Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressoriproteiinia geenejä ihmisen syövissä. Kehittyvät Todisteiden mukaan vapauttaminen miRNA myötävaikuttaa ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ekspressiotasot miR-132 dramaattisesti vähentynyt tutkittiin NSCLC solulinjoissa ja kliiniset NSCLC kudosnäytteistä. Sitten huomasimme, että käyttöönotto miR-132 merkittävästi tukahdutti migraation ja invaasion keuhkosyövän soluja in vitro, mikä viittaa siihen, että miR-132 voi olla uusi kasvain vaimennin. Lisäksi tutkimukset osoittivat, että EMT liittyvät transkriptiotekijän ZEB2 oli yksi suora kohdegeenien miR-132, osoittaa suora sitoutuminen miR-132 kanssa 3′-alueen (3 ’UTR) ja ZEB2. Edelleen, miR-132 saattaa vähentää ilmentymistä ZEB2 tasoilla mRNA: ta ja proteiinia. On huomattava, että EMT merkki E-kadheriinin tai vimentiinista, joka on alavirtaan ZEB2, myös alassäädetty tai up-säädellään miR-132 käsittelyä. Lisäksi yli-ilmentävät tai äänenvaimennusjärjestelmien ZEB2 pystyi nostamaan tai estää migraation ja invaasion keuhkosyöpään solujen samansuuntainen vaikutus miR-132 keuhkojen syöpäsoluja. Samaan aikaan knockdovvn ZEB2 päinvastaiseksi lisätä maastamuuttoa ja hyökkäys välittyy anti-miR-132. Nämä tulokset osoittavat, että miR-132 estää migraation ja invaasion NSCLC-solujen kohdistamalla ZEB2 joihin EMT prosessia. Siten meidän havainto antaa uutta tietoa mekanismista NSCLC etenemisen. Terapeuttisesti, miR-132 voi toimia mahdollisena kohteena hoidossa ihmisen keuhkosyöpää.

Johdanto-osan: Et J, Li Y, Fang N, Liu B, Zu L, Chang R, et ai. (2014) MiR-132 estää Migration ja Invasion of Lung Cancer Cells

kautta

kohdistaminen EMT Regulator ZEB2. PLoS ONE 9 (3): e91827. doi: 10,1371 /journal.pone.0091827

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan

vastaanotettu: 19 syyskuu 2013; Hyväksytty: 15 helmikuu 2014; Julkaistu: 13 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Sinä et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus osittain tukee avustusta Key Project National Natural Science Foundation of China (No.81000950), National 863 Program (No.2012AA02A201, No.2012AA02A502), National 973 Program (No.2010CB529405), Tianjin Scientific Innovation System Program (No.07SYSYSF05000, No.07SYSYJC27900), Kiina-Ruotsi Cooperative Foundation (No.09ZCZDSF04100), ja suurhanke Tianjin Sci-Tech Support Program (No.06YFSZSF05300). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, ja suurin keuhkosyövässä ovat ei- pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka käsittää noin 80% kaikista keuhkosyövässä [1 ]. Potilaat kätkeminen NSCLC diagnosoidaan usein kuin pitkällä, kärsimys metastatically tai paikallisesti edennyt sairauksia, joten lähes 90% keuhkosyöpä potilaat kuolevat etäpesäkkeiden [2]. Vaikka paljon työtä ja progressioiden on tehty tutkimus keuhkosyöpä viime vuosikymmeninä, molekyylitason mekanismi keuhkosyöpään etäpesäkkeiden edelleen heikko.

microRNA (miRNA) on luokan pieni, ei-koodaavat RNA: t noin 19-25 nukleotidia. Se säätelee negatiivisesti geeniekspressiota post-transkriptio tasolla vuorovaikutuksessa 3’alueet (3’UTR) kohde- mRNA: iden [3], [4]. MiRNA ovat fylogeneettisesti säilynyt ja keskeisessä asemassa ovat useissa biologisissa prosesseissa kuten kehitys-, erilaistuminen, apoptoosi, aineenvaihduntaa, immuniteetti ja kasvain edistyminen [5], [6]. Myös kasvava todisteet osoittavat MikroRNA voi moduloida kasvain taudin alkamisen ja etenemisen ja toiminta kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden [7], [8], [9], [10]. Aiemmat tutkimukset ovat dokumentoineet roolit miR-132 säätelyssä erilaistumista dopamiinihermosoluja [11] ja aktivoimalla endoteelin helpottamiseksi patologinen angiogeneesi [12]. Vuonna tumorigeneesin, on raportoitu, että downregulation miR-132 tukee haimasyövän kehittämiseen [13]. Kuitenkin mahdollista roolia miR-132 keuhkosyövän etenemisessä ei ole vielä dokumentoitu.

ZEB2 /SIP1 on jäsenenä deltaEF-1 perheen kahden käden sinkki sormen tekijät ja elintärkeä tehtävä kehittämään erilaisia ​​syöpiä, kuten maha-, munasarja-, squamous ja ei-pienisoluisen keuhkosyövän [14], [15]. ZEB2 erityisesti tukahduttaa ilmentyminen E-kadheriinin sitoutumalla CACCT (G) motiivi E-kadheriinipromoottorin aikana epithelial- mesenkymaalitransitioon (EMT) [16], [17]. Lisäksi E-kadheriinin, muiden geenien, kuten plakophilin 2 ja ZO-3, jotka sisältävät epiteelisolujen-soluliitos myös tukahduttaa ZEB2 [18]. Äskettäin ZEB2 raportoidaan transkriptionaalisesti säätää ylös vimentiinista

kautta

yhteistyössä SP1 aikana EMT [19].

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet tutkimaan otaksuttu rooli miR-132 etäpesäke NSCLC. Olemme havainneet, että miR-132 säätyy alas metastaattisessa keuhkosyövän solulinjat ja kliinisten kudosnäytteitä, viittaa siihen, että miR-132 voi toimia kasvaimia estävä. Havaitsimme, että EMT säädin ZEB2 on yksi suora kohdegeenien miR-132. MiR-132 kykenee estämään EMT ja etäpesäkkeiden NSCLC-solujen kautta halvaannuttaa toimintaa ZEB2.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksynyt eettinen komitean Tianjin Medical University, Kiina, ja kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilla tutkituilla potilailla.

solulinjat ja kliinisissä näytteissä

sub-solulinjat, korkea- metastaattisen L9981 ja matala- metastasoituneen NL9980, eristettiin ja vahvistettu ihmisen keuhkojen suurisoluinen karsinooma solulinjassa [20]. Kehitti high metastaattinen 95D ja matala- metastasoituneen 95C olivat alilinjat ihmisen jättiläinen-keuhkosyövän solulinjassa [21]. NSCLC solulinja YTMLC-9 [22], [23] perustettiin meidän instituutti. Nämä solulinjat viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% vasikan seerumia (Invitrogen, USA), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 IU /ml streptomysiiniä. NSCLC A549, hankittiin American Tissue Culture Collection (ATCC), viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä. Nämä solulinjat kasvatettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Varten transfektioista, solut kasvatettiin 70% konfluenssiin ja transfektoitiin plasmideilla käyttämällä Iipofectamine2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan suosituksen.

yhteensä 90 tapausta NSCLC näytteet saatiin General Hospital Tianjin Medical University. Kaikki 90 potilasta ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Kudosnäytteitä käytettäväksi säilytettiin nestemäisessä typessä. TNM pysähdyspaikan järjestelmä UICC (1997) käytettiin luokitella näytteet ja eloonjäämisaikojen jotka laskettiin toiminnasta päivä kuolemaan kautta arviointi toistumisen ja etäpesäkkeiden, kunnes viime seurannan tasalla. Seuraavia-up eloonjääneiden potilaiden keskimäärin 32,55 kuukautta ja vaihteli 1-96 kuukautta. Tutkimus on hyväksynyt sairaalan eettisen komitean. Kliinis tietoa potilaista noin ikä, kasvaimen koon, histologinen tyyppi, erilaistuminen vaiheessa ja imusolmuke etäpesäke saatiin potilastietoja, joista esitetään yhteenveto taulukossa 1.

Reverse-transkriptio-PCR (RT PCR), Quantitative Reaaliaikainen Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) ja Werstern blot -määritys

Kokonais-RNA uutetaan Mirvana Kit (Applied Biosystems, CA) käänteisesti cDNA: ksi, jonka varsi-silmukka käänteisen transkription primeri miRNA havaitsemiseen. Käänteinen transkriptio miR-132 ja sisäinen valvonta U6 suoritettiin käyttäen käänteistranskriptaasia M-MLV (Takara, Japani). QRT- PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq (Takara) jälkeen protokollaa käyttäen esilämmitetään reaaliaikainen väline (Invitrogen). Kaikki alukkeet esitetään taulukossa S1. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin analysoida suhteellisen geeniekspressioiden ja kukin näyte testattiin kolmena kappaleena. Ct-arvoja käytetään laskettaessa ilmentymisen RNA-tasoihin. Määrä kohdegeenin ilmentymisen (2

-ΔΔCt) normalisoitiin käyttäen U6 varten.

Plasmidi rakenteet

genominen sekvenssi ihmisen miR-132, mukaan lukien noin 200 bp reunustavan sekvenssin, oli monistettu ihmisen genomia, insertoitiin sitten BamHI /EcoRI pcDNA3.1-vektoriin (Invitrogen), nimettiin pcDNA3.1-miR-132. Täyspitkä 3’untranslated alue (3’UTR) ja ZEB2 monistettiin ihmisen genomisesta DNA: sta, ja kloonattiin alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi koodausalue pMIR-GLOTM Luciferase-vektoriin (Promega, USA). Uudelleen yhdistetty vektori nimettiin pMIR-ZEB2. Mutaatioita miR-132 sitovat kohdat otettiin käyttöön kohdennetulla mutageneesillä ja saatu vektori nimettiin pMIR-ZEB2-Mut. Alukkeet, joita käytetään konstruktiot taulukossa S1. Kaikki rakenteet vahvistettiin sekvensoimalla.

Vasta-aineet ja siRNA

Ensisijainen vasta-aineita käytetään Western blot olivat kanin anti-ZEB2 (Santa Cruz, USA), anti-E-kadheriini (Santa Cruz) , anti-vimentiinistä (Santa Cruz) ja hiiren anti-β-aktiini (Sigma, Aldrich, St. Louis, MO). β-aktiini käytettiin normalisointia. Pieni häiritsevä RNA: t (siRNA) kohdistaminen ihmisen ZEB2 mRNA, negatiivinen kontrolli-siRNA (siControl), miR-132-estäjän (anti-miR-132), ja inhibiittori-negatiivinen kontrolli (anti-miR-NC) ostettiin Ruibobio (Guangzhou, Kiina ). Kaikki oligonukleotidisekvenssit on esitetty taulukossa S1.

Cell Migration and Invasion Analyysit

Haavan paranemista määritys suoritettiin analysoida solujen vaeltamiseen kuten aiemmin on kuvattu [24]. Boyden chamber määrityksiä käytettiin tutkimaan soluinvaasiota ominaisuus. Solut transfektoitiin 1 ug: lla pcDNA3.1 tai pcDNA3.1-miR-132-vektoriin. Kuusitoista tuntia myöhemmin, transfektoidut solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen. 1,0 x 10

5 solua 300 ul: ssa viljelyalustaa pantiin yläkammioiden (Millipore). Alakammioissa täytettiin 500 pl täydellistä elatusainetta, jossa oli 10% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 12 tuntia 37 ° C, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylhäältä kammion pumpulipuikolla. Vaeltavien solujen alapinnan insertit kiinnitettiin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla, ja viisi satunnaista kentät kunkin insertin laskettiin 100 x suurennoksilla.

Luciferase Reporter Gene Assay

kiinnittyneet solut ympättiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin yhdessä 200 ng pMIR-ZEB2 tai pMIR-ZEB2-Mut vektori ja 80 ng pcDNA3.1-miR-132-vektori tai pcDNA 3.1 tyhjiä vektoreita ja PRL-TK plasmidin (Promega, Madison, WI), jota käytetään sisäisenä normalisointi. Solut kerättiin talteen sen jälkeen, kun 36 tunnin ja lyysattiin käyttäen hajotuspuskuria (Promega). Lusiferaasireportterigeenin määritys toteutettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Tilastollinen analyysi

Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin vertaamalla keskiarvoja (± SD) käyttäen Studentin

t-

testi riippumattomien ja oletettiin

p

0,05 (*) ja

p

0,01 (**).

tulokset

MiR-132 on Usein Down-säädellään erittäin Metastaattinen Keuhkosyöpä solut ja kudosnäytteiden

arvioinut ilme Mir-132 qRT-PCR useissa NSCLC solulinjoissa selvä metastaattinen kapasiteetti. Olemme havainneet, että miR-132 tasoa esillä vaihteleva kuvio näissä solulinjoissa. On huomattava, että ilmaus miR-132 erittäin metastaattinen L9981 ja 95D-solujen dramaattisesti vähentynyt suhteessa, että vastaavat huonosti metastaattista NL9980 tai 95C solulinjoissa, vastaavasti (kuvio 1A). Lisäksi havaitsimme miR-132 ilmentymistä 45 pariksi kliinisissä ensisijainen keuhkosyöpää kudosta ja metastasoituneen imusolmuke syöpä kudosnäytteitä. Verrattuna niiden ensisijainen kollegansa, imusolmukkeiden metastaattisen kudosnäytteet kanna merkitsevästi vähemmän miR-132 tasoa (kuvio 1 B,

P

0,001, Opiskelijan

t

-testi). Myös analyysi kliinis-potilaiden NSCLC osoitti, että ilmentyminen miR-132 oli merkittävä korrelaatio imusolmuke tila (taulukko 1,

P

= 0,011). Nämä tiedot osoittavat, että alennettu ilmentyminen miR-132 on yleinen tapahtuma erittäin metastaattinen NSCLC-soluja ja kudoksia, jotka voivat olla mukana etäpesäke ihmisen keuhkosyövän soluja.

(A) suhteellinen mRNA tasoja miR-132 havaittiin qRT-PCR ja normalisoidaan endogeeninen kontrolli (U6-RNA) useissa keuhkosyövän solulinjoja erottuva metastaattinen kyky. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (**

P

0,01, Studentin

t

– testi). (B) qRT-PCR-analyysi miR-132 ilmentymistä 45 paria ensisijaisen NSCLC kudosten ja niitä vastaavat imusolmukemetastaaseja. MiR-132 ilmentymisen näiden kahden kudosten verrattiin tapa Wilcoxonin-rank-testiä (***

P

0,001, Opiskelijan

t

– testi).

MiR-132 kykenee estämään Migration ja Invasion NSCLC solut in vitro

Seuraavaksi testasimme toiminnallinen merkitys miR-132 NSCLC soluissa. Haavan paranemista määritys osoitti, että ektooppinen ekspressio miR-132 L9981 tai A549 keuhkosyövän soluja esti merkitsevästi solujen vaeltaminen, verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 2A). Lisäksi olemme suorittaneet Boyden kammion määritys vaikutuksen tutkimiseksi miR-132 solujen invaasiota. Kuten on esitetty kuviossa 2B ja 2C, kun transfektoitiin pcDNA3.1-miR-132 plasmideja, hyökkäys kyky A549-solut osoittivat yli-3-kertainen pieneneminen verrattuna kontrolliryhmään. Kuitenkin solut osoittivat lisääntynyt hyökkäys kun hoitoon miR-132 estäjä (kuvio 2B, 2C). Lisäksi rinnakkaisia ​​tuloksia havaittiin 95D ja L9981 solulinjoissa (kuvio 2C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että miR-132 pystyy tukahduttamaan muuttoliike ja invaasion NSCLC-solujen

in vitro

.

(EN) haavan paranemisen tai käytettiin havaittu siirtymisen kyky L9981 ja A549-solut, vastaavasti. (B, C) Boyden kammion määrityksessä käytettiin tutkimaan hyökkäyksen kykyä 95D, L9981, ja A549-solut, vastaavasti. Tulokset olivat kolmen erillisen kokeen (*

P

0,05, **

P

0,01, Studentin

t

– testi). Vaeltavien solujen määrä kussakin ryhmässä normalisoitui kontrolliin. Solut transfektoitiin pcDNA3.1 (NC) tai pcDNA3.1-miR-132 (miR-132) rakentaa ja miR-132-estäjän (anti-miR-132) tai inhibiittori kontrolli (anti-miR-NC). Muuttolintujen A549 soluja alakammioissa yhdestä koe näytettiin B.

MiR-132 inhiboi suoraan Expression of ZEB2 kautta 3’UTR ja säätelee EMT NSCLC Cells

havaitsemiseksi molekyylitason mekanismin, jolla miR-132 estää etäpesäkkeiden keuhkosyövän soluja, me ennustaa oletetun kohdegeenien miR-132 ihmisen soluissa käyttäen työkalua

Miranda

,

PicTar

ja

TargetScans

. Niistä ennustettu ehdokkaita, ZEB2 oli kiinnostava tässä tutkimuksessa, ottaen huomioon keskeinen roolit ZEB2 kehittämisessä ihmisen syöpien [14], [15]. Sen testaamiseksi, miR-132 suoraan kohteena ZEB2 (kuvio 3A), villityypin tai mutantti-3 ’UTR-sekvenssi ZEB2 kloonattiin pMIR reportteri-vektoriin, kuten on esitetty kuviossa 3B. Lusiferaasiaktiivisuutta pMIR- ZEB2 3 ’UTR-paino- konstrukti oli merkittävästi vähentynyt, kun yli-ilmentyminen miR-132 NL9980 soluja, kun taas sen mutantti vastine ei ollut (kuvio 3C). On huomioitava, että mRNA: n tai proteiinin tasot ZEB2 in L9981 tai 95D-solut vähentää dramaattisesti miR-132, vastaavasti (kuvio 3D, 3E ja 3F). On todettu, että ZEB2 on elintärkeä EMT indusoijan avulla tukahduttaa E-kadheriinin tai indusoivan vimentiinista ilmentymistä ihmisen syövässä [16], [19]. Edelleen vahvistaa, että ZEB2 toimii tavoitteeksi miR-132, tarkastellaan vaikutusta miR-132 näihin kahteen alavirtaan efektoreita ZEB2 Western blotilla. Kuten kuviossa 3E ja 3F, EMT maker E-kadheriinin tai vimentiinista oli dramaattisesti säädelty tai alassäädetty kun yli-ilmentymisen miR-132 sekä L9981 ja 95D-soluissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-132 estää suoraan ZEB2 ilmaisun

kautta

kohdistaminen sen 3 ’UTR ja indusoi EMT NSCLC-solujen.

(A) MIR-132 sitoutumiskohta ennustettu 3’UTR on ZEB2 mRNA. (B) mutantti oli generoitu siemenen alueen ZEB2 3 ’UTR kuten on osoitettu alleviivauksella. 3’-UTR-fragmentti ZEB2 mRNA, joka sisältää villin tyypin tai mutantin miR-132 sitoutuva sekvenssi kloonattiin alavirtaan lusiferaasigeenin pMIR vektoriin. (C) L9981-soluja transfektoitiin pMIR reportteri vektorit, jotka sisältävät joko villityypin tai mutantti-ZEB2 3’UTR (merkitty pMIR-ZEB2-3 ’UTR-wt ja pMIR-ZEB2-3’ UTR-mut) joko pcDNA3.1 (merkitty NC) tai pcDNA3.1-miR-132 vektorin (merkitty miR-132). Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin 48 h transfektion jälkeen. (D) ZEB2 mRNA havaittiin qRT-PCR solulinjoissa transfektoitu pcDNA3.1 (merkitty NC) tai pcDNA3.1-miR-132 vektorin (merkitty miR-132). (E, F) proteiini tasot ZEB2, E-kadheriinin ja vimentiinin tutkittiin Western blot transfektoiduissa soluissa eri plasmideja. Kuvio F esittää suhteelliset harmaa arvot kullakin kaistalla (normalisoitu p-aktiini). Proteiinivyöhykkeet kolmesta itsenäisestä Western blot analyysit kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad, USA). Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (**

P

0,01, Studentin

t

– testi).

ZEB2 Auttaa miR-132- Tukahdetut muuttoliike ja Invasion NSCLC Cells

Sitten tutkimme mRNA tai proteiini ilmentymistä ZEB2 useissa NSCLC soluissa sekä 45 primaarisen keuhkosyövän kudoksiin ja metastaattinen imusolmuke kudoksiin. Tiedot paljasti, että proteiini taso ZEB2 vuonna erittäin metastaattista L9981 tai 95D-soluissa oli selvästi säädelty verrattuna huonosti metastaattista NL9980 tai 95C soluja, vastaavasti (kuvio 4A). Lisäksi, sama tulos siitä, että mRNA-tasot ZEB2 havaittiin metastaattisessa imusolmukkeessa kudoksia, suhteessa primaariseen keuhkosyöpä kudoksiin (kuvio 4B). Huomattavaa on, että ilmaus ZEB2 näkyy käänteinen korrelaatio miR-132 taso NSCLC kudoksissa (kuvio 4C). Seuraavaksi, tutkimme ZEB2 on välttämättömiä migraation ja invaasion NSCLC soluja. Kohdunulkoinen ilmentyminen ZEB2 vuonna NL9980 tai 95C solut huomattavasti korkeampia soluinvaasiota (kuvio 4D), mutta hiljentäminen ZEB2 jonka siRNA in L9981-soluissa johti vähentynyt muuttoliike ja hyökkäys kyky solujen (kuvio 4E, 4F), paljastaen sen positiivinen rooleja osuus NSCLC solumigraation ja invaasiota. Samaan aikaan, transfektoidaan tai hiljentäminen tehokkuuden ZEB2 soluissa havaittiin Western blot (kuvio 4D ja 4F,

pienempi

). Sitten me käsiksi onko toiminnallinen vaikutus miR-132 NSCLC soluihin riippui ZEB2. Kuten kuviossa 4G ja 4H, käyttöönotto anti-miR-132 osaksi NL9980 soluihin lisännyt solumigraation ja invaasio, kun taas hiljaisuus ZEB2 jonka siRNA: iden osittain poisti lisälaite. Samanaikaisesti proteiinin taso ZEB2 varmistettiin Western blot (kuvio 4H,

pienempi

). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ZEB2 toimii tavoitteeksi miR-132, joka vastaa miR-132-säätelyyn muuttoliikkeen ja hyökkäyksen NSCLC-solujen.

(A) ilmentymistä ZEB2 tutkittiin Western pyyhi in NSCLC soluissa. (B) suhteelliset mRNA-tasot ZEB2 havaittiin 45 pariksi NSCLC primaarisen kasvaimen kudokset ja niiden imusolmuke etäpesäke kanssa. ZEB2 ilmentyminen näissä kudoksissa verrattiin tapa Wilcoxonin-rank-testiä (***

P

0,001, Studentin t-testi). (C) käänteinen korrelaatio miR-132 ja ZEB2 ilmaisun NSCLC kudoksissa. ZEB2 ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR ja normalisoitiin GAPDH. MIR-132 ilmentymistä havaittiin qRT-PCR-analyysi ja normalisoidaan U6 ilme. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Pearsonin korrelaatiokerroin (r = -0,68, ***

P

0,001). (D) Solujen invaasiota havaittiin Boyden kammio määritys NL9980 tai 95C transfektoiduissa soluissa pCMV tai pCMV-ZEB2 vektoreita, vastaavasti. (E, F) vaikutus ZEB2 Knockdown solun kulkeutumista tai invaasio arvioitiin haavan paranemiseen tai Boyden kammion määritys, vastaavasti (**

P

0,01, Studentin

t

– testata). Lisäksi hiljentäminen tehokkuutta ZEB2 siRNA tutkittiin Western blot. (G, H) haavan paranemisen tai Boyden kammion määritystä käytettiin havaitsemaan siirtymistä tai hyökkäyksen kykyä NL9980 solujen erilaisia ​​hoitoja, vastaavasti (*

P

0,05, **

P

0,01, Studentin

t

– testi). Lisäksi hiljentäminen tehokkuutta ZEB2 siRNA tutkittiin Western blot.

Keskustelu

Ryhmämme on keskittynyt molekyylitason mekanismi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kehitys viime vuosina, erityisesti antautumalla tutkimusta NSCLC etäpesäke. MiRNA osallistuvat NSCLC synnyssä ja niiden ilmaisun profiileja on käytetty luokitella syöpää [25], [26], [27]. Siksi, odotimme että dyregulation etäpesäkkeiden liittyvien MikroRNA voivat helpottaa kehittyneiden etenemistä NSCLC. Miao LJ,

et

,

al.

Havaittu, että miR-449C voi estää hyökkäyksen NSCLC-solujen kohdistamalla c-Myc mRNA [28]. Myös Luunerottelu Liu,

et al.

Raportoitu että miR-26a voi edistää etäpesäke keuhkosyövän soluihin aktivoimalla AKT kohdistamalla PTEN [29]. MiR-132, jotka johtuvat miR-212/132 cluster [30], on dokumentoitu rooleja edistämisessä haimasyövän kehityksen

kautta

aktivoimalla AKT signalointireitin [31]. Kuitenkin mahdollinen tehtävä tämä mikroRNA ihmisen NSCLC eteneminen on muutamia raportteja. Tässä tutkimuksessa, olemme kiinnostuneita mahdollista roolia miR-132 etäpesäkkeiden NSCLC-solujen.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-132 oli usein alassäädetty erittäin metastaattinen NSCLC solulinjoja ja kudosnäytteitä. Niinpä oletetaan, että miR-132 voi olla uusi kasvain vaimennin miRNA ja sen dyregulation voi liittyä kehittynyt etenemistä ihmisen syövän. Lisäksi alkuperäisen kasvainten synnyssä, Shuyu Zhang ja hänen kollegansa totesi, että miR-132 kohdistama alhainen ekspressiotasot perusterveydenhuollossa haiman kasvaimia ja voi liittyä alussa inhimillisen haimasyövän [13]. Kuitenkin mahdollista roolia miR-132 alussa etenemistä NSCLC vielä tutkittava tarkemmin. Sillä järjestelyihin miR-132 alassäätöä, Shuyu Zhang,

et al.

Raportoitu, että hyper-metylaatio promoottorialue oli vastuussa alennettu ilmentyminen miR-132 [13]. Niinpä me arveltu, että tämä DNA muutos saattaa aiheuttaa muuttaminen miR-132 ilmentymistä ihmisen NSCLC.

Seuraavaksi tutkimme funktio miR-132 NSCLC. Tuloksemme osoittivat, että uudelleen käyttöön 132 dramaattisesti tukahduttanut Solujen migraation ja invaasion NSCLC-solujen

in vitro

. Näin ollen meidän tiedot osoittivat, että vähentynyt ilmentyminen miR-132 voi edistää etäpesäkkeiden syöpäsolujen ja siten helpottaa jatkokehitysosastoa ihmisen syövissä, kuten NSCLC. Olemme edelleen tunnettu siitä, ZEB2 toiminnallisena kohteena miR-132 lusiferaasireportterigeenianalyysissä, RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä, vastaavasti. ZEB2 /SIP1, kuten jäsen deltaEF-1 perheen kahden käden sinkkisormen tekijät, ilmennetään usein eri ihmisen syövissä, mukaan lukien haiman [31], rintojen [32], mahan [33], [34 ], munuaisten [35], pään ja kaulan [36], gliooma [37], hepatosellulaarinen [38], munasarjasyöpä [39], squamous ja ei-pienisoluisen keuhkosyövän [14], [15]. Tärkeän roolin transkriptiotekijän ZEB2 on voimakkaasti korostettu lukuisissa papereita, koska sen toiminta asiakkuutta epithelial- mesenkymaalitransitioon (EMT) ja helpottaa etäpesäke syöpäsolujen [37], [40], [41]. Esimerkiksi Nam EH,

et al

. kertoi, että ZEB2 voivat aiheuttaa EMT ja invaasion ihmisen syöpäsoluja

kautta

nimenomaan tukahduttaa ilmaisun E-cateherin ja up säätelevä vimentiinista ilmaisun [42]. Lisäksi Cong N ja hänen kollegansa totesi, että alassäädetty microRNA-200 perhe pystyi edistää EMT kautta wnt /β-kateniinin reitin suuntaamalla E-kadheriinin repressors ZEB1 /ZEB2 mahalaukun adenokarsinoomaa [33]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ZEB2 oli usein voimakasta ilmentymistä metastasoitunut NSCLC-soluihin ja kliinisen imusolmuke kudoksissa. Ja ZEB2 vastasi miR-132-moduloidun muuttoliike ja invaasion NSCLC soluja. Erityisesti havaitsimme että E-kadheriinin tai vimentiinista, loppupään efektori ZEB2, myös alassäädetty tai up-säännellään miR-132, mikä osoittaa, että miR-132 voi käyttää toimintoja maahanmuutto- ja invaasio NSCLC-solujen moduloimalla EMT. Nämä

in vitro

data hiljaista tarvittava osuus heikennettyjä miR-132 edistämisessä solussa etäpesäkkeitä syövissä. Viimeaikaiset tutkimukset paljasti mesenchymal- epiteelin siirtyminen (MET) on etäpesäkkeitä jotka mahdollistivat perustaminen syöpäsolujen kaukaisella sivuston [43]. Kuitenkin mahdollista roolia miR-132 tässä prosessissa vielä havainnollistetaan edelleen.

Yhteenvetona tutkittiin miten miR-132 NSCLC kehittämiseen. Meidän havainto viittaa siihen, että miR-132 voi olla uusi tuumorisuppressori miRNA. MiR-132 estää migraation ja invaasion NSCLC solujen kohdistamalla EMT säädin ZEB2. Tuloksemme antaa uutta tietoa mekanismi vastuussa inhimillisen NSCLC. Lisäksi miR-132 voi toimia mahdollisena terapeuttista ehdokas hoidossa NSCLC.

tukeminen Information

Taulukko S1.

alukkeet käytetään paperiteollisuudessa listattiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0091827.s001

(DOC) B