Krooninen sairaus

tiivistelmä

Muscle invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC, vaihe ≥T2) liittyy yleensä huonoon ennusteeseen, joka muodostaa toiseksi yleisin kuolinsyy virtsaelinten kasvaimia. Suuren molekyylipainon heterogeenisyyden merkittävää vaihtelua luonnonhistorian ja sairauksien lopputulos on havaittu. Tämä on myös viivästynyt käyttöönotto henkilökohtainen terapeuttisten, joten pitkälle virtsarakon syöpä lähes orpo taudin hoidon kannalta. Altered proteiinin glykosylaatio käännetty ilmentymistä sialyyli-Tn-antigeeni (STN) ja sen edeltäjä Tn sekä aktivoitumisen PI3K /Akt /mTOR-reitin syöpään liittyvä tapahtumat, jotka voivat pitää potentiaalia potilaalle kerrostuminen ja opastettu hoito. Näin ollen, takautuva suunnittelu, 96 virtsarakon kasvaimet eri vaiheissa (Ta, T1-T4) seulottiin STN ja fosforyloidun Akt-muotoja (Pakt), mTOR (pmTOR), S6 (PS6) ja PTEN, liittyvät aktivointi PI3K /Akt /mTOR-reitin. Meidän sarjassa ilmaus Tn oli jäljellä ja ei liity vaiheeseen tai lopputuloksesta, kun taas STN oli staattisesti korkeampi MIBC verrattuna ei-lihaksen invasiivisia kasvaimet (p = 0,001) ja niihin liittyvät laski syöpäspesifisessä eloonjäämisen (log rank p = 0,024). Kääntäen, PI3K /Akt /mTOR reitin välituotteiden osoittivat yhtäläinen jakautuminen ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC) ja MIBC eikä liittävät syöpää specif eloonjäämisen (CSS) missään näistä ryhmistä. Kuitenkin yli-ilmentyminen Pakt, pmTOR ja /tai PS6 sallittu erotteleva STN-positiivinen pitkälle rakkokasvaimista päin pahin CSS (p = 0,027). Lisäksi Coxin monimuuttuja regressio analyysi paljasti, että yli-ilmentyminen PI3K /Akt /mTOR-reitin proteiinit STN + MIBC oli itsenäisesti liittynyt noin 6-kertainen kuoleman riskiä syöpää (p = 0,039). Hiirillä edennyt pitkälle kemikaalien aiheuttamien virtsarakon kasvaimia jäljittelemällä histologisia ja molekyylitason luonne ihmisen kasvaimissa sitten hallinnoitava mTOR-estäjä sirolimuusi (rapamysiini). Tämä vähensi invasiivisia vaurioita ja, samanaikaisesti, ilmaus STN ja myös PS6, loppupään efektori PI3K /Akt /mTOR-reitin. Lopuksi STN havaittiin olevan markkeri huonon ennusteen virtsarakon syövän ja yhdessä PI3K /Akt /mTOR-reitin arviointi, jolla voidaan parantaa kerrostuneisuus edennyt sairaus. Eläinkokeet viittaavat siihen, että mTOR-reitin estäminen voisi olla potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa tämän erityisen alatyypin MIBC.

Citation: Costa C, Pereira S, Lima L, Peixoto A, Fernandes E, Neves D, et al. (2015) Epänormaali proteiini glykosylaatio ja Aktivoitunut PI3K /Akt /mTOR Pathway: Rooli Virtsarakon syövän Ennuste ja Kohdennettu Therapeutics. PLoS ONE 10 (11): e0141253. doi: 10,1371 /journal.pone.0141253

Editor: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ESPANJA

vastaanotettu: 28 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 06 lokakuu 2015; Julkaistu: 16 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Costa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Portugali Foundation for Science and Technology (FCT) Postdoctoral myöntää SFRH /BPD /66288/2009 (José Alexandre Ferreira), SFRH /BPD /101827/2014 ( Luis Lima), SFRH /BPD /85462/2012 (Rui Gil da Costa) ja PhD apurahoja SFRH /BD /103571/2014 (Elisabete Fernandes) ja SFRH /BD /111242/2015 (Andreia Peixoto). FCT on osarahoittaa Euroopan sosiaalirahasto (ESR) alle Human Potential Toimintaohjelma (POPH) alkaen kansallinen strateginen viitekehys (NSRF). Kirjoittajat myöntävät myös taloudellista tukea ICBAS-UP (Céu Costa ja Sofia Pereira) ja Portugalin Association of Urology /Pfizer palkinnon 2013. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelu käsikirjoitus.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on toiseksi tappavin genitourinaarinen kasvain ja aiheuttaa merkittävästi huonompi ennuste upon

muscularis proprialle

invasion [1]. Noin 20-30% hiljattain diagnosoitu tapaukset ovat lihas invasiivisia virtsarakon syöpien (MIBC, T2-T4 vaiheissa), kun taas 50% on ei-lihas- invasiivisia virtsarakon kasvaimet (NMIBC) korkea potentiaali edetä hyökkäystä. MIBC hoito sisältää cystectomy ja (neo) adjuvantti sisplatiini-kemoterapian hoito [2]. Kuitenkin merkittäviä eroja luonnonhistorian taudin ja hoitovaste välillä voidaan havaita kasvaimia identtisillä histologisia piirteitä, mikä niiden suurimolekyylipainoinen heterogeenisyys [3]. Lisäksi noin 50% tapauksista kehittyä etäpesäkkeiden 5 vuoden kuluessa, pakottaen tunnistaminen biomarkkerit avustamaan ennustettavuutta sekä kehittämään tehokkaampia kohdistettuja hoitomuotoja [4].

Vastatakseen tähän tarpeeseen, olemme hiljattain osoitettu lauseke ja syöpään liittyvän sialyyli-Tn-antigeeni (STN) on pieni mahdollinen sarja valitsemattomat virtsarakon syövän potilaille, [5]. STN on epänormaali translaation jälkeisen modifikaation, joka on tuloksena ennenaikaisen stop solukalvon proteiineja

O

-glycosylation jonka sialylaatiota Tn-antigeenin (kuvio 1A). Virtsarakon kasvaimet, STN se esiintyy pääasiassa pitkälle tapauksissa taas poissa useimpien huonolaatuista NMIBC [5]. Lisäksi ei ollut ilmaiseman normaalin uroteelin, ilmaiseva syöpää erityinen luonne [5]. Tutkimukset

in vitro

osoittivat, että STN ilmaisu omistetun virtsarakon syövän solut, joilla on suuri hyökkäys valmiudet [5] ja immunotolerogenic fenotyyppi, mahdollisesti suosii tauti levittämistä [6]. Muutoksia solunpintaproteiinille glykosylaatio on oltava osallisina aktivointiin solunsisäisten onkogeenisten signalointireittien [7], mukaan lukien fosfoinositidi-3 kinaasi (PI3K) /Akt-signalointireitin [8], joka on ajateltu olevan keskeinen rooli virtsarakon syövän kehittymisen . Nämä alustavat havainnot tukevat olettamusta, että STN ilmaisu voi olla keskeinen rooli taudin lopputulokseen, joka oikeuttaa syvempää tutkimusta. Useat tutkimukset viittaavat myös siihen, että Tn-antigeeni, joka on esiaste STN, voidaan myös osallisena onkogeenisten tapahtumien [7]; mutta mitään ei tiedetä ilmaus tästä glykaanin rakon kasvaimet.

A) edustus kalvon proteiinin

O

-glycosylation painottaen STN ilmentymiseen syöpäsoluja. Tämä on erittäin säännelty prosessi ratkaisevan tärkeitä proteiinin vakauden ja toiminta. Lyhyesti, juuri syntetisoidun proteiinit ovat

O

-glycosylated Golgin laitteessa, jonka ppGalNAcTs-välitteisen lisäämällä GalNAc-ryhmän ja Ser /Thr-tähteet. Tämä on peräisin Tn-antigeeni (GalNAc-O-Ser /Thr-proteiinin selkäranka), joka on yksinkertaisin O-glykaanin. Normaaleissa soluissa nämä ketjut pidennetään kautta lisäämällä peräkkäin muiden sokerien ensin CGALT-1: n ja muiden entsyymien kanssa. Tämä kulminoituu erittäin monimutkainen, heterogeenisiä ja pitkänomainen glykaanien usein lopetetaan ABO tai Lewis veriryhmän liittyviä antigeenejä (vasen kuva). Syöpäsoluissa Tn-antigeeni on välittömästi sialyloitumaan ST6GalNAc.I, peräisin STN antigeeni (Neu5Ac-GalNAc-O-Ser /Thr-proteiini selkäranka), mikä rajoitti entisestään ketjun pidentymisen (oikea kuva). Ilmaisu STN solun pinnalla vaikuttaa solu-soluadheesion ja syöpäsolun tunnustamista, joka suosii liikkuvuutta, invaasio ja immuuni paeta. B) Kaaviokuva PI3K /Akt /mTOR-reitin, joka on kaikkialle aktivoidaan rakkokasvaimista. Tämä on erittäin konservoitunut reitin säädellään pääasiassa erilaisia ​​solunulkoisia signaaleja, mukaan lukien mitogeeniset kasvutekijät, hormonit, ravinteet, solun energiataso, että stressiolosuhteissa. Nämä signaalit aktivoivat tyrosiini- reseptorikinaasit, jotka rekrytoivat PI3K, joka katalysoi membraaniin sitoutuneen PIP2 ja PIP3. Sitten Akt ja PDK-1 aktivoidaan sitoutumalla PIP3. PTEN ensisijaisesti defosforyloi PIP3 estäen signalointi etenemisen. Täysi Akt aktivointi vaatii kaksinkertaisen fosforylaatiota PDK-1 itse ja PDK-2 (ei esitetty). Akt fosforyloi mTOR suoraan tai voi myös inaktivoida TSC1 /TSC2 monimutkainen, estäen mTOR inaktivaatio. mTORC1 laukaisee solujen kasvua ja lisääntymistä fosforyloimalla eukaryoottitranslaatioon sääntelyviranomaisten, näiden joukossa p70S6 kinaasia (p70S6K tai S6K1), joka puolestaan ​​fosforyloi ribosomaalisen proteiinin S6 (PS6), ja eukaryoottitranslaatioon initiaatiofaktoria 4E-sitovan proteiinin 1 (4E-BP1 ). Proteiinin mTOR aktivoida sen signalointiryöpyn, sen täytyy muodostaa rapamysiini herkän kolmen komponentin kompleksin mTORC1. Avain PI3K /Akt /mTOR-reitin proteiinit Pakt, pmTOR ja PS6 tarkastellaan tässä tutkitaan korostavat oranssi ympyrä.

fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /Akt ja nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitit ovat yhteydessä toisiinsa signa- välttämätön virtsarakon solujen kasvua ja selviytymistä (kuvio 1 B). PI3K /Akt /mTOR tai mTOR polku yhdistää lukuisia solunulkoisia signaaleja säännellä alavirran signalointia ja proteiinisynteesiä, joka johtaa lopulta kilpailukykyinen kasvu etu, metastaattinen osaaminen, angiogeneesi, ja hoito vastus [9]. Signaalikaskadissa alkaa PI3K aktivaation solukalvon seuraa seriini /treoniini-kinaasi Akt solukalvon translokaation ja aktivoinnin. Parhaiten tutkittu alavirran substraatti Akt on seriini /treoniini-kinaasi mTOR, jonka alavirtavaikuttajainhibiittorit on S6-kinaasi-1 (S6K1). Erityisesti osajoukko mTOR reitin muutosten on osoitettu esiintyvän virtsarakon syövän, kuten mutaatiot

PIK3CA

geenin, joka huipentuu lisääntynyt mTOR signalointi ja virtsarakon syövän solujen resistenssin apoptoosia [10]. Lisäksi farmakologinen tai biokemiallinen esto PI3K reitin rajusti invasiivista kapasiteetti virtsarakon syöpään solulinjoissa. Lisäksi yli puolet ensisijaisesti ihmisen rakkokasvaimista läsnä korkea Akt fosforylaation ja poikkeava aktivaatio tämän reitin on ehdotettu vaikuttavan hyökkäys [11]. Toinen tapahtuma, joka vaikuttaa mTOR-reitin aktivaatio rakkokasvaimista liittyy menetys tuumorisuppressorin PTEN (fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa kymmenen) toiminto [12]. PTEN normaalisti estää aktivoitumisen PI3K /Akt /mTOR reitin vastavaikuttamalla PI3K ja estää aktivoinnin Akt ja PDK-1. PTEN toimii myös säätelemään kemotaksista ja solun liikkuvuus, mikä edistää kasvaimen invaasio [13]. Yhteenvetona, on olemassa todisteita siitä, että kattava arviointi PI3K /Akt /mTOR-reitin liittyviä proteiineja voidaan pitää merkittäviä mahdollisuuksia arvon potilaan kerrostumista. Lisäksi monet prekliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia tukevat että mTOR-inhibiittorit, kuten sirolimuusi (rapamysiini) ja niiden johdannaiset voivat parantaa syövän hoidossa [13,14].

Näiden havaintojen perusteella oletamme, että Tn ja /tai STN voi synergistisesti kanssa mTOR polku ajaa virtsarakon syövän etenemisessä. Sellaisenaan, olemme kiinnittäneet arvioimiseksi ilmentymisen STN ja liittyvien proteiinien aktivoituminen PI3K /Akt /mTOR-reitin aktivaation virtsarakon kasvaimia eri vaiheissa. Arvioimme, että yhdistelmä solunulkoisen ja solunsisäisen onkogeenisten tapahtumat voivat parantaa potilaan kerrostuminen ja tarjota oivalluksia uusia terapeuttisia. Lisäksi olemme arvioineet vaikutusta sirolimuusia kemikaalien aiheuttamien urothelial hiirissä, harkitaan luominen perustelut tehokkaampaa virtsarakon syövän hoitomuotoja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Tämä työ liittyy kokemuksia tuumorinäytteissä potilaiden diagnosoitu virtsarakon syöpä Portugalin Instituten Syöpätautien Porton. Kaikki toimenpiteet suoritettiin sen jälkeen, kun potilaan kirjallinen lupa ja hyväksynyt eettinen komitea Portugali syöpäinstituutti-Porto. Kaikki kliinis tiedot on saatu potilaiden kliiniset tiedot.

Siihen liittyy myös eläinkokeita. Kaikki toimenpiteet, joissa eläimet tehtiin mukaisesti Euroopan direktiivin 2010/63 /EU. Aikana tämän tutkimuksen, eläimet ruokittiin

halun

standardoituja ruoan (Tecklad Global Diet, Harlan, Espanja). Seuraava protokolla hyväksyi Portugalin eettinen komitea eläinten koe (Direção Geral de Veterinaria, hyväksyntä ei. 520/000/000/2003). Kaikki hiiret käytettiin kokeeseen totutettiin yhden viikon ajan tavanomaisissa laboratorio-olosuhteissa ennen kokeita. Ne sijoitettiin satunnaisesti ryhmissä 4-5 muovisissa häkeissä, kova haketta vuodevaatteet. Eläimiä pidettiin huoneessa, jossa kontrolloidussa lämpötilassa 23 ± 2 ° C, 12 tunnin valo /pimeä sykli ja 55 ± 5% kosteus. Eläinten juominen liuokset vaihdetaan kerran viikossa tai tarvittaessa aikaisemmin, ja tilavuus humalassa tallennettiin. Weekly ruoan saanti oli myös huomattava. Kaikki hiiret seurattiin koko kokeen merkkejä hätä ja painonlaskua. Eläimet lopetettiin 0,4% natriumpentobarbitaalilla (1 ml /kg, vatsaonteloon).

Väestö

Tämä tutkimus suoritettiin retrospektiivinen sarjassa 96 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut rakkokasvaimista saatu alkaen arkistoitu parafiiniblokit at Portugalin syöpäinstituutti-Porto (IPOP), Portugali. Rakkokasvaimista poimittiin 82 miestä ja 14 naista, joiden ikä 38-92 vuotta (mediaani 69,5 vuotta), myönsi ja hoidettiin IPOP vuodesta 2005 vuoteen 2007. Neljäkymmentä seitsemän tutki olivat histologisesti luokiteltu NMBIC (Ta ja T1) ja 49 invasiivisia vaurioita (T2-T4). Kuusitoista oli huono laatu ja 80 olivat korkealaatuista kasvaimet, mukaan vuoden 2004 WHO luokitteluperusteita. Lisäksi karsinooma

in situ

(CIS) löytyi samanaikaisesti vuonna 20,8%: lla potilaista. Keskimääräinen seuranta aika oli 45 kuukautta (1-134 kuukautta). Cystectomy tehtiin 64 potilaalla (66,7%), kun taas toinen 32 (33,3%) toimitettiin höyläysleikkaus. Imusolmukkeiden suoritettiin noin 47%: lla potilaista ja näistä 37% esittelyyn etäpesäke. Viisikymmentäneljä (56,3%) kasvaimet olivat ensisijainen ja 42 (43,7%) oli toistuvia kasvaimia. Vuodesta toistuva kasvaimia, 38% ei ollut aikaisemmin hoitoa, 27% hoidettiin Mitomicin C, 11% BCG ja 19% toimitettiin molemmille hoitoja. Lisäksi 5% näistä potilaista hoidettiin neoadjuvanttikemoterapian ennen cystectomy. Taulukossa 1 on yhteenveto kliinis tiedot.

Syöpä-erityisiä eloonjäämisen (CSS) määriteltiin välinen aika kasvaimen poisto leikkauksella ja joko potilaan kuoleman syövän tai viimeisen seurantatiedot. Kaikki toimenpiteet suoritettiin sen jälkeen, kun potilaan tietoisen suostumuksen ja hyväksynyt eettinen komitea IPO-Porto. Kaikki kliinis tiedot on saatu potilaiden kliiniset tiedot.

immunohistokemia

ilmauksia STN antigeenin, sen esiaste Tn, ja fosforyloitu muodot Akt (Pakt), mTOR (pmTOR), S6 ( PS6) ja PTEN virtsarakon kasvaimia käsiksi immunohistokemialla käyttämällä avidiini /streptavidiini peroksidaasi menetelmällä, kuten ovat kuvanneet Ferreira et ai. [5]. Tiedot primaaristen vasta-aineiden ja laimennoksia käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Immunoreaktiivisuus paljastettiin käyttäen diaminobentsidiiniä (DAB, Thermo Scientific LabVision) kromogeenina ja leikkeet vastavärjättiin Harrisin hematoksyliinillä. Negatiiviset kontrollit tehtiin korvaamalla primäärinen vasta-aine, jossa 5% naudan seerumin albumiinia (BSA). Positiiviset kontrollit tunnettu positiivinen kudosten antigeenejä tutkittavana.

immunohistokemia pisteytystä ihmisen kasvaimista

immunovärjättiin kohdat arvioitiin kaksinkertaisen sokeasti valomikroskoopilla kaksi riippumatonta tarkkailijaa (CC ja SP) ja vahvistanut kokenut patologi (TA). Disaccording lukemat analysoitiin uudelleen käyttäen kaksipäinen mikroskooppi (Olympus BX46; Olympus), ja päästiin. Puolikvantitatiivista lähestymistapa perustettiin maalaamaan immunohistokemiallinen merkinnät perustuvat laajuudesta ja intensiteetti värjäys.

Koska puuttuminen Tn ja STN terveellistä uroteelin [5], kasvaimet luokiteltiin positiivisiksi näistä antigeenit, kun kalvo ja /tai soluliman immunoreaktiivisuus havaittiin yli 5%: n kasvain, kuten on kuvattu Ferreira et ai. [5,15]. Pakt, pmTOR, PS6 ja PTEN ilmaisuja pisteytettiin mukaan värjäytymisintensiteettiä (heikko-1 piste, kohtalainen-2 pistettä, voimakas-3 pistettä) kerrottuna positiivisten solujen prosenttiosuuden (0-5% -0 pistettä; 5 -25% -1 kohta; 25-50% -2 pistettä; 50-75% -3 pistettä; 75-100% -4 pistettä). Perustuen ehdottama luokitus Nishikawa et al. [16], kasvaimet, joiden pistemäärä 6 pidettiin negatiivinen, kun taas ne, joilla on score≥6 luokiteltiin positiivinen (yli-ilmentymisen). Pakt arvioitiin perustuu ydin- immunoreaktiivisuus, pmTOR ja PS6 perustuvat soluliman ilmaisun ja PTEN molemmilla soluliman ja tuman värjäytymisen, ehdottivat muita julkaisuja [17,18].

Eläinkokeet sirolimuusiin ja immunohistokemia pisteytys

histologiset osissa Imprinting Ohjaus alue (ICR) hiirillä N-butyyli-N- (4-hydroksibutyyli) nitrosamiini (BBN) aiheuttaman virtsarakon vaurioita, jotka johtuvat aiempien työstä vaikutuksista sirolimuusin virtsarakon syöpään [19 ], valittiin tätä tutkimusta varten. Lyhyesti, neljän viikon ikäisiä urospuolisia ICR-hiiriä (25 g; Harlan, Barcelona, ​​Espanja) jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään, kuten kuvattu yksityiskohtaisesti edellisessä julkaisussa [18]. Ryhmä 1 (n = 6) sisältyvät hiiret altistettiin 0,05% BBN: ää varten 12 viikkoa ja sen jälkeen vesijohtovettä 8 viikkoa (yhteensä 20 viikkoa). Ryhmä 2 (n = 7) sisältyvät hiiret, joita käsiteltiin 0,05% BBN ratkaisu kaksitoista viikkoa, ylläpidetään vesijohtovedellä vielä viikon, ylläpitäjä vatsaonteloon mTOR-estäjän sirolimuusia (1,5 mg /kg, Wyeth) viitenä päivänä viikossa kuuden peräkkäin viikkoa, eli kunnes 19

th viikko, jota seurasi toinen viikko vesijohtovettä (yhteensä 20 viikkoa). Ryhmä 3 (n = 6) sisältyvät hiiret altistettiin 0,05% BBN: 12 viikon ajan sen jälkeen vesijohtovettä 11 viikon ajan (yhteensä 23 viikkoa). Ryhmä 4 (n = 7) sisältyvät hiiret, joita käsiteltiin 0,05% BBN ja sirolimuusi, kuten on kuvattu ryhmän 2, mutta jossa on altistuminen vesijohtovettä jälkeenpäin 3 viikkoa (yhteensä 23 viikkoa). Ryhmä 3 ja 4 luotiin arvioimaan mahdollisuutta myöhään uusiutumisen ja /tai molekyylien muutokset johtuvat pitkäaikaisesta selviytymistä. Kaikki menettelyt suoritettiin mukaisesti Euroopan direktiivin 2010/63 /EU. Aikana tämän tutkimuksen, eläimet ruokittiin

halun

standardoituja ruoan (Tecklad Global Diet, Harlan, Espanja). Histologinen aiheuttamien muutosten näissä kokeissa mukana sekä esineoplastiset ja uudisvaurioiden invasiivista potentiaalia ja invasiivisia kasvaimia, kuten kuvataan yksityiskohtaisesti Oliveira et al. [18]. Tässä vauriot korkea invasiivisia potentiaalin ja lihasten invasiivisia kasvaimia seulottiin STN ja PS6 immunohistokemiallisesti, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti ihmisen kasvaimista, koska käytetyt vasta-aineet ovat reaktiivisia sekä ihmisten ja hiirillä. Voimakkuutta ja laajentaminen Immunovärjäyksen otettu huomioon pisteet ilmentymisen antigeenejä, kuten on kuvattu edellisessä osiossa. Rakko vauriot ja immunovärjäys arvioitiin kaksinkertaisen sokeasti kaksi riippumatonta tarkkailijaa (CC ja SP) ja vahvistanut kokenut eläinlääkärin patologi (RMGC).

Tilastollinen

Tilastotiedot analyysi suoritettiin IBM Statistical Package for Social Sciences-SPSS for Windows (versio 20.0). Chi-square analyysiä käytettiin vertaamaan kategorisen muuttujia. Kaplan-Meier eloonjäämiskäyrien käytettiin arvioimaan korrelaatiota STN ilmaisun ja syöpää erityisiä eloonjäämisen (CSS) ja verrattiin käyttämällä log-rank-testi. Lisäksi Coxin monimuuttuja regressioanalyysi suoritettiin arvioi yksittäisen vaikutusta arvioidaan markkereiden potilaan selviytymisen ja sopeutua mahdollisten sekoittavien tekijöiden (muuttujia, jotka voivat vaikuttaa CSS NMIBC ja MIBC potilasta). Korrelaatio PI3K /Akt /mTOR-reitin molekyylien suoritettiin käyttäen Spearman rho testiä.

Tulokset

Altered proteiinin glykosylaatio, käännetty ilmaus STN-antigeenin ja sen esiaste Tn, PI3K /Akt /mTOR-reitin molekyylejä (Pakt, pmTOR, PS6), ja PTEN inaktivaation, ovat keskeisiä piirteitä rakkokasvaimista. Tässä olemme kiinnittäneet kattava analyysi näiden molekyylien muutosten sarjassa virtsarakon syöpäpotilaiden eri vaiheissa taudin, suunnittelee biomarkkerit köyhien syöpää erityisiä selviytymisen.

aineisto koostui 47 NMIBC ja 49 MIBC potilaat, kuten osoitti taulukossa 1. kuvion 2, NMIBC esitteli korkeamman syöpäspesifisessä eloonjäämisen (CSS, keski CSS: 119 kuukautta) kuin MIBC (potilaiden keski CSS: 43 kuukautta, log rank, p 0,001). Nämä tulokset osoittivat, että meidän sarjassa heijastuu luonnollisen taudin ja korosti merkittävästi alhaisempi CSS MIBC verrattuna NMIBC tapauksiin. Siksi erityistä kiinnostusta asetettiin tunnistamisessa biomarkkereita myöhäisessä vaiheessa tauti perustuu vertailuun NMIBC ja MIBC.

Kaplan-Meier-analyysi osoittaa CSS NMIBC (Ta ja T1) ja s MIBC (T2 , T3 ja T4). Vertailu suoritetaan log-rank-testiä (p 0,001); + Sensuroitu NMIBC potilaita; ⧫ sensuroitu MIBC potilailla.

Tn ja STN-antigeenin ilmaisuja virtsarakon syövän

Tn-antigeeni havaittiin noin 10% NMBC ja MIBC (taulukko 2) ja sen ilme oli jäljellä , ei ylitä 5%: n kasvaimen alueelle ja ilman määriteltyjä kuvio. Toisaalta, STN-antigeeni havaittiin noin 60% tutkituista virtsarakon kasvaimet, joka on sopusoinnussa aikaisempien havaintojemme kanssa [5]. Antigeeni pääasiassa ilmaistiin solukalvon, vaikka sytoplasminen värjäys voidaan myös havaita. STN antigeeni esitteli polttoväli lauseke, joka ei ylittänyt 30%: n kasvain alueen suurimman positiivisen tapauksissa riippumatta niiden histologista alkuperää. Stn lähinnä ilmaisseet dedifferentoituneiden oleviin soluihin näytetään

lamina propria

(T1; 60%) ja

muscularis propria

(≥ T2; noin 60-90%) invaasio; päinvastoin prosenttiosuus positiivisen Ta oli pienempi kuin 30% (

p

0,001; kuvio 3A). Vaikka ilman tilastollista merkittävyyttä, Ta kasvaimet STN positiiviset solut olivat pääasiassa läsnä pinnallinen kasvain kerrokset pois aluksista. Vastaavasti STN positiivisten solujen T1 kasvaimissa (kuvio 3B) havaittiin liittyvän ja /tai tunkeutumaan Tyvisolukerroksessa (kuvio 3B), kun taas MIBC näitä soluja löytyy useimmiten hyökkäyksen rintamilla (kuvio 3B) ja tunkeutuvat ja /tai sisällä aluksia, mikä viittaa rooli hyökkäyksen ja tautien leviäminen. Vahvistaminen Näiden havaintojen läsnäolo STN antigeenin oli tilastollisesti korkeampi MIBC verrattuna NMIBC (

p

= 0,001, taulukko 3).

(A) jakelu STN negatiivisia ja positiivisia kasvaimia pitkin eri vaiheissa virtsarakon syövän; (B) edustavat kuvat STN värjäyksen NMIBC ja MIBC. Vasen-NMIBC osoittaa vallitsevana STN positiivisten solujen pintakerroksiin, poispäin fibrovaskulaarisen tukea; Huomaa alukset ilman positiivisia soluja. Oikea-MIBC osoittaa hyökkäyksen edessä STN positiivisesti värjäytyneiden solujen; Huomaa positiiviset stn urothelial solujen alukset (nuoli), mikä viittaa mahdollinen osallistuminen etäpesäkkeiden.

PI3K /Akt /mTOR väylän virtsarakon syövän

arviointi PI3K /Akt /mTOR /S6 reitin tehtiin käyttäen vasta-aineita aktiivista fosforyloidun Akt-muotoja (Pakt), mTOR (pmTOR), ja S6 (PS6). PTEN, että säätelee negatiivisesti Akt signalointia, arvioitiin myös.

Pakt havaittiin sekä sytoplasmassa ja tumassa. Vuonna NMIBC tapauksissa useilla erilaisilla alueilla intensiteetti ilmaisun havaittiin (kuvio 4A), joka osoittaa heterogeeninen malli, joka ei ollut ilmeistä MIBC (kuva 4B). Lisäksi strooman solut MIBC positiivisia tapauksia näytti parannetun värjäytymisen intensiteetti pääasiassa lähialueilla kasvain. pmTOR immunoreaktiivisuus oli soluliman, ja satunnaisia ​​tapauksia, ydin-. Vuonna uroteeliin kanssa näennäinen normaali histologia pmTOR ilmentyminen rajoittui pinnallinen solukerroksissa. Vuonna NMIBC pmTOR ilmentyminen jakautuu tasaisesti useita kerroksia urothelial soluja, vaikka oli voimakkaampi värjäytymistä pintakerroksiin (kuvio 4C). Lisäksi useat alueet vaihtelevalla värjäytymisen intensiteetti havaittiin, ilmaiseva heterogeeninen ilme. Vuonna MIBC positives tapauksissa pmTOR ilme oli polttoväli ja heterogeeninen (kuvio 4D). PS6 immunoreaktiivisuus oli pääasiassa sytoplasmista. Vuonna NMIBC PS6 ilmentyminen todettiin kaikissa pintakerroksiin, niin sateenvarjo ja erilaistuneita soluja (kuvio 4E). Immunoreaktiivisuus PS6 vaihteli kasvainsoluja. Vuonna MIBC PS6 esitti hajanainen ilme kasvaimen koko alueelle, on enemmän läsnä tyvi- ja mitoosi soluissa (kuvio 4F). Useita positiivisia tapauksissa havaittiin lisääntynyt PS6 värjäyksen intensiteetin hyökkäyksen edessä sekä PS6 ilmentyminen kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja endoteelisolujen.

A ja B) Pakt ydin- ja sytoplasmaattinen ilmaisun NMIBC (A) ja MIBC (B) . Vuonna NMIBC tapauksissa Pakt esitti heterogeeninen kuvion erilaisia ​​alueita voimakkuuden ilmaisun. Vuonna MIBC stroomasolut pääasiassa lähialueilla kasvain osoitti korkeampaa ilmaisua. C ja D) pmTOR sytoplasmista ekspressiota NMIBC (C) ja MIBC (D). Vuonna NMIBC pmTOR ilmaistiin poikki useita kerroksia, vaikka oli voimakkaampi värjäytymistä pinnallinen niistä. Vuonna MIBC positiivinen tapauksissa pmTOR ilme oli keskipiste. E ja F) PS6 sytoplasmaattinen ilmaisua NMIBC (E) ja MIBC (F). Vuonna NMIBC PS6 ilmentymistä havaittiin kaikissa pintakerroksiin sekä sateenvarjo ja erilaistuneita soluja. Vuonna MIBC immunoreaktiivisuus oli hajanainen, mutta enemmän läsnä tyvi- ja mitoosi soluissa. PS6 ilme oli suurempi hyökkäyksen edessä ja kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja endoteelisolujen. G ja H) PTEN soluliman ja ydinvoiman ilmaisuja NMIBC (G) ja MIBC (H). PTEN ilmentyminen oli korkeampi NMIBC verrattuna MIBC.

Kun otetaan huomioon laajentaminen värjäytymisen ja sen voimakkuus, 62/94 (66%), 33/96 (34%) ja 45/95 ( 47%), virtsarakon kasvaimet pidetään positiivisena Pakt, pmTOR ja PS6, vastaavasti. Spearman rho testi osoitti, että Pakt, pmTOR, PS6 ilmaisuja merkittävästi korreloi (P 0,05) riippumatta kasvaimen vaiheen, jolloin mukaisesti täysin aktiivinen reitti. Lisäksi huolimatta histologinen eroista, nämä merkit esitetään yhtä jaettu niitä NMIBC ja MIBC eikä voinut liittyä lihasten invaasiota (taulukko 3).

Toisaalta, 37/92 (40%) ja kasvaimia pidetään positiivisena PTEN. PTEN on ilmaistu sytoplasmassa ja tumassa samojen solujen, mutta alempi jatke ilmentymisen MIBC (33%, kuvio 4G) verrattuna NMIBC (83%; kuvio 4H). Lisäksi PTEN-negatiivinen fenotyyppi merkitsevästi liittyy lihasten invaasiota (Ta ja T1; p 0,001, taulukko 3), jotka voivat vaikuttaa ylläpitää aktiivista PI3K /Akt /mTOR /S6 reitin näissä tapauksissa.

Tn, STN, PI3K /Akt /mTOR polku ja syöpä-erityisiä Survival

Kaplan-Meier-analyysi käytettiin arvioimaan assosiaatioita osoitettu biomarkkereiden ja syöpää erityinen potilaiden selviytymiseen. Havaitsimme, että potilaat otetaan STN ilmentäviä kasvaimia oli pienempi CSS, riippumatta niiden vaiheen (p = 0,024; Kuva 5A). Tämä havaittiin myös arvioitaessa NMIBC yksin (p = 0,020; Kuva 5B). Vielä tärkeämpää on, joukossa NMIBC, STN ilmentäviä T1 kasvainten esitetään pienempi CSS kuin syöpäkasvain (p 0,05). Lisäksi Coxin monimuuttuja regressioanalyysiä säätää mahdollisten sekoittavien tekijöiden eli ikä, sukupuoli, vaihe, laatu, toistuminen tila, läsnäolo samanaikainen CIS suoritettiin. Huomasimme, että STN on itsenäinen prognostinen markkeri pahin CSS (HR = 11,836; 95% CI: [1,063-131,7]; p = 0,044). Erottuva STN positiivinen Tn, Pakt, pmTOR ja PS6 kasvaimia ei todettu eroja CSS verrattuna negatiiviseksi leesioita, riippumatta heidän vaiheessa. Olemme myös havaittu, että potilaat kätkeminen PTEN-syöpäkasvain oli pienempi CSS (p = 0,015, Kuva 6). Lisää tutkimuksia tarvitaan määrittää, jos puute estävä vaikutus PTENin yli PI3K /Akt /mTOR voi selittää näitä havaintoja.

Kaplan-Meier-analyysi osoittaa yhdistyksen välillä STN ja CSS: (A) kaikki tutkittu virtsarakon syöpä potilaat; (B) NMIBC potilailla. Vertailu suoritetaan log-rank-testi (A: p = 0.024; B: p = 0,020); + Sensuroitu stn syöpäkasvain; ⧫ sensuroitu stn positiivisia kasvaimia.

Kaplan-Meier-analyysi osoittaa vaikutus CSS PTEN ilmentymisen kaikissa tutkittu virtsarakon syöpäpotilailla. Vertailu suoritetaan log-rank-testi (p = 0,013); + Sensuroitu PTEN syöpäkasvain; ⧫ sensuroitu PTEN positiivisia kasvaimia.

Näiden havaintojen perusteella ja joilla pyritään parantamaan ennusteen arvioinnissa STN yhteydessä myöhäisessä vaiheessa tauti (MIBC), olemme kattavasti integroineet tiedot STN ja PI3K /Akt /mTOR-reitin biomarkkereita. Kuvion 7, käyttöönotto PI3K /Akt /mTOR-reitin molekyylien sallittu erotteleva STN positiivinen MIBC kasvaimista huonoin CSS (p = 0,027). Lisäksi Coxin monimuuttuja regressioanalyysiä (säädetty ikä, vaiheessa toistuminen tila, läsnäolo samanaikainen CIS ja etäpesäkkeiden) paljasti, että läsnä oli PI3K /Akt /mTOR-reitin molekyylien STN + MIBCrtä itsenäisesti liittyy noin 6-kertainen kuoleman riskiä syöpä (HR = 5,662; 95% CI: [+1,093-29,323]; p = 0,039). Nämä havainnot viittaavat siihen, ensimmäistä kertaa, että yhdistelmä STN ja mTOR polku biomarkkerit voidaan pitää mahdollista parantaa kerrostuneisuus pitkälle rakkokasvaimista; kuitenkin vahvistus suurempia sarjassa on pakollista.

Kaplan-Meier-analyysi osoittaa yhdistyksen välillä Pakt, pmTOR ja PS6 ilmaisuja CSS STN kasvaimia MIBC: Vertailu suoritetaan log-rank-testi (p = 0,027); + Sensuroitu Pakt ja pmTOR ja PS6 syöpäkasvain; ⧫ sensuroitu Pakt ja /tai pmTOR ja /tai PS6 kasvainten.

esto PI3K /Akt /mTOR-reitin eläinmalleissa

BBN aiheuttama hiirten virtsarakon kasvaimia matkii histologia ja molekyylitason luonne ihmisen syövissä [20,21], seulottiin STN ja PS6, loppupään efektori mTOR kautta. Havaitsimme ei STN ilmaisun terve hiiret uroteelin mukaisesti aiemman huomautuksen terveen ihmisen virtsarakon [5].