Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Järjestö on ksenotrooppisen hiiren leukemiaviruksen liittyvä virus (XMRV) eturauhasen syöpä saa edelleen syventäneet huomiota tutkimusten mukaan discrepant XMRV esiintyvyyden vaihtelee nollasta jopa 23%. On epäselvää, jos erot diagnostinen testaus, sairauden vakavuus, maantiede tai muut tekijät selittävät ristiriitainen tuloksia. Raportoimme tässä yleisyyttä XMRV populaatiossa, jossa on hyvin määritelty eturauhasen syöpiä ja RNaasi L polymorfismi. Käytimme laajasti reaktiivisen PCR ja Western blot (WB) määritykset havaitsemaan infektio XMRV ja siihen liittyvät hiiren leukemia viruksia (MLV).

Menetelmät /Principal Havainnot

tutkituissa näytteissä 162 US diagnosoidaan eturauhasen syöpä, joiden väli on pitkälle (Gleason Kymmeniä 5-10, kohtalainen (46%) heikosti eriytetty kasvaimet (54%)). Eturauhasen kudosta DNA testattiin PCR-määrityksissä, jotka tunnistavat XMRV ja MLV variantteja. Jos haluat sulkea pois kontaminaatio hiiren DNA, me myös suunnitella ja käyttää hiiren-spesifinen DNA PCR-testissä. Yksityiskohtainen fylogeneettistä analyysiä käytettiin päätellä evoluution suhteita. RNaasi L tyypitys osoitti, että 9,3% oli homotsygoottisia (QQ) varten R462Q RNaasi L mutaatio, kun taas 45,6% ja 45,1% oli homotsygoottinen tai heterotsygoottinen vastaavasti. Serologinen testaus suoritetaan WB testi. Kolme 162 (1,9%), eturauhasen kudoksen DNA oli PCR-positiivisia XMRV ja oli havaittavissa hiiren DNA: ta. Ei ole ollut homotsygoottisia QQ mutaation. Plasma kaikki kolme henkilöä oli negatiivinen viruksen RNA: n RT-PCR: llä. Kaikki 162 potilaat olivat WB negatiivisia. Fylogeneettinen analyysi päätellä selvä XMRV.

Johtopäätökset ja niiden merkitys

Olemme löytäneet hyvin alhainen esiintyvyys XMRV eturauhassyöpäpotilailla. Infektio varmistettiin fylogeneettinen analyysi ja puuttuminen kontaminoivien hiiren DNA. Havainto on huomaamaton vasta-aineiden ja viremia kaikissa kolmessa potilaat saattavat heijastaa piilevä infektio. Tuloksemme eivät tue yhteenliittymää XMRV tai MLV variantteja, joilla on eturauhasen syöpä.

Citation: Switzer WM, Jia H, Zheng H, Tang S, Heneine W (2011) o ry ksenotrooppiset hiiren leukemiavirus-Related viruksia Eturauhassyöpä. PLoS ONE 6 (5): e19065. doi: 10,1371 /journal.pone.0019065

Editor: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 helmikuu 2011; Hyväksytty: 15 maaliskuu 2011; Julkaistu: 04 toukokuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: rahoitus tutkimuksen antamien Centers for Disease Control and Prevention kohden vuotuiset määrärahat Yhdysvaltain hallitus. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmistä, hitaasti kasvava, noncutaneous pahanlaatuisia kasvaimia miehistä kehitysmaissa [1]. Esimerkiksi on arvioitu, että yli 192.000 miestä Yhdysvalloissa, enimmäkseen Afrikkalainen Amerikan laskeutuminen, diagnosoidaan eturauhassyöpä tänä vuonna [2], [3]. Vaikka luonnollinen historia eturauhasen syöpä ei tällä hetkellä tiedetä, useita etiologies on arveltu, kuten geenivirheitä [4], [5], [6]. Vuonna 2006, käyttäen microarray ja RT-PCR-analyysi ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen (MLV) liittyviä virus (XMRV) tunnistettiin ensimmäistä kertaa noin 40% familiaalinen eturauhassyövän potilailla, jotka sisältävät R462Q mutaatio RNaasi L-geeni, joka on osa antiviraalisen luontaisen immuniteetin [7]. MLV ovat endogeenisiä gammaretroviruses jotka ovat integroitu hiiren genomiin ja voi aiheuttaa syöpää, neurologisia sairauksia ja immuunivajavuustauteja hiirillä ja luokitellaan kolmeen ryhmään niiden isäntä tropismista [8]. Ksenotrooppiset MLV (XMLV) jäljitellä ainoastaan ​​ei-hiiren soluissa. Sen sijaan, ekotrooppisen MLV (EMLV) replikoitua vain hiirillä, kun taas polytrooppinen MLV (PMLV) on laajempi tropismi ja voi replikoitua hiiren ja ei-hiiri-isäntien [8]. XMRV osakkeista noin 93% ja 89% nukleotidin identiteetti XMLV ja PMLV kaikkialla genomissa [7]. Tunnistaminen mahdollisen viruksen syy eturauhasen syöpä on erittäin merkittävä, koska se voisi helpottaa hoitoon ja ehkäisyyn tämän heikentävä sairaus.

Lisätodistusaineistoa XMRV infektion henkilöiden eturauhassyövän on raportoitu Yhdysvalloissa tutkimuksen, jossa on suurempi esiintyvyys XMRV DNA havaitseminen PCR (6%) ja virusproteiineja immunohistokemiallisesti (IHC) (23%) eturauhasen kudoksissa 334 eturauhassyöpäpotilaalla verrattuna 101 hyvänlaatuinen valvontaa (1,9% PCR: llä ja 3,9% IHC) [9] . Tämä tutkimus on myös raportoitu löytää XMRV useammin potilailla, joilla on suurempi eturauhasen kasvaimen viittaa syy-yhteydestä virus ja tauti. Samanlainen suuntaus oli raportoitu toisessa tutkimuksessa, joka ilmoitti 22% XMRV esiintyvyysluku eturauhassyöpäpotilailla Texas mutta löytyi virus sekä kasvaimen ja ei-tuumorikudoksia [9], [10]. XMRV neutraloivat vasta-aineet tunnistettiin äskettäin 11 40 (27,5%) US eturauhassyöpäpotilaalla ja XMRV sekvenssit varmistettiin viidessä näistä 11 henkilöä käyttämällä sisäkkäisiä DNA PCR ja fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) [11].

Sen sijaan tutkimuksissa Euroopassa ja kaksi USA raportoitu vain vähän tai ei XMRV infektiota [12], [13], [14], [15], [16]. Yksi tutkimus Saksan eturauhassyöpäpotilaisiin ja yksi Alankomaissa löytynyt paljon pienempi XMRV esiintyvyys (1/87, 1,2% ja 3/74 = 4%, vastaavasti) käyttämällä vain RT-PCR: llä ja XMRV-spesifisiä alukkeita [12]. Toinen suurempi tutkimuksessa Saksassa yhdistämällä DNA ja RNA PCR löytänyt todisteita XMRV infektio 589 potilailla [14]. Lisäksi seerumit ylimääräinen 146 eturauhassyöpäpotilaalla olivat kaikki negatiivisia testaamalla ELISA sisältää yhdistelmä-XMRV kirjekuori (Env) ja Gag-proteiineja ja epäsuoralla immunofluoresenssilla määrityksissä ilmentävien XMRV [14]. XMRV ei myöskään havaittu DNA kudoksissa 161 ja 200 eturauhassyöpäpotilaalla kaksi US-populaatiot, vastaavasti [13], [15]. Tutkimuksen mukaan Aloia

et al.

Ei myöskään havaitse XMRV proteiineja kudoksissa 596 eturauhasen adenokarsinooman ja 452 hyvänlaatuista eturauhasen kudosnäytteitä käyttämällä IHC [13].

Syyt incongruent XMRV tulokset ei tiedetä, mutta se voi liittyä teknisiin eroihin XMRV testaamista tai liittyvät tekijät potilasryhmiä, mukaan lukien taudin vaiheessa, geneettiset tekijät, tai määrä maantieteellinen kasaantua. Samanlaisia ​​ristiriitainen tuloksia on myös raportoitu vastikään XMRV henkilöillä, joilla on krooninen väsymysoireyhtymä (CFS) [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], joka sisältää tutkimus Lo

et. al

raportointi PMLV kaltaiset sekvenssit keskuudessa Yhdysvaltain potilaiden CFS [24]. Suurin osa eturauhassyövän tutkimuksissa käytettiin PCR XMRV-spesifisiä alukkeita, jotka voivat olla erittäin herkkiä muiden MLV-, kuten variantteja [7], [9], [10], [11], [12], [15], [16]. Lisäksi useimmissa tutkimuksissa ei suorita serologinen testaus vasta-aineita, jotka ovat tunnusmerkkejä retrovirusinfektioiden ja voi siten tarjota lisää infektion, joka ei ole kudosspesifinen.

Me raportoimme tässä XMRV testaus hyvin tunnettu kohortti 162 eturauhassyöpäpotilaille Yhdysvaltain käyttämällä yhdistelmää serologisella ja PCR-määrityksissä pystyy havaitsemaan XMRV ja PMLV. Olemme myös mitataan jakautumista RNaasi L QQ mutaatio arvioida yhdistys XMRV tällä mutantti alleeli [7]. Olemme myös käyttäneet herkkä PCR testiä saastuminen hiiren DNA ne sisällä vääriä positiivisia PCR-tuloksiin. Tuloksemme osoittavat, että XMRV on harvinaista tässä potilasryhmässä ja eivät tue yhdistys tämän viruksen kanssa eturauhassyöpään.

Tulokset

Harvinainen XMRV jaksoja kasvaimen kudoksissa eturauhassyöpäpotilaalla

ß-aktiini sekvenssit havaittiin PCR: llä DNA otteita kaikista eturauhaskudoksiin vahvistetaan niiden eheyden PCR-testausta. DNA vain kaksi (5956 ja 6203) 162 potilasta (1,23%) positiivisen XMRV sekvenssit alkuperäisessä seulonnassa (Fig. 1, taulukko 1). Niistä 77 DNA yksilöitä, joita lisäksi testataan kolmena kappaleena, jonka

pol

PCR, vain yksi potilas (5935) (1,3%) havaittiin positiivinen. Tämä näyte oli positiivinen vain yksi kolme toistoa. Siten yleinen PCR esiintyvyys oli 3/162 eli 1,85%. Potilas 5956 oli positiivinen

gag

ja

pol

sekvenssit 3/5 ja 4/6 toistetaan testejä, vastaavasti, ja

env

sekvenssit havaittiin myös 1/3 toistetaan testejä (taulukko 2). Näytteen 5956 oli myös positiivinen kaikissa kolmessa toistossa

pol

PCR testejä. Vain XMRV

pol

ja

env

sekvenssit havaittiin potilaalla 6203 eturauhasen kudoksen DNA 1/4 ja 1/1 toistetaan testejä, tässä järjestyksessä. Lisäkokeita DNA: ta toisesta eturauhasessa osa 6203 oli toistuvasti negatiivinen, johtui todennäköisesti epätasainen jakautuminen matalan kopioluvun XMRV tässä kudoksessa. DNA kaikista kolmesta potilaasta toistuvasti testattu negatiiviseksi hiiren mtDNA osoittavat, ettei kontaminoivien hiiren DNA: iden. Testaamiseksi viremia analysoitiin RNA otteita plasmasta näytteet kaikista kolmesta potilaasta. Kaikki näytteet olivat havaittavissa sekvenssit qRT-PCR ja nRT-PCR testejä.

edustaja sisäkkäistä

pol

PCR tuloksia käyttämällä eturauhasen kasvain DNA. Kaistat 1-24, eturauhassyöpä potilaalla, joista potilaat 5956 (kaista 8) ja 6203 (kaista 19); kaista 25, negatiivinen ihmisen PBMC DNA valvonta; kaistat 26 ja 27, vettä vain valvoo perus- ja sisäkkäisiä PCR testejä, tässä järjestyksessä; kaistat 28 ja 29, määrityksen herkkyys valvonta koostuu 10 ja 10

3 kopiota XMRV VP62-DNA laimennettu taustalla 1 ug ihmisen PBMC DNA, vastaavasti.

tunnistaminen XMRV monimuotoisuuden eturauhassyöpäpotilailla

Sequence analyysi osoitti, että potilaat 5935, 5956 ja 6203 ovat sairastuneet variantti XMRV kantoja. 168-bp

pol

sekvenssit kaikki kolme potilasta osoitti 90,5-100% nukleotidi-identtisyys toisiinsa, 94-100% ja XMRV, 91,7-98,8%: sta XMLV, 94-100% ja PMLV, ja 91 -100% ja ekotrooppisille MLV (EMLV) tässä lyhyessä alueella. 164-bp

env

sekvenssit henkilöiden 5956 ja 6203 olivat identtisiä keskenään ja jaetaan korkein nukleotidin identiteetti (94,9-100%) ja XMRV ja muut ksenotrooppisia MLV kannoista, vastaavasti, [25].

env

sekvenssit molemmista henkilöistä olivat erittäin poikkeavat EMLVs jakaminen vain noin 46% nukleotidin identiteetti. 413-bp

gag

sekvenssit monistettiin vain eturauhasen kudoksen DNA henkilön 5956 ja oli noin 98%: n nukleotidi-identtisyys ja XMRV, mutta oli identtinen ksenotrooppiset Merv löytyy hiiren kromosomissa 8 (GenBank # AC127575).

fylogeneettinen analyysi

env

sekvenssit päätellä kolme eri klustereiden vahvojen bootstrap tuki perustuu virusten tropismista odotetusti, koska tämä alue sisältää osan viruksen pinnan kalvon mukana solujen tropismista (kuvio . 2a).

env

sekvenssit sekä potilaiden kanssa klusteroituja XMLV sekvenssit, mutta erosivat aiemmin raportoitu XMRV ja prototypical PMLV (Fig. 2a). Sen sijaan päätelty fylogeneettiseen suhteet

pol

sekvenssit kaikista MLV ryhmistä osoittivat, että tämä alue ei klusterin isäntäkirjo (Fig. 2b). Kolme

pol

sekvenssit eturauhassyöpäpotilaalla muodostivat hyvin tuettu linjaa sisältää neuropathogenic Moloney MLV rekombinantti (kanta ts-1-92b, GenBank # AF462057) (Fig. 2b). XMRV

pol

sekvenssit aiemmin raportoitu eturauhassyöpäpotilaalla (koodattu VP), paitsi kaksi (VP29 ja VP184, ystävällisesti Joe DeRisi), ryhmittyneet kanssa henkilöiltä, ​​joilla on CFS (koodattu WPI) merkittäviä bootstrap tuki. VP29 ja VP184

pol

sekvenssit olivat keskenään identtisiä, mutta 1,2% poikkeavat muista XMRV ja muodostivat heikosti tuettu klusteri sisältää seoksen EMLV ja PMLV (Fig. 2b). Nämä tulokset osoittavat laajempaa moninaisuuden XMRV tällä alueella kuin aiemmin nähty, mutta ovat yhdenmukaisia ​​rekombinaatiota Moloney MLV raportoitu äskettäin [7], [25]. VP29, VP79, VP86, VP88, VP90, ja VP184 ovat eturauhassyöpäpotilaille raportoitu Urismann

et al.

Paperia mutta joista XMRV

pol

sekvenssit eivät ole vielä saatavilla GenBank [ ,,,0],7]. Hiljattain raportoitiin

gag

ja

pol

sekvenssit löydetty ihmisen tuumorisolulinja DNA sijaitsivat alueiden ulkopuolelta käytetty tutkimuksessamme ja joita ei näin ollen sisällytetty analyysit [25].

. kirjekuori (

env

), B. polymeraasia (

pol

), ja C.

gag

. Vakaus puurakenteen testattiin 1000 bootstrap replikoituu sekä naapuri liittymään (NJ) ja suurimman uskottavuuden (ML) menetelmät. Bootstrap arvot 60 esitetään suurten solmujen (NJ /ML). Uudet sekvenssit nykyisestä tutkimuksen on kehystetty. Liittyminen numerot prototypical MLV sekvenssit saatavilla GenBank ovat XMRV VP35 = DQ241301, XMRV VP62 = DQ399707, XMRV VP42 = DQ241302, XMRV WPI-1106 = GQ497344, XMRV WPI-1178 = GC497343, XMRV PCA1-PCA17 = GU812341-GU812357, MLV DG -75 = AF221065, MLV MTCR = NC_001702, MLV AKV ​​= J01998, MLV BM5eco = AY252102.1, Moloney MLV = J02255, Moloney neuropthogenic MLV variantti ts1-92b = AF462057, Rauscher MLV = NC_001819, Friend MLV = X02794, Merv Chr 7 = AC167978, Merv Chr 7 = AC127565, Merv Chr 8 = AC127575, Merv Chr 12 = AC153658, Merv Chr 9 = AC121813, Merv Chr 4 = AL627077, Merv Chr 1 = AC083892), XMLV A2780 = FR670594, XMLV BHY = FR670595, XMLV Daudi = FR670596, XMLV EKVX = FR670597, XMLV IMR-5 = FR670598, XMLV MUTZ-1 = FR670599, XMLV S-117 = FR670600, XMLV TYK-nu = FR670601. Sekvenssit, merkitään RAW ovat peräisin polytrooppinen MLV eristettiin HeLa-soluissa tarkoitus kehittää talon WB testi. Sekvenssit, koodataan XMRV VP ja PCA ja WPI ovat eturauhassyöpään ja CFS potilaista. Muita eturauhassyöpä potilas VP

gag

ja

pol

sekvenssit toimitti ystävällisesti Drs. Robert Silverman ja Joe Derisi. Viral tropismista, määritettynä analyysi

env

sekvenssit, on merkitty sinisellä (ksenotrooppisen), violetti (polytrooppinen), ja keltainen (ekotrooppisille) aloilla.

gag

sekvenssi potilaasta 5956 ryhmittyneet kanssa XMRV sekvenssit Eturauhassyöpätutkimuksessa potilas (VP88), joka on ksenotrooppiset Merv löytyy hiiren kromosomissa 8, ja PMLV sekvenssi tunnistettiin verenluovuttajana (BD-28) Lo

et al.

(Fig. 2c) [24]. Tämä sukuperää oli välillä clades sisältävä XMRV eturauhassyöpää ja CFS potilaiden ja useimmat PMLVs ja loput MLV löytyy Lo

et al.

Tutkia [24]. Yksi prototypical PMLV (MCF1233) ryhmittyneet kaikki EMLVs ja kaksi XMRVs, mikä viittaa se on rekombinantti tällä alueella (kuvio. 2c).

Nämä phylogenetic tulokset viittaavat myös siihen lyhyen alueen

env

kohteena uusi PCR sen avulla voidaan määrittää viruksen tropismista kirjoittamalla MLV liittyvät sekvenssit. Tämä tieto voi olla hyödyllistä ymmärtää alkuperä tunnistetun PCR-positiivisten ihmisten. Sen sijaan

gag

ja

pol

alueet osoittivat vähemmän klustereiden by tropismista osoittaa viruksen rekombinaatiolla näillä alueilla. Esimerkiksi

gag

sekvenssit prototyyppi- XMLVs (MTCR), EMLVs (AKV, BM5eco), ja PMLVs (MCF1233) ryhmittyneet yhdessä erittäin merkittävä bootstrap tuki (Fig. 2a).

lähes identtinen fylogeneettistä puurakenteita kullekin geenialueen saatiin sekä NJ ja ML menetelmiä. XMRV sekvenssit sekä eturauhasen syöpä potilaista oli myös erillinen PMLV sekvenssit monistettiin hiiren solulinjassa (RAW) valmistukseen käytetty WB antigeenejä, jotka osoittavat lisäksi, että nämä eivät ole laboratorio epäpuhtauksia (Fig. 2). Nämä tulokset vahvistavat läsnäoloa XMRV sekä potilaiden ja osoittavat, että XMRV monimuotoisuus on suurempi kuin tällä hetkellä arvostetaan.

XMRV sekvenssit esitetään nykyisessä paperi ovat saatavilla GenBank liittymisen numerot HM003608-HM003612, ja HQ116790. Sekvenssien muissa tutkimuksissa XMRV-positiivisten eturauhassyöpäpotilaalla eivät olleet saatavissa GenBank sisällytettäväksi analyysien [9], [11], [12], [16].

puuttuminen vasta plasmassa eturauhasen syöpäpotilailla

Kaikki 162 eturauhassyöpä potilas plasma näytteen havaittiin olevan negatiivinen vasta XMRV /MLV vuonna WB testissä, kuten plasma henkilöiltä 5935, 5956, ja 6203 (Fig. 3). Useimmissa plasmassa yksilöitä jonkin verran epäspesifistä reaktiivisuutta havaittiin infektoitumattom.iin antigeenin mutta ilman näyttöä spesifinen reaktiivisuus Gag ja /tai Env-proteiinien tartunta antigeeni blot (Fig. 3).

Molekyylipainomarkkereihin (kD ) on järjestetty vasemmalla puolella WBS ylemmän paneelit. Odotettu koot viruksen gag (p30, kapsidi (CA)), pr65, ja kirjekuori (Env, gp69 /71) proteiinit Jokaisessa WB ylemmässä paneelit. Edustavia WB tulokset yksitoista eturauhassyövän potilaalla, joista potilaat 5956 ja 6203 (merkitty tähdillä). Määrittäminen MLV spesifinen reaktiivisuus määritetään vertaamalla seroreactivity ksenotrooppiselle MLV-tartunnan HeLa antigeenejä ja infektoimattomia HeLa antigeenejä in ylempään ja alempaan paneeliin, tässä järjestyksessä. Ra, Rauscher MLV koko virus vuohen polyklonaalisia antiseerumeita; Fr, Friend MLV kirjekuori (gp69 /71) vuohen polyklonaalinen antiseerumit; pre-immuuni, vuohen seerumit ennen immunisointia.

RNaasi L R462Q alleeliset jakelu tutkimuksessa väestön ja kliiniset ominaisuudet kolmen XMRV-tartunnan saaneiden

15 162 henkilöä ( 9,3%) määritettiin olevan homotsygoottinen (QQ) varten R462Q RNaasi L mutaatio, 74 (45,6%) oli homotsygoottinen RR alleeli ja 73 (45,1%) oli heterotsygoottinen (RQ) mutaation (taulukko 1).

Patient 5935 on heterotsygoottinen RQ RNaasi L genotyyppi. Hänellä on huonosti eriytetty adenokarsinooma kanssa Gleason pisteet 6, T2C patologisen vaiheessa PSA taso 4,6 ng /ml. Potilaan 5956 on villityypin homotsygoottinen RR RNaasi L genotyyppi. Hänellä oli huonosti eriytetty adenokarsinooma kanssa Gleason pisteet 7, T3A patologisen vaiheessa 12,4 ng /ml PSA tasolla. Potilaan 6203 on heterotsygoottinen RQ RNaasi L genotyyppi, ja oli kohtalaisen eriytetty adenokarsinooma kanssa Gleason pisteet 6, T2C patologisen vaiheessa ja 7,1 ng /ml PSA tasolla. Niinpä emme pystyneet vahvistamaan yhdistyksen XMRV infektion homotsygoottinen QQ RNaasi L-alleeli. Koska alhainen XMRV esiintyvyys, meillä ei ollut tilastollista valta päättää, onko yhdistys XMRV kanssa kasvaimen.

Keskustelu

Käytimme PCR- ja serologisen testauksen tutkia esiintyvyys XMRV 162 hyvin tunnettu Pohjois-Amerikan potilaalla on eturauhassyöpä. Kartoitimme syöpiä Jatko vaiheissa, ja hyödyntää useita PCR-määrityksissä, mukaan lukien testit konservoituneiden alukkeita voidaan havaita erilaisia ​​XMRV ja MLV liittyvät sekvenssit. Lähes puoli näytteet testattiin myös kolmena kappaleena maksimoida herkkyys matalan kopion sekvensseihin. Käytimme laajasti reaktiivisen WB määrityksessä testaamaan kaikille potilaille vasta-aineille. Meidän havainnot dokumentoidaan hyvin alhainen esiintyvyys (1,9%) XMRV sekvenssien eturauhasessa DNA ja vasta-aineen puuttuessa positiivisuus kaikissa yksilöitä. Yhdistetty nämä tiedot eivät tue yhteenliittymää XMRV tai liittyvien MLV eturauhasen syöpään.

pääasiassa negatiivisia PCR tuloksia havaittiin käytöstä huolimatta 1 ug DNA, joka on 4-10 × suurempi kuin tulo DNA käytetty aiemmissa tutkimuksissa raportoiduista XMRV havaitseminen [7], [9], [14], [16]. Samoin havaittiin alhainen esiintyvyys XMRV ei voida selittää vähentynyt PCR määrityksen herkkyydestä, koska meillä seulotaan yksilöiden kanssa samassa määrityksessä käytettiin alunperin Urisman

et al.

[7]. Kolmessa yksilöt havaittavissa sekvenssit, olemme huomanneet, että kopiomäärä oli hyvin alhainen sisäkkäisiä PCR ja jäljitellä testaus usein tunnistamiseen tarvittavan. Mikä tärkeintä, kaikki kolme yksilöä emme pystyneet havaitsemaan hiiren mtDNA käytöstä huolimatta hyvin herkkä menetelmä, joka viittaa siihen, että lähde XMRV ei todennäköisesti seurausta saastumisen hiiren DNA. Nämä tulokset ovat tärkeitä, koska hiiren DNA saastuminen raportoitiin olevan lähteen XMRV tuoreessa tutkimuksessa eturauhassyöpäkudoksille [26]. Kirjoittajat Tämän Tutkimuksessa käytettiin PCR-määritystä varten hiiren intrakisternaalisen Hiukkanen (IAP), joita ne ilmoitettu olevan herkempi kuin hiiri-specific D-loop mtDNA-pohjainen määritys [26]. Vaikka DNA näytteet puuttuivat testaus IAP testissä, olemme havainneet, että IAP määritys on yhtä herkkä meidän COX2 reaaliaikaista mtdna määritys (tuloksia ei ole esitetty), mikä entisestään ilman hiiren DNA-kontaminaation lähteenä meidän positiivinen PCR tuloksia. Lisäksi DNA-näytteet valmistettiin FCCC, jossa vain ihmisen biologisia näytteitä, ja ei solulinjoissa, käsitellään, mikä vähentää edelleen mahdollisuutta hiiren saastumista.

sekvenssianalyysi PCR-positiivisille näytteille on erittäin informatiivinen, koska se vahvisti, että kaikki kolme näytteet olivat XMRV liittyvää. Myös toteamus viruskanta kolmella eturauhassyöpäpotilaille joka eroaa XMRV nähty aiemmissa tutkimuksissa on merkittävä ja osoittaa laajempaa virus monimuotoisuus [7], [9], [14], [16]. Tämä olisi odotettu tulos yhdenmukainen viruksen evoluution aikana leviämistä ja pysyvyyttä. Vasta-aineiden puuttumisen ja plasma viremia näillä kolmella potilaalla on merkittäviä, koska se voi heijastaa eristettyä tai piilevän tartunnan. Menetys vasta-aikana piilevä infektio, kun taas epätyypilliset useimpien retrovirusinfektioista, on kuvattu aiemmin luonnollisen infektion makakit kanssa apinan tyypin D retrovirukset (SRV) [27]. SRV makakeilla on esiintymiseen liittyviä vaikeaa immuunikatoa kädellisillä pesäkkeet ja piilevä SRV infektion näissä vasta-negatiiviset eläimet vahvistetaan herkemmäksi käyttäen PCR-analyysi [27]. Tuloksemme ovat myös yhdenmukaisia ​​viime aikoina makakeilla kokeellisesti tartunnan XMRV Kudosten ruumiinavauksessa ovat PCR-positiivisia mutta viremian ja havaitseminen esiviruksena PBMC katoavat nopeasti, jonka jälkeen menetys vasta-aineet [28], [29]. Vaikka yksi tutkimus kertoo havaitsemisen XMRV neutraloivan vasta 11 potilaalla, joilla on eturauhassyöpä, näitä tietoja ei vahvistanut herkempiä menetelmiä, kuten WB, tai PCR-testaukseen kaikissa tapauksissa, ja voi siten edustaa epäspesifistä reaktiivisuutta [11], [17 ]. Pitkittäistutkimukset voi määritellä paremmin isännän vasteet XMRV infektio.

Tutkimuksemme väestö sisälsi 15 henkilöiden mutantti QQ RNaasi L-alleeli. Kuitenkin yksikään ei ollut XMRV-positiivisia, mikä on ristiriidassa alkuperäisen päätelmiä Urismann

et al.

[7]. XMRV-tartunnan saaneiden tutkimuksessamme oli joko homotsygoottinen villityypin (RR) tai heterotsygoottinen (RQ) RNase L R462Q alleeleja. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​muiden Yhdysvaltain ja Euroopan tutkimuksia, jotka määriteltiin myös korkeampia taajuuksia homotsygoottinen QQ mutantti alleeli XMRV-negatiivisten henkilöiden [9], [10], [16]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että XMRV infektio ei liity tähän alleelinen muoto RNaasia L.

Vaikka tieto ei tue yhdistys eturauhassyövän XMRV, on tärkeää ymmärtää, onko XMRV on syy-asema eturauhasen syöpä, kun se on harvoin havaitaan. Yleensä gammaretroviruses kuten XMRV aiheuttavan pahanlaatuisia transformaatio insertiomutageneesiin, jotta pahanlaatuisia soluja kasvain kaikki kloonaamalla tartunnan. Tämä mekanismi syövän on todettu eläimillä sekä lapsilla altistuvat MLV-johdettu vektorien geeni-terapia tutkimukset [30], [31]. Näin ollen alhaisen taajuuden XMRV-infektoitujen solujen löytyy kaikki kolme potilasta ovat ristiriidassa suora rooli XMRV eturauhasen karsinogeneesin näillä potilailla. Aikaisemmin, ihmisen eturauhassyövän solulinjaa 22Rv1, on osoitettu ilmentävän korkeita XMRV, toteaminen, joka tukee roolia XMRV eturauhassyövän tuumorigeneesiin [32]. Kuitenkin, se raportoi äskettäin, että XMRV ilmaisemat 22Rv1 voi olla peräisin ihmisestä, mutta todennäköisesti syntyi rekombinaation kautta kahden päällekkäisen XMRV-like genomien kulkiessa eturauhasen kasvaimen sisäsiittoisia hiiriä (T. Paprotka

et ai .

18

th konferenssi retrovirukset ja opportunistiset infektiot). Lisäksi toiset ovat osoittaneet, että XMRV integraatiopaikkoja kloonattu eturauhaskudoksiin kaksi yhdeksästä potilailla saattaa olla seurausta saastumisen DNA kokeellisesti tartunnan DU145 soluihin [33], kun taas muut XMRV integraatio sivustot eivät ole lähellä tuumorisuppressorigeeneille tai prototyypin onkogeenejä [34]. Yhdessä nämä tulokset herättävät kysymyksiä roolista XRMV eturauhassyövässä. Kuitenkin, enemmän työtä tarvitaan paremmin ymmärtämään esiintyvyys XMRV ja MLV ihmisillä ja niiden merkitys ihmisen sairauksien.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuskanta

Anonymous, arkistoitu plasma ja eturauhasen kudosta oli saatavilla 162 Yhdysvaltain eturauhassyöpäpotilaille keräämät Fox Chase Cancer Center (FCCC) Biosample Repository Core Facility vuosien 1997 ja 2004 Kokoveri näytteet kerättiin aikaan ennalta kirurgisia testaus tai leikkauspäivänä ennen anestesian alkaen suostuu syöpäpotilaita osana tutkimusta hyväksymä FCCC ihmiseen kohdistuvan komitea. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. FCCC ihmiseen kohdistuvan eettisen komitean hyväksymä kerääminen, varastointi, ja tulevaisuus testaus kerätyt näytteet kaikista suostuu TET. Ei-tutkimus määritys hyväksyttiin testaukseen nimettömiksi näytteiden CDC XMRV ja liittyvät virukset. Ikä, diagnoosi 162 osallistujaa vaihteli 36-71 vuotta vanha, jonka keskimääräinen ja mediaani 57 vuotta. 86% oli valkoihoisia, 12% Afrikkalainen Amerikkalainen, ja 1% oli Aasian, ei kirjata, tai muita. Keskimääräinen ja mediaani seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot olivat 7,22 ng /ml ja 5,5 ng /ml, vastaavasti. Kasvain arvosana 75 162 (46%) osallistujista oli kohtalaisen eriytetty, kun taas 54%: lla oli huonosti eriytetty kasvaimia. Käyttämällä Gleason järjestelmä, 42% tutkimukseen osallistuneista oli asteen 5-6 syöpä, 40%: lla oli luokan 7, ja 18%: lla oli korkealaatuista adenokarsinooma (Gleason pisteet 8-10). Patologiset pysähdyspaikan luokitellaan eturauhasen kasvaimissa T1C (0,6%), T2A (9,3%), T2B (3,1%), T2C (61,7%), T3A (17,9%), T3b (5,6%), ja T4 (1,8%).

Näytteenvalmistus

Plasma jaettiin eriin ja varastoitiin -80 ° C: ssa 4 tunnin sisällä verinäytteen. Plasman näytteitä jaettiin osiin jälleen CDC sulatuksen jälkeen serologiseksi testaus; jäljellä olevat alikvootit jäädytettiin -80 ° C: ssa. DNA-näytteet valmistettiin fenoli-kloroformi-uutolla ja eturauhasen kudosten FCCC käyttäen standardimenetelmiä. Vain ihmisen kudoksia prosessoidaan FCCC. Valittujen näytteiden QIAamp DNA MINIKIT (Qiagen, Carlsbad, CA) käytettiin CDC. Plasman RT-PCR testaus tilavuus 0,5-1,0 ml ultrasentrifugoitiin 45000 rpm keskittyä virus. 360 ul 860 ul plasman supernatantista poistettiin huolellisesti, ja pelletti suspendoitiin uudelleen 140 ul: sentrifugoitiin plasman jäljellä putkeen, ja sitten RNA uutettiin käyttämällä QIAamp Viral RNA MINIKIT (Qiagen, Valencia, CA). Nukleiinihappo pitoisuudet määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen Nanodrop instrumentti (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Eheys DNA- ja RNA-näytteet määritettiin käyttämällä ß-aktiini tai GAPDH PCR, vastaavasti, kuten on kuvattu [35], [36]. Kaikki näytteen valmistelu, kudosviljelmässä, ja PCR testaus tehtiin fyysisesti eristyksissä huoneissa saastumisen estämiseksi.

Molecular havaitseminen XMRV

havaitsemiseksi XMRV ja muut MLV variantit käytimme erillinen PCR-määrityksissä alukkeilla spesifinen havaitseminen XMRV tai konservoituneita alukkeita yleinen havaitsemiseksi MLV ja XMRV, kuten aiemmin on kuvattu [21]. DNA näytteet seulottiin käyttämällä kahta sisäkkäistä PCR-määrityksissä. Ensimmäinen määritys käyttää PCR-alukkeiden GAGOF, Gągor, GAGIF, ja GAGIR palveluksessa Urismann

et al.

Ja Lombardi

et al.

Havaita 413 emäsparin XMRV

gag

sekvenssit eturauhassyöpäpotilailla ja henkilöillä, joilla on CFS vastaavasti [7], [18]. Toinen PCR yleisesti tunnistaa MLV ja XMRV polymeraasia (

pol

) sekvenssejä noin 216-bp pitkä käyttäen alukkeita XPOLOF, XPOLOR, XPOLIF, ja XPOLOR [21]. Sekä

gag

ja

pol

PCR testit voivat havaita 10 kopiota XMRV-DNA laimennettu taustalla 1 ug ihmisen DNA [21]. Näytteet Positiivista joko

gag

tai

pol

sekvenssit uudelleen testattiin sekä määritykset ja testattiin myös kolmannen perättäisen PCR-testi XMRV kirjekuori (

env

) sekvenssit, jotka on myös yleisnimi XMRV /MLV. Ulkoinen XENVOF (5 ’GGG GAT CTT GGT GAG GGC AGG AGC 3’) ja XENVOR (5 ’CAG AGA GAA CAG GGT CAC CGG GTC 3’) ja sisäisiä alukkeita XENVIF (5 ’AGG GCT ACT GTG GCA AAT GGG GAT 3’ ) ja XENVIR (5 ’CCT TTT ACC CGC GTC AGT GAA TTC 3’) monistamiseksi 215 emäsparin

env

järjestyksessä. Lisäksi osajoukko yksilöiden (n = 77) ja riittävästi DNA: ta oli saatavilla testattiin kolmena rinnakkaisena käyttäen sisäkkäisiä

pol

PCR-määrityksen parantamiseksi havaitsemisen matalan kopioluvun XMRV /MLV.

PCR suoritettiin käyttäen 1 ug eturauhasen kudoksen DNA: n 100 ul: n reaktiotilavuudessa käyttäen vakio-olosuhteissa 94 ° C 30 sekuntia, 50 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 45 sekuntia 40 sykliä ABI 9700 thermalcycler ( Foster City, CA). PCR-tuotteet visualisoitiin elektroforeesin etidiumbromidilla värjätty 1,8% agaroosigeelillä. Herkkyyden lisäämiseksi ja määritysten spesifisyyttä, monistettu

gag

,

pol

, ja

env

sekvenssit varmistettiin Southern blot-analyysi käyttäen biotinyloitua oligoprobes XGAGP2 (5 ’ ACC TTG CAG CAC TGG GGA GAT GTC 3 ’), XPOLP (5’ TTG ATG AGG CAC TGC ACA GAG ACC 3 ’), ja XENVP (5’ TGG GCT CCG GTA GCA TCC AGG GTG 3 ’) ja kemiluminesenssidetektiolla. Kuten XMRV

gag

ja

pol

PCR-määrityksissä [21], uusi XMRV

env

PCR-testi oli myös kykenevät havaitsemaan 10 kopiota XMRV plasmidin taustalla 1 ug: lla ihmisen DNA: ta (30/32, 93,8%). Emme havainneet mitään XMRV /MLV-sekvenssejä PBMC DNA 41 US verenluovuttajien käyttäen jokaisen kolmen perättäisen PCR-testejä [21].

Quantitative XMRV RNA RT-PCR

Plasmanäytteet henkilöiden positiivinen XMRV PCR-tulokset eturauhasen kudosten DNA testattiin edelleen virus-RNA käyttäen kahta RT-PCR testejä. Ensimmäinen määritys, jota kutsutaan q

pro

käyttää MLV /XMRV geneerinen proteaasi (

pro

) Taqman-alukkeita Pro-UNV-F1 (5 ’CCT GAA CCC AGG ATA ACC CT 3’) ja Pro-UNV-R1 (5 ’GTG GTC CAG CGA TAC CGC T 3) ja koettimet Pro-UNV-P1C (FAM5’ AGA TAC TGG GGC CCA ACA CTC CGT GCT GAC 3’BHQ1) ja Pro-UNV-PR1 (