Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aktivointi alkion signalointireittien lepotilassa aikuisen haimassa on ominaisuus haimasyövän (PC). Nämä löydöt ovat johtaneet kehittää uusia estäjiä reittejä kuten Notch ja Hedgehog signalointi, jotka ovat tällä hetkellä alkuvaiheessa kliinisissä tutkimuksissa hoidettaessa useiden syöpätyyppien. Retinoidi signalointi on olennaista myös haiman kehitykseen, ja retinoidihoito on käytetty menestyksekkäästi muiden pahanlaatuisten kasvainten, kuten leukemian, mutta vähän tiedetään koskevan retinoidipitoisuudet signalointia PC.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tutkimme roolia retinoidi signaloinnin

in vitro

ja

in vivo

normaalissa haima, haiman vamman, uudistumista ja syöpä. Retinoidi signalointi on aktiivinen satunnaista solujen aikuisen haimassa, mutta on huomattavasti laajennettu koko parenchyma aikana vahingon ja uudistumista. Sekä kemiallisesti aiheuttama ja geneettisesti hiiri malleja PC näytteille puute retinoidi signaloinnin aktiivisuus verrattuna normaaliin haima. Näin ollen, olemme tutkineet Cellular Retinoid sitova proteiini 1 (CRBP1), joka on keskeinen säätelijä retinoidi signaloinnin tiedetään olevan rooli rintasyövän kehitys, mahdollisena terapeuttisena kohteena. Loss, tai merkittävä alisäätely CRBP1 oli läsnä 70% ihmisen PC, ja oli ilmeistä varhaisimmista esiasteleesioita (Panin-1A). Kuitenkin

in vitro

voitto ja toiminnan menetys tutkimusten ja CRBP1 hiirten ehdotti, että menetys CRBP1 ilmaisun yksinään ei ollut riittävä aiheuttamaan syövän synnyn tai muuttaa PC herkkyys retinoidi hoitomuodot.

Johtopäätökset /merkitys

Yhteenvetona retinoidi signalointi näyttää olevan rooli haiman uudistumista ja syövän synnyn, mutta toisin kuin rintasyöpä, se ei välity suoraan CRBP1.

Citation: Colvin EK, Susanto JM , Kench JG, Ong VN, Mawson A, Pinese M, et al. (2011) Retinoid Signaling in Haimasyöpä, Injury ja Regeneration. PLoS ONE 6 (12): e29075. doi: 10,1371 /journal.pone.0029075

Editor: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 lokakuu 2011; Hyväksytty: 20 marraskuu 2011; Julkaistu: 29 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Colvin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cancer Institute of New South Wales (CINSW), National Health ja Medical Research Council of Australia (# 427655), The Cancer neuvosto New South Wales, St. Vincentin klinikkasäätiö, Royal Australian College of kirurgien, Australian Cancer Research Foundation, The Avner Nahmani Haimasyöpä Foundation, ja RT Hall Trust. AVB, CJS, DKC, EAM ja EKC tukevat apurahoja CINSW (06 /RSA /1-05; 08 /RSA /1-15; 07 /CDF /1-28; 09 /CDF /2-40; 10 /CRF /1-01). RLS on Senior Principal Fellow NHMRC ja pitää Petre puheenjohtaja Breast Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lisääntyvä todistusaineisto tukee keskeinen rooli kehityshäiriöitä signalointireitteihin kuten Notch [1] ja Hedgehog [2], [3], [4] haimasyövän, jossa estäjien näistä reiteistä tällä hetkellä varhaisessa vaiheessa kliinisten tutkimusten . Notch ja siili osallistuu myös haiman vamman, uudistaminen ja korjaus [5], ehdot, joiden tiedetään altistaa syöpää. Retinoidi signalointi on elintärkeä sikiön haiman muodostumiseen [6], [7], [8], mutta vähän tiedetään sen mahdollisen roolin haimasyövän.

retinoidien ovat luonnossa esiintyviä tai synteettisiä vitamiini analogeja, joilla on käytetty menestyksellisesti akuutin promyelosyyttisen leukemian (APL) [9]. Huolimatta menestyksestä retinoidi hoidon APL, kiinteiden tuumorien hoidossa on saavutettu sangen vähäistä menestystä [10], [11], ja jotkut todisteita siitä, että tämä vastustuskyky retinoidihoito voi johtua poikkeavuuksia retinoidien signalointi. Downregulation Retinoidireseptorit on raportoitu monissa syövissä, kuten rinta-, keuhko-, eturauhas- ja ruokatorven syöpä [11], ja downregulation alkupään komponenttien mukana retinoidien aineenvaihduntaa ja varastointi ovat nousemassa keskeiseksi sääntelyviranomaisten syövän synnyn ja avustajat vastustuskykyä retinoidi hoitomuodot.

Cellular retinoid Sidonta proteiini 1 (CRBP1) on merkittävä rooli retinoidimuotoisen signalointi ja downregulation CRBP1 ilmaisun tapahtuu rintojen [12], eturauhas- [13], mahalaukun [14] ja munasarjojen [15] syövät. Menetys CRBP1 ilmaisun rintaepiteelissä johtaa erilaistumisen häviäminen ja syövän etenemistä häiritsemällä retinoidi varastointi ja sen aineenvaihdunta aktiiviseksi metaboliitiksi, retinoiinihappo, tuottaa lokalisoitu retinoidi puute [16], joilla on muuttunut retinoidien reagointikykyä [17] ja solutransformaatioon .

Haimasyöpä (PC) on neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan länsimaisissa yhteiskunnissa, joiden kokonaispituus 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [18]. Edistysaskeleet neoadjuvantti- ja adjuvantti solunsalpaajahoitojen ovat johtaneet jonkin verran parannusta tuloksia, mutta pancreatectomy edelleen tehokkain yksittäinen hoitomuotoa PC, ja tarjoaa vain mahdollisuuksia parannuskeinoa. Vain 20%: lla potilaista esiintyy paikallista, ei-metastaattinen sairaus, joka on sopiva resektio [19]. Ne, jotka tehdään resektion ja vastaanottaa adjuvanttihoito on mediaanielossaolosta 12-22 kuukautta ja 5 vuoden pysyvyys 20-25% [20]. Olemassa systeemisiä hoitoja ovat vain vähän tehokkaita ja mediaani potilaiden elinaikaa etäpesäkkeitä pysyy 6 kuukautta. Näin ollen on olemassa suuri tarve kehittää uusia terapeuttisia strategioita haimasyövän.

Tässä tunnistaa mahdollinen rooli retinoidipitoisuudet signalointi haimasyövän ja haiman uudistaminen ja seurauksena voi olla kohdistettavaksi mekanismi kehittää uusia hoitostrategioita. Menetys CRBP1 keskeinen säätelijä retinoidi signalointi ja tärkeitä rintasyöpä, vaikka usein PC, toisin kuin rintasyöpä ei itsessään riitä aiheuttamaan muutosta.

Methods

Ethics Statement

Eettinen hyväksyntä eläinkokeiden saatiin Garvan Institute animal eettisen komitean (hyväksyntä numerot 09/53, 07/10). Monikeskustutkimus eettinen hyväksyntä saatiin Tutkijavoimavarojen eettisten toimikuntien yliopiston opetuksen sairaaloissa: Westmead Hospital, Concord Hospital, Royal Prince Alfred Hospital ja St Vincentin sairaalan Campus Sydneyssä hankintaan tuoreita ja arkistointia kudosten ja kirjaaminen kliinispatologiset tietoja potilaista kanssa diagnoosi haimasyöpä. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

HARVINAISTEN LacZ hiiret

RARE-LacZ hiiret sisältävät LacZ siirtogeenin ohjataan retinoiinihapon vaste-elementti (harvinainen). Solut, joissa aktiivinen nivelreuma signalointi tahra positiivinen β-galaktosidaasin (β-gal). Hoitamattomien eläinten (n = 8) tapettiin klo 10-12 viikon iässä ja niiden haima korjattu β-gal värjäys.

Hiiren haimatulehdus Model

seruleiini aiheuttama malli krooninen haimatulehdus oli käytetyt edellisiin malleihin [21]. -Hiiriä (n = 16) käsiteltiin toistettiin vatsaonteloon injektioita seruleiini (MP Biomedicals, Solon, OH) viisi kertaa päivässä, kahdesti viikossa 10 viikkoa. Tässä mallissa täydellinen rauhasrakkulasolujen solujen uudistumista on raportoitu esiintyvän 6 viikon kuluttua lopettamisesta seruleiini hoidon. Siksi hiiret tapettiin 0, 2, 4 ja 6 viikon kuluttua lopettamisesta seruleiini injektioita ja niiden haima korjattu tutkimiseksi RA signalointi eri ajankohtina aikana toipumisaika.

Hiiren Haimasyöpä mallit

RARE-LacZ-hiiriä (n = 10) 10 viikon iässä käsiteltiin 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO), kuten aiemmin on kuvattu [22]. Hiiret tapettiin, kun he osoittivat merkkejä sairaudesta tai 9 kuukautta DMBA hoidon ja kudos kerätään β-gal värjäys.

LSL-Kras

G12D /+, LSL-Trp

53R172H /+ ja Pdx1-Cre hiiret saatiin hiiri mallit Human Cancer Consortium National Cancer Institute (Frederick, MD). Tuottaa haimatuumorien jossa RA signalointi aktiivisuutta voitiin arvioida HARVINAISTEN LacZ hiiriä risteytettiin LSL-Kras

G12D /+; LSL-Trp

53R172H /+; Pdx1-Cre hiirten tuottamiseksi LSL-Kras

G12D /+; LSL-Trp

53R172H /+; Pdx1-Cre, HARVINAISTEN LacZ jälkeläinen (n = 8). Neljän siirtogeenisiä hiiriä jätettiin iän, kunnes kasvaimet muodostuvat minkä jälkeen ne lopetettiin ja kudosten kerättiin β-gal-värjäyksellä.

β-galaktosidaasi-värjäys

4 um haiman leikkeitä de-vahattu ja nesteytyksestä ennen paljastumista saavutettiin käyttämällä kohde-haku ratkaisua (S2367, pH 9,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) kiehuvassa vesihauteessa 20 minuuttia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus sammutettiin 3% vetyperoksidia metanolissa. Leikkeitä inkuboitiin 1 tunti 1:50 anti-β-galaktosidaasi (AB616) kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, UK). Leimattu polymeeri piparjuuriperoksidaasi anti-kani tunnistusjärjestelmä on käytetty mukaisesti valmistajan ohjeiden (Envision + anti-kani, DAKO Corporation, CA). 3,3′-diaminobentsidiiniä käytettiin substraattina. Counter-värjäys suoritettiin Mayerin hematoksyliinillä (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).

Patient kohortti

Havaitsimme kohortin 90 potilasta, joille tehtiin haiman resektio tai biopsia näistä sairaaloista. Tämä ryhmä edustaa osajoukko aiemmin kuvattu ryhmä 348 potilaista [23], [24].

CRBP1 immunohistokemia

Haiman kudoksen mikroriveissä (4 um: n leikkeitä) on de-vahattu ja nesteytyksestä ennen paljastumista saavutettiin käyttämällä kohde-haku ratkaisua (S1699, pH 6,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) painekattilassa 5 minuuttia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus sammutettiin 3% vetyperoksidia metanolissa. Leikkeitä inkuboitiin 1 tunti 1:50 anti-CRBP1 (FL-135) polyklonaalista kanin vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Leimattu polymeeri piparjuuriperoksidaasi anti-kani tunnistusjärjestelmä on käytetty mukaisesti valmistajan ohjeiden (Envision + anti-kani, DAKO Corporation, Carpenteria, CA). 3,3′-diaminobentsidiiniä käytettiin substraattina. Counter-värjäys suoritettiin Mayerin hematoksyliinillä (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).

Jopa kolme erillistä näytettä haima tutkittiin potilasta kohden. Värjäys arvioitiin kaksi erillistä tarkkailijaa kunkin tapauksen (E.K.C. ja S.A.O.). Standardointi pisteytys päästiin vertaamalla tulokset välillä tarkkailijoiden ja neuvottelut, joissa mahdolliset poikkeavuudet ratkaistiin yksimielisesti. Tulokset annettiin prosentteina solujen positiivisia sytoplasmista värjäytymistä sisällä edustavan alueen kudoksen mikro-array ydin, ja absoluuttinen intensiteetti sytoplasminen värjäys asteikolla 0-3 (0 edustaa värjäytymistä, 1 edustaa heterogeenistä sytoplasminen värjäys, 2 edustaa homogeeninen sytoplasminen värjäys, ja 3 edustavat voimakas homogeeninen sytoplasminen värjäys). Positiivinen pisteet CRBP1 annettiin perustuu seuraavat kriteerit: 50% soluja, joilla on homogeeninen sytoplasmista värjäytymistä, jonka intensiteetti on 1.

Survival analyysi suoritettiin käyttäen Kaplan-Meier-analyysi, jossa erot eloonjäämisessä arvioitiin käyttämällä Log-Rank testi käyttäen StatView 5.0 Software (Abacus Systems, Berkeley, CA).

haiman solulinjat

Kuusi haimasyövän solulinjoissa käytettiin: AsPC-1, BxPC -3, Capan-2, LVI-, MiaPaCa2 ja PANC1 (ATCC, VA, USA). Nämä solulinjat kasvatettiin mukaisesti ATCC-protokollia. Ihmisen haimatiehyen Epithelial (HDPE ja HDPE-EcoRI) soluja käytettiin tavallisena ohjaus (ystävällisesti Ming-Sound-Tsao, Ontario Cancer Institute) ja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [25].

Western blotting

Protein uutteet visualisoitiin käyttäen 4-12% bis-Tris esivalettuja geelejä (Invitrogen, Victoria, Australia) ja siirrettiin PVDF-kalvoille mukaan valmistajan protokollaa. Suodattimet blokattiin kuoritun maidon 5% TBST-puskurissa. Anti-CRBP1-vasta-aine (FL-135) käytettiin 1:500 yön yli. Sitten kalvoja inkuboitiin anti-kani-immunoglobuliini G (IgG), joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (1:2000) (Amersham, (GE Healthcare), NSW, Australia) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen tehostetun kemiluminesenssin reagenssia (Perkin Elmer, Waltham , MA).

RNA: n uutto ja cDNA-synteesi

RNA haiman solulinjojen uutettiin käyttäen Trizol® reagenssia (Invitrogen, Victoria, Australia) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin käyttäen ABgene® Reverse-IT ™ RTase Blend (ABgene, Surrey, Iso-Britannia) sekoitus Oligo dT ja Random heksameerien käyttämällä First Strand Synthesis Method. Denaturoinnin RNA 70 ° C: ssa, Reverse Transcription (RT) reaktiot suoritettiin termosyklerissä DNA moottorin Dyad ™ (MJ Research, Waltham, MA) ja vaiheittaista ohjelmaa 25 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 35 ° C: ssa 30 minuuttia, 47 ° C: ssa 45 minuuttia, sitten 75 ° C: ssa 10 minuuttia.

Quantitative Real-Time PCR (QPCR) B

TaqMan® geeniekspression määrityksiä (Applied Biosystems, Victoria, Australia) of CRBP1 (Hs00161252_m1) suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. GAPDH (4326317E, TaqMan® endogeeninen kontrolli) käytettiin endogeenista ohjaus. TaqMan® qPCR reaktiot suoritettiin kolminkertaisina käyttäen ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Victoria, Australia). Standardikäyrät olivat mukana sen varmistamiseksi, että reaktiot suoritettiin lineaarisella alueella ja niitä käytetään säätämään reaktion tehokkuus. Pyöräilyn olosuhteet sisältyvät alkuperäiseen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 4 minuutin ajan, jonka jälkeen 95 ° C (30 sekuntia) ja 72 ° C (30 sekuntia) 60 syklin.

knockdovvn CRBP1 vuonna HDPE soluissa

Kaksi lyhyttä hiusneula-RNA (shRNA) konstrukteja kohdistaminen CRBP1, siCRBP1-A ja siCRBP1-B sekä salatun ohjaus, siCRBP1-salattu, (ystävällisesti Nicoletta Sacchi, Roswell Park Cancer Institute, NY) transfektoitiin Phoenix-soluihin käyttäen FuGENE transfektioreagenssia (Roche, NSW, Australia). Retroviruksen supernatantit kerättiin ja käytettiin infektoimaan HDPE-EcoRI soluissa. Puromysiinin (1 ug /ml) käytetään valitsemaan onnistuneesti infektoidut solut. Onnistunut knockdovvn CRBP1 määritettiin western blot.

3D viljelmä HDPE solujen

HDPE-EcoRI- soluissa tartunnan shRNA kasvatettiin kammio dioja päällystetty kasvutekijän vähensi matrigeelin (BD Biosciences, San letku, CA) in keratinosyyttien seerumivapaassa väliaineessa (Invitrogen, Victoria, Australia), jota oli täydennetty epidermaalinen kasvutekijä, naudan aivolisäkeuutetta, 10% vasikan sikiön seerumia ja 2% matrigeeliä ja 20 päivää. Media vaihdettiin 4 päivän välein. 3D rakenteet otettiin talteen 3, 7, 10, 15 ja 20 päivää käyttäen BD solujen talteenotto ratkaisu (BD Biosciences, San letku, CA) ja proteiini uutetaan western blot.

stabiili transfektointi MiaPaCa2 solujen

neljä eri kloonien MiaPaCa2 soluissa, jotka ilmentävät eri CRBP1 (MP2

CRBP1-solut) ja niiden valvontaa luotiin vaikutuksen arvioimiseksi CRBP1 ilmaisun MiaPaCa2-soluissa. Solut luotu pcDNA ™ 6,2 /GFP-plasmidin (Invitrogen, Victoria, Australia) ja pQCXIP plasmidi (Clontech Laboratories, Mountain View, CA), joka sisälsi CRBP1 geenin. Vektorit transfektoitiin käyttäen Amaxa Nucleofector® Technology (Lonza Köln AG, Köln, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut, jotka on transfektoitu pcDNA ™ 6,2 /GFP-plasmidin edelleen lajitellaan GFP: n ilmentymisen virtaussytometriaa käyttämällä rikastuttaa populaatio soluja, jotka ekspressoivat GFP: tä /CRBP1. Ilmentyminen CRBP1 kussakin väestön varmistettiin Western blot. Soluja käsiteltiin 2, 5 tai 10 mM all

trans

-retinoiinihappo (ATRA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MA) 1. päivänä solut kerättiin ja laskettiin päivänä 1, 2, 4 ja 6 solujen proliferaation mittaamiseen.

DNA: n uutto

1 mm kudoksen ytimet poistettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut ihmiskudokset PC-näytteiden ja DNA uutettiin käyttämällä Gentra Puregene Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA solulinjoista uutettiin käyttämällä DNA: n eristämiseksi (Stratagene, Santa Clara, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

bisulfiittikäsittelyä

bisulfiittimodifiointi käsittely suoritettiin käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä [ ,,,0],26] pienin muutoksin. Yhteenvetona, 1 ug DNA: ta denaturoitiin käsittelemällä 0,3 M NaOH: lla ja muunnettu 3 M natriumbisulfiitin 6 tuntia. Muunnettua DNA: ta puhdistettiin käyttäen QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Vetysulfiittikäsittelyä valmistui lisäämällä 5,5 ml 3 M NaOH, saostetaan etanolilla, ja suspendoidaan uudelleen 50 ml: aan DNA hydraatioliuokseen (Gentra Puregene Tissue Kit, Qiagen, Valencia, CA).

metylaatiospesifisen PCR (MSP ) B

DNA metylaatiovyöhykkeiden CpG saaren CRBP1 ihmisen haiman solulinjoissa ja ihmisen näytteet määritettiin MSP käyttämällä aiemmin julkaistu alukkeita [26], [27]. PCRmonistukset suoritettiin 12,5 ul reaktioseosten sisältää 1 5 ui bisulfiitin käsitellyn DNA, dNTP (kukin 200 uM), alukkeita (0,4 mM kukin reaktio), 1,5 mM MgCl

2, 0,75 yksikköä AmpliTaq Gold® DNA polymeraasia (Applied Biosystems, Victoria, Australia), ja 1 x PCR-puskuria II (Applied Biosystems, Victoria, Australia). MSP suoritettiin käyttäen seuraavia olosuhteita: 95 ° C (30 sekuntia), 58 ° C (30 sekuntia), 72 ° C (30 sekuntia) ja 40 sykliä. Pyöräily olosuhteet sisälsivät alkuperäisen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan ja loppupidennys 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Kaikki PCR-tuotteet visualisoitiin käyttämällä 1,5% agaroosigeelissä. Myod alukkeita [28], käytettiin kontrollina laadun bisulfiitti käsitellyn DNA. Nämä alukkeet eivät sisällä CpG-sekvenssejä.

5-AZA ja TSA hoidon

MiaPaCa2-soluja käsiteltiin seuraavasti: (1) Käsitelty päivänä 1 300 mM 5-AZA-2’deoxycytidine (5-AZA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja korjattujen Päivä 4; (2) Käsitelty päivänä 1 100 nM Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja korjattujen Päivä 4; (3) käsiteltiin päivinä 1 ja 3 kanssa TSA ja korjattujen Päivä 4; (4) Käsitellyt päivänä 1 5-AZA, päivää 2 ja 3 kanssa TSA ja korjattujen Päivä 4; (5) Käsitellyt päivänä 1 5-AZA, päivää 2, 3 ja 5 kanssa TSA ja korjattujen 6. päivä Käsittelemättömät MiaPaCa2 ja HDPE soluja käytettiin kontrolleina. Hoidon aikana media vaihdettiin päivittäin, ja solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ennen nukleiinihappo- ja /tai proteiini uuttamalla.

Tulokset

Retinoid signalointi normaalissa haima, haiman vamman ja uudistumista

retinoiinihappo Response Element (RARE-LacZ) toimittaja hiirillä, jotka merkitsevät soluja, joilla on aktiivinen retinoidi signalointi [29] osoitti, että normaalissa haima, aktiivinen retinoidi signalointi rajoittuu Langerhansin saarekkeissa ja harvinaisten yhden tai pieniä klustereita eksokriinisisten solujen kanssa acinar tai centro-acinar sijainnin ja morfologia (kuvio 1). Toistuva vatsaonteloon injektioita on kolekystokiniinin analogisten seruleiini [30] indusoi krooninen haimatulehdus hiirillä morfologisia muutoksia, kuten menetys acinar solujen massan ja lisätä haiman fibroosi samanlainen kuin ihmisen kunnossa. Tutkia retinoidi signalointia asettaminen haiman vamman ja elpymistä, me aiheuttama haimatulehdus harvinaisissa-LacZ hiirillä. Hiiriä käsiteltiin 10 viikon injektoimalla intraperitoneaalisesti seruleiini, uhrataan hoidon päätyttyä, tai annettiin toipua 2, 4 tai 6 viikkoa. Hiiret uhrattiin välittömästi lopullisen injektion seruleiini (aikaan akuutin vamman) oli huomattavasti pienempi haimoissa johtuen acinar solu- ja fibroosi muodostumista ”putkimainen komplekseja”, ilmentymä asinussolujen ja ductal metaplasiasta aikaisintaan morfologiset muutokset liittyvät jossa haiman syövän synnyn (kuvio 2A) [31], [32].

RA signalointi aktiivisuutta haimasta peräisin RARE-LacZ hiiriä hoidettiin seruleiini (E), ja sen jälkeen elpyminen 2 viikkoa (F) , 4 viikkoa (G) ja 6 viikkoa (H). Lisääntynyt retinoidi signalointi aktiivisuutta havaittiin merkittävä osa asinussoluista heti lopettamisen jälkeen seruleiini hoito (E), jossa on retinoidi aktiivisuus huipussaan 2 viikkoa (F), alenee 4 viikkoa (G) ja palaavat lähelle normaalia seuraavat 6 viikkoa hyödyntämisaste (H).

2 viikon lakkaamisen jälkeen seruleiini hoidon exocrine uudistaminen olivat aloittaneet kasvun kanssa acinar solumassan, mutta jäljellä putkimainen komplekseja ja jatkuvasta tulehduskeräytymää (kuvio 2B ). 4 ja 6 viikon, exocrine haimoissa oli lähellä täysin, mutta ei täysin regeneroitu, satunnaiset acinar yksiköiden silti näyttää laajentuneen Lumena ja ympäröivän lievä tulehduskeräytymää (kuviot 2C ja 2D). β-galaktosidaasi värjäystä haimasta peräisin seruleiini saaneista RARE-LacZ hiirillä havaittu olevan retinoidi signalointi aktiivisuutta suuren osan asinussoluista heti lopettamisen jälkeen seruleiini hoidon (kuvio 2E). Retinoid aktiivisuus oli korkeimmillaan 2 viikkoa ja vähentynyt 4 viikkoa lähelle normaalia 6 viikon (kuviot 2F, G, H).

Retinoid signalointi haimasyövän

Voit selvittää retinoidi signalointia haima muutettiin aikana syövän synnyn tutkimme retinoidipitoisuudet signalointi aktiivisuutta kemiallisesti aiheuttama (DMBA) [22] ja geneettisesti hiiri malleja haimasyövän [33]. DMBA käsiteltiin RARE-LacZ hiirille kehittyi heikosti eriytetty, sarcomatoid kasvaimia (kuvio 3A), jossa on erilliset puuttuessa solut, jotka osoittivat aktiivista retinoidi signalointi vaikka tarkastelun useita osia (kuvio 3B). Haima promoottori ajaa Cre-rekombinaasin (Pdx1-Cre) indusoima aktivoitu kras ja mutantin p53 sisällä haima ovat tällä hetkellä sopivin geneettisesti hiirimallissa haimasyöpä. Nämä LSL-Kras

G12D /+ /LSL-Trp53

R172H /+ /Pdx1-Cre hiiret kehittävät haiman esiasteleesioita (Panin) että edistystä erittäin invasiivisia ja metastaattinen haiman adenokarsinooma, mediaani 5 kuukautta [33 ]. Nämä hiiret risteytettiin HARVINAISTEN LacZ reportteri hiiret tuottamaan LSL-Kras

G12D /+ /LSL-Trp53

R172H /+ /Pdx1-Cre /RARE-LacZ hiirillä. Haiman kasvaimia, jotka olivat pääasiassa kohtalaisen eriytetty ja sisälsi runsaasti desmoplastic strooman muodostui kaikille hiirille. Oli taas täydellinen puuttuminen retinoidien signaloinnin toiminta näissä kasvaimissa ja esiasteleesioita huolimatta useita leikkaus- ja arviointi 2 riippumattomien tarkkailijoiden, joista yksi oli asiantuntija haiman patologi (kuvio 3D, E, F).

tuumoreiden DMBA käsiteltiin RARE-LacZ hiirillä, erillinen puuttuessa solut, joilla aktiivisen retinoidi signalointi havaittiin (B). In LSL-KrasG12D /+; LSL-Trp53R172H /+; Pdx1-Cre, HARVINAISTEN LacZ haimatuumorien ja esiasteleesioita, oli myös täydellinen puuttuminen retinoidi signalointi aktiivisuutta (D ja F vastaavasti).

menetys CRBP1 ilmaisu on yhteinen ja varhainen tapahtuma haimasyövän

Cellular retinoid Binding Protein 1 (CRBP1), keskeinen säätelijä retinoidi signaloinnin ajatellaan olevan merkittävä rooli rintojen karsinogeneesissä [16], [34]. Alustavia havaintoja myös tunnistettu downregulation CRBP1 transkriptipitoisuuksissa PC [35] ja Panin [36]. Näin ollen, olemme tutkineet menetys CRBP1 mahdollisena syynä vähentynyt retinoidi signaloinnin PC, ja rooli haiman syövän synnyssä.

kohortin 90 potilasta, immunohistokemia osoitti merkittävää downregulation CRBP1 proteiinin ilmentymisen 70 %, ja täydellinen menetys ilmentymisen 50% näistä (35% kokonaismäärästä, kuvio 4A, B, C, D). Menetys, tai alisäätely CRBP1 ilmaisun ilmaantui varhain PC kehittämiseen ja oli läsnä 100%: Panin-1A ja 1B vauriot potilailla, joilla oli poikkeava ilmaisu niiden syöpä (kuvio 4E, F). Menetys CRBP1 ilmentymisen tapahtui myös 50% varhaisen esiasteleesioita (PanIN1A ja 1B), joka liittyy krooninen haimatulehdus, tunnettu riskitekijä PC. Kumpikaan menetys, eikä downregulation ilmaisun liittyi potilaiden hoitotuloksiin (Log-Rank

P

= 0,3539; Kuva S1). Lisäksi, 4 6 PC-solulinjojen osoitettu vahinko tai downregulation of CRBP1 ilmentymisen (kuvio 5A ja B).

(C) CRBP1 metylaatiostatuksen PC-solulinjojen ja (D) palauttaminen CRBP1 lausekkeen yhdistelmä hoitoon MiaPaCa2 soluja 5-atsa ja TSA. (E) CRBP1 Knockdown stabiilisti transfektoiduissa HDPE-EcoRI soluissa. (F) HDPE-soluja kasvatettiin 3D osoittavat, ei muutosta morfologian välillä siCRBP1 solujen ja sekoitetun valvontaa.

Loss of CRBP1 ilmentyminen liittyy reversiibeli promoottorin hypermetylaatio

metylointi PCR (MSP ) ja bisulfiitin genomista sekvensointia (BSG) tunnistettu CRBP1 promoottori hypermetylaation vuonna 27,3% 33 ihmisen PC näytteitä puuttuu CRBP1 ilmaus toisin 5 5 vastaaviin normaaleihin haima näytteitä, joita ei ole metyloituja. CRBP1 promoottorin hypermetylaatio havaittiin MiaPaCa2-soluissa (kuvio 5C), ja käsittely demetyloiva aineen 5-AZA yksinään tai yhdessä HDAC-inhibiittori TSA, indusoima CRBP1 mRNA: ta (kuvio 5D). Kyky kääntää CRBP1 hiljentäminen farmakologisesti esitteli mahdollisia mahdollisuuden käyttää retinoidien ja HDAC-inhibiittorit kuten yhdistelmähoidot terapeuttisesti kohdistaa CRBP1.

alassäätely CRBP1 ilmentymistä solulinjoissa ja hiiri malleja

arvioimiseksi rooli CRBP1 downregulation haiman karsinogeneesissä, kuolemattomiksi ihmisen haiman Ductal epiteelisolut ekspressoivat hiiren ekotrooppisen retrovirusreseptorin (HDPE-EcoRI) oli transdusoitiin retroviraalisesti kaksi shRNA rakentaa kohdistaminen CRBP1 sekä salattu ohjaus. Sitten soluja kasvatettiin 3D viljelyllä 20 vuorokauden kuluessa. Western blot osoittaa, 50% pudotus on CRBP1 ilmentymisen (kuvio 5E), mutta ei ollut havaittavissa eroa morfologia verrattuna kontrolleihin (kuvio 5F). Lisäksi, haimat 12 kuukautta vanha CRBP1 hiirten [37] (saatiin ystävällisesti professori Pierre Chambon) ei paljastanut mitään selvää morfologisia eroja verrattuna kontrollihiiriin (tuloksia ei ole esitetty).

CRBP1 yli-ilmentymisen MiaPaCa2-soluissa

jotta vaikutusten tutkimiseksi palauttaminen CRBP1 ilmaisun, MiaPaCa2 solut, jotka normaalisti eivät ilmennä CRBP1 transfektoitiin stabiilisti tuottaa useita klooneja, jotka ilmentävät eri CRBP1 (low, medium, high ja erittäin korkea) kanssa ei vaikuttanut leviämisen hinnat verrattuna tyhjän vektorin ohjaus (kuvio S2A) ei muuttanut herkkyys retinoidihoito kun käsitellään All-trans retinoiinihappo (atra) (kuviot S2B ja S2C).

keskustelu

syntymässä rooli väärin säädellystä alkion signalointireittien kuten Notch ja Hedgehog [4] tarjoaa mahdollisuuksia kehittää uusia terapeuttisia strategioita haimasyöpä. Retinoidi signalointi on välttämätön normaalille sikiön kehitykseen, mukaan lukien muodostuminen orastavan haiman [6], [7], [8]. Meidän tiedot osoittavat, että signalointi aktiivisuutta normaaleissa haima rajoittuu haiman saarekkeiden ja harvinaisten solujen haimassa, joista monet muistutti Centro-asinussolut, oletetun kantasoluja haima. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että solujen haima ilmentävät RA-synteesimenetelmä entsyymi, aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1), ovat centroacinar soluja, jotka osoittavat kantasolujen ominaisuuksia [38]. Tämä malli toiminta on samanlainen kuin ilmentymistä transkriptiotekijä Pdx1, joka on myös ajateltu merkitä exocrine progenitori- tai ”varsi” soluja. Toiminnallinen lukemien

in vivo

retinoidien signalointi aktiivisuutta käyttäen reportteri hiiret tutkimuksessamme viittaavat siihen, että lisätyn signalointi on rooli haiman uudistumista loukkaantumisen jälkeen. Aktiivinen signalointi, yleensä rajoitu tiettyihin solutyyppeihin yleistyy asti erilaistumista uuden exocrine acini on valmis. Hiirten käsittely Toistuvien seruleiini johtaa dramaattiseen lisääntymiseen ALDH1-positiivisten solujen, jonka oletetaan edustavan lisääntynyt retinoidi signalointi [38], mikä edelleen tukee havaintomme.

vapautettiin retinoidi signalointi on havaittu monissa syöpätyyppeihin [11], ja vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat tunnistaneet poikkeava ilmentymä komponenttien retinoidi signaloinnin sekä loppupään tavoitteita PC [35], [39], [40], [41], [42], [43], vähän tiedettiin koskevan retinoidi signalointi aktiivisuutta. Arviointi retinoidi signalointi reportteri aktiivisuutta sekä kemiallisesti aiheuttama haimasyövän ja geneettisesti malleissa tutkimuksessamme osoitti puute retinoidi signalointi. Näiden havaintojen perusteella, me arveltu, että puute retinoiinihappo signalointi voi haitata normaalia erilaistumisen vastauksena karsinogeenisia ärsykkeisiin ja edistävät haiman syövän synnyn, ja että palauttaminen retinoidi signalointi voi tarjota käyttöön uusi terapeuttinen vaihtoehto.

Koska Näin ollen tutkimme rooli CRBP1, keskeinen osa retinoidien signalointi, ja arvellaan olevan merkittävä rooli rintojen karsinogeneesissä [16], [34]. Havaitsimme menetys, tai alisäätely CRBP1 ilmaisun (jotka mahdollisesti antaa menetystä retinoidi signalointi aktiivisuus) 70%: lla haimasyöpä yksilöitä, joista suuri osa johtuu promoottorin metylaation. Menetys tai alisäätely CRBP1 ilmentyminen oli läsnä aikaisessa esiasteleesioita PC, molemmat yhdessä PC ja kroonisen haimatulehduksen, riskitekijä kehittämiseen PC. Kuitenkin knockdovvn CRBP1 ilmaisun kuolemattomaksi haimatiehyen epiteelisolujen ei indusoinut muutosta. Samoin CRBP1 hiirten ei osoittanut haiman fenotyyppi yli 12 kuukauden ikäisiä. Lisäksi uudelleen CRBP1 PC soluissa puutteellinen CRBP1 eivät muuttaneet epäherkkyys retinoidihoito. Tärkeää on, viimeaikaiset tiedot viittaavat siihen, että haiman tähtisolut voi olla avainasemassa retinoidimuotoisen signalointi ja kestävyys retinoidihoito

in vivo

[44]. Tämä on otettava huomioon, etenkin kun Tässä esitetyt tiedot keskittyvät haiman epiteelisolujen komponentti.

Yhteenvetona Haiman vamma indusoi retinoidi signalointi toimintaa haima, joka on laajalle levinnyt aikana vahingon ja uudistaminen ja mahdollisesti näytelmiä tärkeä rooli tässä prosessissa.