Krooninen sairaus

tiivistelmä

PPAR ovat tumareseptoreista aktivoidaan ligandien. Aktivaatio PPARy johtaa vähenemiseen tarttuvuuden ja liikkuvuus joissakin syövän malleissa. PPARy transkriptionaalinen aktiivisuus voidaan säätelee negatiivisesti JNK-välitteisen fosforylaation. Me olettaisi, että käyttämällä aineita kykenee estämään JNK toiminta voisi tehostaa PPARy ligandeihin. Analysoimme vaikutukset rosiglitatsonin (PPARy ligandi) ja AS601245 (selektiivinen JNK estäjä) yksin tai yhdessä tarttumiseen ja migraatio CaCo-2, HT29, ja SW480 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja tutkitaan, kautta mikrosiruanalyysi, osallistuvia geenejä nämä prosessit. Soluadheesio ja muuttoliike oli voimakkaasti inhiboivat rosiglitatsonin ja AS601245. Yhdistetty hoito kaksi yhdistettä johti pieneni enemmän tarttuvuutta ja muuttoliike kapasiteettia. Affymetrix analyysi Caco-2-solut paljasti, että jotkut geenit, jotka olivat erittäin moduloidaan yhdistetty hoito voisi olla mukana näissä biologisia vasteita. Rosiglitatsoni AS601245 ja yhdistelmähoito alassäädetty ilmentymistä fibrinogeenin ketjujen kaikissa kolmessa solulinjoissa. Lisäksi rosiglitatsoni, yksin tai yhdessä AS601245, aiheutti lasku fibrinogeenin julkaisu. ARHGEF7 /β-PIX geeni oli erittäin alassäädetty yhdistetyn hoidon ja western blot-analyysi osoitti, että β-PIX proteiini alas-moduloidaan CaCo-2, HT29 ja SW480-solut, myös. Solujen transfektio β-PIX-geenin täysin kumosi inhiboiva vaikutus solujen vaeltaminen, määritetään rosiglitatsoni, AS601245 ja yhdistetty hoito. Tulokset osoittivat, että β-PIX-proteiini on osallisena inhibition solumigraation ja ylläpitää positiivinen vuorovaikutus PPARy-ligandit ja anti-inflammatorisia aineita ihmisissä.

Citation: Cerbone A, Toaldo C, Minelli R, Ciamporcero E , Pizzimenti S, Pettazzoni P, et ai. (2012) Rosiglitatsoni ja AS601245 Vähennä Cell Adhesion and Migration kautta modulaatio Erityiset Gene Expression in Human koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 7 (6): e40149. doi: 10,1371 /journal.pone.0040149

Editor: Frederic Andre, Aix-Marseille University, Ranska

vastaanotettu: 22 helmikuu 2012; Hyväksytty: 1 kesäkuu 2012; Julkaistu: 28 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Cerbone et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Regione Piemonte (https://www.ricerca-sanitaria-finalizzata.it/) ja Universitá degli Studi di Torino (https://www.unito.it/unitoWAR/page/istituzionale/ricerca1/Ricerca_601) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: AC ja GR työskentelee MerckSerono Ivrea – RBM SpA Ei ole patentteja, tuotteita kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

PPARy kuuluu tumareseptorisuperperheen koostuu ryhmä noin 50 transkriptiotekijöiden mukana monissa eri biologisissa prosesseissa ja pidetään tärkeänä tavoitteet uusien lääkkeiden kehittämisessä [1]. PPARy-aktivaation agonistit säätelee lipidien varastoinnin adypocytes [2], estää proliferaatiota ja stimuloi niiden erilaistumista ja apoptoosia useissa syöpäsolujen [3]. Täten PPARy-ligandit on pidetty mahdollisina lääkkeinä eri syöpätyyppien. Endogeeninen PPARy ligandeihin kuuluvat tyydyttymättömien rasvahappojen ja useita prostanoidit, kuten 15-deoksi-prostaglandiini J2 (15d-PGJ2) ja 15-hydroksi-eicosatetranoic happo (HETE), jotka ovat arakidonihapon aineenvaihduntatuotteet [4]. Synteettiset ligandit käsittävät insuliini-herkistävä thiazolindinedione (TZD) (troglitatsoni, pioglitatsoni ja rosiglitatsoni), joita käytetään diabetes mellituksen hoitoon [5] – [6] ja useat steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID), erityisesti indometasiini ja ibuprofeeni, jotka ovat heikkoja PPARy-agonistit suurilla mikromolaarisella pitoisuuksilla [7].

herkkyys eri solutyyppejä PPARy ligandit riippuu enimmäkseen PPARy ilmaisun ja toimintaa. Korkea PPAR ilmaisun on raportoitu rasva- ja paksusuolen kudoksiin. Jälkimmäinen on tärkeä kudos ilmentävät PPARy epiteelikudoksissa [1]. Tästä huolimatta havainto, useita tutkimuksia tutkivat PPAR ihmisillä paksusuolen syöpä on rajoitettu. Yksilöiden paksusuolen syöpäpotilaiden, immunohistokemiallinen analyysi osoitti korrelaation PPARy ja solukierron liittyviä molekyylejä, mutta ei yhdistys havaittu välillä PPARy ja potilaan eloonjääminen [8]. Viime aikoina Ogino ja yhteistyökumppanit osoittivat, kolorektaalisyövässä potilaille, että ilmaus PPAR liittyy hyvä ennusteeseen [9] mukaisesti edellisen ilmoittamat tiedot Jackson ja yhteistyökumppanit [10], joka osoitti, että PPARy (mRNA ja proteiini) ilmentymistasot merkittävästi masentunut peräsuolen syöpäsoluissa verrattuna sovitetun ei-pahanlaatuista kudosta. Eläinkokeissa puute suoliston PPARy liittyi parannettu tuumorigeenisyystesti ohutsuolessa ja paksusuolessa ApcMin /+ hiirillä [11]. Vastaavasti, hiirimalleissa paksusuolen syöpä, PPARy-agonistit estivät kasvaimen kasvua tai paksusuolen karsinogeneesin [12] – [14]. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että PPARy-ligandit voivat estää peräsuolen syövän etenemiseen ja se voi olla tärkeä terapeuttinen kohde.

. Erilaisten annosten vaikutuksen rosiglitatsonia (10, 50, 100, 200, 250 uM) on CaCo-2, HT29 ja SW480-solujen lisääntymisen; B. vaikutus eri annosten AS601245 (0,1, 1, 2,5, 5, 10 uM) on CaCo-2, HT29 ja SW480-solujen lisääntymisen. Arvot havaitaan mittaamalla luminesenssi vapautuu metabolisesti aktiiviset solut. Arvot ilmaistuna RLU ovat keinoja S.D. Kolmen erillisen kokeen.

Yksi tärkeimmistä syövän etenemistä, on hankinta invasiivisen käyttäytymisen, monivaiheinen prosessi, johon liittyy syöpäsolujen tarttumista vassel endoteeliin ja liikkuvuuden kautta soluväliaineen. On osoitettu, että PPARy-agonistit vaikuttavat näitä parametreja ei vain ohjaus solun tulehduksen [15], mutta myös useita erilaisia ​​syöpäsoluja [16], [17].

Lisäksi ligandia sitova, PPARy genomista aktiivisuus voidaan moduloida solujen eri prosesseissa.

Itse mitogeeniset hormonit, kasvutekijät ja pro-inflammatorisia signaaleja ovat kaikki tunnettuja vähentää kykyä PPARy vastata ligandin stimulaation. Mekanismit, jotka kontrolloivat tämän alas sääntely ovat monimutkaisia ​​ja käsittävät fosforylaatio [18], ubikitinaa- [19], sumoylation [20] ja sytoplasman shuttling [21]. Keskeinen alaspäin säätäminen mekanismi käsittää fosforylaatiota eri mitogeeni aktivoitua kinaasit (MAPK), jotka ovat keskeisiä signalointi komponentteja solujen jakautumisen, erilaistumisen selviytymistä, stressin vastaus ja apoptoosin [22]. Erityisesti on raportoitu, että c-Jun-terminaali- kinaasin (JNK) fosforyloi PPAR ja säätelee negatiivisesti sen transkriptioaktiviteettia [23]. Perusteella näiden havaintojen me olettaisi, että käyttämällä aineita kykenee estämään JNK toiminta voisi tehostaa PPARy ligandeihin. AS601245 [1,3-bentsotiatsol-2-yyli (2 – {[2- (3-pyridinyyli) etyyli] amino} -4-pyrimidinyyli) asetonitriili; JNK estäjä V] on valittu tehokas ja selektiivinen JNK estäjä, jolla on tulehdusta ominaisuuksia [24], ja sitä on käytetty esillä olevassa työssä arvioida sen osallistumista anti-syöpää aiheuttavia vaikutuksia näyttämä rosiglitatsoni koolonkarsinoomasoluissa. Erityisesti olemme tutkineet vaikutuksia rosiglitatsonin ja AS601245, yksin tai yhdessä, tarttumiseen ja migraatio ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, ja tutki geenien mukana näissä prosesseissa, kautta mikrosiruanalyysi (Affimetryx GeneChip).

Vaikutus eri annosten rosiglitatsonin (0,01, 0,1, 1, 10, 50 uM), AS601245 (0,01, 0,1, 1, 10, 50 uM) ja yhdistetty käsittely CaCo-2, HT-28 ja SW480 solun tarttumisen HUVEC. Soluja käsiteltiin tai ei ole huumeita 24 tuntia, kerättiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan HUVEC yksisolukerrosten. Data esitetään prosentteina adheesion estäminen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja. Valvonta-arvo adheesio oli noin 55 ± 6 solua mikroskooppikenttää kohden (n = 6) kaikissa solulinjoissa. Arvot on keskiarvo ± SD, 3 erotettu kokeita. Varianssianalyysi: *

p

0,05, **

p

0,01 vs. kontrolli; # P 0,05 vs rosiglitatsoni; ## P 0,01 vs rosiglitatsoni; § 0,01 vs molemmat yhdisteet.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

käyttö HUVEC hyväksyttiin eettisen komitean ”Presidio Ospedaliero Martini ”Torinon ja mukaisesti suoritettujen Helsingin julistuksen. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Soluviljelmä ja hoidot

CaCo-2, SW480 ja HT29 paksusuolen syövän solut saatiin European Collection of Cell Cultures (ECACC), ja viljeltiin 37 ° C ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2-ilmaa. ECACC tarjoaa täyden laadunvalvonta ja todentaminen menettelyjä solulinjoista. Nämä solulinjat on valittu, koska ne edustavat kolmea solun malleja eri potentiaalit invaasiokyvyn: korkeampi HT29, keski in Caco-2-solut ja pienempi SW480-soluissa. Soluja kasvatettiin D-MEM-alustassa (CaCo-2, ja SW480-solut) tai McCoyn elatusaineessa (HT29-solujen), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, HyClone, Italia), 2 mM glutamiinia, 1% ei olennaisia ​​aminohappoja liuosta ja 1% antibioottia seosta (penisilliini-streptomysiiniä) (Sigma, Milano, Italia).

tuumorin muuttoliikkeen jonka Boyden kammion määritystä. CaCo-2, HT29 ja SW480-solut maljattiin apikaalisella puolella Matrigel-päällystetty suodattimet seerumittomassa väliaineessa, jota oli täydennetty lääkkeiden eri pitoisuuksilla (0,1, 1, 10, 50 uM rosiglitatsoni, 0,1, 1, 10, 50 uM AS601245 ) ja yhdistyksen lääkkeiden eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. Kemoatrak- hyödynnetään oli 20% FCS väliaineessa laitetaan basolateraalisessa kammiossa. Solut siirtynyt pohjan suodattimien värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin (5 kentät kunkin kolmena kappaleena suodattimet) käyttämällä käännettyä mikroskooppia. Ohjaus muuttoliike oli 45 ± 8 solua /mikroskooppikenttää varten Caco-2-soluihin, 50 ± 5 solua /mikroskooppikenttää varten HT29 ja 40 ± 3 solua /mikroskooppikenttää varten SW480. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n = 5) ja inhibitioprosentti verrattuna solujen migraatiota alttiina ajoneuvon (1% DMSO). Varianssianalyysi *

p

0,05, **

p

0,01 vs. kontrolli;

p

0,05, aa

p

0,01 vs rosiglitatsoni; b

p

0,05, bb

p

0,01 vs AS601245.

Hoidot kanssa rosiglitatsonin ja AS601245 [1,3-bentsotiatsol-2-yyli – (2 – {[2- (3-pyridinyyli) etyyli] amino} -4-pyrimidinyyli) asetonitriili; JNK-inhibiittori V] (SPRI, Geneve, Sveitsi) tehtiin suspendoimalla lääkkeitä DMSO. Pitoisuus ajoneuvon kulttuuri ei ylittänyt 1%. Lisäksi viljelmät, käsiteltiin 1% DMSO: ta yksinään, suoritettiin jättää ajoneuvon vaikutuksia.

HUVEC eristettiin, kuten on kuvattu muualla [25] ja viljeltiin gelatiinilla päällystetyille viljelyastioihin M199, johon on lisätty 20% lämmöllä -inactivated FCS, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 5 UI /ml hepariinia, 12 ug /ml naudan aivojen uutetta, ja 200 mM glutamiinia. HUVEC hyödynnetään II-V kohtia.

Cell Proliferation ja elinkelpoisuus

Solulisääntyminen arvioitiin kit ”CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys” (Promega, Milano, Italia). Tämä määritys havaitsee luminesenssi vapautuu metabolisesti aktiiviset solut. Kvantifiointi luminesenssi ilmoitettiin RLU (suhteellinen Light Unit). Proliferaatioon kokeissa, käsittelyt tehtiin lisäämällä lääkkeiden (eri pitoisuuksina) soluihin ympättiin noin 4000 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle.

Geeniekspressio CaCo-2-soluja käsiteltiin 50 uM rosiglitatsoni, 0,1 uM AS601245 ja yhdistyksen näiden kahden yhdisteiden (rosiglitatsoni + AS601245) havaittiin mikrosiruanalyysillä 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Venn-kaavio esittää joukko geenejä moduloidaan hoitoja.

adheesiomäärityksellä

HUVEC kasvatettiin yhtenäisiksi 24-kuoppalevyillä, pestään, ja jätetään paikalleen yksi päivä M199 plus 10% FCS. Kaupalliset loisteputki solu linkkerin mini kit PKH67 (Sigma) käytettiin kalvon merkintöjä koolonkarsinoomasoluissa. Värjäytyminen tehokkuutta seurattiin fluoresenssimikroskopialla. Paksusuolen syövän soluja (CaCo-2, SW480 ja HT29) käsiteltyä tai käsittelemätöntä (24 tuntia), rosiglitatsonilla tai AS601245 (50-0,01 uM) tai molempia aineita, otettiin talteen ja merkitty kuten edellä on kuvattu, ja päällystetty (1-3 x 10

5 solua /kaivot) lopputilavuudessa 0,25 ml M199 käsittelemättömien HUVEC ja jätetään paikalleen 1 h 37 ° C: ssa 5% CO

2. Inkuboinnin jälkeen tarttumattomat solut poistettiin pesemällä 3 kertaa 1 ml M199-väliainetta. Keskellä kunkin kuopan analysoitiin fluoresenssi kuva-analyysillä [26]. Kiinnittyneet solut laskettiin käyttäen Image Pro Plus Software mikro-kuvantaminen (Media Cybernetics, versio 5.0). Yhden kokeellisen pistettä testattiin neljänä, ja keskivirhe neljän toiston oli alle 10% kaikissa tapauksissa.

Fibrinogeeni vapautumista Caco-2-solut altistettiin eri pitoisuus (01.10.50 uM) rosiglitatsoni, 0,1pM AS601245 tai molempia aineita (50 uM rosiglitatsoni ja 0,1 uM AS601245). Tiedot ilmoitetaan prosentteina fibrinogeenin vapautumisen suhteen säätöarvon ja on keskiarvo ± SD 3 erillisestä kokeesta. Varianssianalyysi: **

p

0,01 kontrolliryhmään verrattuna, # p 0,05 vs rosiglitatsonin.

matrigeelin migraatiokokeessa

kemotaksiamäärityksessä syövän solut suoritti Boyden kammiomenetelmä käyttäen suodatinta 8,2 mm ja 5,0 mm: n huokoskoon (Neuro Probe, Inc .; BIOMAP snc, Milano Italia) päällystetään 0,1 ul /ml matrigeelin (BD matrigeelin ™ Matrix, BD Biosciences, Oxford , UK). Lyhyesti, alustaa, joka sisälsi 20% FCS, kuten kemoattraktantti asetettiin alempiin kuoppiin. Aluksi CaCo-2, HT29 ja SW480-soluja (loppupitoisuudessa 5 x 10

4 solua /ml) suspendoitiin ylemmän kuoppiin (noin 4000 solua /kuoppa varten HT29 ja 8000 solua /kuoppa SW480 ja CaCo- 2) seerumittomassa väliaineessa, jota oli täydennetty lääkkeiden eri pitoisuuksilla (0,1 uM 50 uM sekä aineet) ja yhdistyksen lääkkeiden eri pitoisuuksilla. Migraatiota ohjaus käsittelemättömien solujen, solujen alttiina ajoneuvon (1% DMSO) ja valvonta- ja käsiteltyjen solujen altistettiin mitomysiini C (50 ug /ml) (Sigma), analysoitiin myös. Kammion inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia. Kemotaksista kvantifioitiin laskemalla värjäytyneiden solujen, jotka kulkeutuivat alemmalle puolelle suodattimen käyttämällä optista mikroskooppia (suurennos x 100). Värjätyt solut lasketaan keskimääräinen lukumäärä solua per 5 satunnainen kentät kutakin määritystä varten. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina inhibition käsiteltyjen solujen vs. siirtymä mitataan solussa altistettiin 1% DMSO: ta. Näitä olosuhteita ylläpidettiin transfektoituja soluja, myös.

Fibrinogeeni Release määritys

Fibrinogeeni (FBG) vapautuminen elatusaineissa analysoitiin käyttämällä AssayMax ihmisen fibrinogeeniä (FBG) ELISE Kit Assaypro (St. Charles, MO, USA) valmistajan protokollan.

CaCo-2-soluja kasvatettiin pulloissa ja ympättiin pitoisuudella 4 x 10

6 /pullo. Solut, altistetaan rosiglitatsoni (50, 10 ja 1 uM), AS601245 (0,1 uM) tai molemmat aineet (50 uM rosiglitatsoni ja 0,1 uM AS601245), kerättiin talteen 24 tunnin kuluttua alusta kokeen ja sentrifugoitiin. Kerätyt supernatantteja inkuboitiin 96-kuoppaisella levyllä, joka on päällystetty polyklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen ihmisen FBG. FBG näytteissä oli kerrostettu immobilisoitu polyklonaalinen vasta-aine ja biotinyloitu polyklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen ihmisen FBG, joka on tunnustettu streptavidiini-peroksidaasikonjugaatti. Kaikki sitoutumaton materiaali pestiin pois ja peroksidaasientsyymin substraattia lisättiin. Värin kehittyminen lopetettiin ja värin voimakkuus mitattiin mikrolevylukijalla aallonpituudella 450 nm.

RNA uuttaminen ja Array Hybridisaatio

CaCo-2-soluja käsiteltiin ajoneuvon (1% DMSO) tai 50 uM rosiglitatsoni tai 0,1 uM AS601245 tai rosiglitatsonia plus AS601245 24 tunnin ajan, ja kokonais-RNA: 3 biologisen rinnakkaista kunkin hoidon eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Milano, Italia). Näytteet käsiteltiin DNaasi jotta vältetään genomista saastuminen. Laatu saadun RNA määritettiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA pitoisuus normalisoitiin käyttäen Thermo Scientific NanoDrop ™ ND-1000 spektrofotometrillä. RNA näytteitä kustakin rinnakkaisten analysoitiin käyttämällä Affymetrix GeneChip- Human Genome U133A plus 2,0 pelimerkkejä (Affymetrix). RNA vahvistus, kaksijuosteinen cDNA-synteesi ja sukupolven biotiini-leimattu cRNA in vitro transkriptio (IVT) suoritettiin mukaisesti valmistajan protokollan avulla Affymetrix sarjat. Lopullinen cDNA tarkastettiin laadun ja määrän ennen pirstoutuminen ja siru hybridisaatio. Jokainen siru pestiin ja värjättiin käyttäen Fluidics asemalle 450 (Affymetrix). Fluoresenssin intensiteetin kullekin siru oli kaapattu kanssa Affymetrix GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix). GCOS-ohjelmiston versio 1.2 (Affymetrix) käytettiin määrittämään anturin solu ja laskee intensiteetin jokaisen solun. CEL tiedostoja syntyy, joka sisältää yhteenvedon intensiteetit kustakin koetin, analysoitiin seuraavien bioinformatiikka. Olemme ensinnäkin arvioinut yleistä tietojen laatua käyttämällä R /Bioconductor. Sitten me ladattu aineisto osaksi Rosetta Resolveri tietojen normalisointi, sukupolvi ilmaisun arvoista, ja tilastollinen analyysi. Expression arvot kaikissa hoitoryhmissä saatiin suhde versus negatiivinen kontrolli (1% DMSO). Differential analyysit parien välillä ryhmien suoritettiin 1-suuntainen ANOVA, jonka jälkeen Benjamini-Hochberg useita testaus korjauksen (False Discovery Hinta-FDR katkeaminen 1%) ja Student-Newman-Keuls post hoc-analyysissä. Lopuksi ilmentyvät eri geenit analysoitiin Ingenuity Pathway Analyysi ohjelmistoversio 7.5 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Realtime RT-PCR

Vahvista Affymetrix tulokset valitsimme 5 geenejä, jotka olivat osoittaneet 2-kertainen muutos ilmaisun edelleen tutkittava reaaliaikaisen PCR erillisessä kokeessa. Kaksi näistä (GANAB ja MT2A) havaittiin kasvanut Affymetrix analyysiin, kun taas toiset kaksi havaittiin vähentynyt (FGA ja FGFR2). Lopuksi, yksi geeni (ARHGEF7) havaittiin olevan erittäin vähentynyt yhdistelmähoito, vain. Lisäksi olemme analysoineet ilmentymisen kolmen fibrinogeeniketjua in CaCo-2, HT29 ja SW480-soluissa. Soluja käsiteltiin 1% DMSO kuin ajoneuvo tai 50 uM rosiglitatsonin, 0,1pM AS601245 tai rosiglitatsonia plus AS601245 24 tuntia; kokonais-RNA: 3 biologisesta rinnakkaista kunkin hoidon eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Milano, Italia), sitten kokonais-RNA kvantifioitiin kanssa NanoDrop (Thermo tieteellinen) spektrofotometriä mittaamaan RNA-pitoisuus ja analysoitiin Agilent 2100 Bioanalyser seurata RNA laatua ja eheys. Kokonais-RNA käänteiskopioitiin cDNA: ta 20 ui reaktiossa käyttäen TaqMan® High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, jonka Applied Biosystems. 500 ng kokonais-RNA: ta käytettiin lähtöaineena kustakin näytteestä. Kunkin Realtime PCR-reaktiossa, käänteistranskriboidusta näytettä käytettiin templaattina. Voit testata määritys lineaarisuuden, cDNA allas oli ensin laimennossarja. Reaktiot suoritettiin, kun läsnä oli kaupallinen TaqMan® Gene Expression määritykset ja 1 x pitoisuus TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Kohde-mRNA kvantifioitiin käyttäen ABI 7900 HT Fast RealTimen PCR -järjestelmää (Applied Biosystems). Alukkeet hankkia Applied Biosystems: GANAB (glukosidaasi, alfa-, neutraali AB, Hs00929274_m1), MT2A (metallotioneiini 2A, Hs02379661_g1), FGA (fibrinogeeni alfa-ketjun, Hs00241027_

m1), FGB (fibrinogeenin beeta-ketju Hs00905942_

m1 ) FGG (fibrinogeeni gamma-ketjun Hs00241037_

m1) FGFR2 (fibroblastikasvutekijäreseptori 2, Hs01552926_m1) ja ARHGEF7 (Rho guaniininukleotidiä vaihto tekijä (GEF) 7, Hs00388776_m1). TaqMan-koettimet leimattiin 5’reportterivärin (FAM, 6-karboksifluoreseiini) ja 3 ’vaimenninväri (TAMRA, 6-karboksitetrametyylirodamiini). RealTimen PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina microamp optisen 384-kuoppalevyille kokonaistilavuudessa 10 pl /kuoppa. Tiedot analysoitiin ABI Sequence Detection System (SDS) ohjelmistoa käyttäen suhteellisen kvantifioinnin. Taitteen muutokset määräytyvät ΔΔCt kuvatulla menetelmällä Applied Biosystems User Bulletin nro 2. Lyhyesti, kunkin tason kohde-mRNA normalisoitiin tasolle 18S ribosomaalisen RNA: n (siivous geeni), jotta saadaan ACt ja sitten ΔΔCt laskettiin vastaan ​​DMSO hoitoon.

Western blot-analyysi β-PIX ilmentyminen CaCo-2, HT29 ja SW480-soluja, käsiteltiin 24 tunnin ajan eri pitoisuuksilla rosiglitatsonia (1, 10, 50 uM) , AS601245 (0,1, 1, 10) ja yhdistetty käsittely 50 uM rosiglitatsoni ja 0,1 uM AS601245. Yhtä suuri kuin proteiinin loading vahvistettiin altistamalla kalvot anti-β-aktiini-vasta-aine. Kvantifiointi valkuaistuotteiden (oikealla) suoritettiin densitometrisellä skannauksen. Aineisto on normalisoitu käyttämällä β-aktiini-signaali ja ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (A) Western blot-analyysi Caco-2-solut ja suhteellinen densitometrinen arvoja. (B) Western blot-analyysi HT29 ja suhteelliset densitometrinen arvoja. (C) Western blot-analyysi SW480-solujen ja suhteelliset densitometrinen arvoja. Varianssianalyysi: * p 0,05, **

p

0,01 vs. kontrolli tai rosiglitatsoni käsitellyt solut.

β-PIX Transfektio

β-PIX Plasmidit osti Qiagen (EIM0195303), tuotettu Escherichia coli Competent Cells (Promega) tavanomaisten menettelyjen mukaan ja puhdistettiin käyttämällä EndoFree plasmidin Midi Kit (Qiagen). Ohimeneviä transfektion kokeissa, CaCo-2, HT29 ja SW-480-soluja kasvatetaan kuuden kuoppaiseen levyyn 80% konfluenssiin, 6 ug puhdistettua plasmidin rakenteet transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden. p-PIX ilmentyminen arvioitiin 24 tuntia transfektion jälkeen Western blot. Negatiivinen kontrolli, pQE-TriSystem-6 Vector (Qiagen) käytettiin. Vähintään kolmen erillisen kokeen kullekin tilalle tehtiin.

Tilastollinen analyysi

2-tie ANOVA suoritettiin leviämisen, tarttuvuus, muuttoliike, fibrinogeeni release testejä ja densitometrinen analyysi Western blot.

tulokset

rosiglitatsoni ja AS601245 vaikuttaa solujen Proliferation

Alustavat kokeet osoittivat, että solujen lisääntymistä vaikuttivat rosiglitatsonin ja AS601245 asti 96 tuntia, joka riippuu pitoisuudesta tavalla kaikissa kolmessa riviä koolonkarsinoomasoluissa testattu (Fig. 1). Kuitenkin lääkeannoksia tehokas inhiboimaan solujen proliferaatiota 50%: lla (IC 50) oli melko korkea. Caco-2-solut, IC50 oli 150 ± 25 uM rosiglitatsonin ja 2,5 ± 1 uM AS601245. Annokset pystyy vähentämään soluproliferaatiota 20% (IC20) oli 50 uM ± 12 rosiglitatsonia ja 0,1 uM ± 0,1 varten AS601245. IC50 ja IC20 annokset olivat hyvin samankaltaisia ​​kaikissa kolmessa testatuissa solulinjoissa. IC20 rosiglitatsonia ja AS601245, määritelty Caco-2-soluja, käytettiin sitten microarray kokeiluja tässä solulinjassa.

Cell Adhesion and Migration jälkeen Rosiglitatsoni ja AS601245 Hoidot

vuonna adheesiomääritystä suoritettiin 24 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta, lisäämällä 50 uM rosiglitatsonin yksin vähensi soluadheesion HUVEC noin 55% Caco-2-solujen ja 58% ja 59% vuonna HT29 ja SW480-soluja, vastaavasti (Fig. 2). Estämisen taso alennettiin asteittain käsittelemällä solut pienemmillä rosiglitatsonia. Ensimmäisessä koesarjassa, soluadheesion kapasiteettia määritettiin HCT116-solut, myös. Tässä solulinjassa, solu- adheesio estyi 71% käsittelyn jälkeen 50 uM rosiglitatsoni ja 59% käsittelyn jälkeen 10 uM rosiglitatsonin (tuloksia ei ole esitetty). Käsittely 50pM AS60124 vähennetään tarttumista noin 55, 72 ja 60% CaCo-2, HT29 ja SW480-soluissa, vastaavasti. Eston prosenttiosuus pieneni vähitellen käsittelemällä soluja pienempiä annoksia AS601245 ja käsitellään 0,1 uM AS601245 ei merkittävästi vaikuttanut tämän parametrin. Voit tarkistaa, onko yhdistettyä hoitoa rosiglitatsonin ja AS601245 voi olla additiivinen vaikutus vähentää solujen tarttumisen, 0,1 uM AS601245 liittyi yhä rosiglitatsonia. Kaikissa kolmessa solulinjoissa yhdistelmä 0,1 uM rosiglitatsonia 0,1 uM AS601245 osoitti additiivinen vaikutus, joka vähentää solujen adheesiota. Yhdistetty hoito 0,1 uM AS601245 kanssa suurempia annoksia rosiglitatsoni lisäsi vaikutusta rosiglitatsonin yksin saavuttaa enimmäismäärä eston. Kaikki kolme soluista osoitti samanlaisen vastauksen hoitoja.

. Western blot ilmentyminen CaCo-2, HT29 ja SW480-solujen valvontaa ja transfektoitiin tyhjällä plasmidin kanssa ja plasmidin kuljettaa β-PIX-geenin. B. estäminen kasvainsolun invaasiota jonka Boyden kammio määritystä soluissa transfektoiduissa kanssa β-PIX kuljettaa plasmidin. Ohjaus solut ja transfektoidut solut maljattiin apikaalisella puolella Matrigel päällystettyjä suodattimia seerumittomassa väliaineessa, jota oli täydennetty lääkkeitä eri pitoisuuksina (10, 50 uM rosiglitatsoni, 0,1, 1, 10, 50 uM AS601245) ja yhdistyksen eri lääkeainepitoisuudet 24 tuntia. Kemoatrak- hyödynnetään oli 20% FCS väliaineessa laitetaan basolateraalisessa kammiossa. Solut siirtynyt pohjan suodattimien värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin (5 kentät kunkin kolmena kappaleena suodattimet) käyttämällä käännettyä mikroskooppia. Ohjaus muuttoliike oli 45 ± 8, 51 ± 8 ja 33 ± 4 solua /mikroskooppikenttää varten Caco-2-, HT29, SW480-soluissa, vastaavasti, ja 49 ± 5, 50 ± 6 ja 30 ± 6 solua /mikroskooppikenttää varten Caco-2- , HT29 ja SW480-soluissa, vastaavasti, transfektion jälkeen β-PIX kuljettavat Plasmidit ja tyhjä plasmidin. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n = 5) ja inhibitioprosentti verrattuna kontrolliryhmään siirtoa.

Migration tutkittiin CaCo-2, HT29, ja SW480-solulinjat. Lukumäärä siirtynyt solua /mikroskooppikenttää käsittelemättömissä kontrolli-soluissa oli 45 ± 8 Caco-2-soluihin, 50 ± 3 HT29 ja 40 ± 3 SW480 soluja. Arvo migraation kontrollisolujen alttiina ajoneuvon (1% DMSO) oli 44 ± 6 CaCo-2-soluilla, 51 ± 8 HT29 ja 40 ± 5 SW480-soluissa. Lisäksi jättää että saadut tulokset käsitellyissä soluissa voi riippua soluproliferaatioon, analysoimme soluvaelluksen käsittelemättömissä soluissa ja soluissa käsiteltiin 24 tuntia ja korkeimmat pitoisuudet rosiglitatsonin tai AS601245 (50 uM) läsnäollessa mitomysiini C. Tulokset saatu osoitti, että siirtyminen arvot olivat samanlaiset läsnäollessa tai ilman sitä mitomysiini C: n (solua /mikroskooppikenttää oli 45 ± 8 ohjaus CaCo-2-soluilla ja 44 ± 6 CaCo-2 kontrollisoluja käsiteltiin mitomysiini; 50 ± 3 valvonta- HT29 ja 49 ± 5 soluille käsiteltiin mitomysiini; 40 ± 3 valvontaa SW480-solujen ja 42 ± 8 solua käsiteltiin mitomysiini). Prosenttiosuudet eston rosiglitatsonin käsitellyissä soluissa oli 65% ja 64% varten Caco-2-soluja, 79% ja 80% HT29 ja 60% ja 63% varten SW480, kanssa ja ilman mitomysiini, vastaavasti; prosenttiosuudet inhibition AS601245 käsiteltyjen solujen olivat: 55% ja 50% CaCo-2-soluilla, 80% ja 75% HT29 ja 92% ja 87% ja SW480-solujen kanssa ja ilman mitomysiini, vastaavasti).

kuviossa. 3 raportoidaan siirtymisen saadut tulokset käsitellyissä soluissa rosiglitatsoni, AS601245 ja molemmat aineet, ilmaistuna inhibition prosenttimäärä suhteessa solujen migraatiota altistettu ainoastaan ​​ajoneuvon (1% DMSO). Siirtyminen inhiboitui merkittävästi 10 ja 50 uM rosiglitatsonin ja AS601245 kaikissa kolmessa solulinjoissa. Käsittelyt eri yhdistelmiä keskittymien 50pM molempien yhdisteiden tuottivat additiivisen vaikutuksen estämisessä solujen vaeltamiseen. Yhdistetyt hoito pitoisuus on 50 uM rosiglitatsonin tai AS601245 eivät tuottaneet additiivisia vaikutuksia (tuloksia ei ole esitetty), luultavasti koska nämä pitoisuudet, yksin tuotti inhibition prosenttimäärä lähellä tasanne.

Microarray Analysis of Gene Expression Caco-2 solut

sen analysoimiseksi, onko solu vasteita käsittelyt rosiglitatsonin, AS601245 tai molempien aineiden olivat seurausta tietyn geenin koulutusjakson modulaatio, me suoritti mikrosiruanalyysi käyttämällä Affimetryx GeneChip- alustalla. Koska solu- adheesion inhibitiolla ja siirtymää rosiglitatsoni ja AS601245 oli hyvin samanlainen kaikissa kolmessa solulinjoissa paksusuolen syöpä tutkitaan me valita CaCo-2-solulinja, joka suorittaa tämän analyysin 24 tunnin kuluttua hoitoja. Käytetyt annokset tässä tutkimuksessa olivat ne pystyvät indusoimaan IC20 esto Caco-2-solujen lisääntymistä (50 uM rosiglitatsoni ja 0,1 uM AS601245).

määrä geenejä merkittävästi moduloidaan rosiglitatsonin ja AS601245 oli hyvin korkea . Täydellinen luettelo geenien moduloidaan rosiglitatsonin, AS601245 ja kombinaatio raportoidaan olevat tiedot S1. Venn kaavio (Fig. 4) osoittaa, että rosiglitatsoni moduloitu 1260 geenejä, AS601245 moduloidaan 3245 geenejä ja yhdistetyt hoidot moduloidun 1188 geenejä. Niistä geenit vaikuttavat rosiglitatsonin yksinään tai AS601245 yksin, 1118 olivat yleisiä molemmat kaksi ryhmää. Yhdistetty hoito vaikutti 735 geenit, jotka olivat läsnä sekä rosiglitatsonin ja AS601245 ryhmiä, ja 173 geenejä, jotka eivät vaikuttaneet myöskään rosiglitatsonin tai AS601245 yksin. Taulukossa 1 esitetään geenit vaikuttavat rosiglitatsonin, mukaan AS601245 sekä yhdistetyn rosiglitatsoniannokset ja AS601245, järjestetty suhteessa suhteelliseen biologisten toimintojen ja listattu perusteella p-arvo. Kuva. Kuva.