Krooninen sairaus

tiivistelmä

Testasimme hypoteesia, että (i) synonyymi vaihtelu kooditusalueiden , ja (ii) vaihtelu ei-koodaavat alueet HPV, vaikuttavat kohdunkaulan syöpä (CaCx) synnyssä alle vaikutuksesta ehjä HPV16 genomien. Koko genomin sekvenssi analyysi HPV16-isolaattien enintään 70 CaCx tapauksissa ja 25 ei-pahanlaatuinen näytteitä osoitti, että samaa vaihtelut olivat huomattavasti korkeampia sisällä E6 (p = 0,014), E5 (p = 0,001) ja L2 (p = 0,0002) geenien HPV16 isolaattien sisällä tapauksissa verrattuna isolaatit sisällä hyvänlaatuisen näytteitä. Kaikki 25 (100%) humanisoitu kodoneja yksilöidyille L2 ORF näytteistä analysoidaan olivat tunsivat jonka CaCx tapauksissa taas 8 ulos 25 (32%) on tunsivat HPV16 positiivinen hyvänlaatuisen näytteissä (p = 3.87105E-07 ). L2 (mRNA ja proteiini) ilmentyminen oli ilmeistä vain keskuudessa tapauksissa episomaaliset virusgenomien ja L2 mRNA: n ilmentymisen korreloi merkitsevästi E2-geenin kopio numerot viittaa ilmaisu kaikilta episomaalisina genomeista. Tällaisia ​​tapauksia, Aasian amerikkalainen (AA) isolaattien kuvata kaikki humanisoidun kodonien (100%; 4-6 /näyte) rekisteröidään L2, mikä oli merkitsevästi korkeampi (p = 2.02E-7) verrattuna Euroopan (E) isolaateista (22,8%; ei yhtään tai 1-2 /näyte). Lisäksi suurin osa E variantti isolaatit sisällä tapauksia (54/57; 94,7%) kuvataan muunnelma (T4228C) sisällä lyhyen ei-koodaava alue (NCR2) välillä E5 ja L2-geenit, joka kuvaa heikon promoottorin aktiivisuus spesifistä L2 mRNA ilmaisun . Tämä johti menetykseen 9 ulos 14 miRNA sitoutumiskohtia (HSA-miR-548 perhe), huolimatta merkittävistä yli-ilmentymisen miR548a-5p ja miR548d-5p keskuudessa tällaisissa tapauksissa (28.64 ja 36.25 taittuu, tässä järjestyksessä), verrattuna HPV negatiivinen kontrollinäytteitä. Havainnot esimerkkinä biologista merkitystä sekvenssin vaihtelut HPV16 genomien ja korostaa, että episomaalista HPV16 CaCx tapauksissa käytetään useita mekanismeja ylläpitää L2 ilmaisua, mikä oikeutti mahdollista roolia L2 tällaisissa syöpien, verrattuna niihin, jotka suojelevat viruksen integraation.

Citation: Mandal P, Bhattacharjee B, Das Ghosh D, Mondal NR, Roy Chowdhury R, ​​Roy S, et al. (2013) Differential Expression of HPV16 L2-geenin kohdunkaulasyövän kätkeminen episomaalista HPV16 Genomit: Influence of Synonyymi ja ei-koodausalueen Variations. PLoS ONE 8 (6): e65647. doi: 10,1371 /journal.pone.0065647

Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugali

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2013; Julkaistu: 06 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Mandal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat osittain Department of Biotechnology (Grant No. BT /PR8014 /Med /14/1220/2006), Intian hallitus, ja osittain Intian Statistical Institute (Intramural), ja National Institute of Biomedical Genomics (Core Grant). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yhdistyksen sukuelinten ihmisen papilloomaviruksen (HPV) ja kohdunkaulan syöpä (CaCx) on vahva ja riippumaton muista riskitekijöistä, kuten käy ilmi johdonmukaisen havainnot kirjattiin epidemiologisista tutkimuksista useissa maissa [1]. Noin 50% CaCx tapauksista johtuu HPV16 [2], [3]. Intiassa myös, HPV16-infektio on kaikkein hallitseva tyyppi liittyy CaCx [4] – [6] ja on myös yleisin tyyppi tunnistettu yleisesti väestön tietojen perusteella käytettävissä joidenkin Intian alueiden [5] – [9].

aikana vaiheen ohimenevä infektio, episomaalisia muodossa HPV jäljittelee yhdessä erottamaan epiteelisolut tyvikalvon pinnalliseen vyöhyke, ja viruspartikkelit siinä irtoaa pois yhdessä sloughed-off epiteelisolujen [10] . Kuitenkin korkealaatuista kohdunkaulan neoplasian näyttää ominaista vapautuneilla viruksen geenien ilmentymistä ja epäonnistuneen elinkaari viruksen [11]. Siksi muuttamassa mahdollisuudet HPV todennäköisesti korreloi potentiaalia purkamalla ilmaisun keskeisten virusproteiinien [12] – [14], samoin kuin kyky välttää immuunijärjestelmän hyökkäyksen isäntä, jotta jatkuvat sisällä isäntä kohdunkaulan epiteelin [15].

integrointi virusgenomien isännän genomiin, pääasiassa at hauras sivustoja [16], [17], vaikuttaa eri solureiteillä isäntäsolun syklin koneita. Tämä johtaa häiriöitä viruksen E2-geenin, yleisimmin alueella, joka koodaa sarana-alueen HPV16 E2-proteiinia. Puuttuessa E2-ajettu tukahduttaminen, E6 ja E7 ovat yliekspressoituina ohjaten näin infektoituneita soluja kohtaan muutosta. Päinvastoin, meidän tutkimus [18] sekä muutama muu [19], ovat havainneet, että huomattava osa yksilöiden CaCx satama ehjä E2-geeni [20]. Tämä voi olla joko pelkästään ehjä (episomaalinen) tai samanaikainen, eli seosta, jossa on ehjä (episomaalinen) ja hajotettiin (integroitu) muotoja. Tällaiset havainnot viittaavat siihen, biologinen uskottavuus kohdunkaulan syövän synnyn alle vaikutuksesta HPV16 ehjä E2-geeni tai ehjän virus genomeja, toisin kuin E2 häiriöitä tai integraatiota.

tutkia tarkemmin uusia paradigmoja HPV16 liittyvien CaCx synnyssä alla vaikutus episomaalisen virusgenomien ehjillä E2-geenien, suoritimme genomin laaja sekvensointi tällaisten virusgenomien CaCx tapauksissa ja ei-pahanlaatuiset näytteitä, aluksi ilman E1-geeni [21] ja sen jälkeen sisällyttää E1 tässä tutkimuksessa. Niinpä syntyy sekvenssi tiedot koko HPV16-genomin. Eurooppalainen variantti (E, 86.32%) oli yleisin meidän väestö sekä kontrollien joukossa sekä tapauksissa, jonka jälkeen Aasian ja Amerikan variantteja (AA, 13,68%), jota kirjattu vain joukossa tapauksia.

Nonsynonymous yhden nukleotidin polymorfismit (SNP) pidetään toiminnallinen, koska ne aiheuttavat muutoksia aminohappotasolla joka voisi toiminnallisesti vaikuttaa proteiineja. Aikaisemmat analyysi [21] keskittyi niin vaihtelu yleisin E variantti haplotyyppi E-12, joka perustuu SEULOA tietokantaan. Tutkimus osoitti, että harvinaisia ​​haitallisia vaihtelu geenit tuottaviin infektio (L1, L2, E2 ja E5), yli E-12 haplotyypin tausta ehjä HPV16 isolaattien, saattaa olla syy merkitystä CaCx kehittämiseen. Synonyymi muunnelmia toisaalta voi vaikuttaa myös viruksen geeniekspressioiden moduloimalla kodoninkäyttökaava [22].

Aikaisemmat tutkimukset ryhmämme on myös käsityksen biologista merkitystä ei-koodaavilla alueilla HPV16, kuten osallistumisen nukleotidin vaihtelun sisällä E2BSIV LCR [18], metylaatio CpG: t sisällä E2BSI /II LCR [23] ja toista laajennuksia sisällä NCR-2 [21] patogeneesissä kohdunkaulan syövistä kätkeminen ehjä HPV16 genomit. Tavoitteenamme tässä oli uudelleen tutkia yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) sisällä koko genomin HPV16, joka sisältää E1-geenin, joukossa episomaalista HPV16 isolaattien sisällä hyvänlaatuisen näytteiden ja CaCx tapauksissa. Erityisesti korostimme määrittämisestä yhdistys synonyymi vaihtelu ehjä HPV16 genomeja mahdollisesti kanssa CaCx patogeneesi ja tunnistaminen geenit, jotka tunsivat tällaisia ​​vaihteluja, kun otetaan huomioon niiden biologista merkitystä. Olemme edelleen tutkia mahdollisuutta, että nukleotidiin vaihtelu ei-koodaavat alueet, erityisesti transloimattomat alueet HPV16 genomien ovat biologisesti relevantti myös, lukuun ottamatta niitä, jotka kuuluvat koodaavat alueet.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki näytteet, pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset, kerättiin aiheista kanssa kirjallinen lupa hyväksymä institutionaalisten eettinen komitea ihmiskokeita Intian Statistical Institute, Kolkata, Intia.

näytteet ja kohteet

tiedot koskevat aiheita, näytteet, DNA eristys, HPV seulonta ja määritys HPV16 E2 kopiomäärä ja häiriöitä asema on kuvattu yksityiskohtaisesti aiemmissa tutkimuksissa [8], [18], [20] , [21], [23], [24]. Analysoimme DNA-näytteet käsittävät paneelin HPV16 positiivinen pahanlaatuinen tapauksissa (n = 94) ja HPV16 positiiviset sytologisesti terveillä (n = 29), jota merkitään tässä kuin HPV16 positiivinen hyvänlaatuisen näytteitä. Näistä 70 pahanlaatuiset näytteet ja 25 ei-pahanlaatuisia näytteet on otettu meidän aikaisemmin raportin HPV16 järjestyksessä tietoja ilman tiedot E1-geeni [21]. Pahanlaatuinen Näytteet tyypillistä mediaani-ikä oli 50 vuotta (vaihteluväli = 27-60 vuotta) ja ei-pahanlaatuinen näytteiden mediaani-ikä oli 34 vuotta (vaihteluväli 27-80 vuotta).

Kaikki pahanlaatuinen näytteet (histopatologisesti vahvistettu invasiivisia okasolusyöpää ja kliinisesti diagnosoitu kasvain vaiheen III ja yli kohti FIGO luokittelu ja enemmistö oli diagnosoitu kohtalaisen eriytetty okasolusyöpä patologisesti) olivat peräisin naimisissa aiheista. Ei-pahanlaatuisen näytteet olivat normaalit kohdunkaulan naarmuilta vahvistettu Papa testi ja johdettu naimisissa ja ei-raskaana (tai, 6 kuukautta jälkeinen) naisilla, joilla ei ole aiemmin ollut kohdunkaulan dysplasia /maligniteetti. Muutamia näytteitä tästä ryhmästä oli histopatologisesti vahvistettiin normaali kohdunkaulan biopsiat peräisin oleville naisille kohdunpoisto eri syistä kuin syövät, kuten kohdun esiinluiskahdus, fibroid, kysta jne ja ilman aiemmin ollut kohdunkaulan dysplasia /maligniteetti.

Re-sekvensointi HPV16-genomin

re-sekvensointi HPV16 genomien ainoastaan ​​sellaiset näytteet (ei-pahanlaatuinen ja tapaukset) kätkeminen ehjän virus-genomien perusteella (i) ehjä E2-geenin määritettynä DNA- taso PCR koko E2-geeni [18] ja (ii) Taqman määritys arvioimiseksi E2 ja E6-geenin kopio numeroita (episomaalinen, kun E2 /E6 ratio≥1 ja sekoitetaan tai samanaikainen kun 0 E2 /E6-suhde 1 ) [20].

Viisitoista sarjaa päällekkäisiä alukkeita käytettiin uudelleen sekvensointi HPV16-genomin. Näistä alukesekvenssit ja PCR-olosuhteet yksitoista erilaista aiemmin kuvatut laboratoriostamme [21]. Näiden lisäksi, neljä päällekkäisiä alukkeita käytettiin ulottuu koko alueen E1-geenin. Yksityiskohdat alukesekvenssien ja PCR-olosuhteet E1-geeni on kuvattu taulukossa S1. Re-sekvensointi HPV16 ehjä genomit tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [21] ABI Prism ™ 3100 automaattisen sekvensserin käyttäen dye terminator kemiaa. DNA-sekvenssit analysoitiin käyttämällä PolyPhred paketti (https://droog.mbt.washington.edu/PolyPhred.html) ja HPV16R sekvenssi käytettiin viitteenä linjaukset [25]. Tunnistaminen harvinaisia ​​muunnoksia ja poistamisen mahdollisuuksia sekvensointivirheitä tehtiin kohti edellisen raportin meidän ryhmä [21].

tunnistaminen biologisesti merkittävistä synonyymi vaihtelu koodaavat alueet HPV16-genomin

synonyymi vaihtelut sisällä ORF HPV16 määritettiin sekvenssistä tietojen analysointi. Taajuus käyttö kodonien ja aminohappoja johtuen synonyymi vaihteluista tunnistettiin ohjelman pohjalta ”Graafinen kodonikäytäntöä Analyzer (GCUA) osoitteessa https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html ja lopulta humanisoitujen kodonien sisällä HPV16 ORF tunnistettiin.

tunnistaminen biologisesti merkittävistä vaihtelu ei-koodaavat HPV16-genomin (lyhyt kuin koodausalue NCR2 välillä E5 ja L2) B

nukleotidin vaihtelun suurten ei-koodaava alue HPV16 eli LCR analysoitiin ja aiemmin ilmoitettua [18]. Esillä olevassa tiedonannossa, meidän painopiste oli lyhyt kuin koodaavan alueen, NCR2, välillä E5 ja L2 alueiden HPV16 ottaen mahdollista osallistumista tämän alueen sääntelyn L2 ilmaisun [26]. On todettu äskettäin, että isäntä miRNA pystyvät loukata virusten elinkaaren, virus- tropismi ja patogeneesin virustautien [27]. Näin ollen, käyttämällä RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) ohjelmisto, olemme määritelleet miRNA sitomispaikkojen NCR2 HPV16-isolaattien ja menetys tällaisten sitoutumiskohtien, jos sellainen on, alle vaikutuksesta yhden nukleotidin eroja. Olemme edelleen vahvisti menetys sellaista sitoutumista, työllistää miRBase [28].

RNA: n eristys ja cDNA valmistelu

Yhteensä RNA: ita, mistä kohdunkaulan kudosnäytteitä eristettiin, puhdistettiin ja käsiteltiin DNaasi I käyttäen Qiagen RNeasy kit valmistajan ohjeiden protokollaa. Yksi mikrogramma kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä, tehtiin käänteistranskriptio käyttäen aluketta (dT) 17-P3, eli oligo (dT) 17-aluketta, joka on kytketty kytkijäsekvenssin (5’GACTCGAGTCGACATCGA TTTTTTTTTTTTTTTTT 3 ’) [29] on 20 ui reaktioseosta. Lyhyesti, kutakin RNA-näytettä sekoitettiin 400 ng: n oligo- (dT) -P3 aluketta ja inkuboitiin 70 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Sekoitus (10 ui) oli jäähdytettiin nopeasti jäällä ja sekoitettiin sitten yhtä suuren tilavuuden kanssa seosta, jossa oli 2X käånteistranskriptaasipuskuria, 8 mM dNTP: itä (DTT), 20 U RNaasi-inhibiittoria ja 50 U MultiScribe ™ käänteistranskriptaasia (korkea kapasiteetti cDNA Reverse Transcription kit, Applied Biosystems) ja käänteistranskriboitiin 42 ° C: ssa 60 minuuttia, mitä seurasi inaktivointi 70 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Käänteistranskriptioreaktio, mRNA: n kanssa ja kaikki reagenssit, mutta ei käänteistranskriptaasia, suoritettiin näytteiden negatiivisina kontrolleina.

Kvantitatiivinen PCR perustuva analyysi L2-mRNA: n ekspression

L2-mRNA: n ilmentyminen määritettiin kvantitatiivinen PCR (qRT-PCR) ABI 7900 HT PCR alustan, seuraava suhteellinen kvantifioinnin kanssa ACTB ilme. Tässä määrityksessä 100 ng cDNA: ta käytettiin 10 ul reaktioseosta

Virta

SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja 25 ng sekä eteenpäin (L2 (3) F: 5 ’TAT GGA AGT ATG GGT GTATTT T 3 ’), ja reverse-alukkeita (L2 (1) R: 5’ ATC TGG GGG AAT GGA AGG T 3 ’). ACTB ilmentyminen kvantitoitiin myös reaaliaikaista PCR-reaktiossa 10 ui sisältäen 100 ng cDNA: ta ja 25 ng eteenpäin (ACTB RTF: 5 ’ATCCGCCGCCCGTCCACAC 3’) ja reverse-alukkeita (ACTB RTR: 5 ’TGCCGTGCTCGATGGGGTACT 3’). ACTB ilmaisu toimi sisäisen valvonnan luotettavuuden varmistamiseksi koko RNA-näytettä. Dissosiaatiokäyrä analyysi tehtiin, jotta voidaan sulkea pois esiintyminen ei-spesifinen monistuminen ja alukkeella dimeerimuodostus. PCR-ohjaimet olivat NTC (non-mallin ohjaus) sekä erilliset alikvootit Käänteistranskriptioreaktiot kanssa (i) kaikki reagenssit paitsi mRNA, (ii) mRNA ja kaikki reagenssit, mutta ei käänteiskopioijaentsyymin, ja (iii) HPV-negatiivinen solu mRNA.

immunoblottianalyysi L2 ilmaisun

kudosnäytteitä (10 mg noin) homogenoitiin 100 ui jääkylmää proteiinia lyysipuskuria (30 mM Tris HCI, pH = 7,5, 1 mM MgCI

2, 1 mM EGTA, 0,67% β-merkaptoetanolia, 0,5% CHAPS, 10% glyseroli ja 0,5% Triton X100), joka sisälsi proteaasiestäjäseostabletit (Roche). Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 4 ° C: ssa ravistellen, ja sen jälkeen sentrifugoimalla nopeudella 12000 rpm 4 ° C: ssa 20 minuutin ajan, supernatantti otettiin talteen ja arvioitiin Bradfordin (Biorad, Hercules, CA) valmistajan protokollan mukaisesti. Kolmekymmentä mikrogrammaa kaikista proteiinin näytteet ajettiin 12,5% SDS-PAGE kahtena ja sitten siirrettiin PVDF-kalvoille. Jälkeen epäspesifinen esto, kalvo käsiteltiin 3:5000 laimentamalla hiiren L2 primaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, sc-65709; esiin aminohappoja 40-150 HPV16 L2) yli yön 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen kalvo käsiteltiin uudelleen anti-hiiri-vasta-ainetta (1:5000 laimennus vuohen anti-hiiri-IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) 37 ° C: ssa 2 tuntia ja 30 minuuttia. L2-proteiinin ekspressiota havaittiin kemiluminesens- perustuvaa määritystä, pesun jälkeen kalvo. Expression of ACTB proteiinin määritettiin sisäisenä kontrollina. Hiiren monoklonaalinen ACTB primaarista vasta-ainetta (2:5000 laimennus, Abcam, ab6276) ja anti-hiiri-vasta-ainetta (1:5000 laimennus vuohen anti-hiiri-IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) käytettiin ACTB proteiinin ilmentyminen analysoidaan . Densitomet- analyysin kustakin bändi L2 ja ACTB suoritettiin käyttämällä IMAGE J ohjelmisto (https://rsb.info.nih.gov/ij/docs/index.html). L2-proteiinin ilmentyminen oli edustettuna kannalta suhteellisen tiheyden kunkin kaistan L2 normalisoitu vastaavilla ACTB proteiinin kaista (alue L2-proteiinin band /alueen ACTB proteiinin kaista).

suhteellinen kvantitointi kypsä miRNA by TaqMan miRNA real-time PCR

TaqMan miRNA Kokeita miR-548a-5p ja miR-548d-5p tehtiin, käyttämällä cDNA valmistettiin kokonais-RNA näytteistä, käyttämällä spesifisiä miRNA alukkeita TaqMan miRNA-määritykset ja reagensseja TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit (ABI; Cat # 4366596). 15 ui käänteistranskriptio reaktiot koostuivat 10 ng kokonais-RNA: ta, 5 U MultiScribe käänteistranskriptaasia, 0,5 mM kutakin dNTP: tä, 1 x käänteistranskriptio-puskuria, 4 U RNaasi-inhibiittoria, ja nukleaasi-vapaaseen veteen. Tämä suoritettiin 16 ° C: ssa 30 min ja 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan, lopetettiin 85 ° C: ssa 5 min. Reaaliaikaiseen PCR TaqMan Mirna määritykset, käytimme 0,5 ui 20 x TaqMan Mirna Pitoisuus Primer, 1,33 ui laimentamatonta cDNA, 5 ui 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix ja 3,17 ui nukleaasitonta vettä. Reaaliaikainen PCR-ohjelma sisältyy alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja pariutuminen 60 ° C: ssa 1 minuutin ajan. PCR-ohjaimet olivat NTC (non-mallin ohjaus). Kukin määritys suoritettiin vähintään kaksi kertaa, kolme rinnakkaista näytettä kohden jokaisessa määrityksessä, on microamp optinen 96-kuoppalevyille käyttäen 7900 HT PCR System (ABI). Suhteellinen ilmentyminen miRNA laskettiin RNU6b (TaqMan miRNA ohjattu määritys) kuin endogeeninen kontrolli, ja kalibroitu kontrollinäytteestä.

Tilastolliset analyysit

Järjestö eri nukleotidimuutosta virus- genomin, jossa CaCx synnyssä, määritettiin käyttäen chi-neliö testi tarvittaessa. Tätä me verrataan tapauksia ja ei-pahanlaatuiset ryhmä säätämisen jälkeen koko kunkin ORF. Vääriä löytö hinnat 0.05 saatiin korjaamaan useita testejä käyttäen Benjamini ja Hochberg menetelmällä [30] kantavassa eroa prosentteina humanisoidun kodoneja ja SNP NCR2 välillä CaCx tapauksissa ja ei-pahanlaatuiset näytteiden välillä ja AA: n ja E-variantteja oli määritettiin myös chi-neliö testi. L2-mRNA: n ilmentyminen ja densitometria perustuva analyysi L2-proteiinin ekspressiota tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta. Kolmogorov-Smirnov testi suoritettiin sen selvittämiseksi testin muuttujia ilmaisun L2 mRNA ja proteiini, jota seuraa normaalijakaumaa. Kaksi otoksen t-testiä käytettiin tunnistamaan yhdistyksen taudin ilmiasuun muuttujia joka seurasi normaalijakaumaa. P-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Lineaarinen regressioanalyysi suoritettiin määrittämään yhdistyksen E2 kopio numerot L2 mRNA ilme. Rasiakuvaajien rakennettiin tarkkailla ero jakeluun miRNA ilmaisujen eri luokkien kohdunkaulan näytteistä. Kolmogorov-Smirnov testi tunnistaa miRNA ilmaus muuttujana ei seuraavia normaalijakaumaa. Sen vuoksi ei-parametrinen testi (U-testi) suoritettiin tutkimaan yhdistys miRNA ilmaisun kanssa sairausfenotyyppi. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen ohjelmistoja SPSS (versio 16.0 for Windows) ja R (www.r-project.org).

Tulokset

nukleotidi- vaihtelu E1 ORF: tyyppi ja taajuus

nukleotidin sisällä vaihtelut ORF HPV16-genomin, lukuun ottamatta E1, on havaittu aikaisemmin meidän laboratorio [21]. Yhden nukleotidin vaihtelut kirjattiin 20 asemiin E1 ORF (taulukko 1). Niistä yhden nukleotidin vaihtelut, 19 oli bi-alleelinen muuttuu yhtä lukuun ottamatta, joka oli tri-alleeliset. Taajuus vaihtelut vaihteli 0,01 ja 0,45, ja sen perusteella, vähäinen alleelifrekvenssien (MAFs) luokiteltiin polymorfismit (MAF≥0.05) ja matalan taajuuden vaihtelut (MAF 0,05). 20 vaihtelut ORF oli 9 (45%) ei-synonyymi variaatiot ja 11 (55%) samaa vaihtelut jakautuu koko E1-geenin.

Ei-synonyymi aminohapon muutoksia kaikilla ORF HPV16-genomin

Aiemmin kirjasimme 110 ei-synonyymi muunnelmia jakautuneena ORF HPV16, lukuun ottamatta E1 [21]. Tällaiset vaihtelut pysynyt ennallaan, jopa sen jälkeen lisäämällä otoksen kokoa 70 tapauksessa ja 25 ei-pahanlaatuinen näytteitä. Siten meidän koko genomin analyysi HPV16 ehjä virusgenomien paljasti yhteensä 119 ei-synonyymi muunnelmia. Prosenttiosuus tällaisia ​​vaihtelu E1 ei ollut merkitsevää eroa tapausten välillä (0,08%) ja ei-pahanlaatuiset näytettä (0,11%). Useita testaus korjaukset tehtiin, kun mukaan lukien muiden kuin synonyymi vaihtelu E1 ORF yhdessä muiden ORF. Tällainen analyysi uudelleen vahvisti, että prosenttiosuus ei synonyymejä vaihtelut L2 ORF oli merkitsevästi korkeampi tapauksissa verrattuna HPV16 positiivisia hyvänlaatuisen ryhmä (taulukko 2).

Synonymous aminohapon muutokset ja humanisoidut kodonit poikki eri ORF: n HPV16-genomin

yhteensä 124 synonyymi vaihtelut kirjattiin jakautuvat koodausalueissa HPV16 genomien ehjä isolaattien. Prosenttiosuus synonyymi vaihtelut olivat merkittävästi korkeampia tapauksissa verrattuna ei-pahanlaatuinen näytteitä E6 (tapaukset = 0,104%, ei-pahanlaatuinen näytteistä = 0,026%, p = 0,014), E5 (tapaukset = 0,296%, ei-pahanlaatuinen näytteiden = 0,064 %, p = 0,001) ja L2 (tapaukset = 0,22%, ei-pahanlaatuinen näytteiden = 0,121%, p = 0,0002) ORF: (taulukko 3). Tarkempi analyysi suoritettiin, käyttäen GCUA työkalua (https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html), tunnistaa humanisoidun kodonien E5, E6 ja L2 ORF alle vaikutuksesta synonyymi muunnelmia.

oli 25 humanisoitu kodoneja L2 ja 2 siten kodonit sekä E5 ja E6 (taulukko S2). Havaittiin, että kaikki 25 (100%) humanisoitu kodoneja yksilöidyille L2 ORF näytteistä analysoidaan olivat tunsivat jonka CaCx tapauksissa taas 8 ulos 25 (32%) on tunsivat HPV16 positiivinen hyvänlaatuisen näytteitä. Täten taajuus humanisoidun kodonien L2 ORF oli merkitsevästi korkeampi (p = 3.87105E-07) in CaCx tapauksissa verrattuna HPV16 positiivisia hyvänlaatuisen näytteitä. Merkittäviä eroja ei havaittu taajuudet Humanisoidun kodonien E5 ja E6 ORF, välillä CaCx tapaukset ja HPV16 positiivisen ei-pahanlaatuinen näytteet (taulukko 4).

edelleen luokiteltu HPV16 ehjä Isolaattien E ja AA-variantit jälkeen luokitusjärjestelmä kuten aiemmin ilmoitettua meidän laboratorio [21]. Sisällyttämisen jälkeen lisänäytteitä tässä tutkimuksessa emme onnistuneet tallentamaan AA varianttien joukossa ei-pahanlaatuinen näytteistä, kun taas joukossa E2 ehjä CaCx tapauksissa osuus AA ja E variantit oli 18,6% (13/70) ja 81,4% (57 /70), vastaavasti. Siksi pyritty vertailla AA ja E variantteja kannalta humanisoitujen kodonien L2 ORF keskuudessa CaCx tapauksissa vain. Meidän analyysi paljasti, että kaikki AA variantit (13/13100%) päässeen humanisoitu kodonit L2 alueella kun taas vain muutama E variantteja (13/57, 22,8%) kanna kuten kodoneja ja tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä (p = 2.02E-7) . Määrä Humanisoidun kodonien oli myös selvästi erilainen välillä kaksi vaihtoehtoa. Luonteeltaan kukin AA variantti kanna 4-6 humanisoitu kodoneja toisin kuhunkin E muunnos, joka kanna lainkaan tai enintään 2 humanisoidun kodonien.

Differential ilmentymistä L2 mRNA keskuudessa CaCx tapauksissa kätkeminen episomaalinen (puhdas tai samanaikainen) ja integroitu HPV16 genomit

aikaisemmassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet eheyttä E2-geenin analysoimalla läsnäolo viruksen transkriptio (E7-E1∧E4), joka tuottaa repressori E2, jonka APOT (monistuminen papilloomaviruksen onkogeenisten transkriptio) kanssa kytkettyä-kvantitatiivinen-RT-PCR-E7 ja E4 (sisäkkäin E2-geeni) geenejä [31]. Perustuen tällainen analyysi, näytteet luokiteltiin puhtaana episomaalisena tai samanaikainen (episomaalisina ja integroitu) ehjillä E2-geenit, ja integroitu häiritsi E2-geenit. Tutkimuksessa [31] paljasti myös, että nämä kaksi syöpätyypit erosivat ilmaus E7 ja E2-mRNA: t. Siksi määritettiin L2 mRNA ilmaisun kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR: 23 episomaalisessa /samanaikainen HPV16 positiivinen CaCx tapauksissa ja vertasi tietoja, jotka on 11 integroitu CaCx tapauksissa. Ei L2 ilmentyminen on tallennettu joukkoon integroitu tapauksissa, sen sijaan, että erillinen L2-mRNA: n ekspression episomaalisessa /samanaikainen CaCx tapauksissa (kuvio 1), joka oli hyvin samanlainen kuin vuonna tapauksessa E2 ilmentymisen aikaisemmassa tutkimuksessa [31]. Kaikki näytteet analysoitiin, kuvattiin ilmentymisen ACTB mRNA-transkriptien sisäisenä kontrollina. Tarkempi analyysi ei paljasta merkittäviä (p = 0,224, t-testi) erot L2 mRNA ilmaisun välillä AA [keskiarvo (L2 C

T /ACTB C

T) ± sd = 0,834 ± 0,127] ja E [tarkoita (L2 C

T /ACTB C

T) ± sd = 0,904 ± 0,128] variantteja (kuva 2). Suhde, L2 C

T /ACTB C

T, havaittiin myös olevan korreloi merkitsevästi E2 kappale numeroita (p = 0,004; R

2 = 0,336) sisällä episomaalisesta CaCx tapauksissa (kuva 3 ), perustellaan ilmaus L2 episomaalisen virusgenomeja.

(A) Amplification juoni perustuu kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR HPV16 L2 ilmaisun. L2 on transkriboidaan E2 ehjä /episomaalinen (episomaalinen tai samanaikainen) mutta E2 häirinnyt /integroitu tapauksissa. (B) dissosiaatiokäyrä kuvaa ensimmäisen johdannaisen sulamiskäyrä reaktiota kuvaavat ilmentymisen L2 (Tm 80,5 ° C). (C) Amplification juoni perustuu kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR ACTB ilmaisua. ACTB ilmaistaan ​​sekä episomaaliset ja integroitu HPV16 positiivisia tapauksia. (D) dissosiaatiokäyrä kuvaa ensimmäisen johdannaisen sulamiskäyrä reaktiota kuvaavat ilmentymisen ACTB (Tm 81,0 ° C).

Suhteellinen L2-mRNA: n ilmentyminen edustaa keskiarvo L2 C

T /ACTB C

T.

Differential ilmentymistä L2-proteiinin kesken CaCx tapauksissa kätkeminen episomaalinen (puhdas tai samanaikainen) ja integroidut HPV16 genomien

määrittää L2-proteiinia ilmaisun immunoblottausanalyysillä, osajoukossa 12 CaCx tapauksista (integroitu tai E2 häiritsi CaCx tapauksissa = 4, Aasian American episomaalisia tai E2 ehjä CaCx tapauksia = 3 ja Euroopan episomaalinen tai E2 ehjä CaCx tapauksia = 5) joukosta, jota käytettiin L2-mRNA: n ilmentymisen analyysi. L2 ilmentyminen kirjattiin joukossa episomaalinen CaCx tapauksissa AA ja E variantti isolaatteja, kun taas tällaista ilmaisua ei voitu tunnistaa joukossa integroidun CaCx tapauksissa (kuva 4). Kaikki CaCx näytteet riippumatta episomaaliset tai integroituja, kuvasi ilmaus ACTB proteiinin (endogeeninen kontrolli). Tilan humanisoidun kodonien AA ja E variantti isolaattien näytteiden paljastaa L2-proteiinin ekspressio on esitetty taulukossa 5. L2-proteiinin ekspressio kvantitoitiin densitometrisellä analyysi immunoblot-tulokset IMAGE J ohjelmisto (http: //rsb.info.nih. gov /ij /docs /index.html) ja mitään merkittävää eroa (p = 0,562, t-testi) kirjattiin välillä AA [keskiarvo (alue L2-proteiinin band /alueen ACTB proteiinin band) ± sd = 2,66 ± 1,85] ja E variantit [keskiarvo (alue L2-proteiinin band /alueen ACTB proteiinin band) ± sd = 1,95 ± 0,61] kuten kuvataan kuviossa 5.

Ylähavas kuvaa L2 ilme. Kaistat 1 ja 2: HPV16 positiivinen E2 häiritsi /integroitu CaCx tapauksessa näytteet (D1 ja D2); Kaistat 3, 5, ja 7: HPV16 positiivinen E2 ehjä /episomaalinen (episomaalinen tai samanaikainen) Euroopan variantteja (EV1, EV2, EV3, vastaavasti); Kaistat 4, 6, ja 8: HPV16 positiivinen E2 ehjä /episomaalinen (episomaalinen tai samanaikainen) Aasialainen Amerikkalainen variantteja (AAV3-, AAV2, AAV1-, vastaavasti). Alempi paneeli esittää ACTB ilmaus kaikkien analysoitujen näytteiden. Näyte yksityiskohdat on esitetty taulukossa 5.

miRNA sitoutumiskohtia lyhyellä kuin koodausalueen (NCR2) ja menetys tällaiset sitoutumiskohtien johtuu läsnäolo SNP NCR2 of CaCx tapauksissa

lyhyt ei-koodaava alue (NCR2) yleisesti välillä E5 ja L2 avoimen lukukehykset HPV. NCR2 on ominaista heikko promoottori toimintaa, joka on tiukasti säädeltyä keratinosyyttien erilaistuminen ja käytetään vain transkriptien koodaava vähäinen kapsidiproteiini L2 HPV16: [26]. Toisessa tutkimuksessa raportoitiin 13 selostukset HPV16 kohdunkaulan epiteelisolulinja W12 (kätkeminen episomaalinen HPV16 genomit), joista 6 transkriptit havaittiin käsittämään NCR2 ja L2 [32]. Kun otetaan huomioon se, että CaCx tapauksissa kätkeminen episomaalista HPV16 genomien myös ilmensivät L2-geenin, on keskitytty selvittämisessä tekijöitä, jotka voivat liittyä L2 ilmentymistä tällaisissa CaCx tapauksissa. Käyttämällä RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) ohjelmisto, olemme määritelleet sitoutumiskohdat on NCR2 (nt 4139-4234) ja HPV16 ehjä isolaattien, jotka vastaavat 14 ihmisen miRNA (HSA-miR-3148, HSA -miR-3174, HSA-miR-3613-3p, HSA-miR-3916, HSA-miR-495, HSA-miR-548a-5p, HSA-miR-548b-5p, HSA-miR-548c-5p, HSA -miR-548d-5p, HSA-miR-548h-5p, HSA-miR-548i-5p, HSA-miR-548j-5p, HSA-miR-548w-5p, HSA-miR-548y-5p) (kuvio 6 ). Tällaiset miRNA sitoutumiskohtia valittiin perusteella pienin vapaa energia (MFE≤7) ja hybridisaatio pistemäärä (≥140) (taulukko S3) kohti standardeja normaalisti käytetään muodostumista miRNA: mRNA hybridi. Meidän uudelleen sekventoituja data paljasti, että esiintyminen SNP (T4228C) (kuva S1) on NCR2 E variantti ehjä isolaatteja vain, mikä voi johtaa menetykseen 9 miRNA sitoutumiskohtien vastaavassa selostukset (HSA-miR-548a-5p, HSA -miR-548b-5p, HSA-miR-548c-5p, HSA-miR-548d-5p, HSA-miR-548h-5p, HSA-miR-548i-5p, HSA-miR-548j-5p, HSA-miR -548w-5p, HSA-miR-548y-5p) (kuvio 6), jotka kaikki kuuluivat HSA-miR-548 perheen miRNA. Mielenkiintoista on, että osa E2 ehjä CaCx tapauksissa (54/70, 77%) kätkeminen SNP miRNA sitomispaikkojen NCR2 oli merkitsevästi korkeampi (p = 0,007) verrattuna, että ei-pahanlaatuisten näytteistä (12/25, 48%) . Sisällä E2 ehjä CaCx tapauksissa havaittiin myös, että yksikään AA varianttien (0/13, 0%) kanna SNP että miRNA sitoutumiskohdat NCR2. Näin ollen, ei heikkene miRNA sitoutumiskohdat NCR2 havaittiin AA variantteja.

(A) kuvaa NCR2 (nukleotidiasemat 4139-4236), joka sijaitsee 5 ’UTR: L2-geenin, jossa on yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) asemassa 4228 (T-C). (B) RegRNA ohjelmistopohjainen tunnistamiseen neljäntoista miRNA sitoutumiskohtien NCR2 menetys sitoutumiskohtien vastaten yhdeksää miRNA (

*) HSA-miR-548family johtuen SNP (T4228C).

Edellinen tutkimus meidän laboratorio [21] paljasti esiintyminen toista sisällä vaihtelut NCR2.