ja suuontelon alue yleisesti aiheutuu merkittäviä kosmeettisia epämuodostumia. Vaikka yhdistetyn hoitomuodot mainittiin, joilla on pitkälle edennyt HNC ovat siis tarvitsevat uusia ja vähemmän invasiivisia hoitoja niiden korkea sairastuvuus tauti. Tässä tutkimuksessa ajatellut huomattava heterogeenisyys HNSCC kasvaimia, olemme keskittyneet yhteen hyvin määritelty anatominen sijainti, kurkunpää. Vaikka kurkunpään syöpä on erittäin parannettavissa joko kirurginen poisto tai säteilytys löydettäessä ja käsitellään varhaisessa vaiheessa, pitkälle edennyt syöpä pysyy paljon vähemmän parannettavissa mikä ei merkittävää parannusta kokonaiselinaika hinnat vuodesta 1975 [3]. Siten erittäin herkkä biomarkkerit havaitsemaan kurkunpään syöpään jo varhaisessa vaiheessa ilman kliinisiä oireita, ja merkitsevästi tehokkaampi uusia terapeuttisia aineita tarvitaan edelleen parantaa hoitotuloksia kurkunpään syöpä. Lisäksi nykyiset menetelmät ennustaa HNSCC potilaiden tarkastella muun muassa käyttämällä kliinis parametreja kuten primaarikasvaimen, alueellisten solmu, kaukainen etäpesäke (TNM) – vaihe, syvyys hyökkäystä, ja erilaistumista laatu. Nämä parametrit eivät heijasta ennusteen potilaiden ja muita ennustajia ja biomarkkerit olisi hyödyllistä potilaan hoidossa. Siten molekyyli- ja solubiologian on lupaava alan tutkimuksessa, joka voi johtaa löytö uusien biomarkkereiden ja uusia terapeuttisia kohteita.

MicroRNA (miRNA), joka koodaa pientä ei-koodaavan RNA ~22 nukleotidin, on nyt tunnustettu suuri geeniperheen ilmaistuna kasveissa, eläimissä, ja virukset sekä yksisoluisia leviä [4]. Useimmat eläin miRNA ovat evoluutiossa konservoituneita ja usein klustereita [5]. Ensisijainen miRNA (pri-miRNA) muodostavien varsi-silmukka-rakenteita, jotka pääasiallisesti transkriptoidaan RNA-polymeraasi II: n ja peräkkäin käsittelee kaksi RNaasi III kaltaisia ​​entsyymejä, Drosha solun tumassa ja Dicer solun sytoplasmaan, tuottaa kypsä miRNA [6] [7]. miRNA negatiivisesti säädellä geeniekspressiota on posttranskriptionaalisella tasolla pilkkomalla ja /tai translaation tukahduttaminen niiden mRNA tavoitteiden kautta vuorovaikutuksen avulla täydellinen emäspariutu- 5 ’päähän kypsän miRNA, jota kutsutaan myös siemen alueella [8]. Viimeaikaiset bioinformatiikan analyysit raportoi, että yli 60% proteiinia koodaavan geenien on potentiaalia pariutumaan ja ohjata miRNA [9]. Lisätutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA pelata erittäin tärkeitä rooleja lähes kaikista biologian, mukaan lukien metabolia, solujen proliferaatio, apoptoosin, kehitys ja erilaistuminen [10], [11].

Viime vuosina on ollut huomattavaa kiinnostusta ymmärtämään rooli miRNA taudin prosesseja ja niiden säätelyhäiriö uskotaan edistää pahanlaatuisten käyttäytymistä kasvaimia [12]. Yhteyksiä poikkeava ekspressio miRNA ja patogeneesi useiden syöpätyyppien [12] – [14] on dokumentoitu.

On myös raportoitu, että miRNA voisi olla ihanteellinen biomarkkereita syövän havaitsemiseen, koska: (i ) miRNA ilmentyminen usein väärin säädellystä syövässä [15], [16], (ii) ilmentyminen malleja miRNA ihmisen syövässä näyttävät olevan kudosspesifisiä [17], ja (iii) miRNA on epätavallisen korkea stabiliteetti jopa Formaliinifiksoidusta kudokset [18]. Lisäksi viimeaikaiset laaja miRNA tutkimus on myös paljastanut, että miRNA lupaavia terapeuttisia kohteita syövissä kuten paksusuoli-, rinta-, maha- ja maksan syöpäsairauksia [19] – [26].

Kaikki nämä seikat ovat tärkeitä tarjota syvempää ymmärrystä roolit miRNA vuonna HNSCC synnyssä ja mahdollisina prognostisia ja diagnostisten merkkiaineiden sekä terapeuttisia kohteita HNSCC. Tässä tutkimuksessa olemme profiloitu ekspressiota 723 ainutlaatuinen ihmisen miRNA 3 kurkunpään syöpä, 2 noncancerous kurkunpään kollegansa oligonukleotidigeenisirumenetelmää käyttäen kanssa hiusneularakenteen sisällytetty päälle 5′-pään koettimeen [27] valmistettu mustesuihkutulostimen oligonukleotidisyntetisaattoria [28] (Agilent Human miRNA V2, Agilent Technologies) ja tunnistettu useita miRNA, jotka voisivat toimia mahdollisina diagnostic tauti merkkiaineita. Olemme edelleen vahvistaneet ilmentymisen valitun miRNA käyttäen qRT-PCR (TaqMan® miRNA määrityksiä, Applied Biosystems) 5 noncancerous kollegansa, 14 polyypit tai kyhmyjä, 12 dysplasioita ja 17 kurkunpään syöpiä toimittamaan tietoja viittaa siihen, että muuttuneita ekspressiotasoja miRNA on toiminnallinen seuraus kurkunpään syöpä.

In situ

-hybridisaatio (ISH) lisäksi osoittanut selvästi erilaiseen ekspressioon miRNA syövän vaurio verrattuna normaaliin Levyepiteeli.

lisäksi arvioinut miR-196a esto

vuonna

vitro

ja

vivo

kasvuun HNSCC arvioimaan mahdollisuuksia miRNA uutena terapeuttisena kohteena HNC.

materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimuspöytäkirja tämän tutkimuksen hyväksyi Institutional Review board of Keio University School of Medicine ja Sano Kousei General Hospital. Kaikki kudosnäytteet otettiin varten diagnostisen koepalan tai hoitoja potilaille, joille tehtiin leikkaus hyväksymisen jälkeen tutkimuksen institutionaalisten tarkastelu alukselle Keio University School of Medicine ja Sano Kousei General Hospital. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Eläimet hoidettiin ja käytettyjen protokollien mukaisesti hyväksymien Animal Care ja käyttö komitean Keio University School of Medicine (lupa numero tähän tutkimukseen: 10243- (0 )). Kaikki Leikkaus suoritettiin tribromietanoli anestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Potilaat ja näytteet

Osa näytteestä käsitellään formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut (FFPE) menettely, jonka jälkeen rutiini patologisen analyysejä, kun taas jäljellä oleva kudos tyydyttyneitä RNA

myöhemmin

® (Ambion, Foster City, CA) ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes käsittely. Kaikki FFPE näytteet tarkistetaan kokeneet patologit vahvistaa diagnoosin. Potilaan ominaisuuksista ja patologisten pysähdyspaikan on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

Reagenssit

Ellei toisin mainita, rutiini kemialliset aineet saatiin joko Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO) tai Wako ( Osaka, Japani). miR-196a-inhibiittori (HSA-miR-196a miRIDIAN Serpentiinimutka Inhibitor, IH-300529-06) ja inhibiittori-negatiivinen kontrolli (kontrolli, miRIDIAN microRNA Inhibitor negatiivinen kontrolli ei. 1, IN-001005-01) Tässä tutkimuksessa käytetyt hankittiin Dharmacon (Lafayette, CO). miRIDIAN Hiuspinni Inhibitor suunniteltiin estämään RISC funktio kohde miRNA sen kaksijuosteinen alue [29]. Sillä

in situ

-hybridisaatio (ISH) Mir-196a, 3′-DIG-leimatun lukittu nukleiinihappo-sisällytetty miRNA koetin (miRCURY LNA ™ microRNA detektiokoetinta, Exiqon, Vedbaek, Tanska) käytettiin tässä tutkimuksessa.

RNA uuttaminen ja Microarray Analysis of miRNA

Kokonais-RNA, kuten alhaisen molekyylipainon RNA kudosnäytteistä ja syöpäsolulinjoissa eristettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeita. Laatu RNA-näytteet arvioitiin käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer, ja vain näytteet, jotka täyttävät 28S /18S 1 ja RNA Integrity Number (RIN) ≥7.5 käytettiin kaikissa analyyseissä.

mikrosiruanalyysi, käytimme ihmisen miRNA microarray Kit V2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), joka sisältää 20-40 varustelu kohdistaminen kukin 723 ihmisen miRNA (Agilent design ID 019118) [30] kuten selityksineen vuonna Sanger miRBase, julkaisu 10.1 [31]. Merkintöjä ja hybridisaatio kokonais-RNA-näytteet suoritettiin valmistajan protokollan. Sata ng kokonais-RNA: ta käytettiin syöttää leimausreaktioon, ja koko reaktio hybridisoitiin kunkin matriisin 20 tuntia 55 ° C: ssa. Tulokset analysoitiin Agilent GeneSpring GX7.3. Normaali valvontaa ja syövän näytteitä verrattiin käyttämällä Welchin t-testiä (p 0,05) ja ilmennetty eri miRNA ainakin 2-kertainen muutos ilmaisun katsottiin mahdollisia biomarkkereita. Kaikki in-house data mikrosi- analyysin miRNA talletettiin Gene Expression Omnibus (GEO), jossa annetaan viitenumero on GSE47610.

TaqMan® Quantitative Real-Time PCR määritys miRNA

ekspressiotasot kutakin miRNA varmistettiin TaqMan® Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) määritys käyttäen yksittäisten spesifisiä alukkeita ja koettimia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems, Foster City, CA). Lyhyesti, 10 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio miRNA-specific varsi-silmukka-alukkeita (Applied Biosystems), ja PCR toteutettiin generoidun RNA-cDNA-geenin-specific TaqMan® miRNA reaaliaikainen PCR-määritys ratkaisu on StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktio suoritettiin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 15 s, ja 60 ° C: ssa 60 s. Kaikki näytteet mitattiin kolmena kappaleena, kuten ei templaattikontrollien. Normalisointi tehtiin pienen ydin- RNA U6 (RNU6B; Applied Biosystems), ja suhteellinen ilmentyminen laskettiin käyttämällä vertailevan Ct (Cycle kynnys) menetelmällä. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen parillista t-testiä verrata ekspressiotasot pareittain ja Tukey-Kramer testi vertaamaan ekspressiotasot välillä useita sairauksia ja edelleen analyysit tehtiin pareittain Mann-Whitneyn U-testiä. Merkitsevyystasolla asetettiin p 0,05.

Next Generation sekvensointi miRNA

Uuden sukupolven sekvensointi analyysi suoritettiin käyttäen Applied Biosystems Solid ™ -järjestelmä ja vankka ™ Small RNA Expression Kit mukaan Solid ™ System 3 käyttöopas (Applied Biosystems). Prosenttiosuus pienten RNA kohti kokonais-RNA massa on laskettu Agilent 2100 Bioanalyzer. Pieni RNA pitoisuus rikastettiin käyttäen flashPAGE ™ fraktiointia (Ambion) tarvittaessa. Pieni RNA-lajit (10-40 nt) muutettiin sitten cDNA-kirjastojen avulla Solid ™ Small RNA Expression Kit (Applied Biosystems), jota seurasi puhdistus ja koon valinta PAGE noin ~105-150 kp. Klonaalisia vahvistus päälle helmien kanssa emulsio PCR suoritettiin käyttäen kiinteän ™ EPCR kit. Valmistetut helmet alistettiin laatutarkastuksen ajaa ja sitten sekvensoitiin Solid ™ 3 Analyzer. Yhteensä +11,6-35.900.000 järjestyksessä lukee saatiin kunkin kirjaston, ja loppupään analyysi suoritettiin käyttäen putkiston Solid ™ System pieniä RNA Analysis Pipeline Tool (korona RNA2MAP versio 0,50). Kaikki lukee kartoitettiin peräkkäin vastaan ​​(1) ribosomaalisen RNA: n ja siirtää RNA, (2) tunnettu viitesekvenssin miRNA Sanger miRBase Release 18, (3) hg19 ihmisen viite genomin kokoonpano (Genome viite Consortium GRCh37) sekä ihmisen mitokondrioiden genomin ( NC_001807.4). Summa useita lyhyen lukee kyseisen kuvata kunkin alueen kohteisiin normalisoitiin kokonaisvertailukorkeus-kartoitettu lyhyt lukee kussakin kirjastossa näytteestä, ja käytetään raaka-ilmaisua arvoja vastaavan alueen. Säilyttäminen ja toista tietoa saatiin käyttämällä Kalifornian yliopistossa Santa Cruz taulukko selaimen. Näytteet analysoitiin myös 2 kurkunpään syöpiä (T416, 66 yo mies, T3N0, T506, 74 yo mies, T3N2c) kuten pitkälle edennyt syöpä näytteet ja 3 kurkunpään papillomas (T421, 33 yo mies, aikuisiän, T484, 33 yo mies, aikuisiän; T502, 38 yo mies, aikuisiän) ei-syöpä näytteitä. Kaikki in-house tietoja seuraavan sukupolven sekvensointi miRNA talletettiin DDBJ Sequence Lue Archive (SRA), jossa annetaan viitenumero on PRJDB994.

In situ

hybridisaatio Mir-196a

in situ

tunnistus suoritettiin sarja 4-pm parafiinileikkeillä sisältää normaalit limakalvo ja kurkunpään syövän ainesta 74 yo miespotilas jolle tehtiin yhteensä laryngektomian täydellinen poistaminen kehittyneen T3 kasvain. Kohdat poistettiin parafiini ja sen jälkeen digestoitiin proteinaasi K: lla (10 ug /ml) 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Proteinaasi K -hajotuksen jälkeen, leikkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, ja objektilasit hybridisoidaan sitten 4 pmol Exiqon n miRCURY LNA detektiokoetinta komplementaarinen miR-196a hybridisaatiopuskuriin (50% formamidia, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM sitruunahappoa (pH 6), 50 ug /ml hepariinia, ja 500 ug /ml hiivan RNA: ta), yön yli 50 ° C: ssa. Salattu ja RNU6B koetin (Exiqon) käytettiin myös negatiiviset ja positiiviset kontrollit, vastaavasti. Sitten, sen jälkeen kun oli inkuboitu anti-DIG-AP-Fab-fragmentteja konjugoituna alkaliseen fosfataasiin laimennettuna 1:50 estoliuoksessa (Roche, Basel, Sveitsi) 3 tuntia huoneen lämpötilassa, hybridisoitu koettimet havaittiin käyttämällä nitrosinitetratsoliumia kloridi /5- bromi-4-kloori-3-indolyyli fosfaatti värisubstraattia (Roche) levyihin. Objektilasit vastavärjättiin ydin- nopea punainen ja analysoitiin käyttämällä Nikon ECLIPSE 55i mikroskoopilla.

Soluviljely ja transfektio

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) solulinjat, jotka ovat peräisin kielen (HSC- 2, HSC-3, HSC-4), ikenen (SAS), suuontelon (Ca9-22), kurkunpään (JHU-011) ja nielu (Fadu), olivat kaikki ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä -inactivated naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiinillä 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

transfektiokokeissa, solut transfektoitiin joko miR-196a estäjän tai -estäjä negatiivinen kontrolli käyttämällä Lipofectamine ™ 2000-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Inhibiittori negatiivinen kontrolli perustui C. elegans miRNA ja vastaa ruuttaa-miR-239b. Ohjaus on analysoitu BLAST vastaan ​​kaikki ihmisen, hiiren ja rotan genomiset sekvenssit ja miRNA sekvenssit miRBase järjestyksessä tietokantaan. Tämä molekyyli on samanlainen malli ja muutoksia miRIDIAN microRNA-inhibiittorit, jotka ovat tunnettuja kohdistaa mRNA. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja itsenäisesti vähintään 3 kertaa.

elinkykyyn ja Sytotoksisuusmääritys

JHU-011-soluja maljattiin 24-kuoppalevylle tiheyteen 2 x 10

4 solua /kuoppa ja ympättiin 24 tuntia. Sitten solut transfektoitiin kuten edellä on kuvattu, ja solujen lisääntyminen määritettiin suoralla solujen laskenta 0, 3 ja 5 päivää transfektion jälkeen. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja värjättiin 0,4% trypaanisinisellä mitata solukuolemien käyttäen Countess ™ (Invitrogen). Ydin- counterstaining käyttämällä Hoechst 33258 suoritettiin myös visualisoida elinkykyisten solujen 3 päivää transfektion jälkeen.

Lisäksi, solujen elinkelpoisuus ja sytotoksisuutta arvioitiin ero proteaasin toimintaa käyttäen MultiTox-Fluor Multiplex sytotoksisuusmääritys (Promega, Fitchburg, WI) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut siirrostettiin konsentraatiossa 5 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppaisen levyn ja transfektio suoritettiin, 24 tuntia ymppäyksen jälkeen. Sitten elävien solujen proteaasiaktiivisuutta ja kuolleiden solujen proteaasiaktiivisuutta mitattiin 3 päivää transfektion jälkeen lisäämällä glysyyli-fenyylialanyyli-aminofluorocoumarin (GF-AFC) tai bis-alanyyli-alanyyli-pnenylalanyl-rodamiini 110 (bis-AAF-R110) kuin peptidisubstraatteja, vastaavasti. Soluja inkuboitiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa ja saatu fluoresenssi mitattiin (elävien solujen fluoresenssi 400

Ex /505

Em; dead-solun fluoresenssi 485

Ex /520

Em) saadakseen suhteellinen fluoresenssi (RFU).

Kurkunpään syöpä ksenograftimalleja

Kokeet suoritettiin 6 viikkoa vanhoja BALB /c nude-hiirissä nu /nu. Eläimet hoidettiin ja käytettyjen protokollien mukaisesti hyväksymien Animal Care ja käyttö komitean Keio University School of Medicine (Tokio, Japani). Kymmenen hiirtä jaettiin satunnaisesti 2 ryhmään 5 hiirillä. Hoidon tehokkuus sekä kasvaimia ja niiden Paikallista imusolmukkeen etäpesäke tutkittiin kunkin seuraavan 2 ryhmää: Ryhmä 1, miR-196a-inhibiittori; Ryhmä 2 estäjän negatiivinen kontrolli (kontrolli). Hiiret nukutettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti 5-7 mg tribromietanoli. Orthotopic ksenograftikasvaimissa perustettiin kaulan tasolla kurkunpään ihonalaisella 5 x 10

6 JHU-011-solujen kanssa 25 olevan neulan. Yhden viikon kuluttua kasvaimet mitattiin kolmiulotteisesti mittaharpilla, ja sitten joko miR-196a tai kontrollia yhdistettynä AteloGene ™ (KOKEN, Tokio, Japani) (1 nmol /200 ui) injektoitiin ihon alle tiloihin ympäri kasvaimia. Muita hoitoja tehtiin 13 ja 19 päivää inokulaation jälkeen kasvainsolujen ja määräajoin mittaus kasvain suoritettiin 12 viikkoa injektion jälkeen. Hiiret lopetettiin ja tuumorimassoja kerättiin, sitten leikataan 2 kpl. Puolet kunkin kasvaimen kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin yössä, kuivattu askel-askeleelta etanolia, ja upotettiin parafiiniin. Jäljellä puoli kasvaimen kyllästettiin RNA

myöhemmin

® (Ambion), ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kahdenväliset kaulan imusolmukkeet kerättiin, snap-pakastaa ja parafiiniin. Hematoksyliini-eosiini-värjäys suoritettiin parafiiniin näytteitä histologista analyysejä. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen t-testiä verrata terapeuttista vaikutusta miR-196a estäjä vastaan ​​kurkunpään syöpä

vitro

ja

vivo

. Merkitsevyystasolla asetettiin p 0,05.

Tulokset

Microarray seulonta Altered miRNA ilmentäminen Kurkunpään Cancer

Tunnistaa miRNA väärin säädellystä vuonna kurkunpään syöpiä, ensin tutkinut ilmaisun profiilit 723 ihmisen kypsän miRNA 5 kurkunpään kudoksissa (3 kurkunpään syöpiä ja 2 vierekkäistä noncancerous kurkunpään vastapuolia) käyttäen mikrosiruja. Tulokset osoittivat, että 5 miRNA (miR-130b-5p (aiemmin nimetty miR-130b *), miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, ja miR-801) tai 2 miRNA (miR-133b ja miR-145) olivat merkittävästi säädelty tai alassäädetty, vastaavasti kurkunpään syöpiä (kuvio 1A). Mielenkiintoista on, että ekspressiotasot joko antaa-7 perheen, miR-15, miR-16, tai miR-17-92 klusterin, tiedetään liittyvän erilaisiin muita syöpiä, ei ollut ilmeisesti eroa kurkunpään syövän kudosten ja muiden noncancerous kudoksissa (kuvio 1B).

Aineistot verrataan syövät ja viereisten noncancerous kollegansa, piirtämällä runsaasti tietyn miRNA yhdessä aineisto vastaan ​​vastaava arvo muussa aineisto sekä log mittakaavassa. 723 ihmisen miRNA sisällytettiin Agilent microarray. (A) vertailu normaalin valvonnan ja syöpänäytteissä osoitti säätely ylöspäin 5 miRNA (miR-130b-5p, miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, ja miR-801) ja alaspäin sääntely 2 miRNA (miR-133b ja miR-145). (B) Expression tasot let-7 perhe, miR-15, miR-16, tai miR-17-92 klusterin, tiedetään olevan mukana useita muita syöpiä, ei ollut merkitsevää eroa normaalin valvonnan ja syöpien (

ylempi oikea paneeli

ja

alapaneelit

). Ekspressiotasot 723 ihmisen miRNA esitetään myös (

ylempi vasen paneeli

).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR validointi miRNA ilmentäminen Kurkunpään Cancer

Seuraavaksi vahvistamaan ja validoimaan saatu tieto meidän mikrosiruanalyysi, suoritimme kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysi (TaqMan® MicroRNA määritykset, Applied Biosystems) käyttäen 5 paria ensisijaisen kurkunpään syöpiä ja niiden yhteensovitettujen noncancerous kudoksiin. Vaikka microarray analyysi paljasti säätely ylöspäin 5 miRNA ja alas-säätely 2 miRNA, miR-801 on nyt pidetään fragmentti U11 spliceosomal RNA ja poistettava miRBase [31]. miR-145 oli myös jätetty lisätutkimuksia, koska se on raportoitu usein säädellä vähentävästi syöpiä monissa elimissä kuten eturauhassyöpä [32], rintasyövän [33], virtsarakon syöpä [34], paksusuolen syöpä [35 ], [36], munasarjasyöpä [37], ruokatorven syöpä [38], keuhkosyöpä [39], [40], nenänielun syöpä [41], mahasyöpä [42], samoin kuin B-solujen maligniteetteja [43] ja pidetään ole asianmukainen biomarkkeri kurkunpään syöpään.

miR-455-5p sijasta miR-455-3p käytettiin lisätutkimuksia, koska miRNA 3p ja 5p syntyvät kummaltakin puolelta saman esiaste stem olevan samankaltaiset sekvenssit ja viime raportissa ehdotettiin mahdollisia osallistumista miR-455-5p syövän etenemisessä [44]. Siten qRT-PCR-analyysi suoritettiin jäljellä 4 miRNA (ts miR-130b-5p, miR-196a, miR-455-5p, ja miR-133b). Ekspressiotasot näissä miRNA verrattiin välillä 5 syövän kudosten ja niiden vieressä noncancerous kudoksiin. Tulokset olivat yhdenmukaisia ​​saatu microarray-analyysit, erityisesti silloin, kun täsmäsi näytteitä verrattiin samassa potilailla (kuviot 2A ja B). Korkeammat ekspressiotasot miR-130b-5p havaittiin syövän kudoksissa verrattuna naapurimaiden valvontaa 4 5 paria. Lisäksi ekspressiotasot miR-196a ja miR-455-5p olivat merkittävästi korkeammat syöpäkudoksiin verrattuna naapuri- kontrolleihin (miR-196a, p = 0,0460; miR-455-5p, p = 0,0286) (kuvio 2A), kun taas ilmentymistaso miR-133b oli merkitsevästi pienempi syöpänäytteissä verrattuna kontrolleihin (p = 0,0274) (kuvio 2B).

suhteellinen ilmauksia kurkunpään syöpään liittyvien miRNA 5 pariksi näytteistä mitattiin Taqman® qRT- PCR-analyysi ja esitetään

jäljellä paneelit

. Ilmentymistasoja viereisissä noncancerous kollegansa (NCS) kussakin parissa on asetettu olemaan 1

oikea paneelit

selkeää visualisointia merkittävien kertainen ero kussakin miRNA. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina kanssa keskihajonnat. (A) Up-regulation of 2 miRNA (miR-196a ja miR-455-5p) vahvistettiin syövissä, kun 5 syöpiä verrattiin niiden NCS. *,

p

0,05. (B) miR-133b oli säädellä vähentävästi syöpiä kaikki 5 pareittain. Tilastollisesti merkitseviä eroja ilmentymisen tasojen miR-196a, miR-455-5p, ja miR-133b välillä ei havaittu pareittain. *,

p

0,05.

Niinpä näistä 4 miRNA, 3 miRNA (eli miR-196a, miR-455-5p ja miR-133b) osoittivat merkitsevästi eri ekspressiotasoja syövän kudoksissa verrattuna niiden Hyväksytty kontrollisilkkipaperia ja edelleen määrällisesti miRNA suoritettiin käyttäen 48 kurkunpään näytteitä. Nämä yksilöt sisältyi 5 noncancerous kollegansa, 14 hyvänlaatuisia vaurioita (polyyppi, kyhmy, polypoid tai hyperkeratosis), 12 dysplasiat, ja 17 kurkunpään syöpiä. Kun 48 näytteitä tutkittiin, ilmentymistason miR-455-5p oli huomattavasti korkeampi syövissä verrattuna viereiseen noncancerous kollegansa ja hyvänlaatuisia kurkunpään kudoksiin (p = 0,0113). Lisäksi ilmentymistaso miR-196a oli selvästi korkeampi syövän kudoksissa verrattuna noncancerous muiden kudosten (viereisen noncancerous kollegansa ja hyvänlaatuinen kurkunpään kudoksiin, p = 0,0003, dysplasiat, p = 0,0040) (kuvio 3A). Vaikka miR-133b osoittivat huomattavasti pienempi ekspressiotasot, kun syöpä-näytteitä verrattiin täsmäsi noncancerous kurkunpään kudoksiin (kuvio 2B), ilmentymisen taso tämän miRNA ei ollut merkittävästi pienempi syöpänäytteissä verrattuna noncancerous muiden kudosten (noncancerous vastineet ja hyvänlaatuisia kurkunpään kudoksiin, p = 0,8353, dysplasiat, p = 0,2185) tutkimuksessa käyttäen useita näytteitä (kuvio 3B).

(A) Expression tasot miR-455-5p ja miR-196a mitattiin TaqMan® qRT-PCR käyttäen 48 kudosnäytteitä. Vieressä noncancerous kudokset (noncancerous kollegansa, NCS) esitetään avoimina quadrangles. Merkittävät säätely ylöspäin miR-455-5p havaittiin syövissä verrattuna NCS ja hyvänlaatuinen näytteitä. Ekspressiotasot miR-196a olivat merkitsevästi korkeammat syövän kudoksissa verrattuna joko NCS ja hyvänlaatuisia näytteitä tai precancerous dysplasia näytteitä. Pylväät osoittavat keskiarvo kussakin ryhmässä. *,

p

0,05. (B) Expression tasot miR-133b tutkittiin myös useita näytteitä. Vaikka suhteellisesti pienempi ilmentyminen havaittiin syöpien, erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä verrattuna muihin ryhmiin. Pylväät osoittavat keskiarvo kussakin ryhmässä. *,

p

0,05.

Siksi tutkimaan edelleen merkitystä miR-196a lupaavana biomarkkeri kurkunpään syöpään, qRT-PCR-analyysi miR-196a oli suoritettiin 84 histologisesti varmistettu näytteitä (15 noncancerous kollegansa, 24 hyvänlaatuinen sairaudet, 18 dysplasiat, 27 kurkunpään syövät) ja 7 HNSCC solulinjat. Tutkimus osoitti, että yhä useammin miR-196a ekspressiotaso havaittiin, kun syöpä näytteitä verrattiin noncancerous kollegansa, hyvänlaatuinen kudoksia tai dysplasioita (kuvio 4A). Ekspression miR-196a syöpien oli merkittävästi korkeampi kuin niiden yhteensovitettujen pariksi näytteistä (p = 0,005) ja se oli myös ilmeistä kurkunpään syövän solulinja JHU-011-soluja (tietoja ei esitetty). Lisäksi löysimme ilmaus miR-196a oli merkitsevästi korkeampi kehittynyt syöpä kuin aikaisin syöpä (p = 0,0045, kuvio 4B,

vasen paneeli

), ja myös alussa syöpään kuin prekanseroosi dysplasia (p = 0,0263; Kuvio 4B,

Oikea paneeli

). Yhdessä nämä havainnot, miR-196a voisi olla suotuisa markkeri kurkunpään syöpään.

(A) merkitys miR-196a lupaavana biomarkkeri kurkunpään syövän vahvistettiin TaqMan® qRT-PCR: llä käyttämällä 84 kudosta näytteet. Määritys myös 7 HNSCC solulinjat. Noncancerous kollegansa (NCS) esitetään avoimina quadrangles. Pylväät osoittavat keskiarvo kussakin ryhmässä. (B) Expression taso miR-196a oli korkeampi kehittyneitä (T3 ja T4) syövät verrattuna varhain syöpiä (T1 ja T2) (

vasen paneeli

). Lisäksi merkittävästi suuremman miR-196a ilmentymistä havaittiin varhain T1 a syöpänäytteissä verrattuna precancerous dysplasia näytteiden (

oikea paneeli

). Pylväät osoittavat keskiarvo kussakin ryhmässä. *,

p

0,05.

laadullinen ero Mir-196a isomiRs paljasti Deep Sequencing

Viime kynnyksellä syvä sekvensointitekniikan paljasti, että on olemassa yleensä vaihtelut kypsä miRNA sekvenssejä keksi termin ”isomiR” [45]. Tällaiset vaihtelut johtuvat pääasiassa siirtymää pilkkomiskohtien kun kypsät miRNA käsitellään Drosha ja Dicer, mutta myös käyttöön terminaalin nukleotidin lisäyksiä tai sisäinen RNA muokkausta. Vaikka fysiologinen merkityksiä monimuotoisuuden isomiR pysyy vaikeasti, kertyvät todisteet viittaavat siihen, että on olemassa kehityshäiriöitä /kudosspesifisiä etusija spektrissä isomiRs.

Näin tutkimaan mahdollisia heterogeenisuus ilmaisun profiilit miR-196a isomiRs välillä kurkunpään syöpä ja ei-syöpä kudoksiin, syvä sekvenssianalyysi pienten RNA suoritettiin käyttäen Applied Biosystems Solid-järjestelmä (Kamimoto T et ai., käsikirjoitus toimitettu). On olemassa kaksi erillistä geeniä miR-196a, nimittäin

mir-196a-1

at CHR 17 ja

mir-196a-2

at CHR 12, ja niiden transkriptio- kypsä miRNA samaa 5 ’arm *,

p

0,05. *,

p

0,05. *,

p

0,05. *,

p

0,05.