Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kennedy polku tuottaa phosphocoline ja fosfoetanolamiinia kautta kaksi osaa. Koliini Kinase (ChoK) on ensimmäinen entsyymi Kennedy haara synteesin fosfokoliini, pääkomponentti solukalvon. ChoK proteiinien perhe koostuu ChoKα ja ChoKβ isoformien, ensimmäinen kaksi eri versioita liitos. Äskettäin ChoKα on liitetty syöpää aiheuttavia prosessissa, koska se on yli-ilmentynyt ihmisen erilaisten syöpien. Ei kuitenkaan näyttöä rooli ChoKβ karsinogeneesis- on raportoitu.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä vertaamme

in vitro

ja

in vivo

ominaisuudet ChoKα1 ja ChoKβ lipidimetaboliassa, ja niiden mahdollinen rooli syövän synnyssä. Sekä ChoKα1 ja ChoKβ osoitti koliini ja etanoliamiini kinaasiaktiivisuudet analysoituna soluekstrakteissa, vaikkakin eri affiniteetti niiden alustoille. Kuitenkin ne käyttäytyvät eri tavalla, kun yli-ilmennetään kokosoluissa. Kun taas ChoKβ näyttää etanoliamiinipesurissa kinaasi rooli, ChoKα1 esittää dual koliini /etanoliamiini kinaasin rooli, mikä viittaa myös kunkin ChoK isoformi erillisiä biokemiallisia reittejä alle

in vivo

olosuhteissa. Lisäksi, samalla kun yli-ilmentyminen ChoKα1 on onkogeenisten, kun yli-ilmentynyt HEK293T tai MDCK-soluissa, ChoKβ yli-ilmentyminen ei ole riittävä aiheuttamaan

in vitro

solutransformaatiota eikä

in vivo

kasvaimen kasvua. Lisäksi merkittävä säätelyä ChoKα1 mRNA-tasojen paneelissa rinta- ja keuhkosyövän solulinjat havaittiin, mutta ei muutoksia ChoKβ mRNA tasoja on havaittu. Lopuksi MN58b, aikaisemmin kuvatun estäjä ChoK kanssa

in vivo

kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus, osoittaa yli 20-kertainen tehokkuus kohti ChoKα1 kuin ChoKβ.

Päätelmä /merkitys

Tämä tutkimus on ensimmäinen todiste erillisten metabolisen rooli ChoKα ja ChoKβ isoformit, mikä viittaa erilaiset fysiologiset roolit ja vaikutuksia ihmisen syövän synnyn. Nämä havainnot ovat edistysaskel suunnittelussa kasvaimia torjuvaa perustuvan strategian ChoK esto.

Citation: Gallego-Ortega D, Ramirez de Molina A, Ramos MA, Valdes-Mora F, Barderas MG, Sarmentero-Estrada J, et al. (2009) Differential rooli Human koliinikinaasi α ja p Entsyymit lipidiaineenvaihdunnan: Implications in Cancer Onset ja hoito. PLoS ONE 4 (11): e7819. doi: 10,1371 /journal.pone.0007819

Editor: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 kesäkuu 2009; Hyväksytty: 07 lokakuu 2009; Julkaistu: 12 marraskuu 2009

Copyright: © 2009 Gallego-Ortega et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut apurahoja JCL alkaen Comunidad de Madrid (GR-SAL-0821-2004), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, RD06 /0020/0016), Fundación mutua Madrileña, ja avustus ARM Fundación mutua Madrileña. DGO oli Fellow Comunidad de Madrid. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Human koliinikinaasi-alfa-(ChoKα) ja beeta (ChoKβ) ovat jäseniä koliinikinaasi-perheen. Nisäkkäillä tämä perhe koodaa kaksi erillistä geenien,

CHKA

ja

CHKB

, tuloksena syntyy kolme erilaista proteiinia, jossa koliiniryhmää /etanoliamiinia kinaasi (ChoK /EtnK) domain: ChoKα1 (NP_001268), ChoKα2 (NP_997634) ja ChoKβ1 (NP_005189) [1]. ChoKα1 eroaa ChoKα2 vain ylimääräinen venyttää 18 aminohappoa, kun taas ChoKβ eroaa ChoKα1 ja ChoKα2 noin 40%. Läsnäolo ChoK /EtnK domain annetaan kyky katalysoida fosforylaatiota koliini (Cho) ja fosfokoliini (PCho) [1]. Tämä on ensimmäinen askel biosynteesipolun fosfatidyylikoliinin (PC) [2]. PC on merkittävä fosfolipidi eukaryoottisissa kalvoja ja sillä on kriittinen rooli kalvo rakenne ja myös solusignalointia [2]. ChoK entsyymit voidaan sekaantuneet myös synteesin fosfatidyylietanoliamiini (PE), käyttäen substraattina etanoliamiini tehdä fosfoetanoliamiini (PETN) [1], [3] – [5].

Aikaisemmat tutkimukset viittaavat siihen, että ChoK toimii dimeerinen proteiini, [6], [7], ja osuus eri homo- tai hetero- dimeerin väestöön on ehdotettu olevan kudosspesifisiä [8]. Lisäksi yhdistelmän koliinikinaasi isomuotojen johtaa eri tasolla ChoK aktiviteetti

in vitro

alle soluvapaat järjestelmiä olosuhteissa. Siten α /α homodimeerin on aktiivisin koliinikinaasi-muoto, β /β homodimeerinä vähemmän aktiivisia, ja α /β-heterodimeerin on keskitason fenotyyppi [8].

spesifisen fosfolipaasi D-driven hydrolyysi PC tuottaa koliini ja signaalitransduktion aineenvaihduntatuotteiden kuten PA (fosfatidihappo), ja sen johdannaiset LPA (lysofosfatidihappo) ja DAG (diasyyliglyseroli), jotka ovat tärkeitä mitogeneesiin ja solujen transformaatio [9] – [11]. Koliini saa edelleen muuntaa ChoK osaksi PCho, joka on stabiili metaboliitti pystyy aiheuttamaan mitogeneesiin hiiren fibroblasteissa [12]. Lisäksi useat onkogeenien kuten

RAS

tai

RhoA

kasvu ChoKα aktiivisuus johtanut korkeampiin solunsisäisiä tasoja PCho [13] – [16]. Resonanssispektroskopia (MRS) tutkimukset ovat osoittaneet, epänormaali fosfolipidiaineenvaihduntaan syöpäsoluissa [17], [18]. Lisäksi korkea PCho on havaittu kasvainsolujen sekä Tuumorinäytteissä syöpäpotilaiden verrattuna normaaliin vastaavien rinta-, eturauhas-, aivo- ja munasarjasyöpä [19] – [25]. Kasvu fosfoetanolamiinia on myös raportoitu transformoiduissa soluissa tai kasvaimen näytteitä MRS, vaikka se myötävaikuttaa huomattavasti vähäisemmässä määrin verrattuna lisäystä PCho, että phosphomonoester huippu [26].

Seuraus ChoKα solukasvun, lisääntymistä, taudin alkamisen ja etenemisen syövän on hyvin dokumentoitu. ChoKα on yli-ilmentynyt joissakin yleisimmistä syövistä, kuten rinta-, keuhko-, paksusuolen ja peräsuolen, eturauhasen [27] – [30] ja virtsarakon (julkaisemattomia havaintoja). Lisäksi se on onkogeeninen aktiivisuus, kun yli-ilmentynyt ihmisen soluissa [15]. Lisääntynyt ChoKα mRNA-tasot ovat äskettäin kuvattu itsenäisenä prognostinen markkeri ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaille [30]. Lisäksi, ihmisen rintasyövän solulinjoissa osoittaa säätelyä ChoKα mutta ei ChoKβ, verrattuna normaaliin nisäepiteelisoluissa [21]. Siinä mielessä se on äskettäin raportoitu, että eturauhasen kasvain hiirimallissa (TRAMP) käyttäen IHQ immuunidetektio ChoKβ, alhainen ilmentyminen ChoKβ havaittiin kasvainten näytteissä verrattuna villin tyypin kudosten [31].

seuraus jäsenten Rho GTPaasi perheen syövän puhkeamista ja etenemistä on laajasti kuvattu [32] – [35]. Todisteet siitä, että ChoK osallistuu pahanlaatuisiksi yhdessä Ras ja RhoA on annettu [14], [15], [36]. Lisäksi aktiivisuus ChoKα moduloidaan tunnettua efektorien sekä Ras ja RhoA [15], [29].

farmakologinen esto ChoKα on ehdotettu uutena kasvaimen kasvua estävä strategia [2]. Vahva tuki tälle strategia perustuu käyttöön MN58b, hyvin tunnettu ChoKα estäjä, joka näyttää voimakas antiproliferatiivinen vaikutus useissa tuumorien solulinjoissa in vitro, ja vahva väheneminen kasvaimen kasvua nude-hiirissä ksenografteissa [14], [37] – [40].

Olemme verranneet biokemiallisia ja biologisia ominaisuuksia ChoKα ja ChoKβ, ja osoittaa, että lisäksi niiden homologia, jälkimmäinen ei pysty aiheuttamaan solutransformaatiota HEK293T tai MDCK-soluissa. Lisäksi ehdotamme ero käyttäytymisen välillä α ja β-isoformien fosfolipidien aineenvaihduntaan. Lopuksi kasvaimia torjuvaa ominaisuuksia MN58b voidaan katsoa johtuvan sen spesifinen esto ChoKα. Vaikutukset Näiden havaintojen käsitellään.

Tulokset

karakterisointi entsymaattisia ominaisuuksia ChoKα1 ja ChoKβ isoformit

aktiivisuus Sekä koliinikinaasi isoformeja, ChoKα1 ja ChoKβ, on ollut kuvattu aikaisemmin eri nisäkkäiden kudoksista, mutta niiden koliinikinaasi ja /tai etanoliamiini kinaasiaktiivisuudet ei vielä tunneta täysin [1], [4], [41] – [43]. Niinpä ensin tehtiin vertaileva analyysi

in vitro

kinaasiaktiivisuuden kahden ihmisen ChoKα1 ja ChoKβ isoformeja, niiden kyvyssä fosfory- koliini ja etanoliamiini. HEK293T-solut transfektoitiin asianmukaiset ilmentämisvektorit, jotka käsittävät ihmisen CHKA tai CHKB geenejä tai tyhjän vektorin, ja testattiin ChoK ja EtnK toimintaa. Expression saavutetut tarkistettiin Western blot (kuvio 1 a), ja suhteellinen entsymaattinen aktiivisuus solu-uutteista arvioitu. Sekä ChoKα1 ja ChoKβ näytetään koliini ja etanoliamiini kinaasiaktiivisuudet näissä koeolosuhteissa, mutta määrä konversio oli ilmeisesti erilainen (kuva 1b).

HEK293T solut transfektoitiin eukaryoottiekspressiovektoreihin ihmisen ChoKα1 ja ChoKβ1 geeni. pCDNA3b tyhjää vektoria käytettiin kontrollina. A) yli-ilmentyminen ChoKα1 ja ChoKβ1 in HEK293T soluissa havaittiin Western Blot. GAPDH havaitsemiseen käytettiin kontrollina ekspressiotason. B, C) In vitro ChoK (B) ja EtnK (C) aktiivisuus koliinikinaasi-α1 ja β1 isoformien solu-free uutteita HEK293T transfektoitujen solujen. Prosenttiosuus muuntaminen

14C-koliini tai

14C-etanoliamiinia fosforyloitu tuote on edustettuna. Koe suoritettiin kahtena näytteissä, toistetaan 4 kertaa, ja keskiarvo ± SEM arvot kaikissa kokeissa arvioidaan.

analysoimaan edelleen ChoK ja EtnK kineettinen toimintaa ChoKα1 ja ChoKβ isoformit käyttäen yhdistelmä-DNA-entsyymejä. DH5a

Escherichia coli

transformoitiin koodaavan geenin ihmisen ChoKα1 tai ChoKβ ja entsymaattista

in vitro

määrityksessä joko ChoK tai EtnK joita suoritetaan. Michaelis vakiot (Km) kunkin isoformin eri substraatteja saatiin (taulukko 1). ChoKβ osoitti Km koliini 2,8 kertaa suurempi kuin ChoKα1. Sitä vastoin Km ChoKβ etanoliamiinin oli alempi kuin ChoKα1. Nämä tulokset viittaavat siihen, että soluttomissa järjestelmissä koliini on parempi substraatti ChoKα1 (2,85-kertainen) kuin ChoKβ, kun taas etanoliamiini on parempi substraatti ChoKβ (5,83-kertaisesti) kuin ChoKα1.

ChoK isoformeja differentiaalisesti säätelevät Ras ja Rho GTPaasit

Koska Ras ja RhoA GTPaasit ovat ylävirtaan säätelijöitä ChoKα1 [15], [28], jotkut kaikkein tutkittu proteiineja pienen GTPaasi perheen mukaan lukien H-Ras ja Rho -perhe jäsenet RhoA ja Cdc42 testattiin mahdollisina ylävirtaan modulaattoreina ChoKβ. Tätä varten, joka on

in vitro

ChoK ja EtnK aktiivisuuden määritys suoritettiin HEK293T-soluissa, jotka on transfektoitu konstitutiivista aktiivista mutantit kunkin GTPaasi (Fig. 2a) ja joko ChoKα1 ja ChoKβ. Kuten kuviossa 2 on esitetty, mikään GTPaasit testattu pystyivät lisäämään merkittävästi koliini tai etanoliamiinin kinaasiaktiivisuutta ChoKβ. Sitä vastoin samanlaisissa olosuhteissa, Ras ja RhoA kykenivät indusoimaan tilastollisesti merkittävä muutos aktivointi sekä ChoK ja EtnK toimintaa ChoKα1 (Fig. 2b ja 2c).

koliinikinaasi-isoformit ilmennettiin yksin tai yhdessä osoitti Ras ja Rho GTPaasit sekä

in vitro

ChoK aktiivisuus määritettiin. A) analyysi kohdunulkoisen ilmentymisen Western Blot in HEK293T- transfektoiduissa solu- uutteiden ChoKα1 (52 kDa), ChoKβ1 (45 kDa), RhoA-QL (22 kDa), Cdc42-QL (25 kD) ja H-rasV12 (23 kDa) . Tyhjät vektoreita käytettiin verrokkeina varten endogeenisen tasoilla, ja GAPDH kuin latauskontrollina. B) ja C)

In vitro

koliinikinaasiaktiivisuuden on ChoKα1 tai ChoKβ1 läsnä ollessa lisääntynyt ilmentyminen konstitutiivisen aktiivisia muotoja RhoA, Cdc42 ja H-Ras. D) ja E)

In vitro

etanoliamiinia kinaasiaktiivisuutta ChoKα tai ChoKβ läsnä kunkin ilmoitettu konstitutiivisen aktiivista muotoa GTPaasi. Tulokset on edustettuina kertainen induktio muuntaminen vastaavaksi fosforyloidun metaboliitin määritetään yhteensä cpm /ug koko solu-uutteesta, ja normalisoitiin tyhjän vektorin transfektoiduista soluista kontrollina. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoja ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta jokainen suoritetaan kahtena näytteitä. Tilastollinen merkitys (p≤0.05) on merkitty tähdellä vertaamalla sitä toimintaa saavutettua ChoKα1 tai ChoKβ1 tarvittaessa trans- yksin.

Differential rooli välillä ChoK isoformit solun transformaatiossa ja kasvaimen kehittymisen

seuraus ChoKα1 solun transformaatiossa ja ihmisen syövän syntymistä on tutkittu laajalti, ja se on osoitettu olevan kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden [15], [36]. Koska sen laajaa homologiaa, tutkimme jos ChoKβ voisi aiheuttaa solutransformaatioon kun yli-ilmennetään ei-tuumorigeenisiä soluja. Ensinnäkin kykyä ChoKβ-transfektoitujen solujen kiinnittymisen edis- riippumaton solujen kasvu määritettiin käyttäen solulinjan HEK293T. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, ChoKα1 indusoi merkittävää kasvua määrä pehmeässä agarissa pesäkkeiden [15]. Sitä vastoin samanlaisissa olosuhteissa, ChoKβ yliekspressio ei ollut merkittävää vaikutusta määrään eikä pesäkkeiden koko verrattaessa syntyy ohjaus, tyhjä vektori transfektoidaan HEK293T soluja (Fig. 3). Nämä tulokset vahvistettiin toisella ei-tuumorigeeniset solulinja peräisin eri lajeista, kuten MDCK, saaminen samanlaisia ​​tuloksia huolimatta alemman tason yli-ilmentymisen sekä ChoK isoformien verrattuna HEK293T soluihin. Ero ilmentymisen taso saadaan johtui pikemminkin eri tehokkuutta transfektion kunkin solulinjojen (tietoja ei esitetty).

A) ja B)

In vitro

ChoK aktiivisuus soluttoman otteet transfektoiduista soluista hetkellä pinnoitus, määritetään muuntaminen

14C-leimattu koliini on PCho. C) Valokuvia tyypillisen kokeen pehmeä agar määrityksessä. Yhteensä 10

5 solua maljattiin per 60 mm malja, ja pesäkkeiden lukumäärä kvantitoitiin jälkeen 5-8 viikkoa inkuboinnin jälkeen. D) ja E) Tietokonepohjainen automaattinen määrällisesti pesäkkeiden lukumäärä, keskiarvot ± SEM on esitetty. Määritys suoritettiin 3 riippumatonta kertaa triplikaattinäytteet saada samanlaisia ​​tuloksia. Tilastollinen merkitys (p≤0.05) on merkitty tähdellä.

Kyky ChoKβ aiheuttavan kasvaimen kasvua tutkittiin myös. Sekä ChoKα1- ja ChoKβ-transfektoitiin HEK293T tai MDCK-soluja inokuloitiin subkutaanisesti kateenkorvattomiin hiiriin. Kuten on esitetty kuviossa. 4, yli-ilmentyminen ChoKα1 oli riittävä indusoimaan kasvaimen kasvua immuunipuutteisilla hiirillä molemmissa solujärjestelmien analysoitiin. Sitä vastoin solut, jotka yli-ilmentävät ChoKβ eivät kyenneet indusoimaan kasvaimen kasvun samanlaisissa olosuhteissa. Kuten edellä on mainittu, verrattuna kasvaimen kasvun välillä molemmissa solulinjoissa liittyy erilaisia ​​transfektion tehokkuus, paljon suurempi HEK293T (aproxm. 80-90%) kuin MDCK (aproxm. 15-20%). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa jotka on saatu pehmeä agar kokeissa, ja viittaavat vahvasti siihen, että yli-ilmentyminen ChoKβ ei ole riittävä indusoimaan kasvaimen kasvua olosuhteissa, joissa ChoKα1 ei.

ksenoqraftit vahvistettiin s.c. injektio transfektoitujen HEK293T tai MDCK-solut kateenkorvattomissa nu /nu nude-hiirissä. A) ja B) Western blot -analyysi ektooppisen ilmentymisen koliinikinaasi-isoformien transfektoiduissa HEK293T tai MDCK-soluissa, vastaavasti, ennen hiiriin oli istutettu. C) ja D) analyysi koliinikinaasi-aktiivisuuden ChoKα1 tai β1 transfektoitu HEK293T tai MDCK-solut vapaa uutteet ennen hiiriin oli istutettu. E) ja F) volyymi kasvaimia syntyy ihonalaisella 10

6 transfektoiduista soluista. Kasvainten tilavuus laskettiin kaavalla:

Vol = [D * d

2] /2

, jossa D ja d ovat suuria ja pieniä kasvaimen halkaisijat vastaavasti. Tiedot HEK293T- edustaa keskiarvoja ± SEM kahdesta itsenäisestä kokeesta (n

1 = 12, n

2 = 16), MDCK koe vastaavat vastaavan kokeen n = 12.

ChoKβ isoformi osoittaa etuoikeutettu EtnK aktiviteetti

in vivo

tutkimme seuraavaksi, oliko mitään eroa entsyymiaktiivisuuden molempien ChoK isomuotojen alle

in vivo

olosuhteissa, voisivat selittää heidän ero biologista aktiivisuutta. Näin ollen, toimintaa ChoKα1 ja ChoKβ kuten ChoK ja /tai EtnK in koko solun järjestelmää testattiin. Solunsisäisiä lipidejä ihmisen HEK293T yli-ilmentävät ChoKα1, ChoKβ tai transfektoitu tyhjällä vektorilla, uutettiin analysoidun. Molemmat, liukenematon lipidifraktion sisältävän hydrofobisen lipidejä ja koko proteiinipitoisuus käytettiin latauskontrollina saamiseksi samanlaisia ​​tuloksia. Kuten on esitetty kuviossa 5A, solunsisäinen fosfoetanoliamiini kohoamiseen samassa määrin in ChoKα1- tai ChoKβ-transfektoiduissa soluissa. Kuitenkin, solunsisäinen fosfokoliini tasoja ChoKβ-transfektoitujen solujen eivät olleet merkittävästi erilaiset kuin kontrollisoluihin, kun taas ChoKα1-transfektoidut solut osoittivat lisääntynyttä solunsisäisten PCho tasoilla (kuvio 5B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä epiteelisolujen eri alkuperää: ihmisen rinta-adenokarsinoomasoluja SK-Br-3 (Fig. 5C, D) tai ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinja H1299 (Fig. 5E, F). Lisäksi kaikissa solulinjoissa analysoitiin, proteiinin ilmentyminen määritettiin myös Western blot -analyysi (kuvio. 5G).

HEK293T-, SK-Br-3 tai H1299-solut transfektoitiin eukaryoottiekspressiovektoreihin ihmisen ChoKα1 ja ChoKβ1 geenin tai pCDNA3b tyhjän vektorin, jota käytettiin verrokkina. A), C) ja E) Solunsisäiset EtnK aktiivisuus koliinikinaasi-α1 ja β1 isoformien koko soluissa HEK293T-, H1299 ja SK-Br-3-soluissa. B), D) ja F) Solunsisäiset ChoK aktiivisuus ChoKα ja ChoKβ isoformit kokonaan soluissa HEK293T-, H1299 ja SK-Br-3-soluissa. Määrä

14C-PCho ja

14C-PETN uutettiin ja kvantitoitiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena näytteissä, toistettiin 3 kertaa, ja keskiarvot ± SEM kaikissa kokeissa arvioidaan. Tilastollinen merkitys (p≤0.05) on merkitty tähdellä. Tyypillinen leimaaminen radioaktiivisesti kokeilun tulokset noin 70% radioaktiivisen yhdisteen sisällyttämisen soluihin. G) edustaja Western Blot kohdunulkoisen ChoKα1 tai ChoKβ1 ilmentymistä kussakin solulinjassa. Lähtötasolle valittiin 1-kertaiseksi kuvaajien kunkin solulinjan edustavat: HEK293T solut (PCho: 1153 cpm; PETN: 1231 cpm); H1299-solut (PCho: 22821 cpm; PETN: 13339 cpm), ja SK-Br-3-solut (PCho: 18620 cpm, PETN: 3151 cpm).

Näin ollen ero entsyymiaktiivisuus ChoKα1 ja ChoKβ löytyy HEK293T- ei solulinja erityisiä. Nämä tulokset osoittavat, että ChoKα1 mutta ei ChoKβ, kykenee indusoimaan lisääntynyt solunsisäisiä tasoja PCho kohdassa

in vivo

olosuhteissa. Kuitenkin samoissa olosuhteissa molemmat entsyymit pystyvät tuottamaan phophorylethanolamine. Näin ollen vaikka ChoKβ esittää sekä ChoK ja EtnK mukaista toimintaa

in vitro

olosuhteissa, se osoittaa etuoikeutetut EtnK aktiviteetti

in vivo

.

Lisääntyvät ChoKα mRNA muttei ChoKβ kasvaimen solulinjat

jotta voitaisiin edelleen tutkia merkityksellinen kukin ChoK isoentsyymin tuumorigeneesissä, määritimme tasot sekä ChoKα ja ChoKβ mRNA paneelin ihmisen kasvain- solulinjoissa kvantitatiivisen PCR-tekniikalla . Paneeli rinta- ja keuhkosyövän solulinjat verrattuna ensisijaisen, senescent, ei kasvaimen solulinja HMEC (ihmisen nisäepiteelisoluissa) tai kuolemattomaksi, ei-tumorogeenistä MCF10A solujen valvonnan rinnan solulinjoja, ja ensisijainen Keuhkoputken epiteelisolujen ( BEC) kontrollina keuhkojen solulinjaa. Kaikki kasvainten solulinjat testattu merkittävästi yli-ilmentävät ChoKα mRNA verrattuna normaaliin solulinjojen, kun taas mitään muutoksia ei löytynyt ChoKβ mRNA-tasot (Fig. 6). Nämä tulokset osoittavat, että ChoKβ ei ole erikseen yliaktiivista rinta- tai keuhkosyöpä soluja, mikä viittaa siihen, että korkea ChoKβ ei tarvita edistämiseen syövän.

Q-PCR suoritettiin tason määrittämiseksi ilmentymisen mRNA ei-tumorogeenistä rintarauhasen solulinjoissa (HMEC, MCF10A), rintasyövän solulinjat (MDA-MB435, MDA-MB468, T47D, MCF7), ei-tumorogeenistä keuhkojen solut (BEC) ja keuhkosyövän solulinjat (H510, H82). Tiedot normalisoitiin endogeenisen 18S ribosomaalisen RNA. Jotta vertailu kasvainten ja ei-tuumori- solulinjoista, 2

-ΔΔCt menetelmää sovellettiin ja log

10 RQ on edustettuna. Huomaa, että tiedot viitataan ihmisen nisäepiteelisoluissa (HMEC) mRNA-tasot rintasyövän solulinjoissa ja mitään merkittävää eroa taso molempien ChoK isoformien mRNA löydettiin normaalin MCF10A solulinjassa. Viittaus keuhkosyövän soluja oli ensisijainen keuhkoputken epiteelisolujen (BEC).

MN58b on spesifinen estäjä ChoKα isoformin

Seuraus ChoKα ihmisen syövän synnyn on käytetty suunnittelemaan erityisjärjestelyjä tämän entsyymin estäjät uutena syövänvastainen strategiaa [2], [14], [37]. MN58b on johtava yhdiste tukemaan tätä uutta strategiaa, koska se on osoittanut voimakasta kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta alle

in vivo

olosuhteissa versus ihmisen paksusuolen, keuhko-, rinta- ja virtsarakon kasvainmuodoista [15], [37].

primaarirakenteella nisäkkään ChoKβ näyttää yleisesti 60%: n homologia, kun ChoKα1 [1]. Mitä korkeampi homologia-aste sijoittuu koliini /etanoliamiinin kinaasialue. Tämä homologia voisi tehdä alttiita vastaavan eston sekä ChoKα1 ja ChoKβ samalla estäjiä. Niinpä olemme tutkineet erityisluonteen MN58b kohti näiden kahden ChoK isoentsyymien tarkistaakseen jos sen kasvaimen kasvua estävä vaikutus liittyy nimenomaan estyminen alfa-isoformin, joka on yksi osallistuvat kasvaimen etenemisen tai lääkeaine vastaavasti vaikuttaa molempiin isoformeja. Käyttäen ihmisen ChoKα1 ja ChoKβ rekombinanttiproteiineja, teimme

in vitro

ChoK aktiivisuuden inhibition määrityksessä käytetään yhä MN58b pitoisuuksia, määritetään IC

50 jokaista entsyymiä. Kuten odotettua, huolimatta korkeasta samankaltaisuus välissä näkyy ChoK isomuotojen, MN58b osoitti paljon suurempi spesifisyys vastaan ​​ChoKα1 (IC

50 = 5 uM) kuin vastaan ​​ChoKβ (IC

50 = 107,5 uM). Siten MN58b on 21,5 kertaa tehokkaampi vastaan ​​ChoKα1 kuin ChoKβ isoformi.

Keskustelu

Perheen ihmisen koliini /etanoli- kinaasien käsittää kaksi geeniä,

CHKA

ja

CHKB

jotka koodaavat kolme entsyymejä, ChoKα1 (52 kDa), ChoKα2 (50 kDa) ja ChoKβ1 (45 kDa). ChoKα1 ja ChoKα2 ovat lähes identtiset, paitsi venyttää 18 ylimääräistä aminohappoa ChoKα1, kuin ne ilmenevät ero silmukoinnin samasta geenistä,

CHKA

. Vaikka seuraus ChoKα1 sääntelyssä solujen kasvua ja syöpä on laajasti osoitettu, [13], [15], [27], [28], [37], [38], [44], alustavia todisteita mukaan ChoKβ ei saa osallistua syövän synnyn, koska se ei ole yli-ilmentyy rintasyövän solulinjoissa [21] eikä TRAMP hiiren eturauhassyövän malli [31].

erillisiä ihmisen geenin perhe on kuvattu, joka koodaa EtnK aktiivisuuden [45], mikä viittaa siihen, että EtnK1 on tärkein entsyymi osallistuu PE homeostaasin. ChoK /EtnK domain antaa sen ChoKα ja ChoKβ kyky toimia sekä ChoK ja EtnK mukaista toimintaa solu-vapaissa olosuhteissa [1], [3] – [5], mutta se ei vielä tiedetä, jos nämä aikaisemmin tunnettu entsyymien havaittu mitään selektiivisyyttä kullekin haara Kennedy väylän

de novo

synteesiä PC tai PE. Se on hiljattain kuvattu eri spesifisyyttä Cho ja EtN kaksi isoformia Cho /EtnK on

Tripanosoma bruceita

. Kun taas

Tb

Cho /Etn1 näyttää vain EtnK aktiviteetti,

Tb

Cho /Etn2 esittää sekä ChoK ja EtnK toiminta

in vitro

[46]. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa kuvatuille hiiren EtnK1 joka on ETN erityinen ja EtnK2 joka näyttää dual ChoK /EtnK toiminto [45], [47]. Toisaalta, kun taas hiiren Pcyt1α ja Pcyt1β ovat mukana PC biosynteesiin, Pcyt2 on keskittynyt PE vain [48].

Kuitenkin, se ei ole vielä täysin ymmärretty, jotka ChoK isoformin, jos sellainen on, se vaikuttaa omalta

in vivo

kunkin koulutusjakson säilyttää normaalin homeostaasiin sekä PC- että PE biologisia kalvoja. Tulokset on esitetty tässä vahvistavat, että molemmat entsyymit on kyky fosforyloida koliini ja etanoliamiini alle cell-free-olosuhteet, joko yhdistelmä-DNA-proteiinit tuotetaan

E. coli

, tai solu otteita nisäkässoluissa. Olemme kuitenkin havainneet, että alla kokosolu olosuhteissa ChoKα1 on kyky toimia sekä ChoK ja EtnK, mutta ChoKβ vaikuttaa vain tuotannon PETN. Nämä havainnot eri roolit α ja β-isoformit ovat sopusoinnussa tietoa hiljattain saanut Knock Out (KO) hiirille ChoKα ja ChoKβ geenit [49], [50]. Siten ChoKβ KO hiiret (

RMD

hiiret) ovat elinkelpoisia, mutta kehittää rostrocaudal lihasdystrofia, kun taas normaalia PC rasva-arvot ovat useimmissa kudoksissa analysoitiin paitsi takaraajan luustolihasten [49]. Näin ollen, ChoKα on riittävä ylläpitämään normaalia PC tasolle useimmissa kudoksissa. Sen sijaan puute ChoKα johtaa alkion kuolleisuutta, ja ChoKα

+/- heterotsygoottista hiirillä näyttää kertymistä Cho ja vähentäminen PCho maksassa ja kiveksissä, mikä viittaa siihen, että ei ole ChoKβ korvausta PC biosynteesin

in vivo

. Nämä tulokset viittaavat siihen, eri rooleissa

in vivo

sekä ChoKα ja ChoKβ isoformit. Lisäksi heikennetty tasot PE löytyy ChoKα

+/- heterotsygoottinen hiirissä viittaavat osallistumista ChoKα paitsi biosynteesissä PC mutta myös PE kautta. Tämä on sopusoinnussa myös se, että ChoKβ KO hiirillä, PE tasot säilyvät muuttumattomina, mikä osoittaa, että PE homeostaasin on täysin ylläpidetään EtnK1 ja ChoKα proteiineja ehjä.

ryhmä Ishidate on antanut arvokasta tietoa

in vitro

aktiivisuuden ChoK eri hiiren kudoksista, ja he ovat olettaisi, että aktiivisin muoto koliinikinaasiaktiivisuuden on α /α homodimeeri seurasi α /β heterodimeerejä, ollen β /β homodimeerinä vähiten aktiivinen lomake [8].

in vivo

tulokset esitetään tässä ovat osittain sopusoinnussa tämän hypoteesin.

in vivo

aktiivisuus ChoKβ on keskittynyt PE biosynteesissä ja näyttää suurempi Km koliini kuin ChoKα, tämä voisi olla syy, miksi β /β dimeerit alhaista ChoK aktiivisuutta. Kun ChoKβ yliekspressoitui havaitsimme lisääntyminen solunsisäisiä tasoja PETN mutta ei PCho. Kuitenkin ei havaittu mitään eroja molempien isoformien tuottamiseen PETN, sillä molemmat on samankaltaisia ​​EtnK aktiivisuutta.

PCho on ehdotettu edistämään mitogeneesin nisäkässoluissa [12]. Pitäen mielessä, magneettiresonanssispektroskopia tekniikat ovat osoittaneet korkeampaa phosphomonoesthers in kasvainsolulinjassa näytteissä verrattuna niiden normaaleihin kollegansa [19] – [24]. Lisäksi yli-ilmentyminen ChoKα1 on onkogeenisten [15], ja parannettu ChoKα toiminta on usein ominaisuus tuumorien näytteissä verrattuna normaaleissa kudoksissa [27], [28]. Yhdessä kaikki nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että ChoKα1 aktiivisuuden ja PCho tasoilla on vahva vaikutuksia syövän. Lisäksi yliekspressio ChoKα1 johtaa kasvuun EtnK aktiivisuuden ja PETN tasolla. Kuitenkin tämä vaikutus sinänsä ei ole riittävä indusoimaan solun muuntaminen, koska yli-ilmentyminen ChoKβ ei indusoi tehostettua pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa ja kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa hypoteesin, että se on tuotannon PCho mitä liittyy solujen lisääntymistä ja välittämä transformaatio ChoK, ja että tuotanto PETN saattavat olla riittämättömiä tai merkitystä tässä prosessissa.

Edellä tulokset viittaavat siihen, että kaksi ChoK isoformia tutkitaan lisäksi niiden samankaltaisuus niiden ensisijainen sekvenssit, ovat sekaantuneet eri metaboliareittiä. Niinpä vaikka ChoKα1 osuu molempiin PC ja PE synteesi, ChoKβ vaikuttaa vain PE synteesiä. Lisäksi jalostuskapasiteettia näyttää olevan yksinoikeus ChoKα isoformin. Koska ihmisen HEK293T-, Sk-Br-3 ja H1299 solulinjoissa, ChoKα1 yliekspressio tuottaa kohonneita Sekä PCho ja PETN, vaikka samanlaisia ​​ChoKβ yliekspressio seuraa vain suurempia PETN mutta normaalin PCho, emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että solujen transformaatio vaatii sekä ChoK ja EtnK toimintaa.

yhdenmukainen ajatus, joka yhdistää onkogeeninen aktiivisuus toiminnalle ChoKα, mutta ei ChoKβ, antiproliferatiivinen ja kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus MN58b vasta liittyvät toimintaan of ChoKα. Lisäksi, kuten aiemmin raportoitu,

in vivo

hoidon MN58b johtaa tiettyyn laskua PCho tasoja kasvaimissa, mutta ei merkittävää vaikutusta tasoilla PETN [51]. Edelliset tulokset ryhmämme ovat osoittaneet, että MN58b estää myös koliini liikenteen [38]. Kuitenkin tämä vaikutus on vähäinen vaikutus antiproliferatiivinen ja kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus lääkkeen koska HC-3, paljon voimakkaampi estäjä koliini kuljettajat, on paljon vähemmän voimakas kuin antiproliferatiivisesti kuin MN58b [2]. Lisäksi MN58b on ero vaikuttaa joko normaali tai kasvainsoluja, vahva osoitus differentiaalisen toiminnan takia ChoK esto [38] – [40]. Nämä tulokset ovat myös sopusoinnussa havainto, että ChoKα muttei ChoKβ on myötävirtaan kohde onkogeenisten molekyylien kuten Ras ja RhoA. Näin ollen, vaikka Ras aktivoi ChoKα kautta Ral-GDS ja PI3K [29], ja RhoA aktivoi ChoKα kautta ROCK [15], mikään näistä onkogeenisten GTPaaseja vaikuttaa ChoKβ aktiivisuutta samanlaisissa olosuhteissa. Jälleen nämä tulokset osoittavat, että vaikka molemmat ChoK entsyymit kykenevät fosforyloimaan sekä koliini ja etanoliamiini alle soluttomissa järjestelmissä olosuhteissa, ne näyttää eri affiniteetit näitä alustoille, ja koko solun määrityksissä olosuhteissa niitä säännellään erilliset säätelyreittejä.

Lopuksi osallistuminen ChoKβ rintasyövän ja keuhkosyöpä on tutkittu, ChoKα ja p-mRNA-tasot määritettiin Q-PCR: llä. Kaikki kasvain- solulinjoissa määritettiin merkittävästi yli-ilmentävät ChoKα mRNA, kun taas mitään muutoksia havaittiin ekspression ChoKβ. Samanlaisia ​​tuloksia on viime aikoina raportoitu, käyttäen semi-kvantitatiivisen PCR: rintasyövän solulinjoissa [21].