Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimen kasvu sädehoidon jälkeen on yleisesti tunnustettu syy hoidon epäonnistumisen. Näin tutkimme kasvainsolujen kasvua sädehoidon jälkeen perustamalla syöpäsolujen kasvua malli

in vitro

. Toteutimme tämän mallin kylvämällä ei säteilytetty tulikärpäsen luciferase2 ja vihreän fluoresoivan proteiinin fuusio- geeni (Fluc) leimattu elävien syöpä toimittaja solujen päälle tukikerroksen säteilytettyä syöpäsoluja. Elävä kasvainsolujen kasvua seurattiin bioluminenssina kuvantaminen. Elävät toimittaja solut kasvoivat nopeammin, kun ympättiin säteilytetään kuolettavasti feeder-soluja kuin silloin, kun ympättiin ei säteilytetty feeder-soluja tai kun ympättiin ilman feeder-soluja. Olemme havainneet, että ilmentymisen tasot Shh ja Gli1 proteiineja, jotka molemmat ovat tärkeitä proteiineja Sonic hedgehog (SHH) signalointia, lisättiin säteilytyksen jälkeen, ja että tämä ilmentyminen korreloi positiivisesti toimittaja solujen kasvua. Lisäksi kuolevan solun stimulaation elävien kasvainsolujen kasvua parannettiin lisäämällä SHH signaloinnin agonistien ja estävät SHH signaloinnin antagonisteja. SHH agonistit myös parannettu reportteri solujen kasvua ilman säteilytettyjä syöttösoluja, mikä viittaa tämä mekanismi on rooli syöttölaite solujen kasvua stimulaatiota. Näiden tulosten, voimme päätellä, että SHH aktivaatiota tärkeä rooli aikana kasvaimen kannan uudelleen sädehoidon jälkeen.

Citation: Ma J, Tian L, Cheng J, Chen Z, Xu B, Wang L, et al. (2013) Sonic Hedgehog signalointireitin tukee syöpäsolujen kasvua aikana syöpä Sädehoito. PLoS ONE 8 (6): e65032. doi: 10,1371 /journal.pone.0065032

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 helmikuu 2013; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2013; Julkaistu: 10 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation (81120108017, 81172030) ja National Basic Research Program of China (2010CB529902) (Q Huang ja L Tian) ja osittain avustuksia Yhdysvaltojen National Cancer Institute (CA131408, CA136748, CA155270 ) (ja CY Li). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

monissa syöpien, kasvaimen kannan uudelleen sädehoidon jälkeen tapahtuu ja suuri haaste kliinikoille. Tässä prosessissa, muutamat syöpäsolujen hengissä sädehoidon jälkeen tulee kasvattavat ja korvata kadonneita syöpäsoluja. Harvenneiden aikana fraktioitu sädehoidon on tunnustettu tärkeäksi syy hoidon epäonnistumiseen ja näyttöä siitä, että korko kannan lisäämis- voi tapahtua kiihtyvällä vauhdilla joissakin tapauksissa [1]. Harvenneiden riippuu aktivointi signalointireittien, että stimuloida tuumorisolujen ja monet molekyyli kohdistetut aineita on kehitetty, jotka estävät näitä reittejä, kuten gefitinibi, joka on suunnattu epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) signalointi [2]. Jotta voidaan luoda malli opiskeluun kasvainsolun kannan uudelleen sädehoidon jälkeen, monet muut ovat yrittäneet käyttää niin sanottua ”syöttösoluja”, jotka ovat saaneet sädehoitoa kasvun edistämiseksi käsittelemättömän kasvainsolujen ympätty yhteistyössä kulttuurin kokeiluja. Vaikka tämä malli ei suoraan näytä uudelleenmetsitys käsiteltyjen syöpäsolujen sädehoidon aikana, uskomme, että kasvua edistävää signaalit vapautuu kuolettavasti käsiteltyjen tukisoluja jäljitellä olosuhteissa homogeenisesti käsitelty kasvain. Siksi käytämme käsitettä harvenneiden ja kuolevat solu stimuloidaan elävien kasvainsolujen kasvua synonyymeinä koko tutkimukseen.

Huolimatta tietämyksemme että kuolemassa syöttölaite solut voivat lisätä kasvua elävien kasvainsolujen, mekanismi, jolla tämä tapahtuu edelleen suurelta osin tuntemattomia. Sonic Hedgehog (SHH) signalointireitistä, ensimmäinen tunnistettu banaanikärpänen, on sekaantunut elimen normaalia kehitystä ja homeostaasiin, kantasolujen ylläpitoon ja lisääntymistä selkärankaisia ​​ja voivat siksi olla ehdokkaana mekanismi takana elossa kasvainsolujen kasvua [3]. Lisäksi monet syövät liittyy SHH signalointi, kuten basaliooma, ruokatorven ja mahalaukun syövän, pienisoluisen keuhkosyövän [4] ja haiman adenokarsinooma [5]. SHH-reitin aktivointi aloitetaan sitomalla erittyvän ja lipidi-modifioitu ligandin Shh on Patched1 (Ptch1) transmembraaninen reseptori. Tämän seurauksena, Ptch1 inhibitio Smoothenedin (SMO), 7-pass transmembraaninen-sivuavaa proteiinia, on helpottunut ja SHH signalointikaskadin aloitetaan, joka puolestaan ​​aktivoi Gli transkriptiotekijöiden [6]. On olemassa kolme Gli proteiineja, jotka koodaavat sekä aktivaattori ja repressorin toiminta. Gli1 toimii transkriptioaktivaattorina, Gli2 on yhdistelmä positiivisia ja negatiivisia säätelydomeeneihin, ja Gli3 toimii ensisijaisesti transkription repressori [7]. Läsnä ollessa Shh, Gli1 on transkriptionaalisesti aktivoituu ja fosforyloidun ja Proteolyyttisestä käsittely Gli2 ja Gli3 niiden typistettyjä repressorin muotoja on estetty, mikä johtaa aktivoimalla tiettyjä SHH signalointireitin kohdegeenien, kuten Gli1 ja Ptch1 [8].

Koska mekanismeista kasvain kiihtyi kannan uudelleen sädehoidon aikana ei ymmärretä hyvin, pyrimme tutkimaan rooli vakiintunut SHH väylän kasvainsoluproliferaation sädehoidon jälkeen prosessi. On tunnettua, että sädehoito aiheuttaa apoptoosin, joka voi olla ratkaiseva rooli tuumorisolun kannan uudelleen [9]. Aiemmissa tutkimuksissa olemme osoittaneet, että kuolemassa kasvainsolut käyttävät apoptoottinen prosessi tuottaa kaspaasi 3 välitteistä kasvua stimuloiva signaaleja stimuloida uudelleenmetsitys kasvainten sädehoitoa [10]. Lisäksi olemme löytäneet ”Phoenix Rising” polku, jonka kautta pyöveli kaspaasit, kuten kaspaasi 3 ja 7, vuonna apoptoottiset solut edistävät haavan paranemista ja kudoksen uudistumisen monisoluisten organismien [11]. Ruokatorven syöpä, SHH signalointireitin laajasti aktivoitu ksenografteissa ja jäljellä kasvaimia jälkeen sädehoitoa ja estää SHH signalointi parantaa säteilyn sytotoksisuuden [12]. Siksi ”Phoenix Rising” polkuun kaspaasivälitteinen kasvaimen kasvua stimulaatiota ja SHH signalointireitille voivat molemmat olla mukana kasvainsolun kannan uudelleen sädehoidon jälkeen.

Tässä tutkimuksessa selvitimme roolit SHH signalointireitin vuonna kuolee solu stimuloidaan kasvainsolujen kasvua. Tuloksemme osoittavat selkeää näyttöä rooli Shh erittämät kuolevan solujen edistämisessä nopean uudelleenmetsitys kasvainten pieni määrä eläviä syöpäsoluja. Uskomme, että tämä äskettäin löydetty polun Shh stimuloi kasvaimen harvenneiden avainasemassa syövän sädehoidossa. Lisäksi kohdistaminen SHH reitti voi olla kliinistä vaikutusta parantaa syövän sädehoidon tuloksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelyolosuhteiden

Ihmisen haimasyövän Panc1 solujen ja ihmisen paksusuolen syöpä HT29, hankittiin Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja Dulbeccon Modified Eagles Medium (DMEM) (Thermo, Peking, Kiina), jossa 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Holly lehtiä, Hangzhou, Kiina), 100 U ml

-1 penisilliiniä ja 100 ug ml

-1 streptomysiinillä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

Kasvain harvenneiden Model

in vitro

, HT29 tai Panc1 soluja viljeltiin 10 cm petrimaljaan oli X-ray säteilytetty ja kahdenkymmenen neljän tunnin kuluttua, ne trypsinoitiin ja ympättiin 24-kuoppaisille levyille (Corning, NewYork, USA) tiheys 2,5 x 10

5 solua kuoppaa kohti kolminkertaisena DMEM, joka sisälsi 2% FBS: ää. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, Fluc merkitty, käsittelemätön HT29 tai Panc1 solut ympättiin solutiheyteen 1000 solua per kuoppa. Väliaine vaihdettiin joka 2. päivä 14 päivän ajan.

säteilytys Syöpäsolut

röntgensäteilyn soluja suoritettiin käyttäen Oncor lineaarikiihdytin (Siemens, Amberg, Saksa), joka sijaitsee osastolla säteilyn onkologian Shanghai Jiaotong yliopiston sidoksissa First kansan sairaalassa. Annosnopeus koneen on noin 3,6 Gy /min.

geenitransduktion soluihin

transdusoidut erilaisia ​​eksogeenisiä geenejä kohdesoluihin käyttämällä lentivirusvektoreita. Yleisimmin käytetty lentivirusvektorilla on plex-järjestelmä (Thermo Scientific Inc, Peking, Kiina), joka sisälsi puromysiiniresistenssigeenin. Geenit, jotka olivat tähän vektoriin kloonatut ovat seuraavat: tulikärpäsen luciferase2 ja vihreän fluoresoivan proteiinin fuusio- geenin (Fluc) ohjaa CMV-promoottori, lusiferaasi geenin, jota kuljettaa 8 x villityypin Gli1 sitoutumiskohdan tai 8 x mutatoitu Gli1 sidoskohdan (eli villin tyypin 8 × GBS lusiferaasigeeniin tai mutantit 8 x GBS lusiferaasin geeni), sekä shRNA vastaan ​​Gli1. Kaikki lentivirusvektoreita pakattiin 293T-soluihin valmistajan ohjeita noudattaen. Stabiilisti transdusoidut HT29 tai Panc1 solut saatiin lentivirus infektio ja puromysiiniselektion, kun läsnä on 2 ug /ml puromysiiniä kaksi viikkoa.

Luciferase Assay

Luciferase Reporter Assay System E1500 (Promega , Wisconsin, USA) käytettiin määrittämään tulikärpäsen lusiferaasi toimintaan mukaan valmistajan ohjeiden. HT29 ja Panc1 soluja, jotka ekspressoivat villityypin 8 x GBS lusiferaasigeeni tai mutatoitu 8 x GBS lusiferaasigeeni säteilytettiin 6 Gy ionisoivan säteilyn. Lusiferaasiaktiivisuudet varten 6 Gy säteilytettyjä soluja ja ei-säteilytettyjä soluja testattiin. Mittaukset suoritettiin Berthold luminometrillä (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa), ja tulikärpäsen lusiferaasi arvot ilmentävien solujen villityypin lusiferaasigeenin normalisoitiin tulikärpäsen lusiferaasi-arvot soluja, jotka ilmentävät mutantti lusiferaasigeeniin. Normalisointi minimoi kokeellinen vaihtelua. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

Bioluminescence Imaging

kuva lusiferaasi signaaleja soluista, käytimme NC100 väline Berthold Technologies (Bad Wildbad, Saksa), jotka sijaitsevat in School of Basic Medical Sciences, Fudanin yliopistossa. Sillä Panc1 ja HT29-soluja, mittasimme lusiferaasin signaaleja lisäämällä D-lusiferiinin (Promega, Wisconsin, USA) PBS: ään lopulliseen konsentraatioon 0,15 mg /ml. Viisi minuuttia antamisen jälkeen D-lusiferiini, kuvat otettiin ja lusiferaasin signaaleja (fotonit /s) sitten käsiteltiin ja analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä valmistajan toimittamia ohjelmistoja. Kuvat olivat aina ottaa samaan aikaan pisteen vaihtelevuuden minimoimiseksi. Lusiferaasi signaaleja mitattiin Panc1 ja HT29 14 päivän ajan pisteen maksimoimaan havaittu eroa ei syöttölaite ja käsittelemättömiä kontrolleja Säteilytetystä syöttölaite koeryhmän.

Vasta-aineet ja keskeiset Chemicals tässä tutkimuksessa käytetyt

Kaupallisesti saatavilla vasta-aineita Shh, Gli1, β-aktiini, GAPDH (Cell Signaling Technology, Boston, USA) ja sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Bio-Rad, Kalifornia, USA) ostettiin. SHH signalointi antagonisti syklopamiinia ja Gant61 molemmat saatiin Sigma-Aldrich (Missouri, USA). GDC-0449 hankittiin Selleck Chemicals (Texas, USA). SHH signalointi agonisti SAG saatiin Enzo Life Sciences (NewYork, USA) ja yhdistelmä-hiiri Sonic Hedgehog N-pää saatiin R

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Tulokset

Reportteri-solujen määrä oli Lineaarisesti Associated kanssa Lusiferaasiaktiivisuutta Kun Imaging

Jotta vahvista korrelaatio lusiferaasiaktiivisuuden kuvien reportteri solujen määrä, teimme sarjan laimennus Fluc leimattuja kasvainsoluja (joita kutsutaan ”reportteri solut”). 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 ja 10000 Panc1Fluc tai HT29Fluc kasvainsolut olivat siementen 96-kuoppalevyille 6 toistetaan päivää ennen kuvantamisen. Kuvantamisen tehtiin 5 minuuttia sen jälkeen kun D-lusiferiini avulla NC100 väline. Fotonit kustakin kuopasta otettiin talteen ja analysoitiin sen jälkeen kaksisuuntaisella ANOVA: lla. Tulokset osoittivat, että fotoneja /sec olivat lineaarisesti liittyy solujen määrä ympätty kuoppiin (Fig. 1A, 1B, R

2 = 0,9967 in Panc1Fluc soluissa ja R

2 = 0,9973 in HT29Fluc soluissa).

. Korrelaatio analyysi fotonit mitataan bioluminenssina kuvantamisen

vs

solujen määrä päällystetty. Fluc leimattuja Panc1 solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille 6 toistoa esitettyyn numeroon päivää ennen Imaging. Keskimääräinen fotonit /sec 6 toistoa kullakin solujen lukumäärät analysoitiin kaksisuuntaisella ANOVA: lla (R

2 = 0,9967). Tulokset osoittivat, että voimakkuus kuvasignaalin korreloi positiivisesti solujen määrä päällystetty. Valkoinen mittakaavajana edustaa 1 cm: n pituisia. B. korrelaatio analyysi fotonien mitattuna bioluminenssina kuvantamisen

vs

solumäärät HT29. Menettely ja tulos analyysi olivat samat kuin Panc1 soluja edellä mainittiin (R

2 = 0,9973). Mittakaava on 1 cm. C. Analyysi signaalin voimakkuuden Panc1Fluc soluja kasvatetaan säteilytettyä Panc1 soluissa. 2,5 x 10

5 X-ray säteilytettyjä Panc1 solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille, kuten syöttölaite. Annokset olivat 0 Gy, 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy ja 20 Gy vastaavasti. 1000 Panc1Fluc solut maljattiin kuhunkin kaivoon kanssa tai ilman feeder-solujen toimittaja. 14 päivää myöhemmin levy kuvattiin varten bioluminesenssin intensiteettiä. Top: Lusiferaasiaktiivisuutta analyysi; Pohja: edustaja bioluminesenssi kuva, Mittakaavapalkki on 1 cm. D. Analyysi signaalin voimakkuuden HT29Fluc soluja kasvatetaan säteilytettyä HT29. Menettely ja tulos analyysi olivat samat kuin Panc1 soluissa edellä mainittiin. Top: Lusiferaasiaktiivisuutta; Pohja: edustaja bioluminesenssi kuva, Mittakaavapalkki on 1 cm.

Irradiated Dying Kasvainsolun stimuloidun Living kasvainsolukasvun

Suoritimme sarjan kokeita vaikutusten tutkimiseksi kuolla, säteilytettyjä kasvainsoluja eri annoksina elävien kasvainsolujen. Simuloida

in vivo

skenaarioita, joissa valtaosa tuumorisolut tapetaan säteilyä tai kemoterapiaa, me ympätään pieni määrä (10

3) ja Fluc leimattua ihmisen haimasyövän Panc1 soluja tai ihmisen paksusuolen syövän HT29 solut päälle sängyn paljon suurempi määrä (2,5 x 10

5) leimaamatonta homologisia syöpäsoluja. Jälkimmäinen syöpäsolut kutsutaan ”syöttösoluja” säteilytettiin 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy ja 20 Gy, tai käsittelemätöntä (0 Gy) vastaavasti. Kasvu pieni määrä elävä ”reportteri solut” seurattiin epi- fluoresenssimikroskopialla 3 päivän välein ja bioluminesenssi kuvantaminen day14 (Fig. 1 C, 1D). Lusiferaasiaktiivisuudet käytettiin korvikkeita määrä ”reportteri solujen”, joka varmistettiin meidän lineaarisen kokeessa (Fig. 1A, 1 B). Tuloksemme osoittivat, että toimittaja solut kasvoivat selvästi nopeammin, kun oli ympätty kuolemaisillaan soluja kuin jos kylvetään yksin. Lisäksi tukisoluja säteilytetään 6 Gy oli suurinta kasvua edistäviä kyky kuin muut annokset tekivät, jossa ei säteilytetty syöttösoluja näkyvissä mitään tukitehtävänsä. Kasvainsoluissa säteilytetään suurempia annoksia 6 Gy, kasvua stimuloiva kyky pelkistettiin lisäämällä säteilytasoja (Fig. 1 C, 1D). Nämä havainnot ovat totta sekä HT29 ja Panc1 soluja.

aktivointi SHH signalointireitin korreloi positiivisesti Dying Cell stimuloidun Living kasvainsolukasvun

tutkia SHH signalointireitin aktivaatio liittyy stimulaatio kasvainsolujen kasvua kuolevat solut, teimme Western blot kokeissa kaksi syöpäsolulinjoissa, Panc1 (Fig. 2A) ja HT29 (Fig. 2B). Aktivoitu SHH signalointi vahvistettiin proteiinin tasot Shh ja Gli1 joka kvantitoitiin mittaamalla signaalin 19-kD ja 160 kD: n nauha, vastaavasti. Olemme havainneet, että tasot Shh ja Gli1 proteiinit olivat korkeammat 6 Gy säteilytetään syöpäsoluja kuin muut annokset käsitellään syöpäsolujen (Fig. 2C, 2D). Lisäksi kasvainsolujen säteilytetään suurempia annoksia 6 Gy, Shh ja Gli1 proteiinin tasot alenivat kanssa lisäys säteilyannos. On mielenkiintoista, että suuntaukset ekspressiotaso SHH signalointireitin oli samat taipumus kasvun stimulaation vaikutusta säteilytyksen jälkeen, jotka molemmat olivat suurimmat 6 Gy ja kapenevat pois yhä säteilytasoja.

. Expression profiilin muutoksia Shh ja Gli1 proteiinien Panc1 soluissa säteilytetään eri annoksilla ja havaittiin Western blot. B. Expression profiilin muutoksia Shh ja Gli1 proteiinien HT29 säteilytetään eri annoksilla ja havaittiin Western blot. C. suhteellinen intensiteetti Shh ja Gli1 proteiiniryhmänä Western blot- Panc1 soluissa säteilytetään eri annoksilla. D. suhteellinen intensiteetti Shh ja Gli1 proteiiniryhmänä Western blot- HT29 säteilytetään eri annoksilla. E. Lusiferaasin aktiivisuus Gli1 reportteri säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen Panc1 soluja. ** Edustaa

P

0,01. F. Lusiferaasiaktiivisuus on Gli1 reportteri säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen HT29. ** Edustaa

P

0,01.

edelleen vahvistaa aktivoinnin SHH signalointireitin syöttölaitteeseen soluissa, Panc1 ja HT29 syövän solut transdusoitiin lentiviruksen kuljettaa villin tyypin 8 × GBS lusiferaasireportterista tai mutatoitunut 8 x GBS lusiferaasireportterista kätkeminen pistemutaatio, joka poistetaan sitoutumisen Gli1. Solut tartunnan lentivirukselle valittiin 2 ug /ml puromysiiniä. Stabiilisti transdusoidut Panc1 ja HT29-soluja olivat käsittelemättömiä tai säteilytetään annoksella 6 Gy, ja sitten lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Tulokset viittasivat siihen, että suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus 6 Gy säteilytetään syöpäsoluja oli merkittävästi suurempi kuin ei-säteilytetty syöpäsolujen (

P

0,01), mikä osoittaa, että Gli1 transkriptiotekijän aktiivisuutta nostettiin 6 Gy säteilytetty syöpä solut. Tulokset, jotka havaittiin sekä Panc1 soluissa (Kuva. 2E) ja HT29 (Fig. 2F) olivat samanlaisia ​​ja yhdenmukaisia ​​tuloksia bioluminence kuvantamisen yllä.

SHH Signaling salpaajien esto Dying Kasvainsolun stimuloidun Living Kasvain Cell Growth

Koska merkittävästi säädelty SHH-reitin aktiivisuutta säteilytettyjä soluja, tutkimme onko manipulointi SHH reitin estäisivät tai edistää kuolee kasvainsolun stimuloidut elävien kasvainsolujen kasvua. Noin 2,5 × 10

5 6 Gy säteilytettyä Panc1 solut ympättiin 24 kuopan levyille väliaineessa, joka sisälsi Smo antagonisti (GDC-0449) 0,5 uM, 1 uM, 2 uM tai ajoneuvon hallinnan vastaavasti. 1000 Fluc merkitty elävien Panc1-solut ympättiin säteilytetyn lääkkeellä tai ilman käsitelty tukikerros. Kuten on esitetty kuviossa. 3A GDC-0449 vähentää Panc1 solujen kasvun annoksesta riippuvalla tavalla. Verrattuna kontrolleihin, jotka sisälsivät ajoneuvo, signaali kaivot, jotka sisälsivät 1 uM GDC-0449 tai 2 uM GDC-0449 väheni merkitsevästi (

P

0,05). Nämä havainnot viittaavat siihen, että GDC-0449 voi estää kuolee kasvainsolun stimuloidut elävien kasvainsolujen kasvua.

. GDC0449, prekliinisessä SHH estäjä, estää Panc1Fluc solujen kasvua indusoi kuolee Panc1 solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. * Edustaa

P

0,05. B. Gant61 estää Panc1Fluc solujen kasvun aiheuttama kuolee Panc1 soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. ** Edustaa

P

0,01. C. Cyclopamin estää HT29Fluc solujen kasvua indusoimaa kuolee HT29-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. * Edustaa

P

0,05, ** edustaa

P

0,01. D. Gant61 estää HT29Fluc solujen kasvua indusoimaa kuolee HT29-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. ** Edustaa

P

0,01. E. GDC0449 inhiboi HT29 Fluc solujen kasvua indusoimaa kuolee HT29-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm.

edelleen varmistamiseksi roolit SHH signalointi kuolevan kasvainsolun stimuloidut elävien kasvainsolujen kasvua, testasimme toisen Gli1 antagonisti (Gant61). Ehto oli identtinen edellä mainitun edellytys GDC-0449, lukuun ottamatta, että Gant61 pitoisuus oli joko 5 uM, 10 uM tai 20 uM. Havaitsimme samanlainen kasvu vähenee Gant61 käsitelty kuoppiin verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrollisyvennyksissä (

P

0,01, Fig. 3B). Kuitenkin Panc1 solut käsiteltiin toisen Smo-antagonisti (syklopamiinia) ei osoittanut vähentää solujen kasvua (tietoja ei esitetty).

Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin HT29. Noin 2,5 × 10

5 6 Gy säteilytettyä HT29 ympättiin 24 kuopan levyille väliaineessa tai ilman syklopamiinilla 2 uM, 5 uM tai ajoneuvon hallinnan vastaavasti, johon 1000 Fluc leimattu elävien HT29-soluja ympättiin. Verrattuna vehikkelikontrolliin käsitellyssä ryhmässä, syklopamiini vähentää HT29 solun kasvun annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3C). HT29-solut kasvatetaan auton hallinnan osoitti merkitsevästi enemmän lusiferaasivaikutusta kuin soluja kasvatettiin 2 uM syklopamiinilla (

P

0,05) ja 5 uM syklopamiiniin (

P

0,01).

lisäksi testanneet Gli1 antagonisti Gant61 (Fig. 3d) ja Smo antagonisti GDC-0449 (kuvio. 3E). Molemmissa tapauksissa havaittiin samanlaiset tulokset. Gli1 antagonisti Gant61 esti HT29 kasvuun kuolevan syöttösoluja merkittävästi. Kuitenkin ero hikkelikontrolliryhmään ja GDC-0449 hoidetuissa ryhmissä ei ollut merkittävä (

P

0,05).

Gli1 Knockdown by shRNA Vähentää Dying Kasvainsolun stimuloidun Living Kasvainsolun kasvu

vahvistivat lisäksi roolia SHH signaloinnin kuolee kasvainsolun stimuloidaan elävien kasvainsolujen kasvua käyttämällä shRNA ja pudotus Gli1 ilmentymistä syöttösoluja. HT29 ja Panc1 infektoimia soluja lentiviruksen kuljettavat Gli1 shRNA valittiin mediassa 2 ug /ml puromysiiniä, ja Western blot-analyysi Gli1 ilmaisua käytettiin tarkistaa oikea valinta. Proteiinin tasot Gli1 sekä Panc1 ja HT29 (Fig. 4A, 4B), olivat merkittävästi pienentyneet. Panc1 tai HT29 transduktio Gli1 shRNA tai scramble shRNA säteilytettiin 6 Gy ja käytettiin tukisoluja, vastaavasti. Kasvu Fluc leimatun elävien Panc1 tai HT29 ympättiin Gli1 pudotus feeder-solujen oli merkittävästi heikennetty osoituksena huomattavasti pienempi lusiferaasiaktiivisuudet kuopissa, joissa Gli1 pudotus Panc1 tai HT29 kuin kuopat sekoituskoodin shRNA transdusoitu Panc1 tai HT29 (

P

0,05) (Fig. 4A, 4B).

. Pelkistetty Gli1 proteiinin ilmentymistä Gli1 shRNA transdusoiduissa Panc1 solujen havaittiin Western blot (ylempi paneeli). Alennetun Panc1Fluc solujen kasvun kuolevan Gli1 shRNA transdusoidut Panc1 soluja. * Edustaa

P

0,05; mittakaavajana on 1 cm. B. Pienentynyt Gli1 proteiinin ilmentymistä Gli1 shRNA transdusoiduissa HT29 havaittiin Western blot (ylempi paneeli). Pelkistetty HT29Fluc solujen kasvun kuolevan Gli1 shRNA transdusoiduissa HT29. mittakaavajana on 1 cm.

SHH Signaling agonistit Aktivoi kasvainsolukasvun

vieressä tiedusteli jos SHH signalointireitin agonisti, SAG, joka vaikuttaa suoraan sitoutumalla loppupään tasoitettava, olisi edistää syöpäsolujen kasvua. Panc1 ja HT29 säteilytettiin 6 Gy ja siirrostettiin 24-kuoppalevyille kuten syöttölaitteet väliaineessa tai ilman 3 nM, 5 nM, 10 nM tai 100 nM SAG vastaavasti. SAG-hoito johti lisääntyneeseen reportteri solujen kasvun annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5A, 5B). Edelleen todentamiseksi saadut tulokset SAG, lisäsimme aktiivinen muoto Shh, eli yhdistelmä-DNA-N-terminaalisia fragmentteja Shh 600 ng /ml väliaineeseen. Tulokset viittasivat siihen, että rekombinantti N-terminaalinen fragmentti Shh merkittävästi parannettu kasvainsolujen kasvua kuolevan syöttösoluja verrattuna ajoneuvon ohjaus (

P

0,01) (kuvio. 5C, 5D).

. Aktivointi SHH signalointia SHH signaloinnin agonistin SAG parantaa Panc1Fluc solujen kasvua säteilytetty kuolee Panc1 soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. * Edustaa

P

0,05, ** edustaa

P

0,01. B. Aktivointi SHH signalointia SAG parantaa HT29Fluc solujen kasvua säteilytetty kuolee HT29-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. ** Edustaa

P

0,01. C. aktivointi SHH signalointia SHH signaloinnin agonistien, N-terminaalinen fragmentti Shh, parantaa Panc1Fluc solujen kasvua säteilytetty kuolee Panc1 soluja. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. * Edustaa

P

0,05. D. aktivointi SHH signalointia N-terminaalinen fragmentti Shh edistää HT29Fluc solujen kasvua säteilytetty kuolee HT29. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. * Edustaa

P

0,05.

SHH Signaling agonistit parantavat Living Reporter Cell kasvu puuttuminen säteilytetyn syöttösoluja

Koska Shh ja Gli1 ilmaisun kasvoi säteilytetty Panc1 ja HT29 ja SHH signaloinnin agonistien parannettu kuolee kasvainsolun stimuloidaan elävien kasvainsolujen kasvua, on oletettu, että tehostettu toimittaja solujen kasvua johtui SHH signaali vapautuu kuolemassa soluista, siten aktivoimaan SHH signalointireitille elävissä reportteri soluissa pitäisi myös aiheuttaa solujen kasvu. Jotta voidaan tarkistaa hypoteesia lisäsimme SHH signalointi agonistit SAG ja rekombinantti N-terminaalinen fragmentti Shh kuoppiin, jotka sisältävät Panc1 tai HT29 toimittaja yksin. Sekä SAG ja aktiivinen muoto Shh huomattavasti Panc1 tai HT29 reportterin solun kasvua (Fig. 6). Nämä havainnot viittaavat siihen, että SHH-signaali vapautettiin kuolevat solut johti reportteri solujen kasvua, koska aktivointi SHH väylän toimittaja soluissa.

. SHH signalointi agonisti SAG tehostaa Panc1Fluc solukasvun annosriippuvaisesti. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. ** Edustaa

P

0,01. B. SHH signalointi agonisti SAG tehostaa HT29Fluc solukasvun annosriippuvaisesti. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. * Edustaa

P

0,05, ** edustaa

P

0,01. C. Panc1Fluc solut käsiteltiin N-terminaalinen fragmentti Shh, osoittavat kasvun lisääntymiseen. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. * Edustaa

P

0,05. D. HT29Fluc solut käsiteltiin N-terminaalinen fragmentti Shh, osoittavat kasvun lisääntymiseen. Top: signaalin intensiteetin analyysi bioluminescence kuva; Pohja: edustaja bioluminescence kuvia; mittakaavajana on 1 cm. ** Edustaa

P

0,01.

Keskustelu

Kasvainsolulinja harvenneiden on keskeinen prosessi aiheuttaa kasvain Relapsi syövän kemoterapiaa tai sädehoitoa [13]. Uudelleenmetsitys elossa kasvainsolujen välillä voi esiintyä annoksen jakeet joko säteilyn tai kemoterapian voi johtaa hoidon epäonnistumiseen [14].