Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä sääntelyn RNA: ita, jotka vaikuttavat estämällä käännös ja lisäämällä hajoamisen kohde selostukset. MiRNA on kriittinen rooli monissa biologisissa prosesseissa kuten kehitys- ja erilaistumista ja monet tutkimukset ovat osoittaneet, että suuria muutoksia miRNA tasoilla esiintyvät syöpää. Koska miRNA hajoavat tavoite viestejä, käytimme tämä ominaisuus kehittää uusi laskentamenetelmä pyritään määrittämään todellinen biologinen aktiivisuus miRNA muunnelmia geenien ilmentyminen. Käyttäen menetelmän täällä, me määrällisesti miRNA toimintaa papillaarinen kilpirauhassyövän ja rintasyövän, ja löysi vahvan ja erottuva signaali voimistuvan maailmanlaajuisen miRNA aktiivisuutta, upotettu liittyvien geenien ilmentymisen mittaukset. Mielenkiintoista on, olemme huomanneet, että näillä kahdella syöpien, miRNA aktiivisuus kasvoi maailmanlaajuisesti, ja se liittyy maailmanlaajuisen downregulation miRNA kohdegeenien. Tämä downreguation of miRNA säännellyn geenien on erityisen huomattava geenejä kuljettavien useiden kohdesivustoissa miRNA. Niistä miRNA-tukahdutettu geenejä, löysimme merkittävän rikastamisen tunnettujen tuumorisuppressorien, mikä viittaa siihen, että lisääntynyt miRNA aktiivisuus oli todellakin kasvaimia synnyttäviä.

Citation: Israel A, Sharan R, Ruppin E, Galun E (2009) lisääntynyt MicroRNA vaikutus ihmisen eri syöpätyyppeihin. PLoS ONE 4 (6): e6045. doi: 10,1371 /journal.pone.0006045

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 helmikuu 2009; Hyväksytty: 26 toukokuu 2009; Julkaistu: 25 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Israel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AI on tukee avustusta Fondation Erich et Regine Loewenthal. EG tukee Israelin tiede-, kautta apurahan National Gene Therapy tietokeskus ja kautta EY antaa LSHB-CT-2004-512034 (MOLEDA), LSHB-CT-2008-223317 (LIV-ES), ja LSHB -CT-2005-018961 (INTHER). EG tukee myös avustusta Blum, Harold Grinspoon, Barbara Fox Miller tukeen, Horowitz ja Wolfson Foundations. RS ja ER tukena on tutkimus avustusta ministeriön Science and Technology, Israel. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA ovat yksijuosteisia ei-koodaavan RNA-molekyylejä noin 22 nukleotidin, joka muodostaa parin RNA: iden (mRNA: t), joka kantaa komplementaarinen sekvenssi [1]. MikroRNA sitoutumaan kohteena oleviin mRNA: iden sisällä RNA-indusoidun hiljentäminen kompleksi (RISC), joka sisältää jäsen Argonaute proteiinin perheen. Tämä sitoutuminen estää käännös ja kiihdyttää hajoamista kohdennetun mRNA: iden [2]. Viime vuosina miRNA on osoitettu olevan keskeisessä asemassa geeniekspression säätelyssä, ja on olemassa näyttöä siitä, että miRNA ovat mukana Keski biologisissa prosesseissa, kuten kehitys-, organogeneesin, kudosten erilaistumiseen, solusyklin ja aineenvaihdunta [3 ] – [5]. Merkillistä, ajallisen ja ilmaus miRNA on ominaista kudosten ja kehitysvaiheet, ja useat tutkimukset ovat osoittaneet yhteyden miRNA ilmaistu erityisesti kudostyypeissä ja sääntely kudosspesifisiä geenejä [6].

Muutokset miRNA ilmaisu on osoitettu esiintyvän syövän [7] kuitenkin luonteesta ja vaikutuksesta suurin osa näistä muutoksista ovat edelleen epäselviä. Erityisesti ristiriitaisia ​​havaintoja olemassa yli kysymys siitä miRNA tasot maailmanlaajuisesti vähentynyt tai lisääntynyt syövän. Aikuinen miRNA on osoitettu joissakin tutkimuksissa on vähentynyt syövän [8], kun taas muut tutkimukset ovat havainneet säätelyä miRNA monissa kasvaimissa [9]. Yksi mahdollinen selitys näille poikkeavia havaintoja voi olla eroja kasvaintyypit, kudokset analysoidaan, tai jopa mittausmenetelmiä. Toinen otaksuttu selitys on, että vapauttaminen että miRNA läpikäyvät syövän on monimutkainen prosessi. Eli tulos miRNA asetuksen geenien ilmentymisen riippuu paitsi tasoilla miRNA, vaan myös lukuisiin muihin tekijöihin, jotka välittävät vaikutus miRNA niiden kohdegeenien, kuten komponentteja RISC kompleksin. Näin ollen, saatavuus nämä tekijät voivat selvästi säädellä yleistä vaikutusta miRNA vaikutus niiden kohdegeenien, ja, sen seurauksena, tarjota lisää palautetta tasoilla miRNA itse. Tällainen maailmanlaajuinen muunnelmia miRNA aktiivisuuden ehdottaneet tutkimuksia, jotka ovat osoittaneet, että Argonaute2 (

EIF2C2

) geeni, joka on sisällytetty RISC monimutkainen, usein kahdennettu kasvaimissa [10]. Koska tämä geeni ei ole suoraan mukana miRNA biogeneesissä, voisi olettaa, että tämä geeni on kahdennettu, hajoaminen miRNA kohdegeenien kasvaisi, joihin ei liity kasvua miRNA tasoilla. Tästä syystä yritimme määrittää kokonaisvaikutus miRNA niiden kohdegeenien, niiden

biologista aktiivisuutta

, ja suunniteltu menetelmä tämän vaikutuksen mittaamiseksi suoraan liittyvä tavoite geeniekspressiotasot.

Menetelmämme, jota kutsutaan mirabelleluumu- (MicroRNA Activity perusteella Expression Levels), perustuu siihen havaintoon, että miRNA tiedetään nopeuttaa hajoamista tavoitteensa selostukset, ja että tämä toiminta jättää allekirjoitus mRNA-tasoja niiden kohdegeenien. Pieneneminen ekspressiotasot mRNA kuljettaa sitoutumiskohdan varten miRNA lajeja voidaan havaita sen transfektio samankaltaisella miRNA [11]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet selvän korrelaation miRNA jotka ovat erittäin ilmaistaan ​​tietyssä kudoksessa ja downregulation niiden tavoite selostukset [6], [12], [13]. Siten siirtymä ilmentymisen joukko geenejä kohdennettuja jonka miRNA näytteessä on osoitus siitä, että biologinen aktiivisuus vastaavan miRNA lajia muutokset tässä näytteessä.

Mirabelle lähestymistapa perustuu periaatteeseen, että geeni ekspressiotasot heijastaa sääntelyn vaikutus korkeamman asteen moduulien, ja siksi voisi arvioida näiden moduulien, havainnoimalla transkription muutosten [14], [15]. Erityisesti tuoreet raportit ovat osoittaneet, että vaihtelua aktiivisuutta miRNA voidaan havaita vertaamalla tasoa miRNA kohdegeenien poikki eri kudoksissa [16], [17]. Menetelmämme, vaikka samanlaisen konseptin, poikkeaa aiemmin julkaistu lähestymistapoja, että se on suunniteltu vangita ominaispiirteet miRNA asetus mRNA dokumenttinsa.

On yleisesti hyväksyttyä, että miRNA sitoutuminen määräytyy ensisijaisesti 3 ’ transloimaton alue (UTR) mRNA. Läsnäolo 7-mer komplementaarinen miRNA siemen (nukleotidit 2-8) 3 ’UTR geenin on keskeinen tekijä miRNA tunnustamista; ja useita algoritmeja, kuten TargetScan [18], [19], ovat onnistuneet tunnistamaan miRNA-geeni yhdistysten varovasti tunnistamalla geenien kanssa konservoituneiden sekvenssien vastaavat miR tunnustamista kuvioita. Kuitenkin perustettu yhdistys välillä miRNA ja kohdegeenin ei tarkoita, että kaikki transkriptit tuotetaan tämän geenin tehtäisiin miRNA sääntelyä. Noin puolet ihmisen geenit voivat läpikäydä polyadenylaa- useisiin kohtiin, tai siihen voidaan soveltaa vaihtoehtoisen silmukoinnin vaikuttaa niiden viimeksi eksonit [20], [21], ja siten tuottaa transkriptien jotka eroavat 3 ’UTR-sekvenssit. Niistä mRNA: t transkriptoidaan tällaisia ​​loci, vain ne, joissa on miRNA tunnustettu sekvenssin välillä lopetuskodonin ja polyA-häntä vaikuttaisi miRNA asetuksella. Tämä ominaisuus, hämmästyttävän erottaa miRNA päivästä transkription sääntelyn esiintyvät geenin promoottori sivuston, ja joka vaikuttaa kaikkiin isoformit geenin. Käytimme tätä ominaisuus suunnitella menetelmää, joka nimenomaan vaikutusten arvioimiseksi miRNA sääntelyn.

Tämä lähestymistapa on mahdollistanut se, että jotkut microarray alustoille, kuten Affymetrix, mitata transkriptio määrälle käytettäessä useita sekvenssejä otettu 3 ”loppuun geenin. Affymetrix geenien ilmentyminen tietojen yhteenveto koetin-sarjaa, ja on olemassa useita koetin-sarjat saatavilla useimmista geenejä. Jotkut näistä koetin-sarjat ovat luotettavia indikaattoreita miRNA aktiivisuus, mikä tarkoittaa, että ne havaitsevat sekvenssit, jotka voivat näkyä vain isoformit geeni, joka sisältää sitoutumiskohdan tietyn miRNA: kaikki transkriptit havaitaan näiden koetin-sarjaa olisi muutos vaikuttaa aktiivisuudessa tietyn miRNA. Ensimmäinen askel meidän analyysi oli siis tunnistaa nämä koetin-sarjaa ja miRNA, joita varten ne aktiivisuuden havaitsemiseksi. Teimme kartoittamalla sekvenssin koettimia, ja määrätä heidän asemansa geenin osalta miRNA kohdesivustot ennustettu geenin.

Mirabelle käytetään ilmaisua arvot mitattiin näiden koetin-setit laskemaan biologista aktiivisuutta pisteet kullekin miRNA siemen. Periaatteessa se ottaa syötteenä geeniekspressiovektoria aineisto ja vertaa, kussakin näytteessä, ilmentymistasojen koetin-joukkoja, jotka ovat luotettavia indikaattoreita aktiivisuuden tietyn miRNA siemen ”miR-siemen”, jossa ekspressiotasot muiden koetin-setit läsnä array, jotka toimivat viitteenä. Tuotos Mirabelle on ”miR toimintaa matriisi”, joka tarjoaa aktiivisuuspisteytykset kunkin miRNA perheen (jonka siemenet järjestyksessä), ja kunkin näytteen. Sovitun käytännön positiiviset tulokset annetaan, kun tavoitteita varten miRNA perheen näyttö downregulation, mikä osoittaa, että biologinen aktiivisuus sukulais miRNA kasvatetaan näytteessä, kun taas negatiiviset arvot saadaan säätelyä tavoitteiden, mikä viittaa vähentynyt aktiivisuus.

menetelmät

Mirabelle työkalu

Mirabelle ottaa syötteenä lausekkeen aineisto ja tuottaa miR siemenet toiminnan matriisi, jossa kunkin näytteen aineisto aktiivisuus tulokset lasketaan kunkin miRNA lajit, joiden ennustukset ovat olemassa. Positiiviset arvot saadaan, kun tavoitteet tietylle miR-siemen näyttö enemmän downregulation kuin viittaus, joka osoittaa, että toiminta tämän miR-siemen on lisääntynyt näytteessä, kun taas negatiiviset arvot saadaan säätelyä tavoitteiden, mikä viittaa vähentynyt aktiivisuus. Tämä työkalu on kirjoitettu Perl.

MiR-siemenet aktiivisuus pisteet laskenta

Mirabelle ensin standardoi geeniekspressiotasot raportoitu tulo aineisto käyttäen Z-pistemääriä korjaamiseksi vaihtelevan herkkyyden koetin -sets, ja erot keskimääräisen tason transkriptien läsnä kudoksessa. Seuraavaksi se käyttää t-tilaston laskemiseksi aktiivisuuspisteytykset, vertaamalla kunkin näytteen Z-tulokset koetin-joukkoja, jotka ovat luotettavia ilmaisimia tietyn miR-siemen, jossa Z-moniin muihin koetin-sarjaa. Käytimme kaksisuuntaisia, kahden otoksen t-tilaston, jossa varianssi on erisuuruinen (kaksi näytettä Welchin t-tilasto). On arvotaan uudestaan ​​geeniekspression aineisto, varianssi tämä tilasto on 1, ja sen jakelu on normaalia, jos se perustuu vähintään 20 detektorikoettimena-sarjaa.

Mirna tavoitteet ennusteita

Tässä tutkimuksessa käytimme TargetScan 4,0 ennusteiden (heinäkuu 2007) miRNA tavoitteet [18], [19]. TargetScan 4.0 käyttää molempia evoluution säilyttämistä, ja erityistapauksessa vaikuttavat tekijät ennustaa miRNA tavoitteita. Targetscan 4,0 ennusteet ovat saatavilla noin 158 eri konservoitunutta miRNA siemenet, edustavan noin 450 kypsä miRNA ihmisen. Näistä miR-siemeniä, neljä oli luotettavasti havaita alle 20 koetin-setit microarray, ja oli siten suljettu pois analyyseistä.

Mapping of koetin-sarjojen miR-siemenet

vuonna Affymetrix geenin ilmentymisen mikrosiruja, on tavallista, että on useita koetin-sarjat samaa geeniä, joista kumpikin tunnistaa eri sekvenssi. Mukaan sijainti sekvenssit tunnustettu koetin-sarjaa, on mahdollista määrittää, onko tietty koetin-set havaitsee vain isoformit jotka kantavat miR siemenet kohdepaikkaan, tai myös isomuotoja, jotka voidaan vapauttaa MIR-siemen kohdepaikkaan . Probe-setit havaitsemiseen yksinomaan selostukset kuljettaa miR-siemen tavoite on voimakkaammat miRNA asetuksella kuin koetin-setit, jotka tunnistavat alueen geenin yhteinen selostukset, jotka eivät kanna miR kohdesekvenssiä. Siten ennen askel analyysimme oli antaa jokaiselle koetin-set käytettävissä microarray luettelon miR-siemeniä, jotka vaikuttavat kaikki isomuodot havaita koetin-set. Käytimme seuraavan säännön osoittamiseksi koetin-sarjojen miR-siemenet: kun sekvenssi vastaa tiettyä miR-siemen on suoraan tunnistaa anturi-set tai sijaitsee ylävirtaan sekvenssit havaitsemat koetin-asetettu geenin ja samalla eksonin, pidämme tätä koetin asetettu olla luotettava indikaattori toiminnan tähän miR-siemen. Kuitenkin, jos sekvenssi vastaa tätä miR siemenet sijaitsee alavirtaan sekvenssit tunnustettu koetin-set, koetin-set saattavat havaita lyhyt mRNA: iden, jotka eivät sisällä miRNA kohdekohtia, emmekä määritellä tälle miR -seed. Suoritimme tämän kartoituksen avulla UCSC genomin selaimen tietokannan [22], ihmisen build 17 (https://genome.ucsc.edu). Me ladannut TargetScan ennusteita verkkosivuilla (https://www.targetscan.org) ja kartoitettu ne UCSC genomiin; käytimme ”knownGene” pöytä kartoittamiseen kromosomipaikoissa geeneihin; käytimme ”affyU133Plus2” ja ”affyU133” taulukot löytää sijainnin sekvenssit tunnustettu koetin-setit geeneissä (Text S1).

Aineistot analysoitiin

Pappilary kilpirauhaskarsinoomaa ja rintasyöpä aineistot haettiin GEO tietokannasta [23], liittymistä GSE3467, GSE3744, ja ArrayExpress tietokanta [24], liittymistä E-MEXP-882. Käytimme normalisoidut ilmaisua arvot tietokannasta. Kun raaka tiedot olivat saatavilla, me ladata sen, ja renormalized sen käyttämällä GCRMA, RMA ja MAS 5.0 paketteja Bioconductor [25]. Mirabelle ennusteita ja rikastaminen vaimentua tavoitteita ei vaikuta merkittävästi normalisoinnin algoritmia käytetään. Validointi kokeita transfektio MikroRNA ja antagomirs haettiin GEO tietokannasta, liittymisen GDS1858, GDS2657, ja GSE3425.

TF rikastamiseen analyysi

Sitoutumiskohdat (BS) TF määritettiin skannaamalla edistäjiä kaikki koetin-setit läsnä Affymetrix microarray tulitikkujen kanssa Transfac matriisien, kuten on kuvattu [26]. Kussakin promoottori, 500 emäsparia (bp) välittömästi ennen transkription aloituspaikkoja oli skannattu mukaisesti se, että useimmat aktiiviset TFBS näyttävät lähellä transkription aloituskohdasta [27]. Hypergeometrisessa jakelu käytettiin arvioitaessa rikastus välillä taustalla joukko koetin-setit ja vedostulostus.

GO Merkinnät

Käytimme GO biologisen prosessin merkintöjä varten U133Plus2 array Affymetrix verkkosivuilla ( https://www.affymetrix.com).

tilastot

Käytimme kaksisuuntaisia, kahden otoksen t-testi yhtä varianssi tunnistamiseksi MIR-siemenet esittäen merkittävimmät poikkeamat kasvaimissa vs. normaaleissa kudoksissa, ja sijoittui nämä MIRS mukaan tämän testin. Tämä testi suoritettiin Excelissä. Suoritimme yksi näyte Kolmogorov-Smirnov (KS) testaa arvioida normaaliuden jakelun miR aktiivisuuspisteytykset laskema Mirabelle on aineisto, ja kahden otoksen KS testit vertaamalla jakaumia miR aktiivisuuspisteytykset laskettu alkuperäisestä ja satunnaisesti sekoitettujen aineisto. KS testejä ja niihin liittyviä histogrammeja tehtiin Matlab 7 (Mathworks). Rikastamista suoritettiin käyttäen hypergeometrisen kertymäfunktio Matlab.

rikastaminen vaimentua geenien lukumäärän kasvaessa miR kohdepaikkojen (taulukko 1)

annetulle miR -seeds, suoritimme rikastamiseen testit iteratiivisesti jokaiselle

i

välillä 0 ja maksimaalinen määrä kohdesivustoluetteloon seuraavasti. Koko väestöstä koko (N) oli määrä informatiivinen koetin-sarjaa, jossa on vähintään

i

kohdistaa sivustoja pidetään joukko miR-siementen määrä koetin-setit raportointi downregulation laskettiin onnistumisia (m ). Me testattiin rikastumista downregulation näytteessä koetin-sarjaa tunnistetaan vähintään

i + 1

kohdekohtia näille miR-siemeniä.

rikastaminen GO merkintöjä (taulukko S6) B

Käytimme hyper-geometrisen jakauman tunnistaa merkittävimmin rikastettu merkintöjä näytteessä 9542 koetin-setit liittyy 77 miR-siemeniä, osalta väestöä kaikkien koetin-sarjat array (A). 5069 näistä miR tavoitteet tehokkaasti vaimentua kasvaimissa. Toisessa analyysissä tunnistimme kaikkein merkittävästi rikastettu merkintöjä näytteessä 5069 vaimentua koetin-sarjaa, osalta väestön 9542 ennustetun tavoitteet (B).

Tulokset

Validation että Mirabelle Method

ensimmäinen validoitu Mirabelle menetelmä kudoksissa, joissa runsaasti tietyn miRNA oli kokeellisesti lisääntynyt. Lim et ai. [11] transfektoituja HeLa-soluja miR-124, miR-1, ja miR-373, ja mitattiin geeni-ilmentymisen jälkeen 12 ja 24 tuntia. Wang et ai. [28] transfektoitiin HepG2-solujen miR-124 ja mitataan geeniekspression eri aikavälein. Me altistetaan geenin ilmentymisen datan mirabelle analyysiin, joka lasketaan MIR-siemen aktiivisuus jokaisesta näytteestä. Näytteissä, jotka transfektoitiin MikroRNA, meidän työkalu on tunnistettu oikein hyvin merkittäviä lisäyksiä microRNA toimintaa, nimenomaan miR-siemenet miR-124, miR-1, ja miR-373, vastaavassa kokeissa (teksti S1). Sen varmistamiseksi, että Mirabelle sopii muutosten havaitseminen miRNA aktiviteetti esiintyy

in vivo

, analysoitiin geenin ilmentymisen tuotetut tiedot kokeen Krutzfeldt et al., Jossa miR-122 hiljennettiin systeemisen injektion sellaisen antagomir [29]. Huomasimme, että työkalu oikein tunnistettu merkittävä väheneminen toiminnan miR-122 occuring käsittelyn jälkeen antagomir (Text S1).

inferring MicroRNA aktiivisuutta ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän

Nystyinen kilpirauhassyövän (PTC) on maligniteetti, joka osuus -80% ihmisen kilpirauhassyövän. Kaksi riippumatonta tutkimusta ovat raportoineet tiettyjä korjauksilla miRNA tasoa PTC. Sen vuoksi oli kiinnostavaa määrittää biologista aktiivisuutta miRNA PTC käyttäen Mirabelle työkalua ja verrata niitä muutoksia miRNA ekspressiotasot raportoitu näissä kahdessa tutkimuksessa.

He et al. [30] mitattuna miRNA tasot kudosnäytteitä 15 PTC käyttävillä potilailla miRNA mikrosiruja. Samanaikaisesti ne myös käytetään Affymetrix mikrosiruja määrittämään geenin ilmentymisen yhdeksässä kasvaimissa (T-PTC) ja yhdeksän pariksi ympäröivien kudosten (N-PTC). Analysoimme geenien ilmentyminen tietoja käyttämällä Mirabelle päättelemiseksi miR siemenet aktiivisuuden matriisi (taulukko S1). Kuten ilmenee tästä taulukosta, miR-siemen aktiivisuuspisteytykset olivat huomattavasti korkeammat kasvaimissa kuin normaaleissa kudoksissa, mikä viittaa siihen, että PTC kasvaimia ominaista tehostamista miRNA toimintaa. Todellakin, mediaani miRNA toimintaa pisteet kasvaimissa on suurempi kuin mediaani toimintaa pisteet normaaleissa näytteitä 97% miR-siemeniä. Voit selvittää miR-siemeniä, joiden osalta lisäys toiminta on voimakkainta kasvaimissa, käytimme kahden otoksen t-testi verrata aktiivisuuspisteytykset saatu normaalista ja kasvain näytteet (taulukko S2). He et al., Raportoitu että miR-146, miR-221, miR-222 ja miR-21, näytetään dramaattisin yli-ilmentyminen kasvaimissa tasoilla 19- 4-kertainen kasvaimissa kuin viereiseen kudokseen. T-testin soveltaa myös toiminnan tulokset (käyttäen vain osajoukko siemeniä, joita käytetään He et al., Niiden microRNA array) on onnistuneesti tunnistettu 3 miR-siemeniä, jotka kuuluvat näihin 4 MikroRNA kuudesta merkittävin

p

-arvot (pois 65 eri siemenet). Niinpä PTC tapauksessa top miR-siemenet tunnistetaan niiden biologista aktiivisuutta yhtyvät alkuun yliekspressoitu miRNA.

ottelua ennustuksemme ja biologinen mittauksia ei ole satunnaista ja kun osoitamme alla, tulokset erittäin vahva signaali läsnä geenien ilmentyminen. Aktiivisuus tulokset laskema Mirabelle työkalun perustuvat t-tilastojen ja puuttuessa yhteistä sääntelyä näistä geeneistä, nämä tilastot noudattavat normaalijakaumaa. Kuvio 1A esittää jakauman miR siemenen aktiivisuuden tulokset normaaleissa ja tuumorikudoksissa. Voidaan nähdä, että toiminnan tulokset ovat huomattavasti korkeammat kasvaimia kuin normaaleissa kudoksissa (

p

10

-125 jonka Kolmogorov-Smirnov (KS) testiä). Kontrollina, me lasketaan hypoteettinen toiminnan tulokset samalla aineisto jälkeen satunnainen sekoitus koettimen-sarjaa (Fig. 1 B). Jälkimmäisessä tapauksessa KS testi ei havaitse merkittävää eroa aktiivisuuden jakauma tulokset kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa, kuten voisi odottaa.

(A) Histogrammi näyttää jakelu miR-siementen aktiivisuuden tulokset lasketaan kasvaimen (punainen) ja normaalia näytettä (syaani) on papillaarinen kilpirauhassyövän aineisto. Aktiivisuus miRNA on maailmanlaajuisesti suurempi kasvainkudoksissa suhteessa normaaleissa kudoksissa. KS testi hylkää hypoteesin tasa jakaumien aktiivisuuspisteytykset kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa, joiden p-arvo P≈10

-126. Normaalisuus aktiivisuuspisteytykset hylätään P 10

-300. (B) osoittavat, että poikkeama välillä tulokset lasketaan normaalin ja tuumorikudoksia ei johdu meidän laskentamenetelmän aktiivisuuspisteytykset, me lasketaan nämä pisteiden satunnainen permutaatio koetin-settejä PTC aineisto. Sekä normaali ja kasvain kudoksia, aktiivisuuspisteytykset noudattaa suunnilleen normaalijakaumaa, odotetusti varten t-tilaston. Ei ole havaittavissa poikkeama kasvain ja normaaleista kudoksista, ja KS testi ei hylkää tasa kahden jakauman. (C) Histogrammi näyttää jakelu miR siemenen aktiivisuuspisteytykset lasketaan kasvainta (punainen) ja normaalia näytettä (syaani) rintasyövän aineisto. MiRNA aktiivisuus on huomattavasti suurempi kasvainkudoksissa suhteessa normaaleissa kudoksissa. KS testi hylkää hypoteesin tasa jakaumien aktiivisuuspisteytykset kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa, joiden p-arvo P 10

-298. (D) Histogrammi näyttää jakelu miR siemenen aktiivisuuspisteytykset satunnainen permutaatio koetin-settejä rinnasta aineisto.

inferring MicroRNA toimintaa rintasyövässä

Todettuaan että microRNA aktiivisuus on maailmanlaajuisesti lisääntynyt papillaarinen kilpirauhassyövän etenimme tutkia miRNA toimintaa rintasyöpä, joka on toiseksi yleisin syöpä, ja laajojen tutkimusten geenien ilmentymisen, joitakin erittäin arvokkaita aineistoja käytettävissä yleisillä arkistot . Richardson et al., Julkaistu geeniekspressiovektoria tutkimus rintasyövästä [31], joka perustuu aineisto, joka sisälsi seitsemän normaali kudosnäytteitä ja 40 rinta kasvaimia, joista 18 oli pohjapinta-kaltainen syöpiä (BLC), huonosti eriytetty ja erittäin aggressiivinen muoto syöpiä. Aktiivisuus matriisi päätteli tästä aineisto näkyy taulukossa S3. Kuten on osoitettu kuviossa 1C, taso miRNA biologisen aktiivisuuden Tuumorinäytteissä on täällä myös huomattavasti korkeampi kuin normaaleissa näytteissä; KS testi osoittaa, että toiminnan tulokset kasvaimen ja normaalissa näytteillä on selvä jakautuminen (

p

10

-298). Vertaamalla mediaanin aktiivisuuspisteytykset syövän ja normaalissa kudosnäytteet, kaikki vaan neljä miR-siemenet näyttää olevan suurempi aktiivisuus syövän kuin normaalissa kudoksessa. Senkin jälkeen valitsemalla rajoittava katkeamisen

p

3 · 10

-4 (vastaa 0,05 merkitsevyystasolla jälkeen Bonferroni korjauksen useita testaus), huomaamme, että 77 (pois 150) miR-siemenet on merkittävä lisääntynyt aktiivisuus kasvaimissa (taulukko S4). Kaikkiaan MikroRNA Vastaavista 77 miR-siemenet ennustettu TargetScan säädellä noin 6000 geenejä. Lisääntynyt miRNA aktiivisuus havaittiin todellakin heijastuu heikkenee huomattavasti ilmentymistä näiden kohdegeenien. Out of 9542 koetin-setit liittyvät selostukset säätelee yksi näistä 77 miR-siemenet, 5069 (53,1%) on alhaisempi keskimääräinen ilmentyminen kasvaimissa (eli vastaava kohde geenit vaimentua) kuin normaalissa kudoksessa verrattuna 41,6% kaikkien 40539 koetin-setit array (

p

10

-147 jonka hypergeometrisen testi, kuva 1).

tarjota lisätukea meidän päätellä, että MikroRNA ovat suurin syy massiivinen downregulation näiden geenien, tutkimme laajuus geenikohteen downregulation funktiona numero liittyy sitoutumiskohtia miR-siemeniä. Tämä tutkimus on ollut pohjana aiempien havaintojen perusteella epäillään, että mRNA: n hajoamisen seuraava sitoutuminen miRNA on tehokkaampi transkriptien kuljettaa useita kohdesivustoissa miRNA [32] – [34]. Taulukossa 1 on yhteenveto ilmaus havaittuja suuntauksia koetin-joukkoja, jotka on kartoitettu 77 miR-siemenet näyttämällä merkittävin lisäys toiminnan kasvaimissa. Kuten edellä on mainittu, 9542 koetin-sarjaa havaita transkriptien, joissa on vähintään yksi sitoutumiskohta MiR-siemenet, 53,1% heistä näyttää downregulation kasvaimissa. Kun ajatellaan, 6574 koetin-setit havaitsemiseen transkriptien kuljettaa vähintään 2 kohdesivustot prosenttiosuus paranee 54,4% (p 1,3 · 10

-4 jonka hypergeometrisen testi), ja se kasvaa edelleen anturin-setit havaitsemiseen selostukset kuljettaa enemmän sivustoja miRNA sitova, oli noin 70% 228 koetin-setit havaitsemiseksi selostukset yli 15 kohdesivustot. On huomionarvoista, että vaikka Mirabelle algoritmia ei käytä lukumäärää miRNA sitoutumiskohtia laskelmissaan-aktiivisuuden pistemäärät lasketaan koetin-sarjaa tunnistettiin indikaattoreiden miR-siemen, riippumatta sitoutumiskohtien lukumäärä ne voivat kuljettaa-the miRNA että se tunnistettu meneillään merkittävä muutos toimintaa, näkyy selkeä annos-vaste vaikutuksen. Siksi asteittainen kasvu osuuden vaimentua geenien lukumäärään kohdesivustoluetteloon tarjoaa vahvaa tukea käsitystä, että vähentynyt ilmentyminen kohdegeenien on todellakin johtuu lisääntyneestä miRNA toimintaan.

Koska monet geenit säätelevät useita miRNA lajeja, halusimme varmistaa, että havaitut maailmanlaajuinen downregulation miRNA kohdegeenien ei lisääntymisen vuoksi vain muutamaa lajia miRNA (jotka jakavat kohdegeenien muiden miRNA lajit) pois tästä joukko 77 aktiivista miR -siemenet. Tämän vuoksi suoritimme hypergeometrisen rikastamiseen kuvattua testiä aikaisemmin (ts ,. testaus rikastamisen alas geenien joukossa koetin-sarjaa, jotka tunnistavat tavoitteet ainakin yhden miR-siemen sarjassa tutkittiin) iteratiivisesti. Ensimmäisessä iteraatio, selvitimme Hypergeometrinen rikastamiseen saadaan, kun otetaan huomioon ilmaisua malleja tavoitteiden vain ensimmäinen miR-siemen. Toisessa iteraatio, selvitimme Hypergeometrinen rikastamiseen saadaan, kun otetaan huomioon ekspressiokuvioita tavoitteista ensimmäisen ja toisen miR-siemeniä, ja niin edelleen. Merkillistä, parhaat pisteet saatiin, kun otetaan huomioon tavoitteet ensimmäisen 74 miR-siemeniä, vahvistavat, että todellakin, lähes kaikki alkuperäisen 77 biologisesti aktiivisia miRNA lajien osuuden havaittiin ilmaisua downregulation. Sen varmistamiseksi, että nämä tulokset eivät johtuneet erityispiirteiden analysoitua tietoa, tutkimme muita rintasyövän aineistoja, kuten E-MEXP-882 [35], ja käsitellyt niitä eri normalisoinnin järjestelmien (GC-RMA, MAS5.0) . Käyttäen hypergeometrisen testi, löysimme samalla merkittävä downregulation miRNA kohdegeenien (81 biologisesti aktiivisia miR-siemenet, p 10

-134 hypergeometrisen rikastamiseen testi), edistää vahvistamalla hypoteesi, että maailmanlaajuinen downregulation miRNA kohdennettujen geenien havaittiin rintasyövässä ei ole spesifinen tietylle tutkimus.

Mahdollinen syy havaittu downregulation mikroRNA kohdegeenien voisi olla toiminnan transkriptiotekijöiden (TF: t), jotka yhdessä säätelevät näitä geenejä [36]. Etsiminen tunnetaan TF sitoutumiskohdat promoottorialueissa kohde selostukset kunkin 77 miR-siemeniä, löysimme merkittävä rikastus (

p

0,05) 82 TF: ille (menetelmät). Sitoutumiskohdat näiden TF: ille löytyi 30%: n koetin-setit läsnä jono. Kun jätetään kaikki selostukset jossa on mahdollinen sitoutumiskohtia niille TF: ille, meillä on vielä havaittavissa erittäin merkittävä p-arvo rikastamista vaimentua geenien joukossa miRNA tavoitteet (p 10

-96).

Seuraavaksi asetamme luetella geenejä, jotka ovat ennustettu kohdesivustot varten 77 miR-siemeniä ja odotetaan siis vaikuttaa lisääntynyt miRNA (taulukko S5). Me toiminnallisesti tunnusomaista ne käyttämällä geeniä ontologian (GO) huomautus, ja näytti tilastollisia rikastamisen erityisiä merkintöjä (taulukko S6). Tämä analyysi osoittaa, että useat biologiset prosessit yliedustettuina geenikohteet näistä miRNA: transkription säätelyyn, kehitys ja erilaistuminen, ubikitiinipromoottori sykli, signaalitransduktion, liikenne, ja tuumorisuppressiogeeneksi (synonyymi luokka: sääntely etenemisensä solusyklin) (FDR

p

10

-9). Kuten edellä on todettu, suurin osa näistä geeneistä näkyy vähentynyt ilmentyminen arvoja kasvaimissa, mutta ei kaikkia. Etsimme toiminnallisia merkintöjä, jotka voisivat luonnehtivat koetin-setit, jotka vaimentua tuumoreissa verrattuna muihin ennusti tavoitteita, joita ei ole tehokkaasti vaimentua. Huomasimme, että solusyklin pidätys oli kaikkein merkittävästi rikastettu merkintä (FDR

p

2 · 10

-2), viittaa siihen, että miRNA geenien, jotka aiheuttavat solusyklin pidätyksen todellakin vaimentua vuonna kasvaimia.

Koska tehokkuus geenien mukaan MikroRNA paranee määrän kohdesivustoluetteloon, etsimme geenien kuljettavat eniten kohdesivustoluetteloon meidän 77 miR-siemeniä. Tämä vastaa huipulle Table S5. Mukaisesti alkuun tunnistettu GO merkinnät, löydämme säätelevien geenien geenin transkriptio:

CPEB4

(sytoplasmisen polyadenylaa- elementti sitova 4), joka koodaa proteiinia uskotaan ohjata polyadenylaatiota aiheuttama käännös varhaisessa kehitysvaiheessa, on eniten kohdesivustoluetteloon (38), ja on vaimentua. Kaksi muuta jäsentä CPEB perheen,

CPEB2

ja

CPEB3

, näkyvät myös suuri listan 26 ja 25 kohdekohtia vastaavasti ja ovat myös vaimentua;

DDX3X

(DEAD laatikko polypeptidi 3, X-linked), RNA-helikaasin, on 33 kohdekohtia, ja siihen liittyvä anturi-setit raportoivat downregulation (p = 0,002, 0,00001);