Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peroksisomiproliferaattorireseptorin gamma (PPARy) agonistit, kuten thiazolinediones (TZD), on tutkittu niiden mahdollista käyttöä syövän terapeuttisina aineina. Olemme tutkineet vaikutusta neljän TZD-rosiglitatsoni (Rosi), siglitatsoni (CGZ), troglitatsoni (TGZ), ja pioglitatsoni (Pio) -oni munasarjasyövän solujen lisääntymistä, PPARy ilmaisun ja PPAR lusiferaasireportterilla toimintaa. Olemme selvittäneet TZD toimimaan PPAR riippuvaisilla tai riippumattomasti käyttämällä molekyyli- lähestymistapoja estämään tai yli-ilmentämään PPAR aktiivisuutta.

Keskeiset havainnot

hoito CGZ tai TGZ 24 tuntia vähentynyt proliferaatio kolmessa munasarjan syöpäsolun linjat, Ovcar3, CaOV3, ja SKOV3, kun taas Rosi ja Pio ei ollut vaikutusta. Tämä lasku Ovcar3 solujen lisääntymisen johtui osuus on suurempi solujen G

0 /G

1 vaiheessa solusyklin. CGZ ja TGZ hoito lisäsi apoptoosia 4 tunnin kuluttua hoidon, mutta ei sen jälkeen, kun 8 tai 12 tuntia. Käsittely TGZ tai CGZ lisääntynyt PPAR mRNA ilmentymistä Ovcar3 soluissa; kuitenkin, proteiini pysyivät ennallaan. Yllättäen lusiferaasi promoottori määritykset paljastivat, että mikään TZD lisääntynyt PPARy aktiivisuutta. Yli-ilmentyminen villin tyypin PPAR lisääntynyt reportteriaktiivisuutta. Tämä edelleen täydennetty TGZ, Rosi ja Pio osoittaa, että nämä solut ovat omia valmiuksia toimia välittäjänä PPARy transaktivaatio. Sen määrittämiseksi, ovatko PPARy välittää TZD aiheuttaman laskun proliferaatiossa, soluja käsiteltiin CGZ tai TGZ puuttuessa tai läsnä ollessa vallitsevan negatiivisen (DN) tai villityypin yliekspressio PPARy rakentaa. Kumpikaan vektori muutti TZD välittämä solujen lisääntymistä viittaa tämä vaikutus TZD on munasarjasyöpäsoluja voi olla PPARy riippumattomia.

Johtopäätökset

CGZ ja TGZ alentavan munasarjasyövän solujen lisääntymisen, joka on PPAR riippumattomia. Tämä käsite tukee havainto, että DN tai yli-ilmentyminen villin tyypin PPAR ei vaikuttanut muutoksia solujen lisääntymisen ja solusyklin.

Citation: Al-Alem L, Southard RC, Kilgore MW, Curry TE (2011) Erityiset Tiatsolidiinidioneja Estä munasarjasyöpäsolulinja Proliferation ja aiheuttaa solukierron pysähtymisen on PPARy riippumattomalla tavalla. PLoS ONE 6 (1): e16179. doi: 10,1371 /journal.pone.0016179

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 17 elokuu 2010; Hyväksytty: 14 joulukuu 2010; Julkaistu: 21. 2011

Copyright: © 2011 Al-Alem et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (lupanumeroita CA95609, HD057446 ja RR15592). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on viides johtava syy syövän naisten yleisin kuolinsyy. Niistä kolme päätyyppiä munasarjasyöpä (epiteelin, sukusolujen ja sukupuoli johto strooman syövät), epiteelin munasarjasyöpä osuus on noin 90% kaikista tapauksista, ja on ensimmäinen kuolinsyy gynekologisista syöpäsairauksia [1], [2] . Huolimatta intensiivistä tutkimusta munasarjasyöpää uusia tavoitteita kehitetään jatkuvasti tutkittu, hoito tavoitteet ovat harvassa. Yksi haasteista munasarjasyöpä tutkimuksen puuttuminen koe-eläimen malli, joka esitetään yhteenveto ihmisen tauti, joka voidaan kokeellisesti manipuloida [1], [3]. Näin ollen, munasarjasyövän solulinjoissa on käytetty ymmärtää perustavanlaatuisia prosesseja syöpäsolujen kasvua, erilaistumista ja lisääntymistä. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin kolmea munasarjasyöpäsoluja, Ovcar3, Caov3 ja Skvo3, jotka on johdettu ihmisen munasarjan epiteelin syövän [4], [5], edelleen tutkia hoitomuodot syövän solujen kasvua ja proliferaatiota.

Yksi hoitotavoitteet tutkittavana munasarjasyövän on tumareseptoreista. Lääkkeet, jotka aktivoivat tai estävät tumareseptorien on käytetty hoitamaan monia sairauksia. Itse asiassa noin 13% lääkkeiden nykyisin markkinoilla kohdistaa tumareseptorit [6]. PPARy on erittäin konservoitunut tumareseptorin [7] ilmaisi koko kehon [8] ja on yli ilmaistaan ​​monissa syövissä, mukaan lukien munasarja- ja rintasyöpä, joten se on potentiaalisesti merkittävä toimija kehittämisessä syövän.

Endogeeninen PPARy-ligandit ovat vielä tuntemattomia, mutta hyvin tunnettu ehdokkaita ovat monityydyttymättömiä rasvahappoja, Prostaglandiini J

2 (PGJ

2) ja arakidonihapon [9]. Synteettiset PPARy ligandeihin kuuluvat tiatsolidiinidionien (TZD), jotka koostuvat rosiglitatsonin (Avandia®), Troglitatsoni (Rezulin®), Pioglitatsoni (Glustin ® /Actos®), ja siglitatsoni, jotka kaikki on kehitetty ja /tai käytetään tyypin II diabetes [10], [11], [12]. Käyttö TZD terapeuttisena lähestymistapa syövän on tutkittu, mutta tulokset ovat olleet kiistanalaisia ​​[13], [14], [15]. Tässä tutkimuksessa käytetty molekyyli, fysiologisia ja farmakologisia menetelmiä vaikutuksen tutkimiseksi neljä eri TZD on munasarjasyöpäsoluja ja ovatko nämä vaikutukset ovat PPARy riippuvaisia ​​tai riippumattomia.

Tulokset

Ovcar3, CaOV3 ja SKOV3 munasarjasyövän solulinjoissa ilmentävät PPARy

sen määrittämiseksi, onko munasarjasyöpäsoluja ilmentävät PPARy, reaaliaikainen PCR ja western blot -analyysi suoritettiin. Oli ero PPARy ilmentymistä kolmessa eri solulinjoissa sekä mRNA- ja proteiini tasoilla. Vaikka PPARy-mRNA: n ekspressio oli korkein SKOV3- soluissa (kuvio 1A), SKOV3- solut oli alhaisin PPARy-proteiinin tasot (kuvio 1 B). Sen sijaan Ovcar3 oli alhainen PPAR mRNA: n ilmentymisen mutta runsas ilmentyminen PPAR-proteiinin (kuviot 1A ja 1B vastaavasti). PPARy toimintaa kolmessa solulinjoissa tutkittiin käyttäen soluja transfektoitu 3XPPRE-Luc-

Renillaa

rakentaa ja verrattuna soluihin transfektoitu lusiferaasi ja

Renillaa

konstrukteja josta puuttuu pPre. Ovcar 3 solut osoittivat noin 2 kertaisesti enemmän endogeenisen pPre aktiivisuus verrattuna CaOV3 soluihin, kun taas SKOV3- solut osoittivat 50% enemmän pPre aktiivisuus verrattuna Ovcar3 soluihin (kuvio 1 C).

(A) mRNA: n ilmentymisen (B) Proteiinin ekspressiota ja (C) pPre lusiferaasiaktiivisuus. Data normalisoitiin tasoon PPARy ilmaisun ja aktiivisuutta Ovcar3 soluissa. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 3 mittausta kolmesta yksittäisestä kokeesta. Baareja, jotka eivät jaa kirjettä nimitys ovat merkittävästi erilaiset (

p

0,05). Solut transfektoidaan Luc ja Renillaa rakentaa puuttuu pPre (pPre -) olivat huomattavasti alhaisemmat kuin saman solulinja on transfektoitu pPre-lusiferaasi-Renillaa rakentaa (pPre +) Welch t-testillä (

p

0,05) .

retiinihapporeseptorin (RXR) ei ole rajoittava tekijä PPARy aktiivisuuden

PPARy sitoutuu sen heterodimeerisiä kumppani RXR ennen sitoutumalla DNA [16]. RXR tiedetään konstitutiivisesti soluissa ja sen on osoitettu heterodimerisoitua muihin reseptoreihin lisäksi PPARy, kuten D-vitamiinin reseptorin [17]. Jotta RXR aktivoitava, ligandiaan 9-

cis

retinoiinihappo (9-

Cis

-RA) on oltava läsnä. Sen takaamiseksi, että aktivoitu RXR ei ole rajoittava tekijä kokeissa, soluja käsiteltiin 9-

Cis

RA. Näissä kokeissa solut transfektoitiin eri PPAR-konstruktien, mukaan lukien Δ467, joka on hallitseva negatiivinen (DN) muodossa PPARy [18], [19] sekä yli ilmentymisen muoto villityypin PPARy (OE), jota käytetään lisäämään PPARy ilme. DN muoto PPARy on käytetty kaikissa näissä tutkimuksissa perustuu alkuperäiseen kokeita, jotka osoittivat, että DN transfektio vähensi pPre aktiivisuus 40% alle tasoja transfektoiduissa soluissa ShRNA PPARy (tuloksia ei ole esitetty). Sen takaamiseksi, että PPARy on yli-ilmentynyt onko DN tai OE muodossa kontrolliin verrattuna soluihin (eli solut, jotka on transfektoitu PGL3), PPARy-proteiinin ilmentyminen mitattiin käyttäen western blot -analyysiä. Kuten odotettua oli selvästi induktio sekä DN ja OE muoto PPAR (kuvio 2A insertin). Transfektion jälkeen ohjaus-, DN tai OE vektori, soluja käsitellään myöhemmin ajoneuvon hallintaan tai 1 uM 9-

cis

-RA 24 tuntia pimeässä. Havaitsimme, että läsnä 9-

Cis

RA ei vaikuttanut aktiivisuutta PPARy reportteri määritys Ovcar 3-soluissa, mikä osoittaa, että aktivoitu RXR ei ole rajoittava tekijä tässä solulinjassa (kuvio 2A). Lisäämällä 9-

Cis

RA on Caov3-solut eivät muutu pPre aktiivisuutta, kunnes PPARy on yli-ilmentynyt (kuvio 2B), mikä viittaa, että aktivoitu RXR ei ole nopeutta rajoittava vasta PPARy on erittäin runsaasti tässä solulinjassa. Yllättäen SKOV3- soluissa, 9-

cis

-RA lisäsi PPARy reportteriaktiivisuutta määritys kontrollisoluissa (PGL3), mutta ei ollut vaikutusta, kun PPARy oli yli ilmaisi kontrolliin verrattuna (kuvio 2C).

Solut kaksinkertainen transfektoitu pPre konstruktio ja jokin seuraavista: Tyhjä vektori (PGL3), DN muoto PPARy (DN) tai villityypin muotoa PPARy (OE). Kun kaksinkertainen transfektioiden soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan ajoneuvon ohjaus (DMSO) tai 1 uM 9-

Cis

-RA pimeässä. PPre lusiferaasiaktiivisuus on havainnollistettu (A) Ovcar3, (B) Caov3, ja (C) SKOV3. Controls edustavat soluja, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla ja käsiteltiin ajoneuvon hallinnan, näkyy ensimmäisenä baari kussakin paneelissa. Tulokset pPre lusiferaasianalyysissä ovat keskiarvo ± SEM vähintään 9 mittaukset. Baareja, jotka eivät jaa kirjettä nimitys ovat merkittävästi erilaiset (

p

0,05). Aseta Paneeli A: Western blot PPARy proteiinin Ovcar3 soluissa kaksinkertainen transfektoitu pPre konstruktio ja joko tyhjän vektorin, DN tai OE PPAR konstruktioita ja käsitelty ajoneuvon hallinnan 24 tuntia.

CGZ ja TGZ syy lasku solujen lisääntymisen

Jos haluat määrittää vaikutukset PPAR ligandien soluproliferaatioon, MTS määritykset suoritettiin. Ovcar3 soluja käsiteltiin pitoisuuksilla 0, 0,1, 1 tai 10 uM Rosi, CGZ, TGZ tai Pio 24 tuntia. Suurin TZD käytetty pitoisuus oli 10 uM lähtien PPARy erityistoimia raportoidaan TZD pitoisuuksina ≤10 uM [20] ja korkeammat pitoisuudet ovat tiedetään aiheuttavan solukuolemaa [21]. Hallinto neljä TZD johti eroja solujen lisääntymisen. Hoidon CGZ vähentynyt proliferaatio 80%, TGZ aiheutti 65%: n lasku, kun taas Rosi ja Pio ei ollut vaikutusta proliferaatioon (kuvio 3A-D mustat palkit). Pyrkiessään ymmärtämään, onko laskun proliferaatiossa seuraavissa TZD hoito on yleinen kaikkialla muu munasarjasyöpäsoluja, TZD hoitoon CaOV3 ja SKOV3 tutkittiin. Samanlainen laskun proliferaatiossa nähtiin näissä solulinjoissa hoidetuilla CGZ ja TGZ 10 uM. Caov3-soluja, osoittavat 80%: n ja 30%: n lasku solujen lisääntymisen, kun niitä käsitellään CGZ ja TGZ, vastaavasti (kuvio 3A-B). SKOV3- solut osoittavat 45% ja 35%: n lasku, kun käsiteltiin 10 uM CGZ ja TGZ, vastaavasti (kuvio 3A-B). Samanlainen Ovcar3 soluihin, Caov3 ja SKOV3-soluja käsiteltiin Rosin tai Pio, eivät osoittaneet muutosta leviämisen (kuvio 3C-D).

munasarjasyöpä soluja seerumia 24 tuntia ja käsiteltiin vielä 24 tuntia ajoneuvon ohjaus (DMSO) tai 0,1, 1,0 tai 10 uM CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), tai Pio (D). Proliferaatiota arvioitiin kanssa MTS-määritys. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 3 mittausta kolmesta yksittäisestä kokeesta. Tilastollinen analyysi suoritettiin kunkin solulinjan. Baareja, jotka eivät jaa kirjettä nimitys ovat merkittävästi erilaisia ​​sisällä hoitoryhmässä (

p

0,05). Mustat palkit: Ovcar3, Grey: CaOV3, vaaleanharmaa: SKOV3.

CGZ ja TGZ lasku BrdU DNA sisällyttäminen

MTS määrityksessä mitataan mitokondrioiden toimintaa soluissa, mikä osoittaa niiden elinkelpoisuus [22] ja pidetä epäsuorana arviointi solujen lisääntymisen. Kuitenkin on olemassa raportti, että TZD voi häiritä MTS-määritys [23]. Siksi me myös mitattava määrä DNA-replikaation Ovcar3 soluissa käyttäen BrdU kuin toinen indeksi soluproliferaation. Ovcar3 soluja käsiteltiin 0, 0,1, 1 tai 10 uM Rosi, CGZ, TGZ tai Pio 24 tuntia. BrdU määritykset osoittavat samanlaisia ​​tuloksia kuin MTS-määrityksellä. Oli noin 70% laskun proliferaatiossa käsitellyissä soluissa 10 uM CGZ tai TGZ, ja mitään vaikutusta Rosi tai Pio soluproliferaatioon (kuvio 4A-D).

Ovcar3 soluja seerumia 24 tuntia ja käsiteltiin vielä 24 tuntia ajoneuvon ohjaus (DMSO) tai 0,1, 1,0 tai 10 uM CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), Pio (D). Proliferaatiota arvioitiin kanssa BrdU määrityksessä. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 3 mittausta kolmesta yksittäisestä kokeesta. Baareja, jotka eivät jaa kirjettä nimitys ovat merkittävästi erilaisia ​​sisällä hoitoryhmässä (

p

0,05).

PPARy mRNA ilmaisu on parannettu TZD munasarjojen syöpäsolujen

arvioimiseksi yhdistys näiden ligandien kanssa sääntelyn PPARy, tutkimme vaikutus TZD ilmentymiseen PPARy in Ovcar3 soluissa. Soluja käsiteltiin tai ei ollut 10 uM TZD ja PPARy-mRNA: n ja proteiinin tasot analysoitiin 24 tuntia myöhemmin. PPAR (ekspressio lisääntyi Ovcar3 käsitellyissä soluissa CGZ (6,9-kertainen) ja TGZ (18,1-kertainen) (kuvio 5A). Yllättävää kyllä, oli kasvu PPAR (proteiini seuraavat Rosin, mutta ei CGZ tai TGZ hoitoa (kuvio 5B). In pyrittävä selittämään tämän ristiriidan välillä mRNA ja proteiinin ilmentyminen, me tutki ajankulku PPAR (mRNA ja proteiinin ilmentymisen. Soluja käsiteltiin eri TZD 4, 8, 12 tai 24 tuntia ja molemmat reaaliaikainen PCR ja Western blot-analyysi tehtiin. Emme havainneet korrelaatiota ilmaisu kaavoja PPAR (mRNA ja proteiini eri aikoina, joka osoittaa, että on olemassa mahdollisesti muita mekanismeja, jotka vaikuttavat tasot PPAR (proteiinin näissä soluissa. Eräs mahdollisuus on, että TZD lisää liikevaihtoa ja hajoamista PPAR (proteiinin nähty muissa järjestelmissä [24], [25].

PPARy mRNA ja proteiinin ilmentyminen mitattiin Ovcar3 soluissa käyttäen (A) Reaaliaikainen PCR ja (B) western blot-analyysi sen jälkeen, kun TZD hoitoon. Solut seerumia 24 tuntia ja käsiteltiin vielä 24 tuntia ajoneuvon ohjaus (DMSO) tai jokin seuraavista: 10 uM Rosi, CGZ, TGZ tai Pio. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 3 mittauksia kaksi yksittäistä kokeissa. Bars eri yläindekseiksi ovat merkittävästi erilaiset (

p

0,05).

Koska CGZ ja TGZ vähentänyt soluproliferaatiota CaOV3 ja SKOV3- soluja, mittasimme mRNA ilmaisun PPARy näissä soluissa. Vuonna CaOV3 soluissa, mRNA ilmaus PPAR jälkeen CGZ ja TGZ hoito oli 3,6 ja 4,4-kertaisesti yli ajoneuvonhallintajärjestelmän vastaavasti vaikka nämä muutokset eivät saavuttaneet merkitystä. SKOV3- solut eivät osoittaneet mitään muutoksia PPAR-ilmaisun jälkeen, kun hoidon TZD (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että PPAR (mRNA on läsnä ja säätelee TZD munasarjan syöpäsolujen vaikkakin eri mitassa riippuen solutyypistä ja ligandina voidaan aktivoida PPARg.

CGZ ja TGZ eivät apoptoosia

tässä ja muissa kokeissa olemme tutkitaan ainoastaan ​​Ovcar3 soluja, koska nämä solut osoittivat merkittävin vaikutuksia, kun käsiteltiin TZD. Lisäksi näitä soluja käytetään yleisesti tutkimuksessa munasarjasyöpä, helpottaa verrattuna aikaisempiin tutkimuksiin. in yrittää ymmärtää paremmin mekanismi välittävä lasku solujen lisääntymisen, me tutki apoptoosin edistää tätä laskua. Havaitsimme vähentää solujen lisääntymistä 24 tunnin kuluttua hoidon (kuviot 3 ja 4). Jos tämä lasku johtuu apoptoosin, niin tämä solukuoleman olisi tapahtunut sitä ennen. Siksi tutkimme vaikutus TZD on Ovcar3 soluihin ja määritetään, onko solut joko elinkelpoisia tai apoptoosin ja oli kuolleita 4, 8 tai 12 tunnin kuluttua hoidon avulla FACS-analyysiä. Oli hieman lisääntynyt apoptoottisten ja kuolleet solut 4 tunnin kuluttua hoidon CGZ ja TGZ (kuvio 6A). Kasvu oli kuitenkin ei havaittu näytteissä hoidettiin 8 tai 12 tuntia (kuvio 6B ja 6C). Trypaanisinistä kokeissa vahvistaa elävien versus kuolleet solut osoittivat samanlaisia ​​tuloksia (tuloksia ei ole esitetty).

Ovcar3 soluja seerumia 24 tuntia ja käsiteltiin ajoneuvon hallinnan (DMSO) tai 10 pM CGZ tai TGZ (A ) 4 tuntia, (B) 8 tuntia, tai (C) 12 tuntia. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM 3 mittausten kolmesta yksittäisestä kokeesta. Vaaleanharmaa pylväät edustavat eläviä soluja; tummanharmaa pylväät edustavat soluja läpi aikaisen ja myöhäisen apoptoosin samoin kuin ne, jotka ovat kuolleet. Baareja, jotka eivät jaa kirjain tai numero nimitys ovat merkittävästi erilaiset (

p

0,05).

CGZ ja TGZ syy solukierron pysähtymisen

Eräässä pyritään selventämään syy taustalla laskun proliferaatiossa, vaikutukset TZD solusyklin etenemistä arvioitiin myös. Merkittävä lisäys solujen G

0 /G

1 vaihe havaittiin hoidon jälkeen TGZ ja CGZ (kuvio 7A). CGZ anto vähentynyt merkittävästi G2 /M vaiheessa solusyklin (kuvio 7B), kun taas mitään muutoksia S vaiheessa nähtiin käsitellyissä soluissa CGZ tai TGZ (kuvio 7C). Solut, jotka käsitelty Rosin tai Pio ei osoittanut mitään muutosta solusyklin jakautuminen kontrolliin verrattuna (tietoja ei esitetty).

Ovcar3 soluja seerumia 24 tuntia ja käsiteltiin vielä 24 tuntia ajoneuvon ohjaus (DMSO ) tai 10 pM CGZ tai TGZ. (A) G

0 /G

1, (B) G

2, (C) S-vaiheessa. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 3 mittausta kolmesta yksittäisestä kokeesta. Baareja, jotka eivät jaa kirjain tai numero nimitys ovat merkittävästi erilaiset (

p

0,05).

Effects of TZD on pPre lusiferaasivaikutusta

selvennetään onko antiproliferatiivisia ja solusyklin pysähtymiseen, joita on esiintynyt valitse TZD ovat suora vaikutus PPAR transaktivaation, me transfektoitiin ohimenevästi solut 3XPPRE-MTK-pGL3-reportteriplasmidilla. Kaksi muuta konstruktioita kotransfektoitiin, nimittäin DN muoto PPARy ja yli-(OE) on villityyppisen PPARy konstruktio. Sitten soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan 10 uM Rosi, CGZ, TGZ tai Pio. Mikään TZD hoidot yksinään lisäsi pPre aktiivisuutta (kuvio 8). Kuitenkin solut transfektoitu DN osoitti noin 40% lasku pPre välittämää aktiivisuutta sekä käsittelemätöntä ja TZD käsiteltyjä soluja. Lisäksi lisäämällä ilmentymistä villityypin PPARy kasvoi lusiferaasiaktiivisuuden, kun soluja käsiteltiin tahansa neljästä eri TZD verrattuna soluihin, jotka oli käsitelty ainoastaan ​​TZD (kuvio 8A-8D).

Ovcar3 solut kaksinkertainen transfektoitu pPre konstruktio ja jokin seuraavista: Tyhjä vektori, DN, tai OE PPAR. Sen jälkeen, kun kahden transfektioista, soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan ajoneuvon ohjaus (DMSO) tai 10 uM (A) CGZ, (B) TGZ, (C) Rosi, (D) tai Pio. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 3 mittausta kolmesta yksittäisestä kokeesta. Baareja, jotka eivät jaa kirjettä nimitys ovat merkittävästi erilaiset (

p

0,05).

Analyysi TZD välittämän PPARy riippuvainen itsenäisen toiminnan

Jotta onko vaikutukset TZD ovat PPARy riippuvaisia ​​soluja käsiteltiin 10 uM TZD puuttuessa tai läsnä PPAR-antagonistien (GW9662, T007). MTS-määritys suoritettiin, jotta voitaisiin määrittää, onko läsnä antagonistit voisivat kääntää vaikutuksia TZD on munasarjasyövän solujen lisääntymisen. Tulokset osoittivat, että siellä oli osittainen ”pelastus”, kun soluja käsiteltiin GW9662 (kuvio 9A) tai T007 (kuvio 9B) yhdisteitä yhdessä CGZ tai TGZ. Tässä mallissa on kuitenkin toiminta on ristiriidassa näiden kahden antagonistit ja jopa samalla antagonisti läsnäollessa eri TZD. Esimerkiksi, T007 kykeni täysin estää vaikutuksia CGZ soluproliferaatioon, mutta ei ollut vaikutusta TGZ välittämää laskun proliferaatiossa. Lisäksi käytön GW9662 tai T007 yhdisteitä yksinään ei vaikuttanut leviämisen omasta kuin odotettiin. Tämä voi johtua siitä, että näitä antagonisteja voidaan sekoittaa agonisteja tai PPAR erityisiä [9], [26]. Nämä havainnot osoittavat, että käyttö on farmakologinen lähestymistapa työllistää raportoitu PPAR antagonisteja ei yksin vastaa kysymykseen, onko vaikutus TZD toimivat kautta PPARy. Tämä johti meidät käyttämään molekyyli- lähestymistapaa käyttäen DN tai OE PPAR rakentaa tutkia vaikutukset nähdään soluproliferaatioon ja solusyklin olivat PPARy riippuvaisia ​​tai riippumattomia.

Soluja käsiteltiin GW9662 (A) tai T007 (B ) 24 h ja proliferaatiota arvioitiin. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 4 mittaukset. Baareja, jotka eivät jaa kirjettä nimitys ovat merkittävästi erilaiset (

p

0,05).

transfektoimalla soluja DN tai OE muotoja PPARy ilman läsnäoloa ligandien ei muuttunut solujen lisääntymisen, kuten ilmaistaan ​​BrdU määritykset (kuvio 10). Vielä tärkeämpää on, vaikutukset CGZ ja TGZ proliferaatiossa ei ollut voittaa läsnäolo DN muodossa PPARy (kuvio 10). Lusiferaasimäärityksiä ajettiin näytteiden samassa levyt, jotta voidaan varmistaa, että solut on transfektoitu ja ilmaus DN aiheutti odotettavissa laskua, kun taas yli-ilmentyminen villin tyypin PPAR lisääntynyt pPre aktiivisuutta, vastaavasti (tuloksia ei ole esitetty). Yhdenmukaiset kanssa BrdU määrityksissä, solusykliä koskevat tiedot osoittavat myös, että vaikutus CGZ ja TGZ eivät PPARy riippuvaisia ​​(tuloksia ei ole esitetty).

Ovcar3 solut kaksinkertainen transfektoitujen, seerumia 24 tuntia ja hoidettiin vielä 24 tuntia ajoneuvon ohjaus (DMSO) tai 10 pM CGZ tai TGZ. Proliferaatiota arvioitiin kanssa BrdU määritystä. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM vähintään 9 mittaukset kolmesta yksittäisestä kokeesta. Baareja, jotka eivät jaa kirjettä nimitys ovat merkittävästi erilaisia ​​sisällä hoitoryhmässä (

p

0,05).

Keskustelu

TZD on osoitettu olevan monenlaisia ​​vaikutuksia syöpäsolujen. Oletettu tavoite TZD, PPARy, on yli-ilmentynyt erilaisia ​​syöpiä, kuten rinta-, keuhko-, paksusuoli-, eturauhas- ja munasarja- [2], [27], [28], [29]. Vaikka tarkkaa roolia TZD ja PPARy pelata munasarjasyövän edelleen tuntematon, tämä tutkimus osoittaa, että CGZ ja TGZ on antiproliferatiivinen toimia, joiden munasarjasyövän solulinjoissa, kun taas Rosi ja Pio ole vaikutusta. Se seikka, että nämä anti-proliferatiivista toimia nähdään kaikissa kolmessa solulinjoissa viittaa siihen, että tämä on yleinen ilmiö, ja ei rajoitu yhden munasarjasyövän solulinja. Tässä kuvatuissa kokeissa osoittavat myös, että neljä TZD on erilaiset toimet munasarjasyöpäsoluja mahdollisesti molemmat PPARy riippuvainen sekä itsenäisiä polkuja. Vaikka useat raportit osoittavat, että eri solulinjoilla reagoivat eri TZD, [30], [31], [32], [33], tietojemme mukaan verrata suoraan näiden neljän TZD munasarjasyövän ja rajaamista, ovatko nämä vaikutukset PPARy riippuvainen käyttäen molekyyli, fysiologisia ja farmakologisia lähestymistapoja ei ole tutkittu.

Tässä tutkimuksessa, 10 uM CGZ ja TGZ laski soluproliferaatiota kaikissa kolmessa munasarjasyövän solulinjoissa tutkittu. Nämä havainnot ovat yhdenmukaiset muiden tehtyjen tutkimusten munasarjasyöpäsoluja sekä muut solulinjat, joissa CGZ ja /tai TGZ väheni MTT toimintaa [20], [21], [34]. Kuitenkin meidän tulokset ovat toisin syöpäsolulinjoissa muista kudoksista kuten rinta-, kilpirauhasen, virtsarakon ja muut, jotka edellyttävät yleensä paljon korkeampia pitoisuuksia TZD tekisivät biologisen vasteen. Itse asiassa, jossa annettiin jopa 100 uM, jotka ylittävät raportoitu ligandi erityinen pitoisuuksia 10 uM tai vähemmän [12], voidaan vaatia ennen lisäkasvun estäminen nähdään [35], [36], [37], [38] , [39]. Kuitenkin nämä erot voivat johtua osittain siitä, että käytetään eri solulinjoja tai eroja soluviljelmässä olosuhteissa, joissa, esimerkiksi, tutkijat ovat käyttäneet 1% FBS: ää [39], 5% FBS: ää [35], [36], [37 ], [38], [39], tai 10% FBS: ää [21]. Esillä olevat havainnot osoittavat, että tämän laskun proliferaatiossa johtuu kasvu solusyklin pysähtymisen sijaan apoptoosin lisääntyminen. Myös muut raportit ovat osoittaneet, että TZD johtavat hajoamista sykliini D1 eturauhassyövässä [40], joka aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen, ja lasku kasvainsoluproliferaation. Samoin A2780 munasarjasyöpäsoluja, CGZ vähenee sykliini D1 yhdessä muiden pro-eloonjäämistekijöiden johtaa solusyklin pysähtymiseen [21]. Yang ja työtovereiden [20] ilmoitti, että CGZ ja TGZ hoito ES-2 ja PA-1 munasarjasyöpäsoluja johti solusyklin pysähtymiseen; kuitenkin, tämä muutos solusyklin kinetiikkaan liittyi kohonneeseen apoptoosin. Vaikka tutkimukset tukevat aiempia havaintoja eri munasarjasyöpäsoluja että TZD vähentävät solujen lisääntymistä pidättämällä solut G0 /G1 vaiheessa solusyklin, on olemassa mahdollisuus, että suurempia pitoisuuksia TZD käytetään näissä aiemmissa tutkimuksissa tuloksia induktion apoptoosin [20].

esillä oleva tutkimus osoittaa, että kukin TZD on erillinen toimia munasarjasyövän solujen lisääntymisen. CGZ ja TGZ aiheuttaa dramaattiseen laskuun munasarjasyövän solujen lisääntymisen, kun taas Rosin ja Pio ei ollut vaikutusta. Tämä ei ole odottamatonta, koska jokainen TZD on erilainen affiniteetti ja sitoutuminen PPAR [7], [41], rekrytoi eri koaktivaattoreiden [42] ja voivat saada aikaan erillisiä soluvasteita. Nämä ainutlaatuiset toimet ovat johtaneet käsitteen että TZD ovat selektiivisiä modulaattoreita PPARy ja siksi kohdistaa erillinen geeni tuloksena kudosselektiivisyyttä [12], [42], [43], [44]. Lisäksi TZD on erilaiset spesifisyydet PPAR. Esimerkiksi Rosi ja Pio pidetään voimakkaimmista PPARy-agonistit neljästä TZD tässä tutkimuksessa käytetyt [11]. Havainnot, että nämä voimakkaita PPARy-agonistit eivät estä solujen lisääntymistä edelleen tukevat hypoteesia, että toimet TZD voi olla riippumaton PPAR. Lisäksi Rosi, CGZ ja TGZ ovat erityisiä PPARy kun Pio on osoitettu myös aktivoida PPAR-a [45], [46]. Näin ollen tietomme voi heijastaa eroja selektiivinen modulaatio PPARy, erot spesifinen PPARy tai aktivoitumista erillisten PPARy riippumattomia polkuja.

alkaa ymmärtää selektiivinen modulaatio PPARy mukaan TZD munasarjojen syöpäsolut, tutkimme mRNA ja proteiinin ilmentyminen profiilit PPARy ja aktivointi PPARy: n promoottorin seuraavat TZD hoitoon. On dramaattinen kasvu PPARy-mRNA: n ilmentymisen, kun Ovcar3 soluja käsiteltiin TGZ ja vähäisemmässä määrin CGZ ja Rosi. Sen sijaan, korkein ilmentymä PPARy-proteiinin havaittiin, kun soluja käsiteltiin Rosi. Tämä ristiriita välillä ekspression PPARy-mRNA: n ja proteiinin, kun TZD hoidon ei ole havaittu eikä aiemmin tutkittu, mutta tasot PPARy-proteiinin, kun TZD hoidon on osoitettu olevan erittäin vaihteleva välillä ES-2 ja PA-1 munasarjasyöpäsoluja [ ,,,0],21]. Olemme oletettu, että tarkastelu staattinen 24 tunnin kohdalla ei ehkä tarkasti kaapata induktio PPARy mRNA ja proteiini. Siksi arvioitiin tason PPARy-mRNA: n sekä proteiinin kuviot eri aikoina sen jälkeen, kun TZD: tä hoitoon ja havaittu välisen korrelaation puuttuminen PPARy-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen kaikissa aikapisteissä. Vaihtoehtona teoria selittää tämä ristiriita on, että ilmentymisen lisääntyminen PPARy-mRNA: n, kun soluja käsitellään TGZ voi lisätä liikevaihdon ja hajoaminen PPARy-proteiinin mikä vähentää proteiinin ilmentymisen. Tämä on aiemmin osoitettu muissa järjestelmissä, joissa on osoitettu, että kasvavia annoksia TZD, oli kasvu PPARy proteiinien hajoaminen, mikä johti vähenemiseen vakaan tilan tasot proteiinin endoteelisoluissa [24], [25] . Tämä on arveltu tapahtuvan koska TZD välittäjänä muutoksia fosforyloitumisaste PPARy MEK joka jättää PPARy hajoamiselle altis [47]. Valossa tämän tiedon, meidän proteiini data voidaan selittää sillä, että TZD syy ero hajoamista PPAR (aktivoinnin jälkeen ja että vaihtuvuus määrä PPAR (proteiini soluissa käsitelty TGZ on nopeampi kuin CGZ ja Rosi tuloksena vähenemiseen proteiinin tasot. lisäksi on mahdollista, että Rosin lisää proteiinin stabiilisuutta PPAR (vaikka vaikutukset leviämisen hoidon jälkeen CGZ ja TGZ ovat PPAR (riippumaton. Vaihtoehtoisesti, TZD voivat aiheuttaa muutoksia itse proteiini, kuten kuten fosforylaatio, joka muuttaa muita toimia proteiinin eikä vain muuttamalla sen yleinen transaktivaation kuten äskettäin osoitettu Choi et al. [48].

valossa tuloksemme jotka osoittivat korrelaation puute välisiä PPAR (mRNA ja proteiini jälkeen TZD hoidon, selvitimme muutoksia aktivointi PPAR (toimittaja indeksinä PPAR (aktiivisuuden jälkeen TZD altistuksen. Yllättäen PPAR (aktiivisuutta ei kannustanut tahansa 4 TZD kuluttua 24 h käsittely, toisin kuin aikaisempien raporttien muissa munasarjasyövän solulinjoissa, että 50 mM CGZ lisääntynyt lusiferaasin aktiivisuuden pPre reportteri 18 h [21]. Tämän perusteella edellisen raportin, me arveltu, että promoottoriaktivoinnilla voidaan esiintyvät aikaisemmin tai myöhemmin ajankohtina. Näin ollen testasimme vaikutus TZD on promoottorin aktiivisuus 4, 8, 24 ja 32 tuntia. Oli pientä nousua lusiferaasiaktiivisuudessa käsitellyissä soluissa CGZ 8 ja 32 tuntia (dataa ei esitetty), jotka eivät riittäneet selittämään muutoksia PPAR (lauseke. Discordance välillä proteiinin tasojen ja PPAR (aktiivisuus on aiemmin nähty rintojen syöpäsolut, mutta tarkka mekanismi taustalla tämä ero on tuntematon. [34] tällainen havainto viittaa siihen, että analyysi on vain PPARy-proteiinin tasoja saattaa vahingossa käyttää kohdentaa solujen vaikutuksia tai vastata hoitoihin.

TZD teki ei endogeenisen PPAR-aktiivisuus näissä soluissa, mutta TZD-hoito lisäsi lusiferaasin aktiivisuutta PPARy yliekspressoitiin Ovcar3 soluissa. Tämä osoittaa, että nämä solut aktivoivat konstitutiivisesti PPAR ja, kun reseptori on erittäin runsaasti, edelleen aktivointi on mahdollista. Tämä aktivointi ei ole