Krooninen sairaus

tiivistelmä

Muutokset tetraspanin CO-029 ilmaisu liittyy etenemisen ja etäpesäkkeiden syöpien ruoansulatuskanavan. Kuitenkin kuinka CO-029 edistää syövän etäpesäke on edelleen huonosti. Määrittää mekanismi, me vaiennetaan CO-029 ilmentymistä HT29 koolonkarsinoomasoluissa ja totesi, että CO-029 Knockdown vähensi merkittävästi solujen leviämiskyky. Vähäisemmälle solumigraation mukana oli säätely sekä integriini-riippuvaisen soluväliainekonstruktissa tartunta laminiinin ja kalsium-riippuvaisen solu- soluadheesiota. Solun pinnan tasot laminiinin sitovan integriiniä α3β1 ja fibronektiini-integriini α5β1 korotettiin samalla tasolla CD44 laski upon CO-029 hiljentäminen. Nämä muutokset edistävät muuttunut solu-matriisi tarttumista. Vapautuneet solu-soluadheesion tuloksia, ainakin osittain, mistä lisääntynyt aktiivisuus kadheriinien ja alennettu tasolle MelCAM. Lopuksi CO-029 toimii säätelijänä sekä soluväliaineen ja solu-soluadheesion. Aikana paksusuolen syövän etenemisessä, CO-029 edistää syöpäsolujen liikkumista vapauttamalla solun kiinnikkeistä.

Citation: Guo Q, Xia B, Zhang F, Richardson MM, Li M, Zhang JS, et al. (2012) Tetraspanin CO-029 Estää peräsuolen syövän Cell Movement vapauttamalla Cell-Matrix ja solu-solu Kiinnikkeistä. PLoS ONE 7 (6): e38464. doi: 10,1371 /journal.pone.0038464

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu: 08 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 06 toukokuu 2012; Julkaistu: 05 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health CA096991. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä, joka on yksi yleisimmistä syövistä, on korkea kuolleisuus [1]. Potilaat, joilla on etäpesäkkeitä kaukaisiin elinten, kuten maksan ja keuhkojen kärsivät erittäin huono ennuste. Siksi ymmärtäminen solu- ja molekyylitason mekanismeja peräsuolen syövän etenemisen on kriittinen kehittää uusia strategioita, joiden avulla ennustetta ja eloonjäämisasteesta peräsuolen syövän potilaille.

Tetraspanins säädellä erilaisia ​​fysiologisia ja patologisia prosesseja, ja jotkut tetraspanins ovat syöpään liittyvä etenemisen ja etäpesäkkeiden [2] – [11]. Ihmisen tetraspanin CO-029 ja sen rotan homologin, D6.1A, alun perin raportoitu kasvaimeen liittyvä antigeeni ilmaistaan ​​mahan, peräsuolen, ja haimasyövän soluja ja aiheuttavat kasvaimen etenemiseen edistävää aktiivisuutta [12]. CO-029 ilmentyminen on usein ylössäädellään maksasolukarsinoomassa [13]. Ilmaisu taso D6.1A lisääntyy selvästi suhteessa yksi eriytetyn vanhempien linja, joka dedifferentoituneiden rotan hepatoomasolulinjassa [14]. Samanaikainen integriini α6β4 ja D6.1A in nonmetastasizing rotan haiman adenokarsinooman solulinjan BSp73AS helpottaa maksan etäpesäkkeiden tämän linjan [15]. CO-029 osoittaa myös korkeampi ekspressiotaso metastaattinen koolonkarsinoomasoluja verrattuna tasolla ensisijainen koolonkarsinoomasoluissa [16]. Mahdollinen mekanismi prometastatic aktiivisuutta CO-029 on sen yhdessä integriinien tai tetraspanins, jotka molemmat vaikuttavat solun liikkuvuus. D6.1A liittyy integriinien α3β1, α6β1, ja α6β4 jälkeen proteiinikinaasi C (PKC) aktivointia [15], [17]. Metastaattisessa haiman ja paksusuolen ja peräsuolen karsinooma solulinjat, PKC: n aktivaation parantaa rinnakkais- CO-029 ja tetraspanin CD151 integriinin α6β4 kasvainsoluissa, edistää sisäistämisen tämän integriinin-tetraspanin monimutkainen, vähentää soluväliaineen tarttuvuus laminiinin 332, ja lisää solumigraation [18]. Lisäksi D6.1A yli-ilmentyvä kasvainsolut vapauttavat eksosomeiksi, jotka sisältävät D6.1A, ja nämä eksosomeiksi indusoivat angiogeneesiä helpottaa kasvaimen levittämistä [19]. Tuore tutkimus osoitti, että E-kadheriinin ja p120-kateniinin antagonisoivat CO-029 edistänyt kulkeutumista Isreco koolonkarsinoomasoluissa [20]. Nämä tutkimukset viittaavat vahvasti siihen tärkeä rooli CO-029 etenemisessä ja etäpesäkkeiden kasvainten ruoansulatuskanavan. Määrittää mekanismi, jonka CO-029 edistää kasvaimen etenemistä ja etäpesäkkeiden, me vaiennetaan ilmaus CO-029 HT29 ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluissa. Yhdistämällä in vitro ja in vivo kokeissa olemme huomanneet, että menetys CO-029 vaimensi merkittävästi solun liikkuvuus ja muuttaa tasapainoa solu-solu ja solu-matriisi kiinnikkeistä, mikä johtaa alentuneeseen metastaattisen potentiaalin syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture, Antibodies, soluväliaineen proteiinit, ja muut reagenssit

HT29 ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman solulinja saatiin ATCC (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

käytetyt vasta-aineet tässä tutkimuksessa intergrin α1 mAb TS2 /7, intergrin α2 mAb IIE10, intergrin α3 mAb A3X8, intergrin α5 mAb BIIG2, intergin α6 mAb A6BB, intergrin β1 mAb TS2 /16, intergrin β4 mAb 439-9B (BD Pharmingen, San Diego, CA), CD9 mAb: itä C9BB [21] ja Mab7, CD63 mAb 6H1 [22], CD81 mAb M38, CD82 mAb M104, CD151 mAb: t 5C11 ja TS151r [23], CO29 mAb NS1116 (ystävällisesti Dr. Dorothee Herlyn Wistar Institute), E-kadheriinin mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), EPCAM mAb VU1D9 (Cell Signaling, Danvers, MA), EWI2 mAb 5E8 (ystävällisesti Dr. T. Schweighoffer Novartis Institute for Biomedical Research), ja MelCam mAb P1H12 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Hiiren IgG2b käytettiin negatiivisena kontrollina vasta-aineen (Sigma, Saint Louis, MO). Toinen vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa oli piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Sigma, Saint Louis, MO) ja fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoidulla vuohen anti-hiiri tai -rat IgG vasta-ainetta (Biosource International, Camarillo, CA) .

soluväliaineen proteiinit käyttövalmiiksi hiiri tyvikalvon matrigeelin (BD Biosciences, Mountain View, CA), hiiren laminiini 111 (Invitrogen, San Diego, CA), ja ihmisen plasman fibronektiinin (Invitrogen, San Diego, CA ). Muut reagenssit olivat yhtiöltä Sigma, jos lähde ei ole määritetty.

RNA-interferenssi ja Retroviirus valmistelu ja transduktio

CO-029 pieni hiusneula-RNA (shRNA) (TGCTGTTGACAGTGAGCGATGAATGAAACTCTCTATGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCATAGAGAGTTTCATTCACTGCCTACTGCCTCGGA), joka on suunnattu TGAATGAAACTCTCTATGAA sekvenssi ihmisen CO-029 mRNA, ja ohjaus shRNA (RHS1703) saatiin OpenBiosystems (Huntsville, AL). Toinen CO-029 shRNA joka kohdentuu eri osa CO-029 mRNA-sekvenssin saatiin OpenBiosystems (Materiaalit Methods S1). Vesikulaarisen stomatitis-virus (VSV) -G-proteiinin ekspressiovektori VSV-G (ystävällisesti antaa Dr. C. Stipp, University of Iowa) ja shRNA transdusoitiin osaksi GP293 pakkaus solujen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA). 48 tunnin kuluttua, viruspartikkelin sisältävä viljelmän supernatantti kerättiin, ja solujätteet poistettiin johtamalla supernatantti 0,45-umol /L ruiskun suodattimen. Puhdistettu virusliemi inkuboitiin HT29 transduktioon ja HT29 transdusoitu ohjaus tai CO-029 shRNA valittiin kanssa puromysiini. Puromysiini-resistenttien solujen CO-029 shRNA transductant lajiteltiin virtaussytometrialla rikastuttaa CO-029-vaiennetaan solupopulaatio.

virtaussytometria

Solut irrotettiin 0,5% trypsiiniä-EDTA- , pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kahdesti, blokattiin 5% vuohen seerumia DMEM: ssä 4 ° C: ssa 1 h, inkuboitiin ensisijaisen mAb, ja sitten värjättiin FITC-konjugoidulla vuohen anti-hiiri-IgG 4 ° C: ssa 1 h. Värjätään solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences).

Immunofluoresenssi

Solut kiinnitettiin 3% paraformaldehydillä huoneenlämpötilassa (RT) 15 min, läpäiseviksi 0,1% Brij 98 huoneenlämpötilassa 2-5 minuuttia, blokattiin 20% vuohen seerumia 4 ° C: ssa 1 h, ja inkuboitiin ensisijaisen mAb: t 4 ° C: ssa 1 h, mitä seurasi värjäys sekundäärisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa 1 tunti. Jokaisen vasta-aineen inkubaation jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS: llä. For immunofluore- analyysi, solut tutkittiin kanssa Axiophot fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss, Thornwood, NY), ja kuvat otettiin käyttäen Optronics-digitaalikameralla.

immunosaostus ja Western Blot

Immunosaostukset oli suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24]. Solut hajotettiin 1% Nonidet P-40 hajotuspuskuria 4 ° C: ssa 1 h. Joissakin kokeissa, solun pinnan leimattiin 0,5 mg /ml EZlink sulfo-NHS-LC-biotiinia (Pierce) ennen solujen hajoamista. Poistamisen jälkeen liukenematon materiaali sentrifugoimalla 14000 x g: ssä ja kaksi ajoa pre-tila, lysaatit inkuboitiin ensisijaisen mAb-imeytyy proteiini A- ja G-Sepharose-helmiä (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 3 h ja yli yön 4 ° C. Immunosaostumat pestiin lyysipuskurilla kolme kertaa, liuotetaan Laemmli-näytepuskurissa, kuumennettiin 95 ° C: ssa 5 min, erotettiin SDS-PAGE, ja sitten sähköisesti siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad, Hercules, CA). Kalvot peräkkäin blotattiin ensisijainen Ab ja piparjuuriperoksidaasikonjugoitua toisen Ab (Sigma) immunoblottauskokeissa tai piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun ekstravidiini (Sigma) biotinylaatio kokeissa, minkä jälkeen kemiluminesenssin (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).

soluadheesioanalyyseissä

Soluväliainekonstrukteja adheesiomääritys suoritettiin, kuten on kuvattu aiemmassa tutkimuksessa [25]. Lyhyesti, 96-kuoppaisen mikroviljelmälevyn (BD Bioscience) päällystettiin hiiren laminiinin 111 tai fibronektiinin 4 ° C: ssa yön yli ja sitten blokattiin 1% lämpöinaktivoitua naudan seerumin albumiinia (Sigma) 37 ° C: ssa 1 h. Laminiini 332 valmistettiin viljelemällä RAC-11P solujen konfluenssiin 96-kuoppaisilla levyillä 3 päivää, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin seerumittomassa DMEM tiheydellä 1 x 10

4 solua /ml, ja 0,1 ml solususpensiota lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan. Kun oli inkuboitu 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, irrallinen solut poistettiin huuhtelemalla neljä kertaa PBS: llä. Liitteenä solut visuaalisesti laskettiin.

Cell-soluadheesiota tutkittiin käyttämällä roikkuu pudota aggregaatiotestillä kuten aiemmin on kuvattu [27]. Solut irrotettiin 0,5% tripsin-EDTA: lla ja pestiin kahdesti PBS: llä, sitten käännetyksi yksisoluiset suspension kolme lempeä kulkee läpi 27 gaugen neulan. Yhden solususpensio 1 × 10

4 solut 30 ui liuosta keskeytetty roikkuu pudotus kansi 24-kuoppaisen viljelymaljalle ja annettiin laskea yhteen yön yli 37

oC, 5% CO

2 kosteus. Täydellinen DMEM mittaukseen käytettiin yhteensä solu-tarttuvuus, kun taas kalsium-vapaata DMEM oli kalsium-riippumaton solu-solu tarttuvuutta. Määrittämään vastus solu-solu-adheesio mekaanista rasitusta, solut altistettiin leikkaus voimaa viemällä ne läpi 200 ui pipetillä kärjestä 10 kertaa. Kalsium-riippumaton solu-soluadheesion mitattiin myös suhteellisen lievissä mekaanista rasitusta [28]. Lyhyesti, pesun jälkeen Puck suolaliuoksella (5 mM KCI, 140 mM NaCl, 8 mM NaHCO 3, pH 7,4), yhden solususpensiota (1 x 10

5 solua /ml) inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa yön yli sekoittaen 80 rpm tasoravistelijalla. Solut valokuvattiin joko ennen tai jälkeen mekaanisen rasituksen. Solu-solu tarttuvuus jälkeen leikkausjännityksen kvantifioitiin kuten i) prosenttiosuus yhdistettyjen solujen ja /tai ii) peittämän alueen aggregaatteja. Perustuu lasken yksittäisten solujen prosenttiosuus yhdistettyjen solujen laskettiin käyttämällä kaavaa% yhdistäminen = [1- (määrä yksittäisiä soluja /lukumäärä solua yhteensä)] x 100. Pinta-ala kattaa aggregaatit mitattiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa kuvata aste soluaggregaation. Solujen yhteenlaskettu määritellään solua tallustella sisältää neljä tai useampia soluja.

Cell Migration määritykset

Haavan paranemista määritys suoritettiin kuten kuvattu aiemmassa tutkimuksessa [29]. Lyhyesti, solut ympättiin yksittäisiin kuoppiin 24-kuoppaiselle viljelylevylle. Kun solut saavuttivat konfluenssin, solun yksikerroksinen käsiteltiin ensin 10 ug /ml mitomysiini C: ssa 30 minuutin ajan estämään mitoosia ja siten on mahdollista analysoida solumigraation ilman soluproliferaation. Sitten yksisolukerros haavoittui steriilillä, 200 ui pipetin kärki. Keskipitkällä ja solujen roskat poistettiin ja täydennettävä 2 ml tuoretta alustaa. Solut valokuvattiin faasikontrastimikroskopiaan 24 tunnin välein jälkeen haavoittaen. Arvioida ”haavan”, viisi aluetta pitkin haava valittiin satunnaisesti laskemiseksi keskimääräinen leveys kunkin hyvin. Kuvat otettiin eri ajankohtina jota Olympus käännetyn faasikontrastimikroskooppia.

TranswellTM solujen vaeltamiseen määritys suoritettiin kuten kuvattu aiemmassa tutkimuksessa [30]. Lyhyesti, 8 um huokoskoko, 24 ja Transwell-insertit (BD Bioscience, Bedford, MA), esipäällystettiin 10 ug /ml laminiinin 111 tai fibronektiinin päälle alapintaan inserttien 4 ° C: ssa yön yli ja estettiin 0,1% lämpöinaktivoitua naudan seerumin albumiinia (BSA) 37 ° C: ssa 1 h. Yhteensä 2 x 10

4 solut seerumittomalla DMEM, joka sisälsi 0,1% lämmöllä inaktivoitua BSA: ta tilavuuteen 300 ui lisättiin ylempään kammioon, ja 500 ui DMEM, joka sisälsi 1% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon . Solut siirtoaltaat inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa. Solut jäljellä yläpinnan insertit poistettiin pyyhkimällä vanupuikolla, ja solut, jotka transmigrated huokosten läpi kiinnitettiin ja värjättiin Diff-Quik Stain Kit (Dade Behring, Inc., Newark, DE). Migration kvantifioitiin laskemalla solujen alapinnan insertin.

Tilastollinen analysointi

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään neljä kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin

t

-testi, ja

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

The Silence of CO -029 ekspressio HT29 koolonkarsinoomasoluissa

määrittämiseksi mekanistinen roolit tetraspanin CO-029 syövän etenemiseen, loimme vakaa transductant in HT29 ihmisen paksusuolen adenokarsinoomasolua [31], jossa CO-029 ilmentyminen oli tippuu alas shRNA. Äänenvaimennusjärjestelmä vaikutuksia koko solun ja solun pinnan CO-029-proteiinin ekspressio arvioitiin Western-blot- ja virtaussytometria, vastaavasti (kuvio 1). Verrattuna transductant ilmentävät ohjaus tai nonsilencing (NS) shRNA, The transductant ilmentävät CO-029 shRNA (KD) oli merkittävä väheneminen CO-029 ilmentymistä solun pinnalla (kuvio 1A), joka vaihtelee välillä noin 60%: sta 90%, riippuen solujen yhtymäkohta asema kussakin yksittäisessä kokeessa, ja suuri menetys koko solun CO-029-proteiineja (kuvio 1 B), tyypillisesti noin 90%. Hiljaisuus johtuvat CO-029 shRNA oli erityisiä CO-029, koska ilmaus monien muiden pinnan proteiineihin, erityisesti muiden jäsenten tetraspanin superperheen, ei vähennetty (katso seuraava).

CO-029 shRNA ja nonsilencing shRNA oli stabiilisti ilmaistu HT29. (A) virtaussytometrinen analyysi CO-029 ilmentyminen pinnalla HT29-soluja, jotka transfektoitiin nonsilencing (NS) tai CO-029 shRNA (KD) konstrukteja. Negatiivinen kontrolli mAb oli hiiren IgG, ja CO-029 mAb oli NS1116. Mean fluoresoiva intensiteetti (MFI) CO-029 KD-soluissa oli 62% vähemmän verrattuna NS soluissa. (B) Western blot-analyysi CO-029 proteiinien NS ja KD HT29. KD solut muotoutuneet 90% vähennys CO-029-proteiineja. β-aktiini: latauskontrollina.

The Silence of CO-029 Expression Heikentynyt muutto HT29

Ensin arvioitiin vaikutusta CO-029 hiljentäminen syöpään solujen vaeltamiseen. Vertailla solu muuttavia kykyä NS ja KD transduktanttien, suoritimme 1) haavan paranemista määritys analysoida kollektiivisen solujen vaeltamiseen, eli solu-solu adheesioriippuvaisten solujen vaeltamiseen, ja 2) siirtokuoppaan migraatiokokeessa analysoida yksinäinen solujen vaeltamiseen, eli solu-soluadheesion riippumaton solumigraation. Haavan paranemista kokeissa kannan uudelleen korko tai paranemista haavoittuneiden yksikerroksista heikkeni merkittävästi CO-029 KD transductant soluja, ja tämä vähennys kesti useita päiviä (kuvio 2A ja kuvio S1A). Alennetun haavan paranemista ei johtunut hitaampi soluproliferaatiota KD solujen, koska kokeet suoritettiin, kun läsnä oli mitomysiini. Heikentynyt kyky KD solujen migraatiota voidaan myös havaita Transvvell- migraatiokokeessa. Solumigraation läpi huokosia kalvosuodattimen päälle soluväliaineen proteiineja, kuten laminiinin 111 ja fibronektiiniä väheni huomattavasti kun vaiennettaisi CO-029 lauseke (kuvio 2B ja kuvio S1B). Nämä tulokset osoittavat, että hiljaisuus CO-029 vaimentaa yleinen kyky solujen vaeltamiseen ja että ilmaus CO-029 tarvitaan vahva tai selkeä solujen vaeltamiseen.

(A) Haavan paranemista määrityksessä. Verrattuna NS soluihin, haavan oli merkittävästi heikentynyt KD-soluilla 72 tuntia sen jälkeen luomisen haavojen konfluenteissa yksisoluiset kerrokset. (B) TranswellTM migraatiokokeessa. KD soluilla heikentynyt potevilla siirtokuoppaan muuttoliike kokeita. Tiedot näkyvät keskiarvona ± SD, n = 4. *

P

0,05.

Lisäksi solujen vaeltamiseen 2-ulotteinen matriisi, soluinvaasiota on tärkeä parametrin mittaamiseksi soluliikkuvuus kautta 3-ulotteinen (3D) microenvironment invasiivisia ja metastaattisen syöpäsoluja. Cellular invasiivisuus mitattiin kykyä HT29 transductant solujen hyökätä kautta Matrigel, 3D-matriisiin samanlainen tyvikalvon, tai tyypin I kollageenin geelin, 3D-matriisiin samanlainen sidekudosta. Emme löytäneet merkittävää hyökkäystä kummassakaan ryhmässä HT29-KD solujen joko näistä 3D matriisin ympäristöissä (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että HT29 eivät ole invasiivisia, ainakin tässä invaasiomääritys ja alle

in vitro

Koeolosuhde.

CO-029 Regulated Soluväliainekonstrukteja ja solu-solu Adhesion

Kasvainsolulinja-matriisi ja solu-solu kiinnikkeistä pidetään merkittävät tapahtumat, jotka säätelevät metastaattinen cascade [ ,,,0],32] – [34]. Arvioida vaikutuksia CO-029 hiljentäminen on soluväliainekonstruktissa tarttuvuus, me analysoitiin ja verrattiin soluväliainekonstruktissa tarttuvuutta KD ja NS transduktanttien laminiinille ja fibronektiinin. Kuten kuviossa 3A, HT29-NS ja -KD soluilla eri tartunta kykyjä. KD solut ilmeni kohonneita tarttuvuus on soluväliaineen proteiinien Laminiinin 111 ja laminiini 332, viittaa siihen, että CO-029 hillitsee solun tarttuvuus tyvikalvon, joka on matriisi ympäristö rikastettu laminiineja. Soluadheesiota fibronektiinin, kuitenkin, ei esiintynyt eroja NS ja KD-soluja (kuvio 3A). Tutkimme myös solun tarttuvuus hyaluronaani, suuri proteoglykaani solunulkoisen ympäristön ja ligandi CD44, koska vähentynyt CD44 ilmentyminen pinnalla HT29-KD-soluja. Kuitenkin HT29 ei näyttänyt kiinni hyaluronaani, vaikka vakiintunut protokollaa tätä analyysiä varten [35].

(A) Cell-matriisi tarttumista. Tarttuvuus päälle laminiini 111, laminiinin 332, ja fibronektiini HT29-NS ja -KD solut määritettiin inkuboinnin jälkeen 37

oC, 5% CO

2 1 h. Tarttuvuus KD solujen laminiinin 111 ja laminiini 332 lisääntyi merkitsevästi verrattuna NS soluihin (

P

= 0,042 laminiinille 111 ja = 0,048 laminiinille 332). (B) yhteensä solu-soluadheesion. Solujen yhdistäminen mitattiin Ca

++ – sisältävä media jälkeen suhteellisen vahva mekaaninen kohdistettiin. (C) Ca

++ – riippumaton solu-soluadheesion. Solujen yhdistäminen mitattiin Ca

++ – vapaa tiedonvälitys jälkeen suhteellisen voimakas tai lieviä mekaanisia voimia haettiin, vastaavasti. Aggregoinnissa NS ja KD solujen jälkeen leikkausjännityksen kvantitoitiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

P

arvot ovat 0,03 varten yhteen solujen läsnäollessa Ca

++, 0,001 alueelle aggregaattien läsnäollessa Ca

++, ja 0,0004 lievä stressi puuttuessa Ca

++. Kuvia solun aggregaattien jälkeen leikkaus- jännityksen hoidossa saatiin alle faasikontrastimikroskopiaan. Kaikki tiedot ennustetaan keskiarvona ± SEM (n = 4). *

P

0,05, **

P

0,01.

vaikutuksen arvioimiseksi CO-029 hiljentäminen on solu-solu-adheesion teimme solun -aggregaatioanalyysi. Ensin tutkitaan solun aggregaatiota läsnä Ca

++ [28], joka heijastaa koko solu-solu tarttuvuus mukaan lukien sekä kadheriinin riippuvainen ja riippumattaman solu-solu tarttuvuutta. Hiljentäminen CO-029 lisännyt kyky muodostaa solun aggregaatteja, jotka ovat resistenttejä suhteellisen voimakas mekaaninen rasitus, verrattuna NS-soluja (kuvio 3B). Sitten tutkimme solu-solu-aggregaatiota ilman Ca

++, joka heijastaa kadheriinin-riippumaton solu-solu tarttuvuutta, kuten yhden välittämä IgSF proteiineja. Ca

++ – riippumaton solun soluadheesiota havaittu eroa, kun suhteellisen vahva mekaaninen rasitus sovellettiin mutta vaimentua KD soluissa jälkeen suhteellisen lieviä mekaanista voimaa käytettiin (kuvio 3B). Vuonna HT29, Ca

++ – riippuvaista solu- soluadheesiota tekee merkittävän panoksen koko solu- soluadheesiota, joka perustuu vertailuun suuruuden Ca

++ – riippuvaista ja riippumattaman aggregaattien jälkeen vahva mekaaninen stressin hoitoon (kuvio 3B). Yhdessä CO-029 rajojen koko ja Ca

++ – riippuvaista solu- soluadheesiota.

CO-029 hiljentäminen Altered solupintaekspressoiminen profiili Adheesiomolekyylit

Muutokset pinnassa ilmaus tetraspanins, integriinien, ja soluadheesio proteiinit ovat osallisena kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [17], [36] – [42]. Määrittää mekanismi, jonka CO-029 säätelee solu-solu ja -matriisi kiinnikkeistä, me mitattiin ja sitä verrattiin ekspressiotasot soluadheesion proteiinien pinnalla HT29-NS ja -KD soluja. Sillä soluväliaineen adheesioproteiineja, laminiinireseptori integriinin α3 ja fibronektiinireseptoriproteii- integriinin α5 oli voimistunut jälkeen hiljentäminen CO-029. Integriinit β1, β4, α1, α2, ja α6 pysyi ennallaan, kun taas hyaluronaaniin reseptori CD44 oli merkittävästi vaimentua solun pinnalla (kuvio 4A). Sen määrittämiseksi, onko CO-029 hiljentäminen vaikuttaa integriinin aktivaation, mittasimme ja verrataan vakaan tilan tasoja aktiivista β1 integriinien HT29-NS ja -KD solujen virtaussytometrialla käyttämällä β1 integriinin mAb AG89. Β1-integriini mAb AG89 tunnistaa vain β1 integriinien aktiivisessa tilassa [43]. Vaikka taso aktiivisen β1 integriinien lisääntyi merkitsevästi solun pinnalla HT29-KD soluissa (kuvio 4B vasen histogrammi), se pysyi muuttumattomana jälkeen kalibroitu taso koko β1 integriinien solun pinnalla (kuvio 4B oikea histogrammi). Solusta soluadheesiomolekyylit, taso E-kadheriinin proteiineja ei muuttanut solun pinnalla (kuvio 4C). Tutkimme myös muita solun Soluadheesiomolekyylien liittyvät CO-029 ja /tai tetraspanins kuten EpCAM, MelCAM, ja EWI2, jotka osallistuvat Ca

++ – riippumaton solun soluadheesiota ja joista jotkut kuuluvat IgSF . Vain MelCAM oli merkittävästi vaimentua solun pinnalla (kuvio 4C). Tetraspanins CD9, CD63, CD81, CD82, ja CD151 ei esiintynyt merkittävää muutosta solun pinnalla, kun CO-029 hiljentäminen (kuvio 4D).

ekspressiotasot soluväliaineen adheesioproteiineja (A), aktiivinen β1 integriinit (B), solu-solu-adheesio proteiinit (C), ja tetraspanins (D) pinnalla HT29-NS ja -KD transfektanttisoluilla mitattiin virtaussytometrialla. Suhteelliset tasot näiden proteiinien KD solujen NS-soluja esitetään histogrammit (keskiarvo ± SD, n = 4~8). *

P

0,05, **

P

0,01. (B), kun normalisoitu vastaava suhteellinen taso koko integriini β1, tasot aktiivisen integriinin β1 suhteessa NS soluja esitetään histogrammin oikealla.

CO-029 ja muodostuminen Focal Adhesion, Stressi Fiber, ja vyöliitos

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi CO-029 hiljentäminen soluadheesiota, tutkimme fokaalisen adheesion ja vyöliitos n HT29 transfektanttisoluilla värjäämällä i) vinkuliini, joka on merkkiaine fokaalisen adheesion, ja ii) E-kadheriinin ja β-kateniinin, markkereita vyöliitos, vastaavasti. Huomasimme, että CO-029 hiljentäminen johti pienentyneeseen muodostumiseen polttovälin tarttuvuus, kuten kuvassa 5A. Samaan aikaan stressi kuitu muodostumista lähellä pohjapinta pinta HT29-KD soluihin tuli myös vähemmän kestävä verrattuna yksi HT29-NS soluja (kuvio 5A). Sen sijaan, CO-029 hiljentäminen ei näytä olevan häiritsevä vaikutus muodostumiseen vyöliitos, joka perustuu E-kadheriinin ja β-kateniinin värjäyksen (kuvio 5B). Aivokuoren meshwork aktiini pitkin sivupinnan tai vyöliitos ei esiintynyt huomattavia eroja NS ja KD transfektanttisoluilla (tuloksia ei ole esitetty).

HT29 transfektantit maljattiin lasipeitinlevyille ja viljeltiin täydellisessä median 2 päivä (ja vinkuliinin ja F-aktiini värjäys, A) tai konfluenssiin asti (E-kadheriinin ja β-kateniinin värjäys, B). Solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja inkuboitiin ensisijaisen mAb: t 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen Alex Fluor 594-konjugoidulla sekundaarisella Ab: värjäystä. F-aktiini värjättiin Alex Fluor 594-konjugoitu phalloidin. Kuvat otettiin kiinni kanssa konfokaalimikroskopia. Bar = 20 um.

Vaikutus CO-029 hiljentäminen muotoutumisen Tetraspanin rikastettu Microdomain (TEM) B

Koska CO-029 kumppaniaan tetraspanins kuten CD9 ja CD151 ja laminiinia sitova integriinien [11], tutkimme vaikutus CO-029 hiljentäminen vakauteen TEM. Yhdistysten CD151 kanssa laminiinin sitovan integriinien α3β1, α6β1, ja α6β4 pysyi vakaana tiukoissa lysis ehto, eli 1% Triton X100-solujen hajoamiseen, kun taas liittojen CD151 muiden tetraspanins pysyi stabiilina vain suhteellisen lieviä lysis ehto, eli 1% Brij 97-solujen hajoamiseen [3]. CO-029 hiljentäminen ei vaikuttanut immunosaostus profiilien CD151 joko hajoamiseen ehto (kuvio 6A). Enemmän laminiinia sitova integriinien oli kerasaostuvat CD151 alle 1% NP40 hajoamiseen ehdon CO-029 hiljentäminen. Sekä CD151 ja CD9 liittyvät CO-029 alle 1% Brij 97 lyysi kunnossa, mistä kertoo CD151 ja CD9 immunosaostus profiileja, kun taas tällaisten yhteenliittymien hajotettiin alle 1% Triton X100 lyysi kunnossa, odotetusti. Alle 1% Brij 97 hajoamiseen kunnossa, CO-029 immunopresipitaateista paljasti myös CD9-CO-029 yhdistyksen mutta ei CD151-CO-029 yhdistys takia vähemmän biotinyloinnin CD151 ja yhteistyön kulkeutumista CD151 CO-029 (kuvio 6A).

(A) pinta biotinyloitua HT29-NS ja -KD transfektanttisoluilla lyysattiin kanssa osoitetun pesuaineella puskureita. Tetraspanins CD9, CD151, ja CO-029 immunosaostettiin lysaatit, erotetaan SDS-PAGE, ja havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin. Tasot β-aktiini proteiinien lysaatit tutkittiin Western blot ja toimi lysaatti lisäämisen valvonta. (B) ekspressio tasot integriini α3β1-sitoutumattoman CD151, yhteensä CD151, homoclustered CD9, ja yhteensä CD9 pinnalle HT29-NS ja -KD transfektanttisoluilla mitattiin mAb TS151r, 5C11, C9BB, ja Mab7, vastaavasti, käyttäen virtaussytometrialla. Suhteelliset tasot CD151 ja CD9 KD solujen NS-soluja esitetään histogrammit (keskiarvo ± SD, n = 3~5).

Jotkut CD151-proteiinien solun pinnalla sitoutuvat integriinin α3β1 vuonna suora proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen tavalla [3]. Analysoimme taso integriinin α3β1-sitoutumattoman tai ”vapaa” CD151 proteiineja, jotka tunnustetaan CD151 mAb TS151r [23]. Solun pinnalla, eikä taso vapaan CD151 eikä koko CD151-normalisoitu taso vapaan CD151 muutettiin upon CO-029 hiljentäminen (kuva 6B). Vastaavasti, CD9 proteiineja solun pinnalla joko homoclustered tai liittyy TEM [21]. Huomasimme, että kumpikaan taso homoclustered CD9 eikä koko CD9-normalisoitu taso homoclustered CD9 muutettiin upon CO-029 hiljentäminen (kuva 6B). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että CO-029 ei tarvita vuorovaikutuksen CD151 ja CD9 kanssa TEM.

Keskustelu

Tetraspanins säädellä kasvainprogression ja etäpesäkkeitä. Mutta mekanismit ovat edelleen suurelta osin tuntemattomia. Solutasolla, tetraspanins moduloivat soluadheesion, muuttoliike, leviämisen, ja fuusio. Tarttuvuutta ja motiliteetti syöpäsolujen osittain määrittää kasvaimen metastaattinen potentiaali. Näin ollen, solutasolla, tetraspanins todennäköisesti säädellä tuumorin etäpesäkkeiden moduloimalla kyvyt kasvainsolujen kiinni ja liikkua. Molekyylitasolla, tetraspanins liittävät integriinien, IgSF proteiinien, kasvutekijöiden ja niiden reseptorien, proteaasit, ja solunsisäinen signalointi proteiinit muodostavat TEM [44] – [47]. Näin ollen, molekyylitasolla, tetraspanins säätelevät kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden todennäköisesti muuttamalla toimintoja liittyviä proteiineja [48] – [51].

ilmentyminen tetraspanin CO-029 on tyypillisesti liittyy huono prognoosi ruoansulatuskanavan syöpiin [12], [16], [18], [46], [52], [53], CO-029 on säädelty kun etenemisen paksusuolen, maksan, haiman ja ruokatorven syöpiä [11], [ ,,,0],46], [54], ja lisääntynyt ilmentyminen CO-029 edistää maksan tai keuhkojen etäpesäkkeiden näiden syöpien [17], [52], [53], [55]. Kasvainsolun muuttoliike ja invaasiota ovat välttämättömiä etäpesäke. Liike kasvainsolujen on mukana ainakin kaksi vaihetta etäpesäkkeitä kaskadin [52]. Ensimmäinen vaihe on se, että tuumorisolujen siirtyvät pois primaarikasvaimen ja tunkeutua verenkiertoelimistön; Toisessa vaiheessa on, että kasvainsolut vaeltavat ulos verisuonista ja kohdeniveliin kudoksiin. Pelkistetty cell liike upon CO-029 hiljentäminen osoittaa, että CO-029 tarvitaan kulkeutua tehokkaasti ja invaasion paksusuolisyövän soluja ja viittaa siihen, että CO-029 todennäköisesti edistää molempien vaiheiden tuumorimetastaasin.

CO-029 tulee näkyviin edistää solujen liikkuvuuteen muuttamalla soluväliaineen ja-solujen kiinnikkeistä. On hyvin tunnettua, että solu-solu ja -matriisi tarttumisen suoraan määrittää solun liikkuvuus. Esimerkiksi menetys tai vähentäminen E-kadheriinin ilmentymisen ja /tai aktiivisuuden kasvainsoluihin johtaa lähettämistä kasvainsolujen primäärikasvain massa [56]. Menetelmät S1.