Krooninen sairaus

tiivistelmä

floridtsiinia (floritsiinia tai floretiinia 2 ’-

O

glukosidi) tunnetaan estää glukoosin imeytymistä suolistossa. Olemme tutkineet syöpää vaikutusta floridtsiinia ja sen uusia johdannaisia, joissa käytetään ihmisen syöpäsolulinjoja. Olemme syntetisoitiin uusia asyloidut johdannaiset floridtsiinia kuusi eri pitkäketjuiset rasvahapot mukaan alueselektiivisellä entsymaattisella asyloimalla käyttämällä

Candida Antarktis

lipaasi B antiproliferatiivisia vaikutuksia uusien yhdisteiden tutkittiin verrattuna emoyhdisteiksi, floridtsiinia, aglykoniksi floretiini, kuusi vapaita rasvahappoja ja kemoterapeuttiset lääkkeet (sorafenibia, doksorubisiini ja daunorubisiini) käyttäen ihmisen maksasyövän HepG2-soluissa, ihmisen rinta- adenokarsinooma MDA-MB-231-soluja ja akuutin monosyyttileukemia THP-1-solujen kanssa ihmisen normaaleja ja rotan maksasoluilla. Rasvahappojen esterit floridtsiinia esti merkittävästi kasvua kahden syöpä ja leukemia-solut, kun taas samanlainen hoidon annokset eivät olleet myrkyllisiä normaalin ihmisen tai rotan maksasoluilla. Antiproliferatiivinen teho rasvahappojen estereiden floridtsiinia oli verrattavissa tehoon kemoterapeuttisten. Rasvahappoesterit of floridtsiinia esti DNA topoisomeraaseista IIα toiminnassa, joka voisi aiheuttaa G

0 /G

1 vaihe pidätys, indusoi apoptoosin kautta kaspaasi-3, ja väheni ATP tasolla ja mitokondrion kalvon potentiaalia HepG2-soluissa. Joka perustuu korkea selektiivisyys syöpäsolujen, decosahexaenoic happoa (DHA) esteri floridtsiinia valittiin geenin ilmentymisen analyysi käyttäen RT

2PCR ihmisen syöpälääkkeen kohde- array. Antiproliferatiivinen vaikutus DHA esterin floridtsiinia voisi liittyä alas sääntelyn Antiapoptoottisten geeni (BCL2), kasvutekijän reseptoreita (EBFR perhe, IGF1 R /IGF2, PDGFR) ja sen alavirran signalointia kumppanit (PI3K /AKT /mTOR, Ras /Raf /MAPK), solusyklin koneita (CDK, tERT, TOP2A, TOP2B) sekä epigenetiikka sääntelyviranomaisten (HDAC: t). Nämä tulokset viittaavat siihen, että rasva-esterit floridtsiinia olla mahdollisia kemoterapeuttisen vaikutuksia välittämien heikennetyn ilmaus useiden keskeisten osallistuvien proteiinien solukierron säätelyssä, DNA topoisomeraaseja IIα aktiivisuutta ja epigeneettiset mekanismit seurasi solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin.

Citation: Nair SVG, Ziaullah, Rupasinghe HPV (2014) rasvahappoesterit floridtsiinia indusoida ihmisen maksan syöpäsoluja kautta muunneltu geeni Expression. PLoS ONE 9 (9): e107149. doi: 10,1371 /journal.pone.0107149

Editor: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 12 elokuu 2014; Julkaistu: 17 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Nair et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoittajat: HPVR: Discovery Grant ohjelma luonnontieteiden ja tekniikan neuvosto (NSERC; Grant lukumäärä 327.056, https://www.nserc-crsng.gc.ca) of Kanada ja Atlantin innovointirahastoja (AIF) ohjelma Atlantin Kanadan Opportunities Agency (ACOA; Grant Number 192020; https://www.acoa-apeca.gc.ca). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC), yleisin maksasyövän, edustavat maailmanlaajuisesti viidennen pahanlaatuisen ja kolmas syy kuolleisuuden syöpään liittyvä kuolema [1]. Kanadassa esiintyvyys HCC on kasvanut viime vuosikymmenten [2]. HCC osuus 71,9% maksan syöpiä miehillä ja naisilla Kanadassa. Mukaan Kanadan Cancer Statistics in 2013 esiintyvyys maksasyövän Kanadassa on kasvanut 3,6% vuodessa, ja kuolleisuus kasvoi 2,2% vuodessa. Vaikuttavista tekijöistä on HCC kuuluvat kosketuksiin hepatocarcinogens erityisesti aflatoksiini [3], maksan virusinfektio ja maksakirroosin [4]. Mahdollinen parantava hoitovaihtoehdot ovat kirurginen resektio, maksansiirron, ja ablaatio tai transarterial embolisaatiota [1]. Kemoterapia, suun multikinaasi estäjä sorafenibi (Nexavar) on yleisimmin käytetty lääke HCC hoitoon, mutta voitto selviytyminen on vaatimaton [5]. Seisokkiaika tehokkaiden hoitojen ja korkea esiintyvyys on johtanut etsimään uusia lähestymistapoja soveltuu ehkäisyyn ja hoitoon maksasyövän. Tämän seurauksena monet fytokemikaalit on tutkittu mahdollisina kemopreventiivisiä aineita, jotka voivat kääntää tai tukahduttaa maksakasvaimia etenemistä.

Flavonoidit, yksi tärkeimmistä luokista polyfenolien, ovat osoittaneet joitakin chemopreventive ominaisuuksia vastaan ​​HCC on suuri määrä vuonna vitro [6], [7] ja in vivo tutkimukset [1], [8]. Floridtsiinia (floritsiini tai floretiini 2 ’-

O

-glukosidi), joka on dihydrokalkoni, on yksi tärkeimmistä fenolisten flavonoidi glukosideja löytyy omena [9]. Suurimmat farmakologinen vaikutus floridtsiinia estämällä natrium-riippuvaisen glukoosin liittyy kuljettajat (SGLT1 ja SGLT2), joka estää glukoosin imeytymistä suolistossa ja aiheuttaa munuaisten glukosuria [9]. Lisäksi niiden diabeteslääkkeet omaisuus, floridtsiinia on muita biologisia vaikutuksia, kuten esto Härskiintyminen [10], ehkäisy luukadon rotilla [11] ja parantamiseksi muistia hiirillä [12]. Floridtsiinia stimuloida melanogeneesiprosessin lisäämällä tyrosinaasigeeniä ilmentymisen kautta cAMP signalointireitille [13]. Phloretin, aglykoni floridtsiinia, on raportoitu olevan voimakas antioksidantti aktiivisuus peroksinitriitin huuhtelu ja inhibition lipidiperoksidaation [14]. Glykosylaatio 2-OH laski antioksidantti toimintaa floridtsiinia 18 kertaa verrattuna Phloretin [14]. Phloretin pitoisuuksina 100 uM lisätyn TNFa-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) aiheuttama apoptoosin ja sytotoksisuus LNCaP eturauhassyövän solut [15]. Ei ole kuitenkaan mitään kertomuksen syöpää chemopreventive vaikutuksia floridtsiinia. Eräässä antituumorivaikutus tutkimus omena polyfenolit, floridtsiinia ei vaikuttanut leviämisen joko siirrettyjen B16 hiiren melanoomasoluja tai BALB-MC.E12 hiiren maitorauhasen kasvainsolut [16].

laboratoriossamme floridtsiinia on regioselektiivisesti asyloitiin joukon pitkä ketju, joka on tyydyttynyt, mono- ja poly-tyydyttymättömiä rasvahappoja, käyttämällä immobilisoitua lipaasia B, alkaen

Candida antarctica

(Novozyme 435) [17]. Lipaasin kata- esteröimällä ja transesteröinti flavonoidi glykosideja on raportoitu lisäävän lipofiilisyyden ja parantunut syövänvastainen vaikutus emoyhdisteen [18]. Näin ollen tässä tutkimuksessa tutkimme sytotoksisen potentiaalin rasvahappoestereiden floridtsiinia soluproliferaatioon kiinteitä kasvaimia, kuten maksasyövän HepG2-soluissa ja rinnan adenokarsinoomasolulinja MDA-MB-231-soluja sekä akuutti monosyyttien leukemia THP-1-soluissa. Normaalit ihmisen hepatosyyttien HP-F ja rotan maksasoluilla RTCP10 käytettiin myös määrittämään spesifisyyden estereitä syöpäsoluja. Tämä on ensimmäinen kerta, näitä uusia rasvahappoesterit floridtsiinia on testattu antiproliferatiivinen vaikutus syöpäsoluja. Lisäksi valaista solu- ja molekyylitason mekanismeja rasvahappoestereiden floridtsiinia HepG2-solut, DNA topoisomeraasit IIα aktiivisuutta, solusyklin pysähtymisen, mitokondrion kalvon läpäisevyyden, kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja siihen liittyvän apoptoottisten prosessien tutkittiin myös. Lisäksi olemme analysoineet vaikutus decosahexaenoic happoa (DHA) esteri floridtsiinia ekspressioon 84 geenien, joka kohdistuu syövän vastaista terapeuttisten ja lääkekehityksessä. Tuloksemme tarjotaan kokeellisia todisteita tukemaan lisätutkimuksia rasvahappoestereiden floridtsiinia erityisesti DHA esterin floridtsiinia tehokkaana ja turvallinen kemoterapeuttisten ehdokas.

Materiaalit ja menetelmät

Testiyhdisteet ja kemikaaleja

rasvahappoesterit floridtsiinia (Pz) eli. steariinihappo esteri Pz (Pz-steariinihappo), öljyhappo esteri Pz (Pz-öljyhappo), linolihappo esteri Pz (Pz-linolihappo), α-linoleenihappo esterin Pz (Pz-α-linoleenihappo ), DHA esterin Pz (Pz-DHA) ja eikosapentaeenihapon esterin (EPA) Pz (Pz-EPA) syntetisoitiin laboratoriossamme aiemmin raportoidun [17].

floridtsiinia, floretiinihydrolaasi, kaspaasi 3 kolorimetrinen määritys kit, propidiumjodidilla, rasvahapot eli öljyhappo, steariinihappo, linolihappo, α-linoleenihappo, EPA ja DHA ostettiin Sigma-Aldrich Canada. Cell Tiitteri 96 Aqueous Yksi ratkaisu solujen lisääntymistä (MTS) määrityksellä, CytoTox 96 ei-radioaktiivisen sytotoksisuus (LDH) määritys ja CellTiter-Glo luminoiva määritys sarjat hankittiin Promega, Madison, WI, USA. Steriili dimetyylisulfoksidi (DMSO) (ATCC), GFP-sertifioitu apoptoosin /nekroosin havaitseminen pakki mikroskopialaatu Enzo Life Sciences, Brockville, ON, Kanada; ApoTarget Nopea Apoptotic DNA Ladder Detection Kit Invitrogen, Burlington, ON, Kanada; DCFDA-Cellular reaktiivisia happiradikaaleja havaitsemismäärityksessä osina Abcam, Toronto, ON, Kanada; ja 5 ’, 6,6′-tetra- 1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi (JC-1) Cayman Chemicals, Burlington, ON, Kanada käytettiin myös tutkimuksessa.

solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen maksasyövän solut (HepG2) ja THP-1 akuutti monosyyttileukemian solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA (Dalhousien yliopisto Biosafety todistuksen numero käyttö solulinjoja on 2013-10). HepG2-soluja kasvatettiin Eaglen muunnetun minimum essential media (EMEM), johon oli lisätty 10% FBS: ää (ATCC) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (ATCC). THP-1-soluja viljeltiin RPMI-1640-alusta täydennettynä 0,05 mM 2-merkaptoetanolia ja 10% naudan sikiön seerumia loppukonsentraatioon 10%. MDA-MB-231-rintasyöpäsoluissa (ATCC HTB-26) saatiin Cedarlane, Berlington, ON, Kanada) ja pidettiin DMEM-alustassa (Sigma-Aldrich Canada), johon oli lisätty 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä , 2 mM L-glutamiinia, 5 mM HEPES (pH 7,4) ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada). Kylmäsäilytetyt normaalin ihmisen maksasolujen (HP-F), maksasolujen pinnoitus keskipitkän ja maksasolujen ylläpitoelatusaine ostettiin Zen-Bio, Research Tiangle Park, NC, USA. Normaalit ihmisen maksasoluissa levitettiin 96 hyvin kollageenin 1 päällystetty soluviljelmälevyihin (Life Technologies) ja ylläpidetään maksasolujen ylläpitävässä alustassa 24 tuntia, jotta solujen elpymistä ja kiinnitys. Rotan maksasoluilla (RTCP10), sulatus ja inkubaatio media ostettiin Life Technologies. Rotan maksasoluilla levytettiin kollageeni 1 päällystetty 96-kuoppalevyille (Life Technologies, Burlington, ON, Kanada) käyttäen sulatusta median ja ylläpidetään inkubaatioväliaineeseen. Kaikki solutyyppejä pidettiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO

2/95,% ilmanpaineessa vakiokosteudessa.

Solut laskettiin hemosytometrillä (Kirkas-Line hemosytometrin, Sigma-Aldrich Kanada) ja maljattiin mukaan solujen määrä kussakin kokeessa 6, 24 tai 96-kuoppaisen 24 tuntia ennen kuin lisättiin näytteet. Kaikki testinäytteet solubilisoitiin steriilisuodatettiin DMSO: ssa ( 0,5% kasvualustassa) ennen lisäämistä viljelyväliaineeseen. Ohjaus solut myös ajaa rinnakkain ja saatettiin samaan muuttuvia median kanssa 0,5% DMSO.

Soluproliferaatiomääritys

Solun elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTS-määritystä. Lyhyesti, HepG2-soluja (5 x 10

3 solua /100 ul /kuoppa), MDA-MB-231 (5 x 10

3 solua /100 ul /kuoppa), THP-1 (25 x 10

3/100 ul /kuoppa), normaalin ihmisen ja rotan maksasoluilla (1 x 10

4 solua /100 ul /kuoppa) maljattiin kolmena kappaleena 96 kuopan steriili tasapohjaisille kudosviljelylevyille. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, floridtsiinia rasvahappoesterit, floridtsiinia, floretiini, vapaita rasvahappoja vastaavien estereiden tai sorafenibille valmistettiin median ja 100 ui kunkin käsittelyn lisättiin kuhunkin kuoppaan, kunkin käsittelyn kolme kerrannetta. Siten, solut altistettiin eri pitoisuuksille (0,1, 1, 10, 25, 50, 75, 100 uM) kunkin hoidon. Kontrollit koostuvat solujen väliainetta, joka sisälsi DMSO ( 0,5%), testi nollakoekuoppien sisälsi testiyhdistettä mediassa ilman soluja ja nollakoekuoppien sisälsivät mediaa ilman soluja. Kun on kulunut vielä 3, 6, 12, 18 tai 24 h, 20 ui MTS-reagenssia yhdessä elektronien kytkentäaineen, fenatsiinimetosulfaatin, lisättiin kuoppiin ja soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 3 tuntia. Absorbanssi 490 nm: ssä (OD490) mitattiin käyttämällä Flurostar Optima mikrolevylukijalla (BMG Labtech, Cary, NC, USA), jolloin saatiin elävien solujen lukumäärän suhteessa kontrolliin väestöstä. Prosenttiosuus elinkelpoisuuden testiyhdisteen käsitellyt solut ilmaistaan ​​prosentteina kontrolliin verrattuna ( 0,5% DMSO). EY

50-arvot (konsentraatio, joka tarvitaan vähentämään solujen elinkelpoisuutta 50% verrattuna kontrollisoluihin) kunkin koeyhdisteen analysoitiin käyttämällä Graphpad Prism-ohjelmiston, La Jolla, CA, USA. Valikoiva (SI) on rasvahappoesterit floridtsiinia määritellään suhteena sytotoksisuuden (EY

50-arvot) on normaali HP-F solujen kiinteä syöpä HepG2, MDA-MB-231-solujen (SI = EY

50 HP-F solua /EY

50 kiinteällä syöpäsoluja). Näytteet SI arvot ovat yli kolme katsottiin olevan korkea selektiivisyys syöpäsoluissa.

Sytotoksisuusmääritvs

(LDH) on vakaa sytosolinen entsyymi, jota vapautuu, kun solumembraanivaurioita apoptoottista /nekroottisia soluja. LDH-aktiivisuus mitattiin käyttäen CytoTox 96 Non-Radioactive sytotoksisuusmääritys (Promega, Madison, WI, USA), jossa vapautuneen LDH viljelmän supernatanteissa mitataan kytketyssä entsymaattisessa määrityksessä, jolloin muuntaminen tetratsoliumsuolan punaiseen formatsaanituotteeksi. HepG2-soluja (5000/100 ul /kuoppa) ympättiin ja käsiteltiin 100 uM floridtsiinia rasvahappoesterit, floridtsiinia, floretiini, vapaita rasvahappoja vastaavien estereiden tai sorafenibille valmistettiin seerumivapaassa ja inkuboitiin (37 ° C, 5% CO

2) 6 tuntia. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti poistettiin määritystä levy, ja LDH vapautuu soluista elatusaineeseen mitattiin. Maksimaalinen vapautuminen saatiin käsittelyn jälkeen ohjaus solujen 1% Triton X-100: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Apoptoottiset /kuolioituneita prosenttiosuus ilmaistiin käyttämällä kaavaa: (näyte arvo /maksimaalinen vapautuminen) x 100%. Aiemmat tutkimukset toimittaja oli selvästi, että HepG2-soluissa, LDH-aktiivisuuden maksimi pitoisuus on 1-6 h inkuboinnit koska LDH-aktiivisuuden vapautuu soluista on puoliintumisaika on noin 9 h [19]. MTS-määritys tulokset osoittivat, että kaikki rasvahappoesterit floridtsiinia esti 70-80% soluproliferaation 6 h, sen vuoksi, olemme analysoineet LDH-aktiivisuuden 6 h inkuboinnin jälkeen.

morfologinen havainnointi apoptoosin HepG2-soluissa

2.5.1. Morfologiset havainnon alla käänteinen faasikontrastimikroskooppia.

HepG2-soluja yhtä ympättiin 24-kuoppaisille tasapohjaisille kudosviljelylevyille (BD Biosciences), ja sitten sitä käsiteltiin 100 uM rasvahappoestereiden floridtsiinia, floridtsiinia, floretiinihydrolaasi sorafenibin ja DMSO ( 0,5%) kontrolli. 24 tunnin kuluttua hoidon, morfologian HepG2-soluissa havaittiin alle käänteisen vaihekontrastimikroskoopilla (Nikon Eclipse E 100, Nikon, Mississauga, ON, Kanada) ja tallennettiin 400X suurennuksella käyttämällä Infinity digitaalinen mikroskoopilla kamera (Lumenera Corporation, Ottawa, ON, Kanada).

2.5.2. Apoptoosin määritys /kuolion fluoresenssimikroskopialla.

HepG2-solut ympättiin Nunc Lab-Tek kaksi kammio dia (Sigma-Aldrich Canada) tiheydellä 1 x 10

6 solua /kammio. Kiinnittyneet solut käsiteltiin sitten joko 100 uM rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, floretiini, sorafenibi tai DMSO ajoneuvon (kontrollina) 24 tunnin ajan. Objektilasit pestiin laimennettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Poistamisen jälkeen kammio, kukin dia lisättiin 50 ui Dual Detection Reagent, joka sisältää apoptoosin detektointireagenssia (anneksiini V-EnzoGold) ja kuolion detektointireagenssia (7-AAD) 1 x sitomispuskurissa. Näytteitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan pimeässä. Värjäyksen jälkeen solut pestiin sitoutumispuskurilla ja peitetään peitinlasilla. Värjätyt solut havaittiin fluoresenssimikroskoopilla Zeiss Axiovert 200 m käännettyä mikroskooppia (Carl Zeiss, Toronto, ON, Kanada) on suurennos x 40, jossa on suodatin asetetaan anneksiini V-EnzoGold (Ex /Em: 550/570 nm) ja 7 -Aad (Ex /Em: 546/647 nm).

apoptoosin analysointi DNA Fragmentation

HepG2 (1 x 10

5) solut siirrostettiin 24-kuoppaisille viljelylevyille ja annettiin tarttua yli yön. Tämän jälkeen solut käsiteltiin joko 100 uM rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, floretiini, sorafenibi tai DMSO ajoneuvon (kontrollina). Maljoja uudelleen inkuboitiin vielä 24 tuntia. DNA: n fragmentoituminen havaittiin käyttäen ApoTarget Lyhyt apoptoottinen DNA Ladder Detection Kit (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) mukaan valmistajan protokollaa. Periaate liittyy havaitsemalla internukleosomaalisen DNA-fragmentit on muodostettu apoptoosin aikana. Lyhyesti, kelluva kuolleiden solujen ja trypsinisoitiin tarttuneet solut kerättiin ja sentrifugoitiin 1000 rpm: ssä 10 min. Pesun jälkeen laimennettu fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, solut lyysattiin 35 ui TE-lyysipuskuria (a kit komponentti). Lysaattiin, 5 ui entsyymi A (a kit komponentti) lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 10 min. Sen jälkeen 5 ui entsyymiä B (a kit komponentti) lisättiin, sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin 50 ° C: ssa 30 minuutin ajan. DNA saostettiin kanssa ammoniumasetaatin ja absoluuttista etanolia -20 ° C: ssa. Sentrifugoinnin jälkeen (10 min, 12000 rpm) ja ilmakuivaus, DNA-pelletti liuotettiin 30 ui DNA-suspension puskuria. Havaitsemiseksi DNA tikkaat, uutettu DNA-näytteet ajettiin 1,2% agaroosigeelillä, joka sisälsi 0,5 ug /ml geeliä punainen Tris-boraattia-EDTA (TBE) -puskurissa. Elektroforeesin jälkeen geeli kuva on otettu käyttäen Gel Doc 100-järjestelmä (Bio-Rad, Mississauga, ON, Kanada).

määritys kaspaasi-3 Activity

kaspaasi 3 entsyymi oli mitataan kaspaasi 3 kolorimetristä määritystä kit Sigma-Aldrich. HepG2-soluja (2 x 10

6 solua /kaivo), oli kasvatettu 6-kuoppalevyillä, hoidettiin joko 100 uM rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, floretiini, sorafenibi tai DMSO ajoneuvon (kontrollina). Solut hajotettiin ja valkuaispitoisuus solulysaattia kvantitoitiin BCA proteiinimääritysmenetelmällä (Thermo Fisher Scientific Inc., Ottawa, ON, Kanada). Kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin 200 ug solulysaatin käyttämällä kaspaasi-peptidin substraatti, DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), konjugoitu reportteri-p-nitroanaline (ρ-NA) molekyylejä. Pilkkominen Tämän peptidin kaspaasi vapauttaa kromofori, joka mitataan kolorimetrisesti aallonpituudella 405 nm, kuten on kuvattu toimittajan protokollan.

Cell Cycle Analysis

HepG2-solut maljattiin 5 x 10

5 solua per ml kuuden kuoppalevylle. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen (37 ° C, 5% CO

2), soluja käsiteltiin 100 uM rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, floretiinihydrolaasi, sorafenibi tai DMSO ( 0,5%) kontrolli valmistettiin median ja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Trypsinisoitiin, solut pestiin ja sentrifugoitiin 2000 x g 10 minuuttia ja pelletti suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan PBS: ää. Kiinnitys on täydennetty lisäämällä 1,2 ml 70% kylmää etanolia 2 tuntia. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: lla ja sentrifugoitiin 2000 x g 10 minuuttia. Sen jälkeen kun solut suspendoidaan 0,3 ml: aan PBS: ää, 8 ui DNAase RNaasia (10 mg /ml) lisättiin ja inkuboitiin 1 h. Lisäämisen jälkeen, 15 ui propidiumjodidia (0,5 mg /ml), soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Solut analysoitiin solusyklin käyttäen virtaussytometriä FACS Calibur (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) viritysaallonpituudella 488 nm ja emissio 670 nm: ssä. DNA-pitoisuus määritettiin ModFit ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME, USA), joka antoi histogrammit voidaan arvioida solusyklin jakelu.

Mitokondrioiden Energia aineenvaihdunta Analyysit

ATP tason määrityksessä.

Cellular ATP-tasot mitattiin CellTiter-Glo luminescent iinianalyysikitissä saatu Promega mukaan valmistajan ohjeiden. HepG2-solut levitettiin mustalla aidattuja kirkas pohja 96-kuoppalevylle inkuboitiin 100 uM rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, floretiinihydrolaasi, sorafenibi, vapaita rasvahappoja tai DMSO ( 0,5%) kontrolli mediassa. 24 tunnin kuluttua, CellTiter-Glo Reagent yhtä suuri tilavuus soluviljelyelatusaineen läsnä kuhunkin kuoppaan ja sekoitetaan sisältöä 2 min orbitaaliravistelijassa aiheuttaa solujen hajoamista. Luminesenssi todettiin Flurostar Optima mikrolevylukijalla (BMG Labtech) sen jälkeen, kun oli inkuboitu huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan vakauttamiseksi luminoiva signaali. Taso ATP näytteessä esitettiin prosentteina verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

Mitokondrioiden kalvon potentiaali (MMP).

HepG2-solut ympättiin musta aidattuja kirkas pohja 96-steriili flat pohja kudosviljelylevyille (BD Biosciences, USA) tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa (100 ui) ja inkuboitiin CO

2-inkubaattorissa 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Soluja käsiteltiin 100 uM rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, floretiinihydrolaasi, sorafenibi, vapaita rasvahappoja tai DMSO ( 0,5%) kontrolli valmistettiin median ja inkuboitiin 24 tuntia. Värjäysliuos JC-1 valmistettiin PBS: llä ja 5 uM lisättiin kuhunkin kuoppaan. Soluja inkuboitiin edelleen on CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 1 h. Levyn pesemisen jälkeen PBS: llä kaksi kertaa, fluoresenssi mitattiin käyttämällä Fluostar Optima mikrolevylukijalla (BMG Labtech) 535 nm: JC-1 monomeerit ja 590 nm JC-1 aggregaatteja.

Human topoisomeraasi IIα ( topo IIα) katalyyttinen aktiivisuus

topo IIα katalyyttinen aktiivisuus seurattiin elektroforeesilla käyttäen topoisomeraasi II: lääkeaineiden seulonta-kit (TopoGEN, Inc., Columbus, OH, USA). Lyhyesti, 20 ui Reaktioseokset sisälsivät 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl, 100 mM MgCl

2, 20 mM ATP: tä, 300 ug BSA /ml, ja 5 mM ditiotreitolia. Superkierteisen DNA: n (pHOT1 DNA), super- järjestetty sarja määritettiin olevan ihanteellinen tässä määrityksessä, koska se on pieni ja helppo käsitellä, ja on suuri määrä topo IIα tunnustamista elementtejä. Jälkeen 2 ui (0,25 ug) pHOT1 DNA: ta lisättiin, minkä jälkeen lisättiin 100 uM rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, floretiini, sorafenibi tai DMSO ( 0,5%), ohjaus liuottimessa, reaktio käynnistettiin lisäämällä 4 yksikköä (2 gl) ihmisen DNA: topo IIα ja suoritettiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Reaktio lopetettiin lisäämällä 2 ui 10% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) ja sen jälkeen pilkkomalla 2 ui proteinaasi K: n (50 ug /ml) 37 ° C: ssa 15 min hajota entsyymiä. Kun oli lisätty 2 ui latauspuskuria (0,25% bromifenolisinistä ja 50% glyserolia) lisättiin seokseen, näytteet ladattiin 1% agaroosigeelillä. Elektroforeesi suoritettiin 66 V (2 V /cm) ja 5 h TBE-puskurissa käyttäen Biorad elektroforeettinen Gel System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Superkierteistä DNA (pHOT1 DNA) ja rento DNA sisällytettiin elektroforeesiyksikön ajaa merkkiaineita DNA topologia. Sitten geelit värjättiin 0,5 ng /ml geeliä punainen TBE: ssa 30 minuuttia, ja väri poistettiin 15 min tislattuun veteen ennen digitaalisen kuvan hankinnan käyttämällä Gel Doc 100-järjestelmä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Yksi yksikkö topoisomeraasi II: n aktiivisuutta määriteltiin pienin määrä entsyymiä, joka tarvitaan saavuttamaan täydellinen rentoutuminen 0,5 mg superkierremuodosta pHOT1 DNA 30 min 37 ° C: ssa. Esto topoisomeraasi II rentoutumista aktiivisuus tutkittiin samalla menettelyllä käyttämällä neljää yksikköä entsyymiä ja 100 uM testiyhdisteitä. Prosentuaalinen inhibitio laskettiin seuraavalla kaavalla: Jos S

ohjaus on prosentin superkierteisen DNA kontrolliryhmän kaistaa (ilman entsyymiä ja testiyhdisteitä), S

0 on prosentin superkierteisen DNA kaistalle ilman testiyhdisteiden ja S on prosentin superkierteisen DNA kaistalle testiyhdisteiden kanssa ja entsyymin.

Real Time RT-PCR-analyysi

geeniekspressioprofiilien saatiin HepG2 soluista käsitelty DHA estereiden floridtsiinia tai sorafenibi tai DMSO käsitelty kontrolli soluja. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Arum kokonais-RNA: MINIKIT (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). RNA-pitoisuus ja puhtaus määritettiin mittaamalla absorbanssi käyttäen NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). RNA: n eheys arvioitiin formaldehydi agaroosigeelielektroforeesilla. RNA: ta (400 ng), jota käytettiin cDNA: n syntetisoimiseksi käyttämällä RT

2 First Strand kit (SABiosciences, Frederick, MD, USA). RT

2 RNA QC PCR paneelit (SABiosciences, Frederick, MD, USA) käytettiin arvioimaan laadun cDNA näytteitä ennen kuvaamista ihmisen syövän lääkekohteita RT

2 Profiler PCR array (SABiosciences, Frederick, MD, USA). Geeniekspressioprofiilien 84 geenien tutkittiin käyttäen ihmisen syövän lääkekohteita RT

2 Profiler PCR array (PAH-507ZD) Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) käyttäen RT

2 reaaliaikainen SYBR green PCR master mix (SABiosciences, Frederick, MD, USA). Array on myös viisi viite geenit (beeta-2-mikroglobuliini (B2M), hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin 1 (HPRT1), ribosomaalinen proteiini L13a (RPL13A), glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), ja aktiinin beta (ACTB), kolme käänteinen transkription valvonta (RTCs), kolme positiivinen PCR kontrolleihin (PPC), ja yksi genominen DNA-ohjaus (GDC), jolloin jopa 96 määrityksissä. Kun normalisoinnin RPL13A viitaten geenin, geeni-ilmentymisen tasot erikseen arvioidaan käyttämällä kynnysarvon (Ct) arvoja RT

2 profiler PCR array data-analyysi-ohjelmisto (Microsoft Excel-pohjainen ohjelma SABiosciences, Mississauga, oN, Kanada). Se laskee: 1) ACt kunkin geenin = Ct on kiinnostavan geenin – keskimääräinen Ct valittujen viite geenejä 2) ΔΔCt jokaista geeniä yli kaksi ryhmää; ΔΔCt = ACt (Pz-DHA esterin tai sorafenibille) – ACt (valvonta) 3) kertamuutosta kunkin geenin kontrolliryhmän Pz-DHA esterin hoidetussa ryhmässä kuin 2

(- ΔΔCt). RT

2 RNA QC PCR tiedot eivät osoittaneet genomista DNA saastumista (Ct 35 ilmoittaa vähintään GDC) tai epäpuhtaudet RNA-näytteet perustuen Ct arvosta PPC (Ct pitäisi olla 20 ± 2 kummallakin array) ja ei havaittu käänteiskopioinnin inhibition perusteella Ct-arvoja RTC ja PPC. Toistettavuus ylläpidettiin käyttämällä kolmea biologista rinnakkaista kolmesta yksittäisestä kokeesta.

Tilastolliset analyysit

EY

50-arvot laskettiin käyttäen Graphpad Prism 6 ohjelmisto (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Statistical Analysis System (SAS, versio 9.2). Yksisuuntainen ANOVA Tukeyn post hoc vertailuja P 0,001 käytettiin tilastollisessa vertailussa. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona sen keskihajonnan osoitetaan (keskiarvo ± SD).

Tulokset

Antiproliferative vaikutus rasvahappoestereiden floridtsiinia eri syövän ja normaalien solujen

Tässä tutkimuksessa mahdolliset sytotoksiset vaikutukset rasvahappoestereiden floridtsiinia, floridtsiinia, vapaita rasvahappoja ja floretiinia sekä normaali kaupallinen syöpälääkkeitä tutkittiin ihmisen maksasyöpä (HepG2), rinta adenokarsinooma (MDA-MB-231) ja akuutti monosyyttileukemian (THP-1) solulinjat, ensisijainen normaali ihmisen hepatosyyttien ja rotan maksasoluilla käyttäen MTS-määritystä. Määritys osoitti, että rasvahappoesterit floridtsiinia tappaa HepG2, MDA-MB-231 ja THP-1-soluissa samassa määrin ja annoksesta (kuvio 1) ja aika-riippuvaisella tavalla (taulukko 1). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, ja HepG2-soluissa, antiproliferatiivista EY

50 steariinihappo, öljyhappo, linolihappo, α-linoleenihappo, DHA: ta ja EPA esterit floridtsiinia olivat 37,8, 31,5, 29,2, 53,1, 51,9 ja 26,8 uM . EY

50 olivat 35,2, 37,9, 32,3, 63,8, 55,5, ja 26,5 uM MDA-MB-231-soluja. EY

50-arvot näistä estereistä on THP-1-soluja 40,7, 2,1, 6,2, 35,7, 27,3, ja 14,8 uM. Vaikka rasvahappoestereitä floridtsiinia osoitti suuri teho kuin antiproliferatiivisesti yksikään vanhempi molekyylin, floridtsiinia ja yksittäiset rasvahapot osoitti mitään vaikutusta solujen elinkykyä (EY

50 100 uM) HepG2, MDA-MB-231 tai THP -1-soluja. Mielenkiintoista on, että aglykoni floretiinihydrolaasi havaittiin merkittävä antiproliferatiivinen vaikutus (EY

50 39,6 uM) THP-1-soluissa (taulukko 1).

Maksan syöpä (HepG2-solut) ja normaalin ihmisen hepatosyyttien (HP-F) ja rotan hepatosyyteissä (RTCP10) solut altistettiin yhdisteiden testaamiseksi 1, 10, 50, 100 uM 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTS-määritystä. Tiedot esitetään prosentuaalinen elinkelpoisuus suhteessa ajoneuvon vain hoidettuun kontrolliryhmään. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3) edustavat vähintään kolmea erillistä toisistaan ​​riippumatonta koetta. * P 0,05 merkittävästi erilainen kuin ajoneuvon vain ohjata ryhmän (Tukey HSD, P 0,01).

arvioimiseksi spesifisyyden rasvahappoestereiden floridtsiinia syöpäsoluja, huumeiden vaikutus solujen elinkelpoisuus normaalissa maksasoluissa kvantifioitiin sytotoksisuusanalyysin sekä normaali ihmisen (HP-F) ja rotan (RTCP10) maksasolujen. HP-F-soluja käsiteltiin 100 uM ja pienempiä pitoisuuksia kaikkien rasvahappoesterit floridtsiinia, floridtsiinia, rasvahappo, sorafenibi ja floretiinihydrolaasi 24 tuntia (taulukko 1). Rasvahappoestereitä floridtsiinia ei vaikuttanut elinkelpoisuutta normaalin ihmisen hepatosyyttien kanssa EY

50 100 uM ja ovat tyypillisempiä syöpäsolun linjat (taulukko 1, kuva 1). Vuonna 100 uM hoito rasvahappoestereiden floridtsiinia 24 tuntia, rasvahappoesterit floridtsiinia osoitti vähintään myrkyllisyys ( 90% elinkelpoisuus) rotan hepatosyyteissä myös (kuvio 1). Lupaavin ja eniten valikoiva sytotoksista aktiivisuutta havaittiin Pz-DHA ja Pz-EPA estereitä. Rasvahappoestereitä floridtsiinia paitsi Pz-steariinihappo (noin 50% elinkelpoisuus) osoitti myös paljon vähemmän aktiivisuutta vähentää solujen elinkelpoisuuden ( 80% elinkelpoisuus) rotan hepatosyyttien kuin syöpäsolun linjat. Nämä tulokset viittaavat siihen, että rasvahappoesterit floridtsiinia voi olla kohtalainen tai vähän sivuvaikutuksia. Lupaavin ja eniten valikoiva sytotoksista aktiivisuutta detektoitiin Pz-DHA esterin. N

50 (iM) ja SI arvot Pz-DHA HepG2, MDA-MB-231, THP-1 olivat 51,9 (SI = 11,2), 55,5 (SI = 10,5), ja 27,3 (SI = 21,38) (taulukko 1). DHA on yleinen ravinnon omega-3-rasvahappo ja sillä on myös antiproliferatiivisia [20]. Näin ollen, Pz-DHA esterin valittiin geenin ilmentymisen tutkimuksessa, jossa käytettiin ihmisen lääkkeen kohde RT

2-PCR array, koska se osoitti voimakkainta sytotoksinen vaikutus syöpäsoluihin ja oli vähiten myrkyllinen normaaleihin soluihin verrattuna muihin rasvahappoesterit floridtsiinia