Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Epigeneettiset muutoksia on patogeneesiin kiinteiden kasvainten kuitenkin esikasvaintekijät aktivoidaan promoottori demetylaation on satunnaisesti raportoitu. Käytimme integroiva menetelmä analysoida ilmaisun ensisijainen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) ja farmakologisesti demetyloiduksi solulinjojen tunnistamiseksi poikkeavasti demetyloiduksi ja ilmaisi ehdokas esikasvaintekijät ja syövän kivesten antigeeneillä HNSCC.

Menetelmät /Principal havainnot

totesimme koordinoituja promoottori demetylaatio ja samanaikainen transkription säätelyä esikasvaintekijän ehdokkaita promoottori homologiaa, ja phylogenetic footprinting näistä promoottoreista osoitettu altistavan tunnistus- kohtien transkriptiotekijä BORIS. Poikkeava BORIS ilmentyminen korreloi ylössäätely ehdokkaan esikasvaintekijöiden useissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien ensisijainen ei-pienisoluisen keuhkosyövässä ja HNSCC, aiheuttama koordinoitua esikasvaintekijän promoottorin demetylaatio ja ilme ei-tuumorigeenisiä soluihin, ja transformoituja NIH3T3-solut.

Johtopäätökset /merkitys

Coordinated, epigeneettiset paljastumisen useiden geenien kasvua edistävä aktiivisuus esiintyy aerodigestive syöpiä, Boris on sekaantunut koordinoitua promoottori demetylaation ja uudelleenaktivointi epigeneettiseltä vaiennettu geenien ihmisen syövissä.

Citation: Smith IM, Glazer CA, Mithani SK, Ochs MF, Sun W, Bhan S, et al. (2009) koordinoitu aktivaatio Candidate esikasvaintekijöiden ja Cancer Testes Antigeenit kautta Promoottori Demetylaatio pään ja kaulan syövän ja keuhkosyövän. PLoS ONE 4 (3): e4961. doi: 10,1371 /journal.pone.0004961

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 lokakuu 2008; Hyväksytty: 03 helmikuu 2009; Julkaistu: 23 maaliskuu 2009

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoittajat: NIH T32 avustus, Clinical Innovator Award lentoemäntä Medical Research Institute, ja National Cancer Institute SPORE (5P50CA096784-05 ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset muutoksia promoottori metylaatio ja histoni asetylaatio on yhdistetty syöpään ekspressio eroja ihmisen syöpäsairauksia.

metylointi on ensisijaisesti pidettävä mekanismi tuumorisuppressorigeeniä (APT) inaktivaatio, ja kattava koko genomin profilointi lähestymistapoja promoottori hypermetylaation ovat tunnistaneet useita uusia otaksuttu APT vaiennetaan promoottori hypermetylaation.

Epäsuora todisteet tukevat roolia

hypo

metylaatio kasvainten kehittymiseen. Global genomista hypometylaatio on raportoitu lähes kaikki kiinteät kasvaimet [1] – [3]. Hiiret, joilla on toiminnallinen häiriö DNA metyylitransferaasi 1 (

DNMT1

) funktio osoittaa merkittävää genomista hypometylaatio kaikissa kudoksissa ja aggressiivista T-solulymfooma, jossa kromosomi epävakauden [4]. Kiinteissä ihmisen kasvaimista, meta-analyysi osoittaa yleistä korrelaatio globaali hypometylaatio ja kehittynyt kasvain vaiheessa [3].

Toistaiseksi vain yksittäisiä esimerkkejä promoottorin hypometylaatio liittyy naamaria ilmaus otaksuttu onkogeenien on raportoitu, mukaan lukien :

R-Ras

mahasyövän [5],

c-Neu

siirtogeenisissä hiirimalleihin [6],

HOX11

esikasvaintekijän leukemiassa [7]

BCL-2

geenin hypometylaatio ja korkean tason ilmentymistä B-solujen kroonista lymfaattista lymfoomat [8], demetylointi MMTV /N-rasN siirtogeenisiä hiiriä [9], ja harvinaisia ​​aktivoituminen kaksi

RAS

perheenjäsenet paksusuolen syövän ja pienisoluinen keuhkosyöpä [10]. Nämä havainnot osoittavat, että esikasvaintekijät kudosspesifisillä tai kehityksellisesti rajoitettu ilmaisun-eli alkupuolella kasvu, erilaistuminen tai gametogeneesiin-voidaan epäasianmukaisesti uudelleen ilmaistaan ​​syövissä kautta epigeneettiset muutokset, kuten demetylaatio.

HNSCC on käyttökelpoinen kiinteä kasvain malli järjestelmä, koska vakiintunutta asemaa epigeneettisiä muutoksia sen synnyssä [11], samoin kuin tavanomaiset, minimaalisesti transformoitujen solulinjojen käyttöön geenin löytö strategioita [12]. Käyttämällä farmakologinen demetylaatio normaaleissa, minimaalisesti transformoitu suun keratinosyyttisolulinjoissa yhdistettynä Cancer Outlier Profiili Analyysi (COPA) perusterveydenhuollossa kudoksissa löytö lähestymistapa, pystyimme määrittelemään ehdokas esikasvaintekijöiden jotka käyvät läpi poikkeava demetylaatio ja kohonneen ekspression ensisijainen ihmisen kasvaimista.

Toiminnalliset tiedot ja ennen julkaistut havainnot viittaavat siihen, että näiden geenien ilmentymistä liittyy kasvaimen edistämisen. Muita analyysit osoittivat promoottori homologia ja koordinoitu upregulation yksittäisissä kasvaimista niiden osia kohdegeenien (esikasvaintekijät). Pystyimme laajentaa näiden havaintojen erilaisia ​​kiinteä kasvain tyypit ja sotkea keskeinen transkriptiotekijä, BORIS, koordinoidulla epigeneettiset aktivointi esikasvaintekijöiden. Nämä tulokset osoittavat, että poikkeava demetylaation useita, fysiologisesti tukahdutettua esikasvaintekijät tapahtuu koordinoidusti yksittäisissä kasvaimissa useista kiinteä kasvain tyypit.

Tulokset

Integrative Discovery of epigeneettiseltä Unmasked geenien HNSCC

Oletimme, että normaali solulinjat sisältävät metyloitua geenejä, jotka tyypillisesti tukahdutettu normaaleissa kudoksissa, mutta että nämä geenit voidaan uudelleen ilmaistaan ​​farmakologinen manipulointi. Osaa näistä geeneistä kuuluisi ehdokas esikasvaintekijät aktivoidaan demetylaation ihmisen syövissä, joita voitaisiin edelleen valitaan sen perusteella, primaarikasvaimen ilmaisun erilaisia ​​analyysi käyttäen integroiva menetelmiä. Päätimme mukauttaa aiempiin menetelmiin epigeneettiset seulonta käyttäen 5-atsa /TSA hoitoon, joiden on havaittu olevan menestyksekäs määriteltäessä ehdokas tuumorisuppressorigeeneille. Kaksi tert- muuttaneet normaalia suun keratinosyyttisolulinjoissa käsiteltiin 5 uM 5-atsa deoksisytidiinideaminaasia neljä päivää ja Trichostatin A yhtä vuorokautta ennen sadonkorjuuta kokonais-RNA ilmentämiseen erilaisia ​​analyysi käyttäen dChip [12], [13].

Samalla teimme vertaileva epigeneettisellä jossa hyödynnetään Cancer Outlier profilointi Analysis (COPA) käyttäen 49 ensisijaista HNSCC ja 19 normaalin limakalvon kudoksissa analysoitiin mRNA ilme Affymetrix U133A mRNA ilmaisun microarray alustan (16383 koetin sarjat) koottu ennen työn ja julkisten lähteet ilmaisun (oncomine.org). COPA on erityisen hyödyllistä määrittää eroja ilmaisun tiettyjen geenien lomakelajitelmana primaarituumorin näytteitä, joilla on parantunut suorituskyky verrattuna tilastollisia työkaluja, jotka ovat riippuvaisia ​​mediaani tai keskiarvo ilmaisun ero kahden aineistoja [14]. Laskimme COPA klo 90

persentiilin meidän lopullinen rankingissa kaikista 16383 ominaisuuksia paneelit, koska tämä johti selvimmin erot ilmaisun kanssa näytteen koon. Tilastollinen merkitsevyys ilmentymisen eroja COPAn kaaviot mitattiin U-testi (kuvio 1 B).

(a) Aluksi, minimaalisesti-transformoituja solulinjoja käsiteltiin 5-atsa-deoksisytidiinin ja TSA paljastaa epigeneettiseltä vaiennetaan geenejä. Jotta korreloivan epigeneettiset paljastumista mielekästä voimistunut syöpää erityisiä geenejä, suoritimme vertailevan epigeneettisellä lähestymistapa syövän Outlier profilointi Analysis (COPA) käyttäen 49 kasvaimia ja 19 normaaleissa kudoksissa, joka oli leimaa-antavaa Affymetrix U133A mRNA ilmaisun microarray alustalla. Geenit (by probeset) rankattiin ensin määrin upfold asetuksen 5-atsa /TSA hoitoa ja toinen COPAn kiihdytyssäätely klo 90

persentiili. Tuote Näiden joukkoon käytettiin sijoitus kaikki tavoitteet ja merkitys kynnys (α = 0,005) valittiin johtaen 106 geenejä, joiden alkuun 26 geenit arvioitiin. Jotta ei sulje pois geenejä ulkopuolelle U133A alustan, me katsotaan myös kaikki muut geenit U133 Plus 2.0 alustan ainoana perusteena 5-atsa /TSA upfold sääntelyä. Geenit sittemmin seulottiin läsnäolo CpG-saarekkeiden avulla MethPrimer ja kaikkien geenien todensi bisulfiitti sekvensoinnilla kasvain ja normaaleissa kudoksissa, ja QRT-PCR solulinjojen ja ensisijainen kasvaimia. Yhdentävän tavoitteet 7/26 läpäissyt validointi, kun taas 2/46 ei-integroiva tavoitteiden ohi. Funktionaaliset kokeet suoritetaan sitten näitä geenejä. (B) edustaja COPA kuvaaja

MAGEA3

osoittaa tilastollista lähestymistapaa löytää ehdokas yliekspressoitu onkogeenien. Ero kasvaimen (n = 49) ja normaalissa (n = 19) lauseke oli merkittävä, p-arvo 0,001 mitattuna U-testi. (C) Promoottori demetylaatio aiheuttaa transkription säätelyä. Ylössäätely käsittelyn jälkeen 5-atsa /TSA esitetään solulinjoissa mitattuna QRT-PCR. Suhde 5-atsa /TSA käsitelty ilmaisua perustasolle on esitetty

C19ORF28

,

H19

,

TKLT1

,

GPR17

,

GRIN1

,

MAGEA2

,

MAGEA3 /6

,

MAGEA4

,

MAGEA11

. Jokainen geeni osoitettiin merkittävä ylösajon 5-atsa /TSA käsittely ainakin yhdessä solulinjassa. Virhe palkit osoittavat SE.

määrittää geeni riveissä kahdella tavalla: 1) COPA sijoitusta klo 90

persentiilin of säätelyyn ylöspäin ensisijaisen kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen ilmaisun ja 2) upfold asetuksen jälkeen farmakologinen demetylaation jälkeen dChip normalisoinnin solulinjoissa.

integroiva sijoitus tuote laskettiin (kuvio 1A). Käyttämällä merkitys kynnys (α = 0,005) ja myöhemmin satunnainen permutaatio meidän listalla-listoja, tunnistimme 106 geeniä, jotka olivat merkittävästi eri tavalla säädelty perustuu epigeneettisellä seulonta ja kudosten microarray ilmaisun (taulukko S1). Me empiirisesti valinnut alkuun pisteytys 26 geenejä jatkotutkimuksiin. Seitsemäntoista 26 sisältävien geenien promoottori liittyvät CpG-saarekkeiden käyttämällä MethPrimer ohjelmisto valittiin lisätutkimuksia [15].

erillinen rinnakkainen analyysi huomioon mahdollista aktivoida proto-onkogeenien, jotka eivät sisälly U133A alustan, me analysoitu 32500 geenien U133plus2 alustan sijoittui pelkästään perusteella 5-atsa /TSA upfold sääntelyn meidän normalisoitu solulinjoja, jotka eivät kuuluneet primaarikasvaimen ilmaisun erilaisia ​​analyysi. Havaitsimme 46 kohdegeenien kanssa 2-kertainen säätelyä 90%: n luottamusväli ja keskieroarvo ilme yli perustason yli 50. Näistä 30 oli vahvistettu olevan CpG-saarekkeiden (taulukko S2).

validointi kasvain promoottori demetylaation kohdegeenien

CpG saarilla promoottorialueen 47 valitun geenikohteet CpG saaret olivat bisulfiitti sekvensoitiin normaalissa limakalvonäytteistä potilailta ilman syövän diagnoosia vahvistamaan epigeneettiset hiljentäminen kypsissä ylemmässä aerodigestive suolikanavan limakalvon (taulukot S1 S2). Vain 18/47 promoottorialueille osoitti täydellistä metylaatio lainkaan jaksotelluille CpG sivustot kaikissa normaaleissa kudoksissa. Nämä tavoitteet sittemmin bisulfiitti sekvensoitiin 10 ensisijainen HNSCC määrittämään esiintymisen hypometylaatio. (Kuvio 2A). Näiden tavoitteiden, 9/18 osoitti demetylaatio (katso taulukko 1) kasvaimen kudoksissa yli 30% näytteistä, kuten

TKTL1

(4/10, p 0,05),

H19

(6/10, p 0,05),

MAGEA2

(5/10, p 0,05),

MAGEA3 /6

(5/10, p 0,05),

MAGEA4

(5/10, p 0,05),

MAGEA11

(5/10, p 0,05),

GPR17

(3/10, p 0,10),

GRIN1

(6/10, p 0,05),

C19ORF28

(5/10, p 0,05), (khiin neliö). Vahvista transkription säätelyä kohdegeenien 5-atsa /TSA hoito meidän solulinjassa järjestelmä (nähtävissä kuviossa S1), suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR: llä 5-atsa /TSA-käsiteltyjen normaalien solujen verrattuna valehoidettujen solujen näille yhdeksän geenit (kuvio 1C). Jokainen geeni osoitettiin merkittävä ylösajon 5-atsa /TSA käsittely ainakin yhdessä solulinja tukevat funktionaalinen geeni sääntelyä promoottori hypometylaatio. Käyttäen alkuperäistä kohortin 10 ensisijainen kasvaimia, suoritimme alustava analyysi määrittää suhdetta promoottorin hypometylaatio ilmaisuun. QRT-PCR ilmentymisen kanssa bisulfiitti sekvensointi vastaavan promoottorin alla on esitetty kuviossa 2b-j. Käytimme Mann-Whitney U-testi vertaamaan QRT-PCR ilmentymisen metyloitu ja metyloitumaton ryhmiä. Kolme geeniä oli tilastollisesti merkitsevä voimistunutta ilmentymistä in metyloitumattomalla ryhmään:

MAGEA2

(p = 0,007),

MAGEA3 /6

(p = 0,007),

MAGEA11

(p = 0,05). Mahdolliset assosiaatiot ilmaisun ja promoottorin metylaatiostatuksen tässä pienessä kohortin myös ehdotettu

TKTL1

(p = 0,06),

MAGEA4

(p = 0,09),

C19ORF28

( p = 0,09),

GRIN1

(p = 0,06), mutta

H19

(p = 0,7), mutta

GPR17

(p = 0,38) eivät osoittaneet tätä yhdistystä.

(a) Näkyy ovat bisulfiitti sekvensointi johtaa 10 kasvaimia ja 10 normaalit:

TKTL1

(4/10, p 0,05),

H19

(6 /10, p 0,05),

MAGEA2

(5/10, p 0,05),

MAGEA3 /6

(5/10, p 0,05),

MAGEA4

(5/10, p 0,05),

MAGEA11

(5/10, p 0,05),

GPR17

(3/10, p 0,10),

GRIN1

(6/10, p 0,05),

C19ORF28

(5/10, p 0,05). (B-j) QRT-PCR ilmaisun kanssa bisulfiitti sekvensointi vastaavan promoottorin alla (valkoinen on metyloitumaton, harmaa on metyloitu). Merkitys mitattiin vertaamalla ilmentymisen metyloitu metyloimatonta Mann-Whitneyn U-testiä. Merkitys löydettiin MAGEA2 (p = 0,007), MAGEA3 /6 (p = 0,007), MAGEA11 (p = 0,05). Vahva assosiaatiot ilmaisun ja promoottorin metylaatiostatuksen löydettiin myös TKTL1 (p = 0,06), MAGEA4 (p = 0,09), C19ORF28 (p = 0,09), GRIN1 (p = 0,06). H19 (p = 0,7) ja GPR17 (p = 0,38) eivät osoittaneet assosiaatiot bisulfiitti sekvensointi ja ilmentyminen tässä kohortissa. Virhepylväät kuvaavat keskivirhettä.

toiminnallinen validointi kandidaattigeenejä

Suoritimme sitten lyhytaikaisissa transfektioissa arvioimiseksi ja /tai vahvistaa kasvua edistävät vaikutukset näiden yhdeksän tavoitteita, jotka osoittavat kasvainspesifisen promoottorin, hypometylaatio. Vaikka H19 koodaa ei käännetyt RNA-transkripti, H19-tuote näyttää aikaansaavan kasvua keuhkosyövän ja rintasyövän solulinjoissa [16] ja saattavat aiheuttaa lääkeresistenssin maksa-solujen karsinooma [17]. Kuvio 3A esittää saadut tulokset lyhytaikaisella transfektiolla olevan

H19

rakentaa osaksi OKF6-tert-1R soluissa. Neljän päivän oli 41,4% (± 15%) lisäys kasvua transfektoiduissa tyhjän vektorin. MAGE-perheen koostuu liittyviä perheenjäseniä, joiden tiedetään voimistuvan eri kasvaintyypeissä [18], mutta on viime aikoina liitetty indusoimaan transkription uudelleenohjelmointi tuumorisoluissa [19].

MAGEA2

indusoi 72,7% (± 26%) lisäys kasvu päivänä kolme (kuvio 3B).

MAGEA4

transfektio indusoi 203% (± 17%) lisäys kasvuun (kuvio 3D). Toiminnalliset kasvu erot testattiin, mutta ei löytynyt

C19ORF28

.

(a) Ohimenevä transfektio olevan

H19

rakentaa osaksi OKF6-tert-1R soluja (päivänä 4 , 41,4% ± 15%: n kasvua). (B) Ohimenevä transfektio olevan

MAGEA2

rakentaa osaksi OKF6-tert-1R soluja (päivänä 3, 72,7% ± 26%: n kasvua). (C) Ohimenevä transfektio olevan

TKTL1

rakentaa osaksi OKF6-tert-1R soluja (päivänä 4, 50,1% ± 38%: n kasvua). (D) Ohimenevä transfektio on

MAGEA4

rakentaa osaksi OKF6-tert-1R soluja (päivänä 4, 203% ± 17%: n kasvua). For (e) kehitimme kvantitatiivinen määritys mittaamiseksi metyloitumaton promoottorit, kutsutaan Quantitative Unmethylation-Specific PCR (QUMSP). QUMSP prosenttiosuus

C19ORF28

,

GRIN1

,

H19

,

MAGEA11

,

MAGEA2

,

MAGEA3 /6

,

GPR17

, ja

TKTL1

suoritettiin erillisessä kohortin pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta käyttävät 25 kasvaimia ja 11 ylempi aerodigestive limakalvonäytteistä määritystä promoottori demetylaatio. Tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin

GRIN1

,

MAGEA11

,

MAGEA2

. Seuraavaksi promoottori demetylaatio pidettiin syynä mRNA: n ilmentymisen nousu näkyy expo aineisto. (F) esittää QUMSP tulokset riippumattoman kohortin 14 keuhkojen normaalien ja 13 keuhkojen kasvain potilaita. Merkittäviä eroja QUMSP havaittiin

H19

,

MAGEA11

,

MAGEA2

, ja

MAGEA3 /6

.

kuvassa 3C,

TKTL1

indusoi 50,1% (± 38%) lisäys kasvu päivänä neljä. Tehostettu ekspressio TKTL1 on äskettäin ollut mukana muuntaminen solujen aerobinen, glykolyyttiset aineenvaihdunta sekä lisääntynyt proliferaatio koolonkarsinoomasoluissa [20] – [25]. TKTL1 on itsenäisesti liittyy huono hengissä kurkunpään syöpä, paksusuolen ja urothelial syöpiin sekä kaukainen etäpesäke munasarjasyöpäpotilailla [22], [23], [26] varmistamiseksi edelleen TKTL1 ehdokkaaksi esikasvaintekijän in HNSCC teimme kiinnittynyt siirtomaa painopiste määrityksissä TKTL1 laitteista matalissa ilmentävät HNSCC solulinjoja JHU-011 ja JHU-028, ja havaitsi merkittäviä kasvu lisää sekä solulinjoissa (kuvio 4 A, B). Sitten Työllisiä shRNA rakentaa on TKTL1 voimakkaasti ilmentävän solulinjan UM-22B Anchorage riippumaton kasvun määrityksissä ja totesi dramaattinen lasku koko ja pesäkkeiden lukumäärä (kuvio 4 C, D) verrattuna valetransfektoituihin soluihin.

(a) TKTL1 pakko yliekspressio kautta väliaikaisen transfektion taustalla matalan ilmentävät JHU-011-solujen indusoi lisääntynyt kiinnittymisestä riippuvaisille pesäkkeiden muodostumista ja (b) TKTL1 shRNA in voimakkaasti ilmentävän Fadu solulinjan indusoi kasvun estäminen. (C) ankkurointi riippumaton kasvu UM-22B-soluissa on merkittävästi inhiboi TKTL1 shRNA (d), jossa lasku pesäkkeen koko. (* = P 0,01, ** = p 0,001, chi neliö).

Candidate esikasvaintekijän ilmaisun ja promoottori demetylaatio muissa ihmisen syöpätyyppeihin

Voit selvittää ehdokas esikasvaintekijän ilmentymistä muuttunut laajempaa kasvaintyypeille, analysoimme ilmaisun saadut tiedot EXPO kerättyä 1041 ihmisen kasvaimista kaikista histologialtaan [27]. Tietoja ensimmäinen mediaani-ilmentymisen normalisoidaan kunkin matriisin ja sittemmin mediaani normalisoinnin mukaan koetinsarjaa ominaisuus poikki 1041 kasvaimet monista syövän tyypit kuten keuhko- ja urothelial, mutta ei HNSCC. Valitsimme osajoukko näistä kasvaimista, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), lymfooma, melanooma, haimasyöpä, eturauhasen syöpiä, ja urothelial syövät, esitettäväksi (kuva 5A-D).

H19

merkittävästi yläreguloituja NSCLC (p = 0,008) ja uroteelisyöpä (p = 0,0013), laskettuna U-testi vertaamalla array-normalisoitu ilmentymistä kasvaintyyppi kaikkiin muihin kasvaimiin. Totesimme huomattavasti ilmentymistä MAGEA2 in NSCLC (p = 0,005), mutta ei urothelial syöpiä (p = 0,18).

TKTL1

osoitti myös yli-ilmentymisen NSCLC (p = 0,05), mutta ei uroteelisyöpä (p = 0,55), ja

MAGEA4

yliekspressoitiin NSCLC (p = 0,04), mutta ei merkittävästi niin in uroteelisyöpä (p = 0,12). Jotta voitaisiin vahvistaa kohde-spesifinen demetylaatio huomattava primaaristen kasvainten, olemme kehittäneet nopean, kvantitatiivinen määritys nimenomaan mittaamiseksi metyloimattoman promoottorit, jota kutsutaan Quantitative Unmethylation-Specific PCR (QUMSP). Kaksikymmentäviisi HNSCC kasvaimia ja 11 ylempi aerodigestive limakalvonäytteistä analysoitiin promoottori demetylaatio (kuvio 3E). Kasvainspesifisen demetylaatio havaittiin

GRIN1

(p = 0,005),

MAGEA11

(p = 0,001), ja

MAGEA2

(p = 0,002). Suoritimme samanlainen analyysi käyttämällä erillistä, riippumatonta kohortin 13 NSCLC näytteiden 14 keuhkonäytteissä potilailta, joilla kasvainsairaus ja vahvisti promoottori hypometylaatio kohde geenejä. Merkittäviä eroja

H19

(p = 0,02),

MAGEA11

(p = 0,03),

MAGEA2

(p = 0,005) ja

MAGEA3 /6

(p = 0,02). Katso kuva 3F.

Expo aineisto arkistossa oli louhitaan kasvainkudoksen geenin ilmentymisen mitattuna Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisun alustalla. Aluksi data oli mediaani-normalisoitu ilmaisun array ja kukin geeni oli mediaani normalisoitu luku. Vain osajoukot ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, lymfooma, melanooma, haimasyövän, ja uroteelisyöpä näytetään. (A) esittää ilmentymisen

H19

näiden syöpien. (B)

MAGEA2

lauseke, (c)

TKTL1

ilmaisun, ja (d)

MAGEA4

. Tilastollinen merkitsevyys mitattiin kunkin tuumorin tyyppi vertaamalla geenin ilmentymisen kasvaimen tyyppi ilmentymistä kaikissa jäljellä 1041 näytettä. Kasvaintyypeille ilman p-arvot ei lähestynyt tilastollista merkittävyyttä. Keuhkojen ja urothelial osoitti merkittävää ilmentymistä päällekkäisyyttä.

Aberrant ilmaus ehdokas esikasvaintekijöiden tapahtuu koordinoidusti yksittäisissä primaarikasvainten

Näiden analyysien, me nopeasti huomata, että transkription säätelyä kautta promoottori hypometylaatio yleensä tapahtuu synkronisesti osajoukko kasvaimia. Meidän kohortin 49 ensisijaisen HNSCC määritettiin kautta ilmentymisen erilaisia ​​analyysi, rakensimme matriisin Pearsonin korrelaatiokertoimet välillä ekspressiotasot kohde (kuvio 6A). Meidän yhdeksän kohdegeenien merkittäviä klusterointi lisääntyneen ilmentymisen todettiin sisällä MAGEA perheen geenien. H19 ei ollut mukana, koska sen puuttuminen on U133A alustalla. Erillinen klusterin liittyvä yli-ilmentymisen todettiin varten

TKTL1

,

GRIN1

, ja

GPR17

. Vuodesta NSCLC ilme saatujen tietojen Expo aineistot loimme samanlaisia ​​matriiseja tutkia korrelaatioita yksittäisten geenien. Totesimme, että MAGEA perhe ilmaisun ja

H19

ilme näytti erittäin merkittävä korrelaatio yksittäisten NSCLC (katso kuvio 6B). Sen sijaan ei ollut kohde-tavoitetta korrelaatioita NSCLC ilmentymisen toisen klusterin (

TKTL1

,

GRIN1

, ja

GPR17

), joka osoitti koordinoitu ilmaisun HNSCC.

(a) Näyttää geenin ilmentymisen korrelaatio p-arvo matriisin -parin kunkin geenin parin kaikissa kasvaimia. Tämä vertailu osoittaa korrelaation jokaisen geenin parin 49 pään ja kaulan kasvaimia. (B) Gene pari ilmaisu p-arvo korrelaatiomatriisin 80 NSCLC. Huomionarvoista C19ORF28 ei laatoitettu tähän array alustalla. (C) analyysi promoottorialueet geenien. Näkyy on phylogram meidän edistäjinä kiinnostavissa ClustalW analyysiin toistuvassa sekvenssin rinnastus. Alueella merkittävää homologiaa jäljessä näkyy sekvenssikohdistuksen ja E tilastojen EMBL-EBI: n PromoterWise vertailua. (D) Promoottori hypometylaatio (QUMSP) korrelaatio p-arvo matriisin HNSCC (25 kasvaimia). (E) Promoottori hypometylaatio (QUMSP) korrelaatio p-arvo matriisin NSCLC (13 kasvaimet).

Expression kuvioita korreloi promoottori homologia promoottorin demetyloituu kohdegeenien

Sitten halusimme onko promoottori homologia liittyy liittyy ilmaus kahden proto-onkogeenin klustereita. Olemme myöhemmin käytetään Euroopan bioinformatiikan instituutin ClustalW työkalu (kuvio 6C) ja phylogram analyysi toistuvassa sekvenssin rinnastus vastaavien promoottorien. Vahvista homologia määrällisesti, käytimme EMBL-EBI: n PromoterWise vertailijatyökalulla joka löytyy merkittäviä pareittaisesta alueilla promoottorin homologisia

GPR17

,

GRIN1

, ja

TKTL1

. Kuten odotettua aikaisemmista tutkimuksista, MAGE-A family ryhmitelty yhteen, kun MAGE-A perheenjäseniä ja H19 tiedetään olevan konsensus-sitoutumiskohdat metylaatioherkät sitovat tekijät

CTCF

ja

CTCFL

/

BORIS

. Lisäksi tämä toinen ryhmä

GRIN1

,

GPR17

, ja

TKTL1

ryhmitelty yhteen sekvenssihomologialla.

Lisäksi halusimme nähdä, jos aste promoottorin hypometylaatio korreloi yksittäisissä kasvaimia. Sekä ensisijainen HNSCC (kuvio 6D) ja NSCLC (kuvio 6E), useita merkittäviä korrelaatioita metylaatiostatuksen välillä ei havaittu tavoitteiden, mutta metylaatiostatus ei klusterin ryhmissä määritelty MAGE-perhe /H19 ilmentymisen klusterin tai

TKTL1

,

GRIN1

,

GPR17

klusteri. Pikemminkin oli merkittäviä korrelaatioita kaikkien tunnistettu ehdokas esikasvaintekijät. Hypometylaatio siis ilmaantui liittyvältä tavalla yksittäisissä kasvaimissa kaikille kohdegeenien, mutta samanaikainen geenien ilmentymistä sisällä kaksi klustereiden liittyi promoottori homologiaa sijaan metylaatiostatuksen. Tämä merkitsi sitä, että tiettyjä transkriptiotekijöitä voi olla osallisena säätelyssä epigeneettiset paljastumista ja /tai transkription aktivaatio perustuu promoottori homologia näiden ehdokas esikasvaintekijät.

BORIS ilmentyminen liittyy esikasvaintekijän aktivaation primaarikasvaimia, indusoi promoottorin demetylaatio, ehdokas esikasvaintekijän ilmaisun, ja solutransformaatiota

ilmeinen läsnäolo useista MAGE geenien keskuudessa tavoitteet sai meidät tutkimaan ylävirtaan säätelyreittejä tunnettuja syöpää kivesantigeenien. BORIS ja CTCF ovat ainutlaatuinen kognaattiparina transkription tekijöitä epigeneettisellä asetuksessa jotka jakavat samanlaisen DNA: ta sitovan domeenin. BORIS transkriptionaalisesti vaiennetaan useimmissa normaaleissa kudoksissa, mutta ilmentyy normaaleissa alkion, sukusolujen ja syöpä kudoksiin. Me määrittää, jos ilmaus BORIS korreloi ehdokas esikasvaintekijän ilmentymistä erillisessä kohortin 36 ensisijaisen HNSCC. Kuvio 7A esittää lämpöä kartan rakennettu mediaani normalisoitu, qRT-PCR ekspressiotietojen meidän esikasvaintekijöiden, lajiteltu BORIS ilme. Näissä 36 syöpien, BORIS yli-ilmentyminen korreloi merkittävästi yli-ilmentymisen 6/9 esikasvaintekijöiden lukien:

MAGEA3 /6

(p = 0,0017),

MAGEA4

(p = 0,04),

MAGEA11

(p 0,001),

GPR17

(p = 0,01), ja

C19ORF28

(p = 0,001). Tutkimaan edelleen korrelaation Boris ilmaisun kanssa kohdegeenien kiinteiden syöpien, olemme analysoineet EXPO aineisto tietoja 1041 ihmisen kasvainten monenlaisia ​​kudosta lähteistä ja histologialtaan. Merkittävä positiivinen korrelaatio Boris lausekkeen ilmaus jokaisen meidän yhdeksän esikasvaintekijöiden todettiin:

GRIN1

(p 0,001),

C19ORF28

(p 0,001),

H19

(p 0,001),

MAGEA11

(p 0,001),

MAGEA2

(p 0,001),

MAGEA3 /6

(p = 0,003),

MAGE4

(p 0,001),

TKTL1

(p 0,001),

GPR17

(p 0,001), (kuva S2). Vaikka BORIS selostukset ovat yleensä havaita normaaleissa soluissa, olemme päättäneet, että 59% kaikista kasvaimista on BORIS taso, joka ylittää mediaani ilmaus kaikkien geenien, ja 90% kasvaimista on BORIS ekspressiotaso 25% mediaanitulosta ilmaisun arvon kaikki geenit, mikä osoittaa, että poikkeava BORIS ilme on yleinen tapahtuma ihmisen syövässä.

(a)

BORIS

ilmaisu korreloi ilmentymistä kohde- geenien HNSCC (QRT-PR) lämpö kartta (Pearson korrelaatio) (b) Ohimenevä transfektio on

BORIS

rakentaa osaksi NIH-3T3 ja OKF6-Tert1R solulinjoissa.

BORIS

yliekspressio lisännyt solujen kasvun 3T3 solulinjassa (päivänä 3, 77% ± 34%: n kasvua) ja OKF6-Tert1R solulinja (päivänä 3, 161% ± 78% kasvua lisääntyä). Solujen kasvua lähtötasosta lasketaan jakamalla arvot päivällä 1: n Calcein signaali. (C) ankkurointi riippumaton kasvu määritettiin sen jälkeen, kun transfektio tyhjällä vektorilla (EV), CTCF, Boris eri doksisykliinipitoisuudet, edustavien pesäke (alla). (D) QUMSP yhdeksän kiinnostuksen kohteita transfektion jälkeen tyhjällä vektorilla (käsittelemätön) ja BORIS konstrukti (käsitelty) läsnä ollessa 0,0625 ug /ml doksisykliiniä. (E) Taita lisätä Quantitiative RT-PCR yhdeksän kiinnostuksen kohteita jälkeen BORIS transfektion normalisoidaan arvoihin transfektion jälkeen tyhjällä vektorilla.

tutkia toiminnalliset ja epigeneettiset vaikutukset BORIS, tetrasykliini indusoituva pBIG2i-BORIS konstruktit transfektoitiin väliaikaisesti NIH-3T3 ja OKF6-Tert1R solulinjojen läsnä ollessa doksisykliini, mikä lisää kiinnittynyt solujen kasvua villityypin, BORIS ei-ilmentävien NIH3T3, ja OKF6-Tert1R solulinjat. 3T3-soluissa oli 77% ± 34%: n kasvua päivänä kolme. OKF6 solulinjoissa oli 161% ± 78%: n kasvua päivänä kolme (kuvio 7B). Mikä tärkeintä, nämä vaikutukset havaittiin, kun tasot

BORIS

ilmentyminen säädeltiin olevan samanlainen vallinneelle tasolle primäärikasvaimissa.

Tätä vaikutusta ei nähty lisääntynyt doksisykliinipitoisuudet joka indusoi korkeita on

BORIS

selostukset. Tarkasteltaessa selostukset osoitti, että ilmentyminen seitsemän yhdeksästä kohdegeenien lisääntyi merkitsevästi OKF6-Tert1R ilmentävän solun BORIS (Kuva 7E). Testata, jos BORIS ilmaisi matalalla tasolla voisi edistää muutosta, tutkimme NIH3T3-solut kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Jälkeen 12 päivää, merkittävä määrä pesäkkeitä (30 +/- 3) havaittiin kokeissa Boris-ilmentävien solujen, mutta ei soluissa, jotka on transfektoitu kontrollina plasmidi (kuvio 7C).

Lopuksi testata mahdollisuutta Boris voi liittyä epigeneettisiä muutoksia sekä transkription säätelyä meidän kohdegeenien, me kvantitatiivisesti määritetään metylaatiostatuksen meidän ehdokas proto-onkogeenien jälkeen BORIS transfektion ja totesi, että kuusi yhdeksästä tavoitteiden (C19 ORF28, GPR17, GRIN1, MAGEA2 , MAGEA3 /6, ja MAGE11) osoitti yli 100% kasvu demetyloiduksi promoottori jo 48 tunnin kuluttua induktion BORIS (kuvio 7D).

keskustelu

edellä esitetyt tiedot osoittavat, että HNSCC ja NSCLC tehdään aktivointi ehdokas esikasvaintekijöiden liittyvine demetylaation koordinoidusti yksittäisissä kasvaimia. Pystyimme osoittamaan muutoksen liittyville Boris ilmaisi ektooppisesti Boris-negatiivinen solulinjoissa sekä kasvua vaikutuksia yksittäisten kohde- geenejä, jotka on osoitettu olevan epigeneettiseltä aktivoida ja ilmaisi Boris. Tämä ei sulje pois osuutta vielä tunnistamattomia geenejä Boris liittyviä vaikutuksia tai osuuskunta vaikutus välillä tunnistettu kohdegeenien.