Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS), mukaan lukien edenneen eturauhassyövän, ovat ehdotettu syy kasvaimen vastus kohti perinteisen kasvaimen hoito. Siksi uusia terapeuttisia aineita tarvitaan kipeästi kohdistamiseen CSCS. Huolimatta minimaalinen ymmärtää niiden toimintatavat, luonnolliset tuotteet ja kasviperäisten hoitojen on yleisesti käytetty ehkäisyyn ja monien syöpien hoidossa.

berberis libanotica

Ehrenb (BLE) on kasvi runsaasti alkaloideja, joka saattaa olla syövän vastaista aktiivisuutta ja suuri potentiaali poistamiseksi CSCS. Testasimme vaikutus BLE eturauhassyövän soluissa ja tuloksemme osoittivat, että tämä ote aiheuttama merkittävä väheneminen solujen elinkelpoisuuden ja inhiboivat ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (DU145, PC3 ja 22Rv1) annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. BLE uute aiheutti häiriön solusyklin, joka johtaa G0-G1 pidätys. Lisäksi olemme huomanneet 50% solukuolema, ominaista tuotannon korkea reaktiivisia oksidatiivisia lajeja (ROS). Estää solun maahanmuuton ja invaasio päästiin myös käsittelemällä BLE uutetta, viitaten rooliin metastaasin inhiboinnissa. Mielenkiintoista, BLE uute oli suuri vaikutus CSCS. Soluja kasvatettiin 3D pallo-muodostumisen määritys rikastamiseksi populaation syövän kantasoluja /progenitorisolujen. Tuloksemme osoittivat merkittävä väheneminen alalla muodostumiseen kyky. Kolme kierrosta hoidon BLE uutetta riittivät poistamaan itseuudistumisen kykyä kestää hyvin CSCS. Lopuksi tuloksemme osoittavat korkeaa terapeuttista potentiaalia BLE uutetta kohdistamisessa eturauhassyövän ja sen CSCS.

Citation: El-Merahbi R, Liu YN, Eid A, Daoud G, Hosry L, Monzer A, et al. (2014)

berberis libanotica

Ehrenb Ote Näyttää antineoplastisia Vaikutus Eturauhassyöpä Stem /kantasolut. PLoS ONE 9 (11): e112453. doi: 10,1371 /journal.pone.0112453

Editor: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Italia

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 08 lokakuu 2014; Julkaistu: 07 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 El-Merahbi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat rahoituksella Medical Practice Plan-MPP (AUB-FM) ja Libanonin kansallisen neuvoston tieteellisen tutkimuksen (CNRS) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on yleisimmin diagnosoitu ei-kutaaninen maligniteetti ja kolmanneksi yleisin syy syövän kuolleisuus Länsi miespuolisesta väestöstä [1], [2]. Ensisijainen PC on androgeeniriippuvaisissa luonnossa ja hoidetaan yleensä androgeenien puute hoitoa (ADT). Useimmiten kuitenkin, hormonihoito johtaa uusiutumisen muutaman vuoden ja PC lopulta etenee androgeenista itsenäinen valtio tai ns kastraatiotason kestävät PC (CRPC). CRPC on aggressiivisesti metastasoitunut ja tappava muoto PC ja tällä hetkellä ei ole olemassa tunnettua tehokasta hoitoa sitä.

Eturauhassyöpä kantasolut (CSCS) osake ominaisuuksia normaalilla kantasolujen koska ne yleensä ilmaista korkea: aldehydi (ALDH) – myrkkyjä entsyymi – [3], moniresistenssin (MDR) effluksipumppujen ja ABC kuljettajat [4] – [6]. Nämä puolustava strategiat tekevät tavanomaiseen hoitoon tehoton, koska läsnäolo nopeasti lisääntyvät solut kasvaimessa irtotavarana ja suuret mahdollisuudet säästävät oletetun syövän kantasoluja /esisolujen [7]. Lisäksi on esitetty, että eturauhasen CSCS eivät ilmennä androgeenireseptoreita (AR) [8], [9] ja ehkä reagoi ADT kypsinä kasvainsoluja tehdä. Sen jälkeen ADT, syövän kantasoluja voidaan usein hoitaa kiinnittyä uudelleen kasvaimen massan androgeenista riippumaton PC, joka on aggressiivisesti metastasoitunut ja tappava muoto PC.

Monenlaisia ​​strategioita on käytetty löytö romaani lääkkeet, jotka veisivät myönteisiä vaikutuksia syöpäpotilaille. Kohdennettu hoito tarvitaan kiireesti poistamaan paitsi syöpä irtotavarana, mutta myös CSC altaan tavataan kasvain. Edellinen työ laboratoriossamme on osoittanut kykynsä rikastuttaa asukkaan PC kantasolujen /esisolujen kasvattamalla niitä 3D aloilla muodostavien viljelyolosuhteissa, nimittäin nimeltään prostaspheres [10], [11]. Useat tutkimukset ovat viime aikoina osoittaneet, että useat bioaktiivisia ruoka yhdisteillä voi olla anti-CSC vaikutus. Esimerkiksi, se on viime aikoina raportoitu, että palmuöljyn uutettiin gamma-tokotrienolia [12], polysakkaridi-P (PSP), aktiivisen komponentin erotettu sieni Turkki hännän [13], ja Genisteiini, suuri isoflavone ainesosana soijapapuja ja soijaa [14], osoittavat tehokkaita estävä aktiivisuus protosphere muodostumiseen kykyyn ja tuumorigeenisyystesti PC soluja. Näitä aineita on osoitettu kohdistaa eturauhasen CSCS

in vitro

, ja kasvaimien muodostumisen estämiseksi

in vivo

. Nämä havainnot korostavat mahdollinen käyttö kasviperäisten bioaktiivisten yhdisteiden tuottamiseksi terapeuttisten aineiden kohdistaminen CSC joko ehkäisyyn tai hoitoon PC.

Berberis libanotica

, erityisesti sen juuret, on ollut käytetään perinteisessä kasviperäisiä Libanonin korjaustoimenpiteitä reuma- ja hermosärkyä sairauksien [15], [16].

B. vulgaris

ja

B. stata

ovat kaksi tutkittu laji

berberis

[17] – [20]. Alkaloidit muodostaa suurimman yhdisteiden luokkaa raportoitu olevan olemassa

berberis

lajien ja muodostavat hyvin monenlaisia ​​sekundäärimetaboliitteja tärkeitä biologisia vaikutuksia [21], [22]. Erilaisia ​​kasviperäisiä alkaloideja näyttelytila ​​

in vitro ja in vivo

antiproliferatiivisia ja antimetastaattisia vaikutuksia eri syöpiä. Alkaloidit, kuten camptothecin [23] ja vinblastiinin [24], on jo onnistuneesti kehitetty syöpälääkkeet. Berberiini, suuri alkaloidi luonteenomaiset

Berberis

lajia, on tutkittu intensiivisesti sen farmakologisia ominaisuuksia. Se oli osoitettu estävän migraatiota melanooma syöpäsolujen [25], ja kasvu ihmisen kielen squamous carcinoma kasvaimia hiiren ksenograftimallia [26], parantaa tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi rintasyövän [27], ja kohdistavat sytotoksista vaikutusta monia solulinjoja [25], [28], [29]. Tähän mennessä biologiset ja phytochemical ominaisuudet

B. libanotica

uutteet on tutkittu vain kaksi julkaisua raportointi inhibition aikuisten T-soluleukemian elinkelpoisuus kautta etanolia osa [30], ja inhibitio avainentsyymien liittyy Alzheimerin taudin [15]. Kuitenkin tiedetään vähän vaikutusta BLE uutetta PC ja leviämisen ja elinkelpoisuus CSCS. Siksi tavoitteena on tutkia terapeuttista tehoa

B. libanotica

juuriuutetta (via ammoniakki-dikloorimetaani louhinta) estossa leviämistä ja vähentää elinkelpoisuus ihmisen PC solulinjojen kasvatettu perinteisen 2D yksikerroksisen malli. Lisäksi tämä tutkimus keskittyy kehittyneen määritys (pallo muodostuminen määritys) tutkimaan vaikutusta BLE uutetta kohdentamisessa rikastetun populaation eturauhasen CSCS.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa, PC3, DU145, ja 22Rv1 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja lähetettiin meille lahjana Dr. Kathleen Kelly National Institutes of Health ( Bethesda, MD). Soluja viljeltiin RPMI-1640-AQ väliaineessa (Sigma, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Sigma, USA), 1% penisilliini-streptomysiiniä (Sigma, USA) ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (Sigma, USA) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa (95% ilmaa, 5% CO

2). Solut kerättiin trypsiini-EDTA: lla 37 ° C: ssa (Sigma, USA). Solut pelletoitiin, suspendoitiin uudelleen ja siirretään uuden 75 cm

2 kudosviljelykolveissa huolto- tai kylvetään kokeissa pitoisuutena 1 x 10

4 solua /cm

2 PC3 ja DU145 ja 1,5 x 10

4 solua /cm

2 varten 22Rv1 solulinjan.

BLE Extraction

juuret

berberis libanotica

Ehrenb kerätty syyskuuta 2011 Cedars alueella Pohjois- Libanonissa (korkeus 1400-1700 m; arvioitu GPS sijainti: N 34 ° 14’41 ”E 36 ° 2’15”). Ei erityisiä oikeuksia edellytettiin näille kohteille /toimintaa, koska ne ei liity uhanalaisia ​​tai suojeltuja lajeja. Tehdas tunnistettiin Pr. G. Tohmé (CNRS, Libanon). Kupongin näyte (koodinumero BLCS12) talletettiin kasvio tiedekunnan Sciences II, Libanonin yliopisto, Beirut, Libanon.

kasvin juuret olivat varjoa kuivatut ja jauhetut sähkösekoittajalla tehosekoitin. Ammoniakki-dikloorimetaani uute valmistettiin seuraavasti: 10 g kasvien jauhetta kostutetaan 2 h NH

4OH liuos sen jälkeen dikloorimetaania lisäys (100 ml). Seosta maseroitiin 24 tuntia magneettisekoittimella sekoittaen, jota seurasi suodatus. Orgaaninen faasi konsentroidaan 40 ° C: ssa alipaineessa ja kryo-kuivattiin. Saadut uutteet säilytetään viileässä paikassa pimeässä säiliöissä. Pyöröhaihduttimesta käytettiin IKA RV 10 BASIC ja lyophiliser oli LYOVAC GT4.

MTT /Sytotoksisuusmääritys

antiproliferatiivisia ja sytotoksisia vaikutuksia BLE mitattiin

in vitro

kautta MTT ([3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi]) määrityksiin. DU145 ja PC3-soluja siirrostettiin 100 ui täydellistä alustaa 96-kuoppaisilla viljelylevyillä tiheydellä 7500 solua /kuoppa, ja 22Rv1 soluja tiheydellä 13250 solua per kuoppa. Soluja inkuboitiin yön yli inkubaattorissa ja sitten käsiteltiin kolmena rinnakkaisena eri uutteen pitoisuudet laimennettuna 100 ul täydellinen mediaa 24, 48 ja 72 tuntia. Siinä tapauksessa, että ROS scavenger N-asetyyli-L-kysteiini (NAC; Sigma), DU145-soluja esikäsiteltiin 5 mM NAC: ssa 30 minuuttia, ja soluja käsiteltiin sitten 30 ug /ml BLE uutetta 24 ja 48 h kuten edellä . Kunakin ajankohtana, 20 ui 5 mg /ml – 1 x fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) -MTT reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Lopuksi, 100 ui liukenemisen lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Alennetun MTT optinen tiheys (OD) mitattiin aallonpituudella 595 nm käyttäen ELISA-lukijaa (Multiskan Ex). Prosenttiosuus solujen elinkelpoisuuden esitettiin OD suhde käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen ilmoitettuina pitoisuuksina.

trypaanisiniekskluusiolla menetelmä

sisältävät supernatantit kuolleet solut kerättiin ja liitteenä elävien solujen kerättiin trypsiinin EDTA: a ja lisättiin supernatanttiin. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 100 ui: aan ja 50 ui solususpensiota sekoitettiin 50 ui trypaanisinistä ja sitten elää /kuolleet solut laskettiin hemosytometrillä.

Cell Cycle Analysis virtaussytometrialla

DU145 ja PC3-soluja siirrostettiin päällekkäiset 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

5 solua /kuoppa ja inkuboitiin 24 tuntia ennen lääkkeen hoitoa 24, 48 tai 72 tuntia. Sitten solut otettiin talteen, pestiin kahdesti PBS: llä, sentrifugoitiin 1500 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan kylmää PBS: ää, kiinteä 4 ml: ssa kylmää absoluuttista etanolia ja sen jälkeen säilytettiin -20 ° C ° saakka värjäystä ja analyysi. Kiinnitetyt solut käsiteltiin sitten 1 h 200 ug /ml DNaasi-vapaata RNaasi A, värjättiin 1 mg /ml propidiumjodidia (PI) (Sigma, USA) ja inkuboitiin 10 minuuttia pimeässä virtausputki (BD Flacon ). Fluoresenssi PI, mitta DNA-pitoisuus solupopulaatiossa, suoritettiin käyttäen virtaussytometrialla (FACScan, Becton Dickinson). Kaikkiaan 10000 aidatulla tapahtumien hankittiin arvioidakseen osuudet solujen eri vaiheissa solusyklin. Analyysi solusyklin jakautuminen suoritettiin käyttäen FlowJo Software.

laktaattidehydrogenaasin (LDH) Pitoisuus

sytotoksisuus BLE uutteen DU145 solulinjassa määritettiin mittaamalla aktiivisuus laktaattidehydrogenaasin (LDH ) vapautuu sytosoliin vaurioituneiden solujen käyttäen Sytotoksisuus Detection Kit PLUS (LDH) (Roche Diagnostics GmbH). Määritys suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita. Lyhyesti, keskipitkän supernatantit valvonta- ja käsiteltiin solut kerättiin ja yhtä suuri tilavuus Reaktioseokseen lisättiin. Reaktio seoksia inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Inkuboinnin jälkeen absorbanssi määritettiin 490 nm: ssä käyttäen ELISA-levylukijaa. Prosenttiosuus sytotoksisuus laskettiin: (exp.value – spontaani valvonta release) Ö (max.control vapautuminen – spontaani valvonta vapautuminen) x 100.

ROS havaitsemista nitrosinitetratsolium Pitoisuus

DU145 soluja viljeltiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaiselle levylle tiheydellä 1 x 10

4 solua /cm

2, ja sitten inkuboitiin 24 tuntia ennen BLE uutteet hoitoa 24, 48 tai 72 tuntia. Jokaisessa kunnossa, ROS tuotanto arvioitiin jonka nitrosinitetratsolium määritys (NBT, Sigma). Elatusaineet aspiroitiin ja soluja inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 1 mg /ml NBT 37 ° C: ssa pimeässä 60 minuutin ajan. NBT vähennettiin ROS tummansininen liukenemattomia muoto NBT kutsutaan formatsaanisuolaksi että voitaisiin visualisoida. Määrällisesti formatsaanituotteesta, solunsisäinen formatsaanisakka liuotettiin KOH 2M ja DMSO 5 M liuosta, ja absorbanssi määritettiin 630 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijaa.

apoptoosimäärityksessä

Apoptosis oli määritettiin käyttämällä solujen DNA: n fragmentoituminen ELISA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa) havaitsemiseksi BrdU-leimattujen DNA-fragmenttien viljelmäsupernatanteissa ja solulysaateista. Määritys mukaisesti käytettävä valmistajan protokollan ja kuten aiemmin on kuvattu [31]. Soluja inkuboitiin 30 ug /ml BLE uutetta 48 h: n läsnä tai poissa ollessa 5 mM N-asetyyli-L-kysteiiniä, joka lisättiin 30 minuuttia ennen BLE hoitoa. Apoptoosin valvontaan käsittelemättömissä soluissa säädettiin 100%, ja tulokset esitettiin graafisesti prosenttia valvontaa.

Haavan paranemista määrityksessä

haavan paranemista, tai tyhjästä määrityksessä soluja siirrostettiin kuusi kuoppaiset levy samat numerot, ja inkuboitiin, kunnes ne saavuttivat 80-90% konfluenssiin. Sitten soluja käsiteltiin 10 ug /ml mitomysiini C: llä (Sigma), 2 tuntia, jotta estää solujen lisääntymistä. Steriili 200 ui kärkeä käytettiin tyhjästä haavojen leveys on sama kunkin yksikerroksista, levyt pestiin sitten kahdesti PBS: llä poistamiseksi irrotettuja soluja, ja loput soluja viljeltiin täydellisessä median kanssa tai ilman hoitoa. Kuvat ovat myöhemmin 0, 12, 30, ja 48 h. Kulkeman matkan soluista haavoittuneita alueelle luetteli sulkemista haavat. Koe toistettiin kolme kertaa kahden mittauksen kussakin kokeessa.

Sphere muodostumisen määritys

Tässä tutkimuksessa kaikki kolme solulinjat, PC3, DU145 ja 22Rv-1, pystyivät muodostamaan sferoideja ei-tarttuva kulttuuri, viittaa syövän läsnäolon kantasolujen kaltaisia ​​soluja näissä solulinjoissa. Kun laskurin yksittäinen solususpensio eturauhassyövän solulinjoissa, pitoisuutena 1000 solua /kuoppa suspendoitiin kylmään Matrigel ™ /seerumitonta RPMI-1640 (01:01) kokonaistilavuudessa 50 ui. Solut ympättiin tasaisesti ympyrän tavalla pohjan ympärille vanteen kuoppa 24-kuoppaiselle levylle ja annettiin kiinteytyä inkubaattorissa 37 ° C: ssa 45 minuuttia, ennen kuin 0,5 ml täydellistä RPMI-1640 2% FBS-alustaan ​​( kanssa tai ilman hoitoa) lisättiin varovasti keskelle kunkin hyvin. Spheres saivat täydennystä lämpimällä median kuin alkuperäisessä kylvö (tai ilman hoitoa) joka toinen tai kolmas päivä. Spheres laskettiin 13 päivän kuluttua. Levittämään aloilla, väliaine aspiroitiin ja Matrigel ™ pilkottiin 0,5 ml Dispaasi liuosta (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1 mg /ml, liuotetaan RPMI-1640-puutteellinen) kanssa, 60 minuuttia 37 ° C: ssa. Kuulat kerättiin, inkuboitiin 1 ml: ssa lämmintä trypsiini-EDTA 37 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ja sitten läpi 27 gaugen ruiskulla 5 kertaa. Solut laskettiin hemosytometrillä ja uudelleen kylvetään.

TranswellTM invaasiomääritys

invaasiomääritys, 2,5 x 10

5 solua ympättiin seerumivapaassa väliaineessa tai ilman käsittely yläkammiossa päälle matrigeelin ™ pinnoitettu kalvo (24-kuoppaiset insertin, huokoskoko, 8 um, Falcon), ja jota on täydennetty seerumia käytettiin kemiallis-houkutin alemmassa kammiossa. Kukin kuoppa oli juuri päällystettiin 100 ul: Matrigel ™ (BD Bioscience) laimennoksena 1:10 kylmää PBS: ää, ja se oli sitten ilmakuivattiin yön yli, ennen invaasiomääritys. Solujen annettiin kulkeutua membraanin läpi päällystetty Matrigel ™ 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa 24 ja 48 tuntia. Non-vaeltavia solujen ylemmässä kammiossa sitten varovasti raaputettiin, puuvillan kärki asetin. Tunkeutuvat solut alapinnan kalvon kiinnitettiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Värjäyksen jälkeen kokonaismäärä hyökkäävän solujen laskettiin valomikroskoopilla (x 10 tavoite) 6 peräkkäisen kentän kullekin kuopalle.

RNA ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin soluista, käsiteltiin tai ei-käsitelty 30 ug /ml BLE uutetta 48 tuntia, käyttäen RNeasy Micro Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA muodostettiin kokonais-RNA käyttäen Super Script III First Strand Synthesis System for RT-PCR: llä (Invitrogen), ja PCR suoritettiin käyttäen Platinum Taq-polymeraasia (Invitrogen). Kvantitatiivista RT-PCR-monistus vaihe suoritettiin käyttäen SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems, Bedford, MA). Kaikki reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena käyttämällä spesifisiä alukkeita luetellaan alla, ja kaikki arvot normalisoitiin talon GAPDH. Käytetyt alukkeet olivat: GAPDH-F: 5 ’ACCTGGCTAGCGAAAAGCAA3’; GAPDH-R: 5’CCACTTTGTCAAGCTCATTTCCT3 ’; Sox2-F: 5’AACCCCAAGATGCACAACTC3 ’; Sox2-R: 5’GCTTAGCCTCGTCGATGAAC3 ’; Oct4-F: 5’AGAACATGTGTAAGCTGCGG3 ’; Oct4-R: 5’GTTGCCTCTCACTCGGTTC3 ’; Nanog-F: 5’ACCTCAGCTACAAACAGGTGAA3 ’; Nanog-R: 5’AAAGGCTGGGGTAGGTAGGT3 ’; CD44-F: 5’TTTGCATTGCAGTCAACAGTC3 ’; CD44-R: 5’GTTACACCCCAATCTTCATGTCCAC3 ’; CD166-F: 5’TGGCAATATCACATGGTACAGG3 ’; CD166-R: 5’AGCCTTGGTTGTCTTGTACTC3 ’.

Data Analysis

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Microsoft Excel 2013 merkitys analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä, ja erot kahden tarkoittaa kanssa p 0,05 (*) ja p 0,01 (#) pidettiin merkittävinä ja erittäin merkittävä, vastaavasti.

tulokset

BLE uute estivät PC soluproliferaatiota annoksesta ja aikariippuvaisesti

ensimmäinen tavoite oli tutkia

in vitro

vaikutuksia BLE uutteen PC solujen kasvuun ja kannattavuuden. MTT: tä käyttäen määrityksiä (Fig. 1A), leviämisen aktiivisuus PC solulinjojen DU145, PC3 ja 22Rv-1 havaittiin korreloivan käänteisesti uutetta pitoisuus viljelyväliaineessa. 72 tunnin kuluttua hoidon jälkeen estävä vaikutus alkoi alhaisina pitoisuuksina, ja esti merkittävästi proliferaatiota 50%: lla, kun PC-soluja kasvatettiin väliaineessa, mukana 30 ug /ml BLE uutetta. Kuitenkin suuri uutteen pitoisuus (100 ug /ml), noin 75%: n anti-proliferatiivinen vaikutus oli merkittävästi saavutettu. Nämä tulokset olivat yhteensopivia konfluenssiin muutosten kulttuuri (kuva S1) ja tarkasti trypaanisinieksluusiolla määritykset (Fig. 1 B). Korkeina pitoisuuksina (60 ja 100 ug /ml), lisääntynyt sytotoksisuus ja solukuolemaa ei havaittu.

inkuboinnin jälkeen kolmesta eturauhassyövän solulinjoissa (DU145, PC3 ja 22Rv-1) 24, 48 ja 72 h tai ilman hoitoa BLE uutetta, soluproliferaatiota määritettiin. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina tutkittu ryhmässä verrattuna sen valvontaan. Tulokset edustavat keskimäärin viisi toisistaan ​​riippumatonta koetta. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01).

BLE uutetta aiheuttama solu- myrkyllisyys DU145 solulinjassa

BLE oli sytotoksinen ja indusoi merkittävät solukuoleman DU145 solulinjassa annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 2). Sytotoksisen potentiaalin BLE uute määritetään perustuen mittaukseen solunsisäinen LDH-entsyymin, joka on stabiili sytosolinen entsyymi vapautuu soluviljelyalustaan ​​kun solukalvon vaurioita. 30% sytotoksinen vaikutus on merkittävästi saavutettiin 48 h 100 ug /ml ja 72 h 60 ug /ml. Kuitenkin enintään solukuoleman prosenttiosuutta oli noin 50% 72 tunnin kuluttua hoidon pitoisuutena 100 ug /ml BLE uutetta.

Solukuolemaan määritettiin laktaattidehydrogenaasin (LDH) määritys käsitelty tai ilman osoitetut pitoisuudet BLE uutetta 24, 48 ja 72 tuntia. Solukuolema laskettiin prosenttiosuutena LDH: n vapautuminen mukaan aiemmin mainittu kaava. Data edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01).

BLE pro-oksidatiivinen indusoimaa DU145 solukuoleman

Solunsisäinen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS ) tuotanto mitattiin käyttämällä nitrosinitetratsoliumia (NBT). Intensiteetti väriaine on kääntäen propotional läsnäolo ROS. Tulokset Kuvio 3 osoittaa annoksesta ja ajasta riippuva väheneminen NBT. NBT vähentäminen aloitettiin 24 h 100 ug /ml, kun taas enimmäisprosenttiosuus NBT vähennys oli 72 tunnin kuluttua hoidon 100 ug /ml BLE uutetta. Mielenkiintoista on, että läsnä on ROS scavenger (N-asetyyli-L-kysteiini, NAC), BLE ei vaikuta solujen elinkelpoisuuteen 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua. Lisäksi BLE-indusoidun solujen DNA pirstoutuminen, osoittaa apoptoosin ja solukuoleman, ei nähty, kun läsnä on NAC (Fig. S2). Tämä viittaa siihen, että BLE uute indusoi solukuoleman induktioon ROS tuotanto.

ROS tuotanto mitattiin nitrosinitetratsoliumia (NBT) väheneminen DU145 solulinjassa kanssa tai ilman hoitoa osoitetun pitoisuuksia BLE uutetta 24, 48 ja 72 tuntia. NBT vähennys laskettiin prosenttiosuutena kontrollin samaan ryhmään. Data edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01).

BLE otteita aiheuttama solusyklin pysähtymisen G0-G1 vaihe

Yrittäessään ymmärtää, miten BLE uute pystyy vähentää solujen määrän ja estävät solujen lisääntymistä, pyrimme analysoimaan solusyklin. Tutkimme solujen DNA-sisällön jakelu virtaussytometrillä sen jälkeen, kun 24, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen. Solusyklin analyysi osoitti, että DNA-sisällön jakelu on muuttunut BLE-käsiteltyjen PC3 (taulukko 1) ja DU145 (taulukko 2) soluja. Kuten esitetty taulukossa 1, BLE hoito PC3-soluja, joko 10 ug /ml tai 30 ug /ml aiheutti lisääntymisen, 24 h, ja solujen määrä G1 vaiheen solusyklin, todisteeksi G1 pidätyksen. 48 h ja 72 h jälkikäsittelyä, G1 väestö kasvoi alle 50% kontrolliryhmässä yli 60% PC3-soluissa käsitelty BLE uutetta 10 ug /ml tai 30 ug /ml. Kiinnostavaa kyllä, tämä liittyi samanaikainen lasku prosenttiosuus S vaiheessa olevien solujen ja kertyminen pre-G1 (G0) olevilla soluilla. Sama profiili havaittiin, kun DU145-solut altistettiin samalle käsittely ja analysointi (taulukko 2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että BLE hoito johtaa häiriön solusyklin.

BLE ote vähentänyt muuttoliike ja hyökkäys kyvyt DU145 solujen

Seuraavaksi tutkimme vaikutus BLE uutteen solumigraatioon ja invaasiota ,, kaksi fenotyyppiä, jotka liittyvät etenemiseen etäpesäkkeitä. Käyttämällä haavan paranemista määrityksessä, kun läsnä on mitomysiini C estää solun jakautumisen, BLE hoito suppressoi merkitsevästi solumigraation kyky DU145-solujen kontrolliin verrattuna, jolloin haava oli täysin parantunut jälkeen 48 h (Fig. 4A ja B) . Nämä tiedot olivat yhteensopivia invaasiomääritys jossa käsittelyllä 30 ug /ml BLE uutetta, invaasio kyky vastauksena FBS, väheni merkitsevästi enemmän kuin kolme taittuu kontrolliin verrattuna (Kuva. 4 C ja D). Mielenkiintoista on, BLE hoito vähensi merkitsevästi pohjapinta invaasiota (ei FBS) solujen verrattuna kontrolliin. Lisäksi ja korjatut vaikutus proliferaatioon /apoptoosin vaikutuksesta BLE on invaasio säilyi merkitsevänä välillä hoidon ja kontrolliryhmään. Tämä viittaa siihen, että BLE ote on suuri estävä vaikutus PC solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

(A) tyhjästä, vuonna DU145 soluissa tehtiin käyttämällä keltainen kärki, ja kuvat otettiin T = 0 tuntia, 12 h, 30 h ja 48 h tai ilman hoitoa, ja kvantifiointi halkaisija haavansulkemiseen arvioitiin ajan (B). Data edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01). (C): edustavat kuvat laajuisten hyvin invaasiomääritys. DU145-solut ympättiin Matrigel ™ pinnoitettu kalvo yläkammiossa laajuisten hyvin ja oli joko käsitelty tai ei käsitelty 30 ug /ml BLE uutetta läsnä ollessa tai poissa ollessa FBS alemmassa kammiossa. Solut, jotka hyökkäsi alempaan kammioon 48 tunnin kuluttua kiinnitettiin metanolilla, värjättiin H 0,05; # P 0,01).

BLE uute kohdennettuja rikastetun populaation PC kantasolujen /esisolujen 3D pallojen muodostuminen määrityksessä

kyky muodostaa ja levittää palloista tarttumattomat kulttuuri on yksi ominaisuuksista CSCS. Sen vahvistamiseksi, että BLE hoito voi estää eturauhassyövän CSC ominaisuuksia, muodostumista prostaspheres PC solulinjojen tutkittiin läsnä ollessa tai puuttuessa BLE-uutetta. Tässä määrityksessä prostaspheres muodostettiin sulauttamalla 1000 yhden solua per kuoppa Matrigel ™ alhaisessa seerumissa (2% FBS). Kun on viljelty DU145 soluja 13 päivää, on pieni määrä näitä soluja pystyivät muodostamaan kasvaimen aloilla, käsittelemättömän olosuhteissa, joissa on palloja muodostavan yksikön (SFU) 6,8%. Kuitenkin, käsittely 20 ug /ml tai 30 ug /ml BLE uutetta merkittävästi vähentänyt prostaspheres yli 50% (kuvio. 5A). Lisäksi mitään palloja havaittu kuoppiin käsitelty BLE uutetta pitoisuutena yli 30 mikrog /ml. Mielenkiintoista on, että keskimääräinen koko BLE uutteen käsiteltyjen prostaspheres oli merkitsevästi pienempi verrattuna kontrolliin (kuvio 5B ja D), ja tämä voi selittää merkittävä väheneminen keskimääräinen lukumäärä solua per prostasphere kuten on esitetty kuviossa 5C.

(A) Sphere-Forming Unit (SFU) on esitetty tai ilman BLE hoitoa (20, 30, 60 ja 100 ug /ml). Luotu palloja kutsutaan G1 (Generation 1) aloilla. SFU lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti: SFU = (pallojen lukumäärä lasketaan Ö syötettyjen solujen) x 100. Data edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01). (B) edustavat kuvat DU145 prostaspheres kanssa tai ilman BLE hoitoa. Kuvat visualisoitiin Carl Zeiss mikroskoopilla 10x suurennus ja analysoitiin Carl Zeiss Zen 2012 kuvankäsittelyohjelmaasi. (C) kvantifiointi keskimääräinen halkaisija DU145 prostaspheres kanssa tai ilman hoitoa olosuhteissa. Data edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01). (D) kvantifiointi keskimäärin solua DU145 prostasphere kanssa tai ilman hoitoa. Data edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01).

Self-uusimisen toimintaa pidetään yhtenä tärkeimmistä tunnusmerkeistä kantasolujen /progenitorisolujen. Siten varmistetaan, että meidän ote pystyy kohdistamaan itseuudistuvien CSC allas, pallo muodostumisen aktiivisuutta arvioitiin yli viisi sukupolvea. DU145-solut, jotka pystyivät muodostamaan aloilla, ensimmäisen sukupolven (G1) kerättiin ja lisättiin dissosioimalla aloilla yksittäisiksi soluiksi, ja sitten sama määrä soluja (1000 solua /kuoppa) uudelleen kylvetään. Analyysi suoritettiin kunnes viidennen sukupolven (G5), seuraavat kokeellinen suunnittelu kuvataan kuviossa 6B. Käsittely 20 ug /ml BLE uutteet oli riittävä merkittävästi vähentämään alalla muodostumisen mahdollisuuden noin 50%, kun hoidetaan kerran ja johdonmukaisesti yli viiden sukupolven (Fig. 6A). Mielenkiintoista on, että kun peräkkäisten käsittely ja leviämistä soluja, jotka kykenivät vastustamaan ja hengissä ensimmäinen BLE käsittely G1, erittäin Demoted SFUs tuotettiin G2, eikä prostaspheres muodostuivat G3. Erityisesti, solut, joita oli käsitelty kerran G1 kykenivät palauttamaan niiden palloja muodostavan kyky, kun edelleen etenemisen prostaspheres ilman mitään hoitoa (Fig. 6B). Tämä viittaa siihen, että sarja hoito BLE uutetta tarvitaan ja pystyy kohdistamaan erittäin kestävä CSCS ja sammuttaen niiden itseuudistumisen kyky. Erityisesti, solut käsiteltiin 30 ug /ml BLE uutetta oli merkittävä väheneminen ekspressiotasot Sox2, Oct4, Nanog, CD44 ja CD166, kaikki merkit tiedetään ilmentyvän eturauhassyövän kantasoluja, verrattuna kontrolliin ei-käsiteltyjen solujen (Fig. S3).

(A) SFU saatu sarjoittain kuljetettiin prostaspheres yli viisi sukupolvea on esitetty käsittelemätöntä olosuhteissa (aina ohjata) ja 20 ug /ml BLE uutetta saaneista ehto (käsiteltiin kerran jälkeen eteneminen kontrollista). (B) Prostate CSC oli rikastettu DU145-solulinjasta ja käsiteltiin joko BLE uutteet (20 ug /ml) tai media (kontrolli) (G1). Jokaisen lisääminen, solut, jotka saivat ensin BLE uutetta (20 ug /ml) tai media (kontrolli) ympättiin erillisiin kuoppiin. Kuulat kasvatettiin viiden sukupolvien kopioita jokaisen kunnossa. SFU lasketaan ja keskimäärin kaksi erillistä koetta, on esitetty. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD (* P 0,05; # P 0,01).

Keskustelu ja päätelmät

yleisenä tavoitteena syövän hoito on kohdistaa syöpäsolujen vain jättäen elinkelpoisia normaalit solut vahingoittumattomina. Tässä tutkimuksessa,

berberis libanotica

uute osoitti antineoplastisia vaikutuksia vähentämällä elinkelpoisuus ja lisääntyminen kolme PC solulinjojen aika- ja annoksesta riippuvalla tavalla, jolloin 22RV-1-solulinja oli suurempi herkkyys hoitoon kuin muut kaksi solulinjaa (PC3 ja DU145). Konsentraatio 30 ug /ml BLE uute onnistunut saavuttamaan IC50, kun taas pitoisuus 60 ug /ml indusoi 70% proliferaation inhibition ja solujen kuolema saavuttaa 100 ug /ml.