Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lihavuus on keskeinen riskitekijä kehittämiseen paksusuolensyöpä; kuitenkin, hormonitoimintaa /paracrine /metabolinen verkot välittävät tässä yhteydessä tunnetaan huonosti. Tässä oletamme, että lihavuus johtaa erittyvä tuotteita rasvakudoksesta indusoivien pahanlaatuisuuteen liittyvän metabolisen muutoksia koolonkarsinoomasoluissa. Ihmisen HCT116 paksusuolen syöpäsoluissa, altistettiin ilmastoitu viljeltyjen ihmisen rasvakudos fragmentteja lihavia vs. ei-lihavilla henkilöillä. Hapenkulutuksen (OCR, enimmäkseen mitokondrio hengitys) ja solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR, useimmiten laktaattituotanto kautta Glykolyysivaiheen) tutkittiin nähden suhteessa solujen elävyyden ja ilmentymistä liittyvien geenien ja proteiinien. Tuloksemme osoittavat, että vakioitua elatusainetta lihavilla (vs. ei-lihavilla) koehenkilöillä väheni pohjapinta (40%,

p 0,05

) ja maksimaalinen (50%,

p 0,05

) OCR ja geeni-ilmentymisen mitokondrioiden proteiinien ja Bax vaikuttamatta solujen elinkyvyn tai ilmentämistä glykolyyttisiä entsyymejä. Samanlaisia ​​muutoksia voidaan toisteta inkuboimalla soluja leptiinin, kun taas, leptiini-reseptorin erityisiä antagonisti estivät alennettu OCR aiheuttama vakioitua elatusainetta lihavilla henkilöillä. Olemme päätellä, että erittyvä tuotteiden rasvakudoksesta lihavilla henkilöillä estävät mitokondrioiden hengitykseen ja toimivat HCT116 koolonkarsinoomasoluissa, vaikutus, joka on ainakin osittain välittyvät leptiini. Nämä tulokset korostavat otaksuttu uusi mekanismi lihavuuteen liittyvä riski ruoansulatuskanavan pahanlaatuisten kasvainten, ja ehdottaa mahdollisia uusia hoitokeinoja.

Citation: Yehuda-Shnaidman E, Nimri L, Tarnovscki T, Kirshtein B, Rudich A, Schwartz B (2013) eritetty Human Adipose Leptiini Vähennykset mitokondrio hengitystä sisään HCT116 koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (9): e74843. doi: 10,1371 /journal.pone.0074843

Editor: Giovanna Bermano, Robert Gordon University, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 24 tammikuu 2013; Hyväksytty: 08 elokuu 2013; Julkaistu: 20 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Yehuda-Shnaidman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Israel Science Foundation Grant 134/06 BS Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on käymässä yhä selvemmäksi, että hälyttävä liikalihavuuden lisääntymisen ei ainoastaan ​​lisää väestön riskiä sydän- ja aineenvaihdunnan häiriöt [1], koska ylipaino on nyt myös tunnustettu tärkeäksi riskitekijä kehittämiseen esiintyy syöpien, kuten paksusuolen syöpä [2]. Silti, kun taas yhdistyksen välillä lihavuuden ja sen sydän- ja metabolisen ilmenemismuodot on tutkittu laajasti viime vuosikymmeninä, mekanismit ”liikalihavuuteen maligniteetti yhteys” edelleen huonosti.

Rasvakudos on aktiivinen hormonitoimintaa urut, erittävä rasvahappoja ja peptidihormoneille tai sytokiinien (adipocytokines), jotka ovat suoraan mukana paitsi sääntelyn koko kehon aineenvaihduntaa, vaan myös tulehdus- ja immuunivasteiden [3]. On ehdotettu, että liikalihavuus liittyvä kasvu adiposyyttien koon ja /tai määrän, muuttaa adipocytokine eritystä ja lisääntynyt angiogeneesi, voivat kaikki osaltaan lisääntynyt riski tiettyjen pahanlaatuisten kasvainten, mukaan lukien paksusuolen syöpä [1,4,5]. Muutokset adipocytokine tasoilla vaikuttaa solujen lisääntymistä, apoptoosin, invasiivisia kasvua ja angiogeneesiä [1]. Vaikka lukuisia adipocytokines on tunnistettu, vain muutama on tutkittu niiden kyvyn suhteen säädellä paksusuolen syövän kasvaimen kasvua. Seerumin taso leptiini liittyy läheisesti rasvakudos (AT) massa [6] ja aiemmin saapuvat meille vaikuttavan paksusuolensyöpä taudin alkamisen ja etenemisen,

in vitro

[7].

toisin kuin normaalit solut, jotka perustuvat ensisijaisesti mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation ATP tuotantoon, useimmat syöpäsolut luottavat raskaammin aerobista Glykolyysivaiheen; ilmiö jota kutsutaan ”Warburg vaikutus” [8]. Aiemmin osoitettiin, että normaaleissa happitilanne, ei-metastasoitunut solut kuluttavat vähemmän glukoosia taas metastaattinen solujen konstitutiivisesti esiintyy enemmän Glykolyysivaiheen nopeudella, mikä viittaa siihen, että ”Warburg vaikutus” kumppaniaan korkeammalla pahanlaatuinen fenotyyppi [9]. Vastaavasti, korkea glukoosin otto jopa normaaleissa hapen olosuhteissa on ominaista pahanlaatuisten syöpien, kuitenkin, molekyyli- tapahtumia mukana ei täysin ymmärretä. Erityisesti on epäselvää, onko siirtyminen mitokondrion ja glykolyyttisissä hengitys on ensisijainen, eli seurauksena kohonnut ilmentyminen glykolyyttisten proteiinien tai on pikemminkin toissijainen mitokondrioiden toimintahäiriön (joka muodostaa vastine ”Pasteur vaikutus”).

korkea syövän liikalihavuuteen voi osoittaa pahanlaatuiseen edistävät tekijät peräisin muuttunut rasvakudoksesta. Vaikka useimmat rasvasolut eivät välttämättä ole suorassa kosketuksessa paksusuolen soluja, on olemassa vielä paikallisia rasvasolut vatsan rasvaa, jotka sijaitsevat lähellä koolonkudoksessa ja voivat vaikuttaa välityksellä erittyy tuotteita, paksusuolen solujen aineenvaihduntaa. Aikana paksusuolen syövän synnyn syöpäsolut tunkeutuvat suolen, päästä kierto ja anna maksassa. Vuonna vaeltavat reitin koolonkarsinoomasoluissa voivat kohdata verisuonia peräisin rasvasta-massasta ja runsaasti adipokines. Parhaan tietomme mukaan se on tutkimaton onko AT indusoi metabolinen kyseeseen koolonkudoksessa edistämällä tehostetun Glykolyysivaiheen ja /tai estämällä mitokondrion hengitystä. Käsitellään tämän hypoteesin, teimme yksityiskohtainen bioenergetic analyysi paneelin ihmisen paksusuolen syövän solulinjoja altistettiin väliaine (CM) kerätään viljellyissä ihmisen sisäelinten (omental) AT-fragmentit on saatu aiheiden monenlaisia ​​BMI. Me raportoimme tässä, että HCT116 koolonkarsinoomasoluissa altistuvat CM alkaen lihavilla henkilöillä osoittavat merkittävää vähenemistä mitokondrioiden hengitykseen nopeudella ja geenin ilmentymisen taso mitokondrioiden proteiineista, joilla ei ole merkittävää muutosta ilmentymistason Glykolyysivaiheen proteiineja. Lisäksi huomaamme, että leptiini voi olla keskeinen molekyyli signaali välittäjänä vuorovaikutusta AT ja koolonkarsinoomasoluissa.

Methods

Ihmisen näytteiden keräämistä ja medium (CM) valmistelu

tutkimus protokolla hyväksyi paikallinen eettinen komitea on Soroka University Medical Center ja Ben Gurionin yliopiston. Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin osallistuvan potilaista. Ihmisen omental AT koepaloja kerättiin aikana valittavia vatsan leikkauksia, kuten aiemmin on kuvattu [10] ei-lihavilla (BMI: 26,2 kg /m

2 ± 0,9 (keskiarvo ± SD), ikä: 51,2 ± 11 v,

n

= 4) tai lihavia henkilöt (BMI: 42,1 kg /m

2 ± 5,8, ikä: 38,8 ± 16 v,

n

= 10). Viljellyt rasvakudoksessa fragmentteja (2-3 mm

3, 100 mg /ml väliainetta) inkuboitiin 37 ° C: ssa väliaineessa [DMEM + 10% (v /v) FCS: ää, 2 mM L-glutamiinia], annetaan asettua yön yli, kasvualusta korvattiin, ja fragmentit inkuboitiin edelleen 24 tunnin ajan samassa väliaineessa ilman FCS: ää. Fragmentit poistettiin pinseteillä, ja media (CM) siirretään hyvin puhtaaseen putkeen, jäädytettiin nopeasti (10 sekuntia) nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Cell Culture

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat: HCT116, HM-7 ja Caco

2 viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% (tilavuus /tilavuus) FCS: ää, 2 mM L- glutamiinia ja 0,2% (v /v) penisilliini-streptomysiiniä. HCT116 ja Caco

2-solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). HM-7 on solun variantti LS174T, aikaisemmin valittu sen kyky tuottaa suuria määriä limaa [11] ja olevan erittäin metastaattinen in

in vivo

[12] ja

in vitro

järjestelmät [13].

solut ympättiin: 0,2% gelatiinia peittämä 24 kuopan XF24 levyille (3 x 10

4 solua /kuoppa, Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) ja OCR ja ECAR kokeet; 24-kuoppalevyille (7,5 x 10

5 solua /kuoppa) proteiini- tai RNA. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin DMEM (kontrolli), leptiinin (100 ng /ml), ei-lihavilla tai lihavia CM. Milloin on osoitettu, leptiini antagonisti (1 ng /ml) lisättiin soluihin, joita inkuboitiin CM.

Cell hengitysmittauksiin

Cellular OCR ja ECAR mitattiin käyttäen XF24 Analyzer (Seahorse Bioscience, MA , USA), kuten aiemmin on kuvattu [14,15]. Maksimaalisen hengityksen, 0,4 uM FCCP käytettiin. Optimaalinen FCCP konsentraatio määritettiin alustavissa kokeissa.

RNA ja reaaliaikainen PCR-

RNA eristettiin käyttäen Tri-reagenssia liuosta (MRC, Cincinnati, OH). Käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen High-Capacity cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) satunnaisia ​​alukkeita on Veriti® 96 kuopan lämpösyklilaitteeseen (Applied Biosystems). Reaaliaikainen PCR tehtiin käyttämällä SYBR® Green (Applied Biosystems) ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System. Alukkeet on kuvattu taulukossa S1. Kaikki tulokset normalisoitiin p-aktiinin ilmentymistä.

Western blotting

Solut ympättiin 7,5 x 10

5 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin DMEM (kontrolli), leptiinin (100 ng /ml), CM ei-lihavilla tai lihavilla henkilöillä ja inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa. Solut hajotettiin ja sentrifugoitiin 23000 g, 15 min. Proteiini määritettiin supernatanteista microbicinchoninic happo-pohjainen proteiini (BCA) (Pierce, Rockford, IL). 25-50 ug proteiinia näytteitä ajettiin elektroforeesissa SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Whatman, Schleicher HCT116 HM-7 [16]. Niinpä katsotaan HCT116 solulinja olla ”keskipitkällä pahanlaatuinen” koolonisyöpäsolulinja ja käytetään näiden solujen seuraavassa kokeita. Käyttämällä XF24 analysaattori, mittasimme hapenkulutuksen (OCR, enimmäkseen mitokondrio hengitys) ja solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR, laktaatti syntyy kautta Glykolyysivaiheen [15]) ja HCT116-solujen. Todellakin, leptiini hoito HCT116-solujen vähensi OCR tasoilla (kuvio 1A) ilman merkittävää muutosta ECAR (kuvio 1 B). Lisäksi maksimaalinen hengitystiheys mitattuna läsnä FCCP oli merkittävästi pienempi seuraavat leptiini hoidon (kuvio 1C). Huomattavaa on, että leptiini hoito ei aiheuttanut solukuolemaa, samalla tavalla edellisessä tutkimuksessa [7] ja vahvistanut tässä mittaamalla solujen määrän (kuva S1A) ja solujen elinkykyä (kuvio S1B).

HCT116-soluja käsiteltiin DMEM (kontrolli), vs. leptiinin (100 ng /ml), 24 tunnin ajan. (

) Basal OCR, (

B

), Basal ECAR, (

C

), FCCP aiheuttama maksimaalinen OCR (0,4 uM) mitattiin käyttäen XF24 Analyzer (

n

= 5). *,

P

0,01 vs. kontrolli (Opiskelijan

t

-testi). **,

P

0,05 vs. kontrolli (Opiskelijan

t

-testi). Tulokset normalisoitiin solujen määrä ja ilmaistaan ​​prosentteina kontrollista.

Lisääntynyt ilmentyminen useiden glykolyyttisten entsyymien on liittynyt syöpää fenotyypin (tarkistetaan 8,19,20), mukaan lukien: pyruvaatti kinaasi (erityisesti M2 kasvainspesifisiä isoformia, mutta myös M1 (PKM1, PKM2 [19,21])), heksokinaasin (erityisesti isoformin 2, mutta myös 1 (HK1, HK2 [22,23])), ja phosphofructokinase (PFK [ ,,,0],8]).

Leptiini hoito ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia geenien (kuvio 2A) tai proteiini (kuvio 2B, C) ekspressiotasot HK1, HK2, PKM2 tai PFK. Kuitenkin proteiinin taso koko PKM1 ja PKM2 isoformit (PKM1M2) oli merkitsevästi korkeampi leptiini-käsiteltyjen solujen (kuvio 2B, C), viittaa siihen, että leptiini voi vaikuttaa glykolyyttisen reitin ainakin jossain määrin (mahdollisesti lisäämällä PKM1), vaikka ei näy ECAR.

HCT116-soluja käsiteltiin DMEM (kontrolli) vs. leptiinin (100 ng /ml), 24 tunnin ajan. (

) Gene ekspressiotasoja havaittiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (

n

= 4). (

B

) Yhteensä solulysaateista analysoitiin Western blot. (

C

) densitometrinen analyysi Western blot tietojen tehtiin. *

P

0,05, vs. valvontaluetteloihinsa kunkin proteiinin (Opiskelijan

t

-testi).

Mitokondrioiden hengitys voi vaikuttaa erilaisia ​​muutoksia mitokondrioiden geenien myös koodaavat Hengitysketjun komplekseja , mikä vaikuttaa myös syövän synnyn [24,25]. Me seuraavaksi arvioidaan jos laski OCR aiheuttama leptiinin liittyy muutoksia geeni ja proteiinin ekspression profiili suurten mitokondrioiden proteiineja. Mittasimme mRNA-tasot hengitysteiden ketjun komplekseja geenit: kompleksi 1 (

ND1

,

NDUFA13

), kompleksi 2 (

SDHB /C /D

), kompleksi 4 (

COX1 /2 /4- /5

), kompleksi 5 (

ATP6, ATP5H

) ja sytokromi C (

CytC

). Leptiini hoito pienensi merkittävästi ekspressiotasot ydin- koodattu mitokondrion geenit:

NDUFA13, COX5, CytC

(kuvio 3A); ja mitokondrioiden koodatun geenit:

ND1, SDHD, COX2

(kuvio 3B). Lisäksi proteiini taso sytokromi C heikkeni huomattavasti leptiini (kuvio 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että leptiini, koska yksittäinen tekijä; voi vähentää mitokondrioiden massa ja toiminta HCT116 koolonkarsinoomasoluissa.

HCT116-soluja käsiteltiin DMEM (kontrolli) vs. leptiinin (100 ng /ml), 24 tunnin ajan. (

,

B

) geeniekspressiotasot todettiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (

n

= 4). *,

P

0,05, **,

P

0,01 vs. valvontaluetteloihinsa kunkin geenin (Opiskelijan

t

-testi). (

C

) Solulysaatit analysoitiin sytokromi C (CytC, yläpaneeli) ja β-aktiini (alapaneeli) Western blot, ja densitometrinen tietojen analyysi tehtiin. *

P

0,01, vs. kontrolli (Opiskelijan

t

-testi).

vaikutukset lihavia CM on HCT116 hengitykseen

Testasimme vaikutukset medium (CM) , kerätään sisäelinten (omental) AT lihavien vs. ei-lihavilla henkilöillä, on glykolyyttisissä vs. mitokondrion hengitystä hintojamme HCT116-soluissa [16] (kuva 4). Yksityiskohdat aiheista on koottu taulukkoon S2.

HCT116-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan DMEM (kontrolli), CM kerätään sisäelinten AT ei-lihavilla henkilöillä (n = 4) tai lihavia (n = 10) ja analysoitiin niiden OCR (

) ja ECAR (

B

) tasot käyttäen XF24 Analyzer. *,

P

0,05 vs. ei-lihavilla tai ohjaus (Studentin t-testi). (

C

) Maksimaalinen OCR tasoille FCCP (0,4 uM) mitattiin käyttäen XF24 Analyzer. Ohjaus (

n

= 9), ei-lihavilla (

n

= 4), lihavia (

n

= 10). *,

P

0,05 vs. ei-lihavilla näyte (Mann Whitney koe). Tulokset normalisoitiin proteiinipitoisuuteen ja ilmaistiin prosentteina kontrollista.

Tuloksemme osoittavat, että CM alkaen lihavia johti merkittävästi (p 0,05) väheni OCR tasolla ~ 40% (kuvio 4A) . Mielenkiintoista on, että ECAR tasot ole kasvanut lihavia CM (kuvio 4B), kuten voisi odottaa vastauksena ”Warburg vaikutus”. Lisäksi maksimaalinen soluhengitysnopeuden mitattuna mitokondriaalisen uncoupler FCCP, olivat merkittävästi alhaisemmat soluissa altistetaan lihavia-CM vs. solut altistetaan ei-lihavilla CM (kuvio 4C).

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että CM AT, erityisesti lihavia yksilöitä, on kyky estää mitokondrioiden hengityksen HCT116 koolonkarsinoomasoluissa; ominaisen muutoksen aineenvaihdunnan uudelleenohjelmointi tyypillistä pahanlaatuisen muutoksen.

vaikutus lihavien CM on HCT116 Glykolyysivaiheen

Kun otetaan huomioon pitkän aikavälin keskustelu koskien glykolyyttisissä vs. mitokondrioiden toimintoja aikana syöpä [26], ensin todentaa, että puute kasvusta ECAR vastauksena lihavia CM vastasi ekspressiotasot keskeisten glykolyyttisten proteiineja. Siksi vaikutus testattiin lihavia CM geenien ja proteiinien ilmentyminen tasolla näiden valittujen keskeisten glykolyyttisiä entsyymejä. Solut altistuvat lihavia CM ei aiheuttanut mitään lisäyksiä geenin (kuvio 5A) tai proteiini (kuvio 5B) ekspressiotasot HK1, HK2, PKM1 tai PFK verrattuna solujen alttiina ei-lihavilla CM. Sen sijaan merkittävä lasku mRNA tasolla

PKM2

(kuva 5A) Todettiin, mutta tämä ei liittynyt laski samaan aikaan proteiinin ekspressiotasot (kuvio 5B). HM-7 ja Caco

2-soluja käytettiin kontrolleina solut, joissa on enemmän tai vähemmän pahanlaatuinen ominaisuudet verrattuna HCT116, vastaavasti [16]. Tuloksemme osoittavat positiivista korrelaatiota maligniteetti tason solujen ja proteiinin ilmentymisen taso HK1 ja PKM2, kun taas ilmentymistaso PFK väheni HM7 solulinjassa (kuvio 5B, C). Tämä on korrelaatio laski OCR /ECAR suhde koolonkarsinoomasoluissa pahanlaatuisuuteen tasolla (Caco

2 HCT116 HM-7, kuva S2). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia raportoitu syövän kudosten ja aktiivinen jakautuviin soluihin [27]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että muutokset glykolyyttisten entsyymien ilmentyminen voi selittää hengitysvaikutukset aiheuttama lihavia CM. Tämä sai meidät testata onko CM muuttaa mitokondrioiden toimintaan.

HCT 116 soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan CM kerätään sisäelinten AT ei-lihavilla henkilöillä (

n

= 4) tai lihavilla henkilöillä (

n

= 9). (

) Bax-geenin ekspressiotasoja havaittiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. *,

P

0,05 vs. vastaavaan ei-lihavilla näyte kustakin geenistä (Mann Whitney koe). (

B

) Solulysaatit analysoitiin Western blot. HM-7 ja Caco

2 käytettiin verrokkeina (katso tulokset) (

C

), densitometrinen analyysi Western blot tiedot. *,

P

0,01, **,

P

0,05 (Kaksisuuntainen ANOVA, Bonferronin testi).

vaikutus lihavien CM on HCT116-solujen mitokondriot

Verrattuna ei-lihava CM, soluja inkuboitiin lihavia CM osoitti merkittävästi pienempi mRNA-tasoja mitokondrioiden hengitysketjun komplekseja (kuvio 6). Lasku oli havaittu geenien koodaama joko ydin- (kuvio 6A) tai mitokondrion (kuvio 6B) DNA, yhdessä viittaa alempi mitokondrioiden massa. ATP nopaliinisyntaasin (ATP5H, ATP6) vähennys näytteillä samanlainen trendi. Huomattavaa on, että lihavilla CM ei vähentänyt solujen määrää (kuvio S3A) eikä solujen elinkykyä (kuvio S3B). Lisäksi, HCT116-solut käsiteltiin ei-lihavilla CM ilmaistuna korkeamman geenin ja proteiinin tasot Bax, on merkittävä pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsen [28], verrattuna ohjaus- tai lihavia CM-käsiteltyjen solujen (kuvio 6C, D ). Yhdessä nämä tulokset osoittavat vakavaa mitokondrioiden toimintahäiriöitä HCT116-solujen aiheuttama CM alkaen lihavia yksilöitä.

HCT116-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan DMEM (kontrolli), CM kerätään sisäelinten AT ei-lihavilla henkilöillä. (

,

B

) geeniekspressiotasot todettiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR. Lihavat (

n

= 8), ei-lihavilla (

n

= 4). *,

P

0,05, **,

P

0,01 vs. vastaavaan ei-lihavilla näyte kustakin geenistä (Mann Whitney koe). (

C

) Gene ekspressiotasoja havaittiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Ohjaus (

n

= 3), ei-lihavilla (

n

= 4), lihavia (

n

= 9). *,

P

0,05, vs. kontrolli (Mann Whitney), **

P

0,05, vs. ei-lihavilla (Mann Whitney). (

D

) Solulysaatit analysoitiin Bax (yläpaneeli) tai β-aktiini (alapaneeli) vasta-aineita, Western blot ja densitometrinen analyysi on tehty. Pystysuuntaiset valkoiset viivat merkitsevät kuva liitos esittää merkitystä vain bändejä, selvyyden vuoksi (esitetty on yksi blot). Ohjaus (

n

= 3), ei-lihavilla (

n

= 3), lihavia (

n

= 6). *,

P

0,01 vs. kontrolli (One Way ANOVA, Tukey testi). **,

P

0,001, vs. ei-lihavilla näytteistä (One Way ANOVA, Tukey testi).

Lopuksi se oli aiemmin osoittaneet, että leptiini pitoisuus CM korreloi suoraan BMI rasvakudoksen luovuttajien [29 ], joten päätimme jos leptiinianalogit erittyy rasvakudoksesta eksplanttien voisi välittää vaikutuksen lihavia-CM on paksusuolensyöpä soluhengityksestä. Itse asiassa, lisäksi leptiini antagonisti, joka estää leptiinin toimintaa [30], merkittävästi suojattu pieneneminen OCR että indusoitiin lihavia CM (kuvio 7).

HCT116-soluja käsiteltiin 24 tuntia CM kerättiin alkaen sisäelinten AT ei-lihavilla tai lihavilla, tai ilman leptiinin antagonisti (1 ng /ml). OCR-tasot mitattiin käyttämällä XF24 Analyzer. Ei-lihavilla (

n

= 4), lihavia (

n

= 7), ei-lihavilla antagonisti (LEPA ei-lihavilla,

n

= 3), liikalihavia antagonisti (Lepa Lihavat,

n

= 6). *,

P

0.05 vs. näytteitä lihavia (Studentin t-testi). Tulokset normalisoitiin proteiinipitoisuuteen ja ilmaistiin prosentteina kontrollista.

Keskustelu

rasvakudos on merkittävä hormonitoimintaa urut vaikuttaa koko kehon aineenvaihduntaa. Jossain vaiheessa aikana liikalihavuus etenemisen, eri stressin ärsykkeille voi johtaa huonosti AT, mikä puolestaan ​​salainen häirinnyt signaalia, joka voi muuttaa toiminta vierekkäisten tai kaukaisia ​​soluihin ja kudoksiin (paracrine ja hormonaaliset viestintä). Tämä häiritsi ylikuulumista voidaan edistää tulehdusta, kehittämiseen insuliiniresistenssiä ja puhkeamista ja /tai etenemistä erilaisten syöpien (tarkistetaan 4,31). Todellakin, lihavuus on nyt selvästi liittyy lisääntynyt riski kehittämistä varten eri syöpätyyppien, erityisesti syöpien perifeeristen kudosten, jotka ovat välittömässä läheisyydessä sisäelinten AT (kuten maksan, paksusuolen, haiman, munuaisen [1,2] ). Asiaankuuluva tutkimus äskettäin raportoineet Sung et al. [32], jotka osoittivat, että hiirillä, jossa paksusuolen syövän synnyn kemiallisesti aiheuttama, eniten koolontuumoreissa havaittiin hiirillä ruokittu rasvainen ruokavalio. Tämä liittyy korkeampi vatsan rasvaa ja pitoisuudet leptiinin, insuliinin ja IGF-1. Itse asiassa se on äskettäin arvosteli, että lihavilla sisäelinten AT kohdistaa erilaisia ​​vaikutuksia taudin etenemiseen eri vaiheissa syövän synnyn [4]. Kuitenkin perus osuus AT kasvaimen fysiologia ei ole selvää eivätkä niihin liittyvistä mekanismeista. Me raportoimme tässä, että AT on lihavia aihe voi edistää syövän etenemisen indusoimalla aineenvaihdunnan muutoksia ja erityisesti mitokondrioiden toimintahäiriöitä.

Energia solujen aineenvaihduntaa johtuu vuorovaikutuksesta kahden tärkeimmän bioenergetic väyliä, oksidatiivisen fosforylaation ja glykolyysiin [33 ]. On hyvin tunnettua, että usein metabolinen muutos havaittu tuumorisoluissa on suurempi Glykolyysivaiheen nopeudella ja maitohapon tuotantoa, koska lisääntynyt ilmentyminen glykolyyttisiä entsyymejä koodittavien geenien ja glukoositransporttereita ([34] ja viite. Viitteet). Kuitenkin meidän tulokset osoittavat vain lievän vaikutus leptiini on Glykolyysivaiheen. Koska solujen lisääntyminen ei vaikuta CM päässä lihavilla AT nämä tulokset voidaan selittää sillä, että monet kasvaimet tuottavat suurimman osan ATP ( 80%) mitokondrion hengitystä [33], [35], joka on paljon tehokkaampi kuin Glykolyysivaiheen. Lisäksi kaikki havainnot tukevat glykolyyttisissä muuttuu kasvaimien syntyyn. Sen sijaan jotkut tukea parannettu mitokondrioiden ATP tuotannon tukemiseksi energiantarpeen syöpäsolujen [36,37]. Huomattavaa on, että tuloksemme ei voi sulkea pois muutoksia glukoosin otto ja käyttö ylävirtaan glykolyyttisen välituotteiden leptiini /lihavia CM. Jatkotutkimuksissa siitä, onko ja miten muutokset glukoosin käyttöä ja glukoosiaineenvaihdunnan vaihdetaan leptiinin tai lihavia CM voi olla mekanistinen komponentti liikalihavuuden /leptiinin vaikutus lisäksi muutoksia mitokondrioiden hengitykseen.

Monet molekyylit voidaan visioi välittävät välistä ylikuulumista lihavia ja paksusuolen syöpä. Leptiini on hormoni, jota AT korrelaatio koko kehon rasvaa painoindeksin. Se tiedetään vaikuttavan ravinnon kautta keskustassa toimia [38], mutta se aiheuttaa myös reuna toimien kautta reseptorien perifeerisissä kudoksissa (kuten maksassa, lihaksessa, AT, paksusuolen [7,39]), ja voi olla läsnä suurella keskittyminen ääreiskudoksissa ympäröi viskeraalisen rasvan varikolla. Itse asiassa, varaamiseen raporttien mukaan leptiini olevan keskeisessä ehdokas yhdistää lihavuuden ja syövän, mukaan lukien: (a) leptiinin edistää paksusuolen syövän etenemiseen ja aggressiivisuus [7,40], solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua [17,18]; (B) leptiinin edistää rintarauhaskasvainten lihavilla hiirillä [41]; (C) leptiinin reseptorin ilmentyminen lisääntyy kasvainkudoksissa ja on tarpeen edistää kasvaimen etenemistä [42]; ja (d) leptiini ja leptiinin reseptorin tasoja käytetään osoittamaan rintasyövän etenemisessä [43]. Todellakin, meidän mittaustietojen näyttöä aineenvaihdunnan muutoksiin aiheuttama leptiinin HCT116 koolonkarsinoomasoluissa jotka ovat samanlaisia ​​kuin havaitsemat lihavia CM. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiemman raportin Park et al. (2012) hiirillä, jotka osoittavat, että kasvaimen epiteelisolujen puuttuu leptiinireseptorin hallussaan korkeampia perus- että maksimaalinen OCR tasolla vertaamalla soluihin normaalilla leptiinin reseptorin [42]. Mielenkiintoista on, Park et ai. ei havaittu merkittävää eroa mitokondrioiden geenien ilmentymisen eikä OCR tasolla seuraavissa leptiini hoitoa. Tämä ristiriita voidaan selittää eri kokeilun asetukset, hiirillä kasvaimen epiteelisolujen vs. ihmisen paksusuolen syövän soluja; ja että eri leptiinin pitoisuuksia käytetään. Mitokondriovauriot seuraavat 24 tuntia hoidon leptiinin voi olla seurausta kasvaa aluksi rasvahappojen hapettumista johtuen korkeampien rasvahappojen-hapot pitoisuudet ja AMP aktivoitu proteiinikinaasi aktivointi [44], tukeakseen kasvanut-ATP kysyntä syöpäsolujen [36 , 37]. Tämä voi ajautua myöhemmin mitokondriovaurioita, kuten on osoitettu sydämessä [45]. Todellakin, altistettaessa välittömästi HCT116 solujen CM, lisääntynyt OCR havaittiin (ei kuvassa).

Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että HCT116-solut altistettiin lihavia CM osoitti alempi pohjapinta ja maksimaalinen OCR tasoilla yhdessä alemman ilme tasot ydin- ja mitokondrioiden-koodattuja geenit, mikä viittaa keskeinen asema mitokondriot metabolisen uudelleenohjelmointi paksusuolen syövän liikalihavuus. Tukee tuloksemme, on osoitettu, että mitokondriot ovat avainasemassa aikana tuumorigeneesin (tarkistetaan 24,25), jossa se voi olla huonosti johtuen puutteita oksidatiivisen fosforylaation prosessin ja /tai alentuneiden mitokondriaalisen DNA [20, 24]. Esimerkkejä ovat: NDUFA13 (GRIM-19), olennaisena alayksikköä monimutkainen 1, pelkistetään kolorektaalikarsinoomasta [46]; SDHs, monimutkainen 2 alayksiköt, katsotaan tuumorisuppressorigeeneille koska niiden mutaatiot johtavat kasvaimien syntyyn; ja COX2, kompleksi 4 alayksikkö, pelkistetään monenlaisia ​​syöpiä ([24], ja ref. viitteet). Lisäksi mitokondriaalisen DNA havaitaan vähennetään valtioiden lihavuuden [47] ja syöpä ([20], [24], mutta katso 25). Mekanismin avulla voitaisiin lisätä mitokondrion hajoaminen (mitophagy) ja /tai alempi mitokondrion lisääntymistä [20]. Parannetun oksidatiivista stressiä syöpäsolut voivat vähentää ilmentymistä mitokondrioiden geenien [48]. Tärkeintä on, että lasku mitokondrio-DNA korreloi etenemistä ja aggressiivisuus syövän maligniteetti. Tämä ilmiö mahdollistaa mitokondrio-DNA olla diagnostinen väline arvioitaessa syövän etenemiseen ([24,25] ja viite. Viitteet). Kaikkiaan havainnot viittaavat siihen, että liikalihavuus edistää syöpäsolujen etenemistä ja aggressiivisuus, tuloksena on vakava sairaus.

Toinen mielenkiintoinen tulos on se havainto, että HCT116-solut altistuvat lihavia CM eivät pysty lisäämään Bax ilme, toisin kuin ei-lihavilla CM-käsiteltyjen solujen (kuvio 6C, D). Vaikka Bax aktiivisuustaso sinänsä ei mitattu, selitys voisi kuulua ”mitocheckpoint teoria (käsitellään 24) viitaten mitokondrioiden kyky liikaa tulla vahingollista ärsykkeiden palauttamalla mitokondrioiden toimintaan tai apoptoosin edistämiseksi geenien ilmentymisen muutoksia. Tapauksissa, joissa mitokondriot ovat vääristyneet, solut tulevat vastustuskykyisiksi apoptoosin ja siten, vamma ärsyke voi johtaa kasvaimien syntyyn. Hengitysteiden kompleksit pidetään mitokondrion ”tarkastuspiste” mekanismi pelissä rooli tukahduttaa kasvainten synnyssä. Siten tuloksemme voi ehdottaa huonosti mitokondriot kärsivän syöpäsoluja. Lisääntynyt Bax tasot aiheuttama ei-lihavilla CM voidaan selittää adipo-sytokiinien tuotannon AT jotka ovat erilaisia ​​eri lihavia ja ei-lihavilla AT johtuen ero makrofagien väestö (useimmat makrofagien laiha AT ovat M2 makrofagit, kun taas lihavia ovat M1 makrofagit [31]). Kun dissecting suhde lihavuuden ja paksusuolensyöpä nämä tulokset lisää arvokkaita ja uusia oivalluksia korostamisessa mitokondriot avaintekijänä tässä prosessissa.

Lopuksi havaitsimme merkittävän suojan leptiinin antagonisti vastaan ​​lihavia-CM aiheuttama