Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolu (CSC) malli arvelee läsnäolo pieni määrä CSCS heterogeenisessä syöpäsolujen väestöstä, jotka ovat viime kädessä vastuussa kasvaimen aloittamista sekä syövän uusiutumista ja etäpesäke. CSCS on eristetty erilaisista ihmisen syövistä, ja pystyvät tuottamaan hierarkkinen ja heterogeeninen syöpäsolun väestöstä. CSCS ovat myös resistenttejä tavanomaisille kemo- ja radio-hoitoja. Kirjoittajat raportoivat, että ionisoiva säteily voi aiheuttaa kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia heterogeenisissä syöpäsoluja. Altistuminen ei-kantasolujen syöpäsolujen säteilylle tehostetun spherogenesis, ja tämä liittyi säätelyä pluripotenttisuuden geenien Sox2 ja Oct3 /4. Knockdovvn Sox2 tai Oct3 /4 inhiboivat säteilyn aiheuttamien spherogenesis ja lisääntynyt solujen herkkyys säteilylle. Nämä tiedot osoittavat, että ionisoiva säteily voi aktivoida stemness reittejä heterogeenisissä syöpäsoluja, jolloin rikastuminen CSC alapopulaatio paremmin kestävää sädehoitoa.

Citation: Ghisolfi L, Keates AC, Hu X, Lee Dk, Li CJ (2012) Ionisoiva säteily aiheuttaa Stemness syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (8): e43628. doi: 10,1371 /journal.pone.0043628

Editor: Taro Yamashita, Kanazawa University, Japani

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 24 heinäkuu 2012; Julkaistu: 21 elokuu 2012

Copyright: © Ghisolfi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Skip Ackerman Center for Molecular Therapeutics Fund ja Global Research Laboratory Award (opetus- Science and Technology, Korea). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä kantasolut (CSCS), alapopulaatio pahanlaatuisten solujen heterogeeninen syöpäsolun väestöstä katsotaan olevan vastuussa syövän uusiutumiseen, etäpesäke ja lääkeresistenssin. CSCS on eristetty erilaisista ihmisen maligniteettien, mukaan lukien leukemian [1], [2], rintasyöpä [3], [4], aivokasvain [5], maksasyövän [6], haimasyöpä [7] ja peräsuolen syöpä [8], [9]. CSCS on kyky itse uudistaa ja erilaistua lukuisia soluja, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimen massa [10], [11]. CSCS myös ilmaista korkeita lääkeresistenssin kuljettajan proteiineja (esimerkiksi ABC) [12], [13], [14], DNA: n korjaukseen entsyymit [15], [16] ja anti-apoptoottiset proteiinit [17], [18], [ ,,,0],19], mikä tekee niistä erittäin vastustuskykyinen tavanomaisten syövän hoitomuotoja kuten kemoterapiaa ja säteily. Esimerkiksi julkaisemat tutkimukset Bao et al [20] ovat osoittaneet, että ionisoiva säteily voi rikastuttaa CD133 + gliooma syövän kantasoluja

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi nämä kirjoittajat osoittivat, että tämä rikastus vaikutusta välittävät etuoikeutettu aktivoituminen DNA-vaurioita tarkastusasemaa CD133 + gliooma syövän kantasoluja verrattuna CD133- kuin varsi gliooma soluja. CSC malli, kehottaa siksi suunnittelussa terapeuttisten että tavoite CSCS parantaa syövän hoitoon [21], [22].

Vaikka on yhä enemmän todisteita tukemaan CSC hypoteesia, tarkkaa alkuperää näiden solujen edelleen kiistanalainen. Yksi mahdollisuus on, että CSCS johtuvat onkogeenisistä transformaatio normaalin kudoksen kantasolujen [23]. Tässä skenaariossa mutaatiot sääntelymekanismeja ohjaamalla kantasolun itseuudistumisen arvellaan edistää muodostumista CSCS [24], [25], joka sitten tuottaa hierarkkinen ja heterogeeninen syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että peräisin syöpäsolun on kyky tuottaa useita solutyyppejä (eli multidifferentiative plastisuus), tunnusmerkki kantasolujen kaltaisia ​​soluja [26], [27], [28]. Vaihtoehtoisesti, CSCS voi olla peräisin ei-kantasolujen syöpäsolut, jotka ovat saaneet stemness ominaisuudet [22], [29]. Pitäen mielessä, julkaisemat tutkimukset Quintana et al, ja Roesch et al [30], [31] ovat osoittaneet, että CSC fenotyyppi voidaan hankkia tuumorisolut aiemmin negatiivisiksi erityisiä CSC markkereita.

Tässä tutkimus, meidän tiedot viittaavat säteilytys syöpäsolujen uutena potentiaali alkuperä syöpään stemness. Altistuminen heterogeeninen syöpäsolujen ionisoivalle gammasäteilyn parannettu spherogenesis alle kantasolujen viljelyolosuhteissa. Yllättäen säteilytys CSC-köyhdytettyä heterogeeninen syöpäsolu populaatioiden aiheuttamaa syntymistä palloja muodostavan soluja. Molekyylitasolla, analyysi pluripotenttisuuden geeniekspression seuraavat gammasäteilyn osoitti säätely ylöspäin Sox2 ja Oct3 /4 mRNA ja proteiini. Sen sijaan knockdovvn Sox2 tai Oct3 /4 lyhensi elossa pesäkkeet seuraavat sädehoitoa, ja myös merkittävästi esti säteilyn aiheuttamien spherogenesis. Nämä tiedot osoittavat, että säteily voi aktivoida stemness reittejä heterogeenisissä syöpäsoluja, mikä viittaa uuden mekanismin resistenssin syöpäsolujen sädehoitoa. He myös sitä, että kohdentaminen CSCS voi parantaa tehoa sädehoidon.

Tulokset

gammasäteilyä Lisäykset Spherogenesis syöpäsolujen

Ensin tutkittiin, mikä vaikutus ionisoivan säteilyn kyky maksasolusyövän soluja, joita varten CSC komponentti on aiemmin kuvattu [6], [32], kasvaa pallojen mukaisesti kantasoluja media (SCM) viljelyolosuhteet. Yksisolukerrosviljelmänä HepG2 soluista ja Huh7 solut altistettiin 0-10 Gy gammasäteilyä (LD

50 katso kuva S1) ja ympättiin sitten kloonitiheydessä sivulle ultra low kiinnityslevyt seerumittomassa SCM. Sphere muodostumiseen arvioitiin 7 päivän jälkeen ja 14 päivän kulttuuria. Molemmat solulinjat pystyivät muodostamaan palloja (kuviot 1c, 1d). Kuten kuvioissa 1 a ja 1 b, joka on 40-50%: n lisäys pallojen lukumäärä havaittiin HepG2-soluissa päivänä 7 ja päivänä 14, ja Huh7-solut päivänä 14 hoidon jälkeen 2 Gy tai 4 Gy gammasäteilyä. Nämä havainnot osoittavat, että ionisoiva gammasäteilyn avulla voidaan lisätä huomattavasti

in vitro

spherogenesis HepG2 ja Huh7 soluja.

A ja B HepG2 solut (a) ja Huh7 soluja (b), altistettiin kasvavia annoksia gamma-säteilyä, ja sitten ympätään kantasolujen median 96-kuoppaisille ultra low kiinnityslevyt 500 solua /kuoppa. Pallo numerot laskettiin 7 päivän jälkeen (ylhäällä) ja 14 päivää (alhaalla) kulttuurin, ja suhteellinen numerot olivat raportoi kuvaajia. Alempi säteilyannokset 2 ja 4 Gy indusoi merkittävää kasvua alalla muodostumista molemmissa solulinjoissa verrattuna käsittelemättömiin näytteisiin. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM neljästä riippumattomasta kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja. C ja D edustavat kuvat HepG2 (c) ja Huh7 (d) pallojen muodostunut 14 päivän jälkeen kulttuurin kantasolujen media. Kuvat otettiin käyttäen digitaalikameralla (AmScope, iScope Corp., Chino, CA), joka on asennettu Zeiss Axiovert 25 käännettyä mikroskooppia. Suurennos: 100x.

gammasäteilyä indusoi Spherogenesis HepG2 ja Huh7 Non-side Väestö Cells

Side väestö virtaussytometrialla (määritelty kyky sulkea DNA-sitovan väriaine Hoechst 33342 ) [33], [34] on käytetty rikastuttaa CSC ja ei-CSC eri syöpäsolulinjoissa sekä johdetut viljelmät primaaristen kasvainten [26], [35], [36]. Tämä lähestymistapa on osoittanut, että HepG2 ja Huh7 CSCS edustavat ~1-2% irtotavarana kasvainsolujen [6], [32]. Koska kyky muodostaa palloja

in vitro

alle tarttumattomat viljelyolosuhteet pidetään ominaisuus CSCS [32], [37] meidän tiedot viittaavat voimakkaasti siihen, että gammasäteilyä HepG2 ja Huh7 solujen merkittävästi lisääntynyt määrä CSCS molemmissa solulinjoissa.

sen tutkimiseksi, lisääntynyt spherogenesis havaittu altistumisen gammasäteilyn saattavat olla peräisin sisällä heterogeeninen kuin kantasolujen syöpäsolun väestö, käytimme puolella väestöstä virtaussytometrialla tunnistamaan ja eristämään ei- CSC HepG2 ja Huh7 soluja. Tyypillinen ei-puolen väestöstä lajittelu kokeilu on esitetty kuvassa 2a. Solut herkkä effluksipumpun estäjä verapamiili (R3 portti) alhaista Hoechst värjäyksen intensiteetti ja tunnistettiin puolella väestöstä (SP) komponentti kasvain (eli CSC-rikastettu). Verapamiili erottelua solujen korkea Hoechstin värjäyksen intensiteetin (R4 portti) eristettiin ei-puolen väestöstä (non-SP) soluissa. Sen mahdollisuuden poissulkemiseksi epäspesifisten vaikutuksia pallo muodostumista johtuvat FACS lajittelun menettely, HepG2 ja Huh7 solut olivat myös mock-lajiteltu perustuu propidiumjodidi (PI) värjäys. Sen jälkeen solulajittelussa SCM, ei-SP (eli CSC köyhdytettyä) soluja ja kontrollisoluja (lajittelemattomien irtotavarana tai PI-lajitellaan HepG2 ja Huh7) säteilytettiin 0, 2 tai 4 Gy gammasäteilyä SCM. Säteilytetyt irtotavarana, säteilytettyä kuin SP-soluissa ja säteilytettyä PI-lajiteltu jälkeen solut ympättiin ultra low kiinnityslevyt ja pallo muodostumiseen arvioitiin jälkeen 7 ja 14 päivän kulttuuriin.

HepG2-soluissa (vasen paneelit) ja Huh7 solut (oikea paneeli) värjättiin Hoechst 33342 kanssa (alempi paneelit) tai ilman (ylempi paneeli) Verapamiili, ja sitten lajitellaan käyttäen MoFLO2 fluoresenssi solulajittelijaa. R3 portti tunnistanut Side Population (SP) fraktio. Non-Side Population (Non-SP) soluissa, eristettiin kautta R4 portin, kerättiin, huuhdeltiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen kantasolujen media. B ja C Lajittelemattomat, ei-SP ja PI-lajiteltu HepG2 (b) ja Huh7 (c) solut altistettiin 0, 2 tai 4 Gy gammasäteilyä ja sitten ympättiin 96-kuoppaisille ultra low kiinnityslevyt 500 solua /kuoppa . Sphere numeroita Sitten laskettiin 7 päivän jälkeen (ylälevyissä) ja 14 päivää (alapaneeli) kulttuurin, ja suhteellinen numerot olivat raportoi kuvaajia. Valkoiset pylväät edustavat lajittelematonta kasvainsoluja, mustat palkit edustavat lajitellaan ei-puolen väestöstä (non-SP) soluihin, ja viivoitetut pylväät edustavat PI-lajitellut solut. 14 päivän jälkeen kulttuurin SCM, säteilyannokset 2 ja 4 Gy indusoi merkittävä kasvu alalla muodostumiseen irto- kasvain väestö ja ei-SP väestöstä molemmissa solulinjoissa verrattuna hoitamattomiin näytteitä, kun taas PI-lajiteltu Huh7 solut osoittivat huomattavasti pallo muodostumista seuraava 2 Gy sädehoidon. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM viidestä itsenäisestä kokeesta (lajittelemattomia ei-SP populaatiot) tai keskiarvo ± SEM kaksi erillistä koetta (PI-lajiteltu populaatio). * P 0,05, ** p 0,01 versus käsittelemätön kontrolli soluja.

Kuten kuviossa 2b ja kuviossa 2c, ei merkittävää eroa alalla muodostuminen havaittiin 7 vuorokauden kulttuurin SCM lajittelemattoman ei-SP, tai PI-lajiteltu HepG2 tai Huh7-solut altistettiin 2 tai 4 Gy gammasäteilyä. Sen sijaan, lajittelemattoman HepG2-soluissa altistetaan 2Gy säteilyn ja lajittelemattoman Huh7-solut altistettiin 2 tai 4 Gy säteilyn oli kasvanut merkittävästi alalla muodostumisen jälkeen 14 päivää viljelyn SCM (kuva 2b, 2c). Lisäksi PI-lajiteltu ohjaus solut molemmista solulinjoista osoittivat samanlaisia ​​palloja muodostavan kyvyn lajittelemattomien irtotavarana HepG2 tai Huh7 soluissa 14 päivän jälkeen kulttuurin SCM. Erityisesti PI-lajiteltu Huh7 soluja altistetaan 2 Gy gammasäteilyä osoitti huomattavasti pallo muodostumista kuluttua 14 päivän viljelyn SCM (p 0,05). PI-lajiteltu HepG2 solut altistettiin 2 tai 4 Gy säteilyn näytetään myös merkittävästi koholla pallo muodostumista 14 päivän jälkeen kulttuurin SCM. Nämä erot, eivät kuitenkaan tilastollisesti merkitsevä. Yllättäen altistuminen gammasäteilyn selvästi aiheuttama spherogenesis ei-SP jakeet HepG2 ja Huh7 soluja 14 päivän jälkeen kulttuurin SCM. Varten HepG2-soluja, käsittelemällä ei-SP osa 2 Gy gammasäteilyä indusoi 150%: n lisäys alalla muodostumiseen verrattuna käsittelemättömiin ei-SP-soluja (p 0,001). Samoin hoito Huh7 kuin SP solujen 4 Gy gammasäteilyä indusoi 80% kasvu alalla muodostumiseen (p 0,01). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että pieni annos gammasäteilyä voidaan edistää muodostumista CSCS sisällä heterogeeninen kuin kantasolujen syöpäsolun väestöstä.

Stemness Gene Expression lisääntyy HepG2 ja Huh7 Solujen jälkeen gammasäteilyä hoito

sen tutkimiseksi, mikäli lisääntynyt spherogenesis aiheuttama gammasäteilyllä voi johtua kohonnut stemness geenin ilmentymistä, HepG2-soluissa ja Huh7 solut altistettiin eri annoksia gamma-säteilyä, ja taso Oct3 /4 ja Sox2 mRNA arvioitiin real- PCR. Kuten on esitetty kuviossa 3a ja 3c, merkittävä kasvu Oct3 /4-mRNA: n ja proteiinin havaittiin HepG2-soluissa 6 tuntia altistuksen jälkeen ja 2 tai 4 Gy gammasäteilyä. Lisääntynyt Oct4 proteiini tasot havaittiin myös Huh7 soluissa 6 tuntia altistuksen jälkeen 4 Gy säteilyn (kuvio 3d). Säteilyn aiheuttamista lisäyksiä tason Huh7 solun Oct3 /4 mRNA, kuitenkaan ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuva 3b).

A ja B, E ja F HepG2 ja Huh7 solut altistettiin 0, 2 tai 4 Gy gammasäteilyä, ja kokonais-RNA uutettiin sen jälkeen 3, 6 tai 24 tuntia. Oct3 /4 (a ja b) ja Sox2 (e ja f) mRNA-tasot kussakin solulinjassa määritettiin sitten kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitiin GAPDH mRNA-tasot kussakin näytteessä. HepG2-soluja, käsiteltiin 2 ja 4 Gy gammasäteilyä indusoi merkittävää lisäystä Oct3 /4 mRNA-tasoja. Sox2 mRNA-tasot myös voimakkaasti yläreguloituja Huh7 soluissa pieni annos gammasäteilyä hoitoa. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM neljästä riippumattomasta kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0001 vs. t0 näytteen tai käsittelemättömiä näytteitä. Katkoviiva edustaa verrattuna valvonta samana ajankohtana. C ja D, G ja H HepG2-soluissa ja Huh7-solut, altistettiin 0, 2 tai 4 Gy gammasäteilyä ja Oct4 tai Sox2 proteiinin ilmentyminen määritettiin Western blot -analyysillä sen jälkeen, kun 6 tuntia (Oct4, c ja d), tai 4 tunnin kuluttua (ja Sox2, g ja h). Oct4 ja Sox2 proteiini nousivat seuraavat sädehoitoa sopusoinnussa kasvaa mRNA tasot jokaiselle geeniä.

Yhdenmukainen havaintomme koskien Oct3 /4 ilmaisun, huomasimme, että Sox2 mRNA ja proteiini-tasot olivat merkitsevästi lisääntynyt Huh7-soluissa 3 ja 6 tuntia altistuksen jälkeen 4 Gy säteilyn (kuvio 3f, 3h). Ei kuitenkaan kasvua Sox2 mRNA ja proteiini tasoilla havaittiin HepG2-soluissa sädehoitoa (kuvio 3e, 3g). Nämä tulokset viittaavat siihen, että gammasäteilyä voi aiheuttaa uudelleenohjelmointia eriytetty syöpäsolujen enemmän varsi kaltainen fenotyyppi indusoimalla stemness geeniekspressiota.

Oct3 /4 ja Sox2 knockdown herkistää HepG2 ja Huh7 Hepatosellulaarinen syöpäsolujen gammasäteilyn

Koska Sox2 ja Oct3 /4 säätelyä korreloi lisääntynyt stemness (spherogenesis) HepG2 ja Huh7 solujen altistuksen jälkeen gammasäteilyä, me seuraavaksi tutkittava, onko nämä tekijät voivat vaikuttaa kykyyn HepG2 tai Huh7 soluja vastustamaan sädehoitoa. Näitä kokeita varten, Sox2 tai Oct4 geenin ilmentyminen on vaiennettu vuonna Huh7 ja HepG2-soluissa käyttäen epäsymmetristä häiritsevä RNA (aiRNA). aiRNA valittiin, sen sijaan, että siRNA, johtuen niiden erinomaisen spesifisyyden [38]. Knockdown tehokkuutta arvioitiin Western blot 48 h kuluttua aiRNA transfektion. aiRNA kohdistaminen Sox2 tai Oct4 tehokkaasti vähentää ilmentymistä sekä proteiinien (kuvio 4a ja 4b). Tämä vastaa aiempien tutkimusten avulla alkion kantasoluja, jotka osoittavat Oct4 ja Sox2 liittyvät samaan sääntelyyn koulutusjakson, joka sisältää automaattisen sääntelyyn silmukoita ja vastavuoroinen automaattisen transkription asetuksen [39], [40]. Yksittäinen geeni Knockdown sisällä Sox2-Oct4 sääntelyyn piiri olisi näin ollen odotetaan vähentävän ilmentymisen tasoa sekä proteiineja.

A ja B HepG2-solut (a) ja Huh7-solut (b), transfektoitiin 100 nM aiRNA kohdistaminen GFP, Sox2 tai Oct4 ja knockdown tehokkuutta arvioitiin Western blot 48 tunnin kuluttua. Sox2 ja Oct4 kuuluvat samaan sääntelyn piiriin; Näin ollen, yksittäinen geeni pudotus johtaa vähentyneeseen ekspressiotasoja molemmat proteiinit. C ja D HepG2 ja Huh7-solut transfektoitiin aiRNA kohdistaminen GFP, Sox2 tai Oct4 säteilytettiin 0, 2, 4, 6, 8 tai 10 Gy gammasäteilyä ja yhtä suuri määrä soluja maljattiin 6-kuoppaisille levyille pesäkemuodostusta . Päivänä 7, pesäkkeet laskettiin ja elossa olevien klonogeeniset solujen ilmaistaan ​​luonnollisena lokin piirrettiin. Rivit on asennettu käyttämällä ensimmäisen kertaluvun polynomiregression ja edustavat keskiarvoa neljästä itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna GFP-transfektoiduissa soluissa.

vaikutuksen arvioimiseksi Sox2 tai Oct4 Knockdown solujen elävyys sen jälkeen sädehoitoa, Huh7 ja HepG2-solut transfektoitiin aiRNA kohdistamista Sox2, Oct4 tai GFP. 24 tunnin kuluttua solut jaettiin ja altistettiin 0, 2, 4, 6, 8 tai 10 Gy gammasäteilyä. Yksisolususpensiot ympätään sitten täydellinen DMEM standardin 6-kuoppaisille levyille, jotta solut saisivat kiinnittyä ja muodostaa pesäkkeitä. Kun 7 päivän viljelyn täydellisessä DMEM yhdyskunnat muovailla kunkin hoidon värjättiin ja laskettiin. Kuten kuviossa 4c ja 4d, hiljentäminen ja Sox2 tai Oct4 geeniekspression HepG2 ja Huh7 solut johti merkittävään kasvuun herkkyydessä gammasäteilyn (vähentynyt LD

50 arvoa; katso taulukko 1) verrattuna soluihin transfektoitu aiRNA suunnattu GFP, tai ei-transfektoiduissa soluissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että downregulation stemness geenit voivat herkistää maksasyövän solut gamma sädehoitoa.

Oct3 /4 ja Sox2 knockdown HepG2 tai Huh7 Solujen Estää säteilyn aiheuttamien Sphere Formation

koska pudotus on Sox2 tai Oct4 lisääntynyt herkkyys HepG2 ja Huh7-solut sädehoitoa, tutkimme seuraavaksi, onko spherogenesis kyky HepG2 ja Huh7-soluissa gamma-säteilytys, joka liittyy ilmentymisen näistä tekijöistä. Arvioida säteilyn vaikutusta hoidon, Huh7 ja HepG2-solut transfektoitiin aiRNA suunnattu Sox2, Oct4 tai GFP, talteen 24 h, ja sitten jaetaan ja altistettiin 0, 2 tai 4 Gy gammasäteilyä. Sitten solut ympättiin kloonitiheydessä päälle ultra-low kiinnityslevyt seerumittomassa SCM. Kun 7 päivän viljelyn gammasäteilytetty transfektoitujen solujen aiRNA suunnattu GFP osoitti samanlaista lisäystä alalla muodostumista käsittelemättömän ryhmän. Huh7 ja HepG2-soluissa käsiteltiin Sox2 tai Oct4 aiRNA ja altistetaan säteilylle, muodostetaan kuitenkin huomattavasti vähemmän aloilla kuin ohjaus transfektoitujen solujen GFP aiRNA (kuvio 5a ja 5b). Vielä tärkeämpää on, solut käsiteltiin Sox2 tai Oct4 aiRNA oli merkitsevästi alentunut kyky muodostaa palloja altistuminen 2 tai 4 Gy gammasäteilyä, verrattuna ei säteilytetty soluihin. HepG2-solut, merkittävä esto pallo muodostumista on havaittu myös ei-säteilytetty solujen upon hiljentäminen on Sox2 tai Oct4. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen Sox2 ja Oct3 /4 vaaditaan CSC HepG2 ja Huh7 soluja, ja että säätelyä näiden tekijöiden ei-CSCS voi riittää aiheuttamaan hankinta CSC fenotyypin siten antaen korkeamman säteilyn kestävyys on suurin tuumorisolupopulaatioon.

A ja B HepG2-soluissa ja Huh7-solut transfektoitiin aiRNA kohdistaminen GFP, Sox2 tai Oct4 altistettiin 24 tunnin jälkeen 0, 2 tai 4 Gy gammasäteilyä, ja sitten maljattiin 96-kuoppaisille ultra low kiinnityslevyt 500 solua /kuoppa kantasolujen media. Sphere numerot kunkin Knockdown ryhmää ja sädehoitoa rekisteröitiin Viljelmän päivänä 7 kantasolujen media. Hiljentäminen Sox2 tai Oct4 vähensi pallo muodostumista HepG2 ja Huh7 soluja käsiteltiin pienillä annoksilla gammasäteilyä verrattuna ei-säteilytetty solut tai solut transfektoitu aiRNA vastaan ​​GFP. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM neljästä riippumattomasta kokeesta, n = 4. * p 0,05, ** p 0,01, verrattuna GFP-transfektoituja soluja tai ei-säteilytettyjen kontrollisoluja (0 Gy).

keskustelu

Syöpä kantasolut (CSCS) arvellaan edustamaan pieni osa-solupopulaatio läsnä useimmissa kasvaimia että samanlainen normaalin kudoksen kantasolujen hallussaan kyky itse uudistaa, jakaa epäsymmetrisesti ja symmetrisesti, ja tehdään useita linjan erilaistumista [41], [42]. Nämä piirteet CSCS ovat pohjimmiltaan vastuussa niiden ainutlaatuinen kyky luoda ja ylläpitää kasvaimissa [10], [42], [43]. Lisäksi CSCS uskotaan myös avainasemassa syövän etäpesäkkeiden, syövän uusiutumiseen, ja syöpä lääkeresistenssin [15], [20], [44], [45].

Tässä tutkimuksessa osoitamme että syöpäsolut voidaan indusoida, gammasäteilyn, hankkia stemness, jolle on tunnusomaista kasvanut stemness geenin ilmentymisen ja syövän kantasolun fenotyyppi. Side väestö virtaussytometria on osoittanut, että CSCS HepG2 ja Huh7 edustavat noin 1-2% bulk kasvainsolujen [6], [32]. Ottaen huomioon, että kyky muodostaa palloja in vitro ei-tarttuva viljelyolosuhteissa on spesifinen CSCS [32], [37], meidän tiedot osoittavat, että gammasäteilytys HepG2 ja Huh7-soluissa lisäsi merkittävästi määrä CSCS molemmissa solulinjoissa.

Viimeaikaiset julkaisut ovat osoittaneet, että toisin kuin suurin kasvainsoluja, CSCS hallussaan luontainen vastustuskyky sädehoitoa

in vitro

ja

in vivo

[20], [45], [ ,,,0],46], ja että tämä ominaisuus todennäköisesti johtuu korkeampi ilmentyminen vapaiden radikaalien poistavaa entsyymejä, tehostuminen DNA-vaurioita korjaus ja suosivaa DNA-vaurioita tarkastuspiste aktivointi [15], [16], [20], [47] . Tutkimaan edelleen alkuperä lisääntynyt määrä CSCS gammasäteilytettyihin HepG2 ja Huh7 solujen suoritimme virtaussytometrillä käyttämällä Hoechst 33342 eksluusio eristämiseksi puolelle väestöstä (SP) soluja, jotka rikastettu CSC, ja ei-puoli väestöstä (non-SP ) soluja, jotka ovat uhanalaisia ​​CSC. Yllättäen havaitsimme kasvoi merkittävästi alalla muodostumista HepG2 ja Huh7 ei-SP-solujen altistuksen jälkeen 2 tai 4 harmaa gammasäteilyä (kuvio 2). Lisäksi lisääntynyt pallo muodostuminen havaittiin myös hoitamattomilla HepG2 ja Huh7 kuin SP-soluissa. Nämä havainnot osoittavat, että ei-SP-soluissa (ts CSC kasvainsoluja) voidaan hankkia CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia, ja ovat yhdenmukaisia ​​viimeaikaisten käsite, joka kasvaimet koostuvat eri solujen eri kypsyminen vaiheissa [48], [49] , joilla on kyky muuntaa entistä kantasolujen kaltainen tila [50], [51].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että säteilyn aiheuttama rikastamista CSCS liittyy aktivaatio itseuudistumisen signalointireittien tällaiset koska Wnt /β-kateniinin, Notch ja Hedgehog [52], [53], [54]. Lisäksi, koska CSCS pystyvät sekä epäsymmetrisen ja symmetrisen solunjakautumisen [55], [56] rikastamista vaikutuksen uskotaan välittyvän pääasiassa CSCS olevien symmetrinen solunjakautumisen. Tuloksemme kuitenkin viittaavat siihen, että ylimääräinen osa tätä vaikutus voi olla hankinnan stemness ominaisuuksien kun sädehoitoa ei-varsi syöpäsoluja. Tätä päätelmää tukevat myös havaintomme lisääntyneen Sox2 ja Oct3 /4 pluripotenttisuus geeniekspression maksasolukarsinoomassa soluissa gammasäteilyä (kuva 3).

Yhdessä c-Myc, Klf4 ja Nanog, Sox2 ja Oct3 /4 transkriptiotekijät pidetään avain geenien tuotantoon hiiren ja ihmisen indusoi pluripotenttien kantasolujen [57], [58]. Erityisesti Sox2 ja Oct3 /4 ilmaisu näyttää olevan keskeinen rooli ylläpidosta itseuudistumisen, plastisuus ja uudelleenohjelmointi kyky sekä alkion kantasoluja ja CSCS [59], [60], [61], [62] . Lisääntynyt ilmentyminen Sox2 ja Oct3 /4 seuraavat gammasäteilyä hoidon (kuvio 3) on näin ollen yhdenmukainen induktion geneettisen ohjelman joitakin HepG2 ja Huh7-soluja, joka johtaa lisääntyneeseen stemness, ja hankinta kantasolun kaltainen fenotyyppi [ ,,,0],63], [64], [65]. Koska CSC osa molemmissa solulinjoissa edustaa ≤2% koko solupopulaation (kuvio 2) [6], [32], havaittu yli-ilmentyminen Sox2 ja Oct3 /4 HepG2 ja Huh7-soluissa pieni annos säteilytyksen todennäköisesti edustaa muutoksia kuin CSC väestöstä.

tässä tutkimuksessa havaitsimme, että säätelyä alaspäin Sox2 ja Oct3 /4 HepG2 tai Huh7 soluja oli heikompi vastustuskyky gammasäteilyä joka klonogeeniset selviytymisen määritys, joka mahdollistaa selviytymisen ja proliferaation kantasolujen syöpäsolujen sekä CSCS (kuvio 4). Tämä havainto on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten osoittaa, että radioresistance irtotavarana kasvainten solujen näyttää liittyvän CSC komponentti kasvaimen väestöstä [20], [45], [46]. Tämän tutkimiseksi edelleen, me pudotti Sox2 tai Oct4 ilmaisua HepG2 tai Huh7 solujen epäsymmetrisillä-RNA teknologian ja tutkittiin niiden kykyä kasvaa pallo kulttuureissa. Huomasimme, että knockdovvn Sox2 tai Oct4 ilmentyminen liittyy merkittävä väheneminen alalla muodostumiseen seuraavissa gammasäteilyä hoidon (kuva 5). Koska tämä koe suoritettiin alle kantasolujen viljelyolosuhteissa, jotka ovat selektiivisiä CSC rikastamiseen ja selviytymistä, tuloksemme olisi vain heijastaa vaikutus Sox2 ja Oct3 /4 knockdown päällä CSCS. Mielenkiintoista, Sox2 ja Oct3 /4 downregulation vähensi alalla muodostavan kyvyn ei-säteilytetty HepG2 ja Huh7 soluja, mikä osoittaa, että nämä tekijät voivat myös vaatia huoltoa nykyisten CSCS. Nämä havainnot viittaavat siihen, että knockdovvn Sox2 ja Oct3 /4, voi olla mahdollinen lähestymistapa herkistävät maksasolukarsinoomat sädehoitoon, koska saarto nämä tekijät voivat estää itseuudistumisen ei-CSCS jotka ovat hankkineet stemness ominaisuuksia, sekä nykyisiä CSCS.

Pitkäaikainen, ei-kohdennettu vaikutuksia, ionisoivan säteilyn, kuten perimän epävakaisuuden, sopeutumisreaktiot ja sivustakatsojavaikutus katsotaan olevan merkittävä rooli säteilyn aiheuttama syövän synnyn [66], [67], [68] . Solujen altistaminen säteilylle, erityisesti pienten annosten, voi välittää genomin epästabiilisuuden ja sopeutumisreaktiot, on potentiaalia aiheuttaa geeniekspression, kromosomi uudelleenjärjestely, translaation jälkeiset modifikaatiot ja epigeneettiset muutokset aloittaa syövän synty. Nämä muutokset voivat myös indusoida muiden solujen, jotka eivät ole joutuneet ensimmäistä säteilyn vaurioita (mukaan sivustakatsojavaikutus), mikä on enemmän monistettiin fenotyyppi. Lisäksi ne ovat periytyviä, ei-klonaalisia, ja luottaa epigeneettisiä muutoksia, kuten säätely- DNA: n metylaatio [69], [70], [71]. Meidän todennut, että gammasäteilyä voi aiheuttaa spherogenesis ei-kantasolujen syöpäsoluja, ja että tämä prosessi edellyttää ilmaisun Sox2 ja Oct3 /4, ovat sopusoinnussa aktivointi ”stemness ohjelma” välittyy kohdentamattomaan epigeneettiset vaikutuksia säteilytettyjä soluja jos kyseeseen geenin ilmentyminen liittyy merkittävästi lisääntynyt radio-vastus [72].

viimeisen vuosisadan sädehoitoa on käytetty laajalti parantavaa tai adjuvantti syövän hoitoon, ja pieni annos säteilyä lievittävä toimenpide hallintaan joilla on pitkälle edennyt syöpä. Kuitenkin useimmat ihmisen maligniteettien, mukaan lukien hepatooma, reagoivat huonosti tämän tärkeän hoitomuoto. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että säteily voi aiheuttaa kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten pallo muodostumista ja stemness geeniekspression kuin CSCS, mikä osoittaa, että ei-kantasolujen syöpäsolut voivat hankkia lisää kantasolu- kaltainen tila tiiviimmän kyky itsenäisiin uudistaa, mikä viittaa uusi mekanismi radioresistance yleisesti havaittu ihmisen syöpäsairauksia.

Methods

Soluviljely ja lääkehoito

HepG2 maksasyövän solut hankittiin American Type Culture Collection (HB-8065). Huh7 maksasyövän solut ystävällisesti Dr. Raymond Chung [73], [74]. HepG2 ja Huh7 ihmisen maksasyövän-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma-Aldrich), 2 mM glutamiinia, 50 IU /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. Arvioida pallo muodostuminen (spherogenesis) HepG2 ja Huh7 soluja viljeltiin kantasolujen media (SCM) koostuu DMEM-F12, 1 x B27 täydentää, 200 ng /ml EGF, 10 ng /ml perus-FGF, 0,4% BSA, 4 ug /ml insuliinia, 50 IU /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

gammasäteilyä hoito

Lajittelematta HepG2 ja Huh7-solut ja ei-SP lajitellun populaation suspendoitiin SCM jaettiin eriin 1,5 ml: n putkiin, jonka pitoisuus on 1 x 10

6 solua /ml. Putket sijoitettiin jäihin ja säteilytettiin 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy tai 10 Gy gammasäteilyä käyttämällä

137Cs säteilyttäjällä (CIS Diagnostic). Käsitellyt solut ympätään sitten SCM spherogenesis määritystä (0.5 x 10

3 /kuoppa), tai täydellinen DMEM MTT elinkelpoisuuden määritys (1 x 10

3 solua /kuoppa) ja pesäkemuodostusta ( 3 x 10

3 solua /kuoppa).

Hoechst 33342 Värjäys ja Side Population virtaussytometria

Side Population virtaussytometrialla suoritettiin menetelmän Goodell et al. [75] kanssa muutoksia parantaa värjäytymisen maksan solulinjoja. Lyhyesti, HepG2 tai Huh7 viljelmät trypsinisoitiin ja irrottaa solut otettiin talteen sentrifugoimalla 500 rpm 5 minuuttia. Pelletoidut solut suspensoitiin uudelleen konsentraationa 10

6 solua /ml esilämmitetyssä DMEM, jota on täydennetty 2% FBS: ää ja 10 mM HEPES, joka sisälsi 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) kanssa tai ilman 50 uM verapamiili (Sigma-Aldrich). Sitten soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vesihauteessa 90 minuuttia kevyesti sekoittaen 15 minuutin välein. Lopussa itämisaika, solut sentrifugoitiin 500 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja suspendoitiin uudelleen lopulliseen konsentraatioon 2 x 10

7 solua /ml jääkylmää Hankin puskuroidulla suolaliuoksella, johon on lisätty 0,2% FBS: ää, 10 mM HEPES, 40 pm mesh-suodatettiin ja värjättiin 2 ug /ml propidiumjodidia. Näytteitä pidettiin jäissä, kunnes ne erotettiin käyttäen MoFlo nopea FACS kone (DakoCytomation) jakeisiin, joka sisälsi Side Population (SP) solut ja ei-Side Population (ei-SP-solut) [6], [32], [ ,,,0],33], [34]. Hoechst 33342 oli innoissaan ja UV laser 350 nm ja sen fluoresenssi havaittiin käyttämällä 450 nm: n Hoechst sininen suodatin ja 670 nm: n Hoechst punainen suodatin. Propidiumjodidia fluoresenssi mitattiin käyttäen 650 nm: n suodattimella. Non-SP ja lajittelemattoman solut siirrettiin sitten SCM gamma sädehoitoa ja analysointi pallo muodostumista. PI-lajittelu bulk-solujen, HepG2 ja Huh7-solut suspensoitiin uudelleen konsentraationa 10

6 solua /ml esilämmitetyssä DMEM, jota on täydennetty 2% FBS: ää ja 10 mM HEPES, käsiteltiin sitten edellä kuvatulla tavalla.