Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aktiviinilla ja TGFp jakaa Smad signalointi ja paksusuolen syövät voidaan inaktivoida joko reitin yksinään tai samanaikaisesti. Differentiaalinen vaikutukset activin ja TGFp signalointia paksusuolen syöpä ei ole aikaisemmin leikeltiin. Keskeinen myötävirtaan tavoite TGFp signalointi on CDK2-inhibiittori p21 (p21

CIP1 /waf1). Täällä arvioimme activin erityisiä vaikutuksia p21 sääntelyä ja tuloksena toimintoja. Huomaamme, että TGFli on enemmän voimakas induktori kasvun hidastuminen, kun taas activin on enemmän indusoi apoptoosin. Edelleen, kasvun hidastuminen ja apoptoosin molemmat ligandit ovat riippuvaisia ​​Smad4. Kuitenkin aktiviini downregulates p21-proteiinin Smad4 riippumaton muodin yhdessä lisääntynyt ubikinaation ja proteasomaalisten heikkenemisen muuttoliikkeitä, kun taas TGFli ylössäätelee p21 on Smad4 riippuvalla tavalla vaikuttamaan kasvuun pidätys. Aktiviiniproteiinien aiheuttama kasvun hidastuminen ja solukuolemaa ovat riippuvaisia ​​p21, kun taas activin muuttoliikkeelle vastustetaan p21. Edelleen, ensisijainen paksusuolen syövät osoittavat ero p21 ilmaus sopusoinnussa niiden

ACVR2 /TGFBR2

reseptoristatus. Yhteenvetona, me raportoimme p21 koska differentiaalisesti vaikuttaa activin /TGF kohde ja välittäjänä ligandin ominaisia ​​toimintoja paksusuolen syöpä, joka voidaan hyödyntää tulevia riskejä kerrostuminen ja terapeuttisesta.

Citation: Bauer J, Sporn JC , Cabral J, Gomez J, Jung B (2012) vaikutukset aktiviinin ja TGFp on p21 Colon Cancer. PLoS ONE 7 (6): e39381. doi: 10,1371 /journal.pone.0039381

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 21 toukokuu 2012; Julkaistu: 26 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Bauer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana Yhdysvaltain Public Health Service DK074019 BJ, National Institutes of Health myöntää R01CA141057 ja Arra P30 CA060553 BJ, UCSD Digestive Diseases Research Development Center DK080506 BJ, ja Robert H. Lurie Kattava Cancer Center avustustuen P30 CA060553 BJ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aktiviinilla on jäsen TGFp superperheen joka säätelee solujen erilaistuminen, proliferaatio ja apoptoosi monissa epiteelin ja mesenkymaaliset solut [1]. Samanlainen kuin TGF, aktiviini käyttää kahta pinnan reseptorien solunsisäisten Smad2, 3 ja 4 signaalitransduktion. Aktiviini-reseptori 1 (ACVR1B) ja aktiviini-reseptori 2 (ACVR2) ovat transmembraaniproteiineja, joilla ekstrasellulaarisen ligandia sitovan aktiivisuuden ja solunsisäinen seriini /treoniini-kinaasiaktiivisuutta. ACVR2B ei korvaa toimintoja ja signalointi ACVR2 [2].

Erityisesti

ACVR2

todettiin mutatoitunut useimmissa peräsuolen syöpiä suurtaajuus mikrosatelliittien epävakaus (MSI-H) , mikä johtui lähinnä lukukehyksen A

8 suolikanavan eksonin 10 [3], [4]. Palauttaminen aktiviinin signalointi, sen kasvun hidastuminen, kasvun pysähtymisen ja sen induktio muuttoliikkeen ilmetä

ACVR2

täydennetään [5]. Olemme aiemmin osoittaneet tiheä

ACVR2

mutaatioita MSI-H paksusuolensyöpä näytteitä yhdessä menetykseen ACVR2 proteiinin ilmentymisen [6] ja osoittivat, että ACVR2 menetys liittyy suurempia koolontuumoreissa ja huono histologinen [7 ]. Molemmat

ACVR2

ja

TGFBR2

mutaatioita esiintyy yleisesti samanaikaisesti MSI syövissä [6], ja solulinjoja voidaan myös menettää sekä TGF ja activin signalointi [8]. Mielenkiintoista, molemmat reseptorit harvemmin inaktivoituvat MSS paksusuolen syövät, joka on yleensä huonompi ennuste kuin MSI-H koolonsyöpien [9], ja molemmat reitit voidaan kohdistaa itsenäisesti. Toistaiseksi tiedetään vähän erillisten osuus aktiviiniin signaloinnin paksusuolen syövän kehitystä ja etäpesäke ja erityisesti, miten TGFp ja activin signaloinnin vaikutukset eroavat huolimatta identtinen intrasellulaarisen Smad signalointi.

p21 (tunnetaan myös nimellä p21

CIP1 /waf1) on sykliiniriippuvaisen estäjä ohjaava solusyklin pysähtymiseen kautta cdk1 ja 2 eston ja on mestari säätelijä monituumorisuppressori reittejä kautta sekä p53-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien [10]. Se on tunnettu kohde geenin TGFp paksusuolen syöpä [11], ja on liittynyt activin aiheuttama kasvu pidätys plasmacytic ja rintasyövän solujen [12], [13], mutta vaikutukset aktiviinin on p21 koolonkarsinoomasoluissa kuin sekä alavirran vaikutuksia ole arvioitu.

tässä tutkimuksessa selvitimme mekanismeja TGFp ja aktiviiniin päälle p21 sääntelyä ja sitä seurannut funktionaalisia vaikutuksia sen paksusuolen syövissä. Huomasimme, että huolimatta identtinen intrasellulaarisen Smad signalointi, TGFp ja activin säädellä p21 kautta erilaisia ​​mekanismeja, jotka ovat toiminnallisesti merkityksellisiä paksusuolen syöpä joka johtaa enemmän apoptoosin tai vähentäminen kasvun hidastuminen riippuu activin /TGFp signalointi aseman p21 kuin differentiaalisesti säännellyn tavoite.

tulokset

läsnäollessa Smad4, TGFp on enemmän voimakas induktori kasvun hidastuminen Vaikka aktiviinilla on voimakkaampi apoptoosin indusoija

Voit testata ja verrata vaikutuksia aktiviinin ja TGFp solun kasvuun, käytimme koolonsyöpäsolulinjoissa, joilla on erilainen Smad4 tila, kuten on kuvattu muualla [22], [23], lisäksi Smad4 pudotus.

ACVR2 Twitter /

TGFBR2 /Smad4

villityypin mikrosatelliittimerkkien vakaa koolonisyöpäsolulinja FET ja

ACVR2 /TGFBR2

villityypin /

Smad4

-null SW480 koolonkarsinoomasoluissa hoidettiin joko aktiviinin tai TGF ja solujen kasvua arvioitiin. Ylimääräisenä ohjaus, Smad4 pudotettiin kautta siRNA FET soluissa, joita käsiteltiin ja analysoitiin sen mukaisesti. Vaikka sekä aktiviinista ja TGFp hoito johtanut merkittäviin kasvun hidastuminen vuonna

Smad4

villityypin FET, vaikutus oli selvempi seuraavista TGF hoitoa. Sitä vastoin ei-ligandi oli kasvua tukahduttava puuttuessa Smad4 on

ACVR2 /TGFBR2

villityypin /

Smad4

-null SW480 paksusuolen syöpäsoluissa tai sen jälkeen Smad4 pudotus on

Smad4

villityypin FET soluja (kuvio 1A).

A) jälkeen

ACVR2 /TGFBR2 /Smad4

-wild tyyppi FET, FET-soluissa ohimenevän Smad4 knockdown, ja

ACVR2 /TGFBR2

-wild tyyppi /

Smad4

-null SW480-soluja käsiteltiin kantajaa (kontrolli), activin tai TGFli 24 tuntia, metabolista aktiivisuutta kautta MTT-kasvun määrityksessä arvioitiin. Kasvun hidastuminen tapahtui vasta läsnäollessa Smad4 seuraavat sekä activin ja TGFp käsittely (*** p 0,001). Edelleen, TGFp johti merkittävään kasvuun kasvun hidastuminen verrattuna activin (*** p 0,001). B) määrittämiseksi apoptoosin, joka on TUNEL määritys suoritettiin

Smad4

-wild tyyppi FET,

Smad4

-KD FET, ja

Smad4

-null SW480-soluissa käsitelty kontrollivehikkelillä (C), activin (A), tai TGF (T). Apoptoosi määritettiin TUNEL-merkitseminen apoptoottisia kappaleita. C) Normalisointi [% apoptoottisia kappaleita /ytimet] paljasti, että aktiviinin ja TGFp aiheuttaman apoptoosin tapahtui pääasiassa

Smad4

-wild tyyppiä FET eikä

Smad4

-KD FET tai

Smad4

-null SW480 paksusuolen syöpäsoluissa. Vuonna Smad4 ilmentävät solut, aktiviini indusoi apoptoosia enemmän kuin TGF (* p 0,05). D) BrdU-leimattu solunsisäinen DNA-fragmentit, ohjeellinen apoptoosin, määritettiin 24 tunnin kuluttua aktiviiniproteiinien tai TGFli hoitoon

Smad4

-wild tyyppi FET paksusuolen syöpäsoluissa, FET solujen p21 KD, FET solujen Smad4 KD ja

Smad4

-null SW480 paksusuolen syöpäsoluissa. Kasvu DNA pirstoutuminen todettiin jälkeen aktiiviinimolekyylien ja TGFp käsittely ainoastaan ​​Smad4 villityypin solut, joissa activin jotka lisäävät pirstoutuminen verrattuna TGF. Kun läsnä on Smad4, p21KD johtaa pohjapinta apoptoosin lisääntyminen, mutta aktiviini hoito johtaa ei apoptoosin induktioon. Smad4 Knockdown johti menetykseen apoptoosin FET soluissa sukua havaitut vaikutukset

Smad4

-null SW480-solut (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

verrataan apoptoosin induktion joko ligandin läsnä ollessa ja puuttuessa Smad4 tai p21. Aktiviini indusoi apoptoosin suuremmassa määrin kuin TGF, ja apoptoosia tapahtui vain, kun läsnä on Smad4 (kuvio 1 B, C). Smad4 /p21 riippuvuutta vahvistettiin vaihtoehtoinen apoptoosin määritystä määritetään BrdU-merkintöjä solunsisäisten DNA-fragmenttien. Apoptoosi nostettiin seuraavat activin ja TGFp hoitoa Smad4 positiivisia FET soluja, joissa activin asiakkuutta suurempaan apoptoosin. Ei induktion apoptoosin joko ligandin havaittiin

Smad4

-null SW480-soluja tai FET soluissa Smad4 Knockdown rinnalle TUNEL kokeissa (kuvio 1 B, C). p21 Knockdown in

Smad4

villityypin FET solujen johti menetykseen apoptoosin induktion (kuvio 1 D).

Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikka activin ja TGFp jakaa solunsisäisen Smad signalointi, jokainen suosii selvästi loppupään fysiologisia vaikutuksia johdonmukainen annoksilla. Lisäksi osoitamme, että sekä kasvun hidastuminen ja indusoiman apoptoosin joko ligandin ovat Smad4-riippuvaisia.

aktiviini Säätelee Nuclear p21 on Smad4-riippumattomalla tavalla

Yksi tunnettu kasvun tukahduttava kohdegeenien TGF on p21, joka on upregulated seuraavat TGFli hoidon FET koolonkarsinoomasoluissa [11]. Vaikutus aktiviinin on p21 paksusuolensyöpä ei ole arvioitu. Analysoida loppupään vaikutuksia Smad4 riippuvaisten aktiviinin signalointi, päätimme p21 ilmaus seuraavat activin hoitoa verrattuna TGF hoitoon. Toisin kuin aiemmin tunnetut TGFp vaikutuksia p21, löysimme ei lisätä p21 transaktivaatiota ja vain vaatimaton kasvu transkriptio seuraavissa aktiviinin hoitoa läsnäollessa Smad4, kun taas TGFli selvästi indusoi sekä p21-spesifinen transactivation ja transkription kun Smad4 oli läsnä (kuvio 2A). Mitä tulee p21-proteiinin ilmentymisen, huomasimme, että toisin kuin TGFli, activin hoito laski ydin- ja yhteensä p21 riippumatta läsnäolon Smad4, kun taas sytosolin p21 pysyi suhteellisen vakiona (kuvio 2B). Analysoida edelleen sääntelyä p21-proteiinin aktiviinin, teimme ajankulku osoittaa, että kun hieman alkuperäisestä voimistumista, p21-proteiini on vaimentua 24 tunnin kuluessa activin hoidon (kuvio 2C, kahden vierekkäisen oikea kaistaa).

)

Smad4

-wild tyyppiä FET, ja

Smad4

-null SW480 paksusuolen syövän soluja käsiteltiin vehikkelillä (kontrolli), aktiviinin tai TGFp: ssa 24 tuntia. p21-spesifinen transactivation määritettiin käyttäen Dual Luciferase Assay kanssa pWWP-luc ja PRL-TK (vasen paneeli) ja mRNA: n ilmentymisen tasoja p21 kvantitoitiin qPCR ja normalisoitiin L19 (oikea paneeli). Vaikka TGFli selvästi indusoi sekä p21-spesifinen transaktivaatiota ja transkriptio läsnäollessa Smad4, ei lisätä p21 transaktivaatiota ja vain vaatimaton kasvu transkriptio seuraavissa aktiviinin hoitoa läsnäollessa Smad4 havaittiin (* p 0,05). B)

Smad4

-wild tyyppiä FET, ja

Smad4

-null SW480-soluja käsiteltiin ohjattu ajoneuvo (C), aktiviini (A), TGF (T), tai molempien yhdistelmänä ligandien (A + T) 24 tuntia ennen lyysiä varten kokonaisproteiinin, ydin- ja sytoplasman valmistelu. Histoni H3, α-tubuliinin, ja GAPDH käytettiin lastaus ohjauslaitteet vastaavien jakeet. Vaikka TGFli lisääntyi merkittävästi p21 tasoa kaikissa kolmessa jakeiden Smad4 positiivisen solulinjan vain, activin aiheuttama lasku ydin- ja yhteensä p21 proteiinin Smad4-positiivisten ja -negatiivisilla soluja (vasen paneeli). Densitomet- analyysi kaikista blotteja paljasti tilastollisesti merkittäviä muutoksia p21 tasoilla (oikea paneeli) (ns = ei-merkitsevä, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). C) Alustava säätelyä p21-proteiinin seuraa downregulation 24 h kuluttua aktiviini hoidon.

Smad4

-wild tyypin FET-soluja käsiteltiin aktiviinin tai kantajaa (kontrolli) ja kerättiin eri ajankohtina kvantifiointiin p21-proteiinin ilmentymisen. GAPDH käytettiin latauskontrollina ja suhteellinen ilmentyminen laskettiin kautta densitometrian. D) Kun TGF-induced upregulation of p21 oli Smad4 riippuvainen, aktiviini aiheuttama downregulation p21 havaittiin vielä puuttuessa Smad4.

Smad4

-wild tyyppi FET soluja käsiteltiin ajoneuvo (CNT), aktiviinin tai TGFli läsnäollessa joko ryntäily siRNA (SC) tai Smad4 siRNA (KD) ja koko p21-tasot määritettiin. GAPDH käytettiin lastaus ja C32 solulysaatti kuin p21 positiivisena kontrollina.

Varmista, että ligandin vaikutukset p21 olivat suoraan riippuvaisia ​​Smad4, me pudotti Smad4 in

Smad4

villi tyypin FET koolonsyöpien soluihin käyttäen siRNA. Huomasimme, että perustason p21 ilmentymistä FET soluissa väheni Smad4 taintumisen (kuvio 2D, kaista 3), joka perustelee tärkeyttä Smad4 koulutusjakson ylläpitämiseksi korkealla p21 tasoa tässä solulinjassa [11]. Johdonmukaisesti, TGFp aiheuttama säätelyä p21 kumottiin menetys Smad4 (kuvio 2D, kaista 7). Kuten odotettua, downregulation p21 by aktiviiniin ei vaikuttanut puuttuminen Smad4 (kuvio 2D, kaista 5), ​​joka on johdonmukainen Western blot-analyysi p21 tasojen FET ja SW480-soluissa (kuvio 2B) osoittaa downregulation p21 vuonna Smad4 positiivinen ja negatiivinen solulinja. Siten Smad4 signalointi näyttää vaaditaan prosesseja, jotka ovat riippuvaisia ​​korkealla p21 ilmaus, mutta tarpeeton prosesseihin liittyy alhainen tai vähentynyt p21 tasoilla.

Activin aiheuttama kasvun hidastuminen on riippuvainen p21 Expression, ja Smad4 /p21 Signaling voi vastapainoksi Activin aiheuttama Smad4 riippumaton Migration

Myöhemmin olemme pyrkineet määrittämään toiminnallista roolia p21 aktiviiniin aiheuttama kasvun hidastuminen ja solujen elinkykyä. Olemme havainneet, että menetys p21 kautta siRNA pudotus aiheutti poistaminen aktiviinin aiheuttaman kasvun estämiseen

SMAD4-

villityypin solut, osoittaen, että aktiviini /Smad4-indusoidun kasvun hidastuminen on p21-riippuvaista (kuvio 3A). Edelleen, menetys p21 ei johtanut ainoastaan ​​kumoamisen aktiviinin solukuolema, mutta myös lisäys solujen määrä viittaa eloonjäämishyötyä menetys p21 (kuvio 3B). Nämä havainnot korostavat merkitystä Smad4 /p21-akselin activin-välitteistä kasvun hidastuminen ja solukuolemaa.

A) FET soluja käsiteltiin joko scramble (SC) tai p21 erityiset siRNA (KD). Kasvun hidastuminen arvioitiin MTT-aineenvaihdunnan määritys seuraavista aktiviini hoitoa. Aktiviini indusoi solujen kasvun inhibitiota, kun läsnä on p21, mutta vaikutus oli päinvastainen puuttuessa p21 (* p 0,05). B) yhteensä elinkelpoisuus on vähentynyt Smad4 villityypin koolonsyöpien seuraavat aktiviinin hoitoa läsnäollessa p21. FET-soluja käsiteltiin joko ryntäily tai p21 erityisiä siRNA. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinisen värjäyksen jälkeen, aktiviini hoitoon. Trypaanisinistä soluilla activin hoidon määrä väheni läsnäollessa p21, mutta kasvoi sen jälkeen p21 taintumisen (*** p 0,001). C) Aktiviini (A) indusoi soluvaelluksen Smad4-positiivisten ja Smad4-negatiivisia solulinjoja. Cellular muuttoliike aiheutetaan

Smad

4-villityypin FET solujen ja

Smad4

-null SW480-soluissa aktiviinin hoitoa, mutta selvempi induktio maahanmuuton nähdään puuttuessa Smad4. Menetys p21 johtaa lisääntymiseen perustason maahanmuuton Smad4 ilmentävät solut (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). D) p21 Knockdown lisää yleistä pro-muuttavien vaikutus aktiviinilla FET soluissa. Menetys p21 puuttuessa Smad4 ei lisätä vaeltavien induktio (* p 0,05, ** p 0,01).

Näin testasimme rooli p21 activin muuttoliikkeelle by arvioidessaan solujen liikkuvuuden läsnä ja poissa ollessa Smad4. Huomasimme, että aktiviinin tehostettu muuttoliikkeen Smad4 positiiviset ja Smad4 negatiivisia soluja (kuvio 3C), joka väittää varten Smad4 riippumattoman reitin säännellä maahanmuuttoa. Nämä tiedot tukevat samanlaisia ​​havaintoja TGFli signalointia jolle vahvan pro-muuttavien ja Smad4 riippumaton vaikutus osoitettiin [20], [22]. Kuten aktiviiniproteiinien hoitoon liittyi lasku p21 tasolla sekä muuttovoitto on kasvanut, odotimme, että menetys p21 by Knockdown lisäisi perustason muuttoliike sekä muuttoliike jälkeen aktiiviinimolekyylien hoidon Smad4 ehjien solujen, jos jäljellä p21 oli ainakin osittain mukana torjua activin muuttoliikkeelle. Tämän mukaisesti hypoteesin, osoitamme lisääntynyt tyvi maahanmuuttoluku in Smad4 ilmentävät soluissa p21 taintumisen (kuvio 3C) sekä yleistä selvempi muuttoliike päälle activin käsittely (kuvio 3D).

lisäksi havaittu, että tyvisolusyöpä muuttoliikettä tehostui aktiiviinimolekyylien hoidon puuttuessa joko p21 tai Smad4 in Smad4-positiivisten FET soluja, mutta että knockdovvn p21 ei ollut lisävaikutusta muuttoliikettä kun Smad4 oli poissa, kuten SW480-soluissa (kuvio 3D). Sillä TGFli, huomasimme, että solujen vaeltaminen tehostettiin riippumatta läsnäolon p21 (kuvio 2B, kuvio S1D). Tämä tukee jälleen, että p21-välittyvät vaikutukset seuraavat activin hoidon riippuvat Smad4 ja että p21 toimii alavirtaan Smad4 sen antiproliferatiivisia ja anti-muuttavien vaikutukset (kuva 4). Lisäksi tämä viittaa siihen, että kyseessä on TGFp, jotkut promigratory signaalit voivat ohittaa Smad4 kuten aiemmin on oletettu, [22] kiertämään p21 ja sen estäviä vaikutuksia. Yhteenvetona päätellä, että p21 voi ehkäistä maahanmuuttoa alavirtaan Smad4 ja että downregulation p21 voi olla vastuussa joidenkin pro-muuttavien potentiaalin aktiviinin signalointi. Niinpä ero sääntely p21 voi olla keskellä erillisiä funktionaalisia vaikutuksia aktiviinin ja TGFp.

Aktiviinilla Treatment Johtaa ubikinaation p21 ja esto Proteasome poistetaan aktiviinia aiheuttaman p21 alassäätely

edelleen leikellä mekanismi aktiviiniin välittämän p21-proteiinin väheneminen, arvioimme p21 ubikinaa- seuraavat activin hoitoa ja sen riippuvuus proteasomista (kuvio 5A, B). Tästä vertasimme p21 ubikinaation seuraavat activin ja TGFp hoitoa. Toisin kuin TGF, aktiviini indusoi p21 polyubiquitination (kuvio 5A). Hoito MG-132 proteasomaalisten estäjä kumottu activin aiheuttama p21-proteiinin väheneminen, (kuvio 5B) vedoten ubikitiinistä välittämää proteasomaalisten heikkenemistä activin aiheuttaman p21 downregulation. Tämä on kuin UV-induced p21 proteiinien hajoaminen [24], mutta eroaa pohjapinta p21 proteasomaalisten hajoaminen [25], joka ei käytä ubikinaation.

)

ACVR2 /TGFBR2 /Smad4

-wild tyypin FET-soluja esikäsiteltiin 30 minuuttia proteasomaalisten estäjä MG-132 ja sitten käsiteltiin vehikkelillä (kontrolli), aktiviini, TGFp 24 tuntia, ja ubikitinaatio koko p21 arvioitiin kautta immunosaostus p21 ja blot -menetelmällä ubikitiinispesifinen vasta-aine (ylempi paneeli) ja reblotting p21. Useita bändejä osoitus polyubiquitination nähtiin vasta aktiviini hoitoa. B) Aktiviinilla aiheuttama p21 downregulation riippuu proteasomin.

Smad4

-wild tyypin FET-soluja esikäsiteltiin 30 minuuttia proteasomaalisten estäjä MG-132 ja sen jälkeen käsittelemällä kantajaa (kontrolli) tai aktiviinin 24 tuntia ja verrattiin käsiteltyihin soluihin vastaavasti ilman proteasomaalisten inhibitiota. p21 ilmentymistä arvioitiin ja estivät p21 downregulation seuraavista aktiviinin hoidon yhteydessä proteasomaalisten esto.

Nuclear p21 on menetetty alajoukko Primary koolonsyöpien kanssa Ehjä

ACVR2

sitten arvioi alentunut activin /TGFli signalointi vaikuttaa p21 lokalisointiin ensisijainen paksusuolen syövissä. Määritimme läsnäolo tai heikennyksen ydinvoiman p21 ilmentymisen 56 ensisijainen paksusuolensyöpä yksilöitä eri genomista alatyyppejä, ja korreloi tämän datan activin ja TGFp reseptoristatus (taulukko 1). Olemme havainneet, että suuri osajoukko koolonsyöpien osoitti menetys ydin- p21, ja että tämä häviö liittyy säilyttäminen ACVR2 (taulukko 1 ja kuvio 6), mikä viittaa siihen, pieneni signalointi kautta Smad4 /p21-akselilla, mutta ehjä aktiviini Smad4-riippumaton signalointi . Päinvastainen päti TGFBR2: säilyttäminen TGFBR2 liittyi jatkuva ydin- p21 (taulukko 1). Tämä data on johdonmukainen

in vitro

havainnot TGFp /Smad4 riippuva säätelyä p21 ja aktiviiniin /ei-Smad4 riippuva downregulation p21.

Viisikymmentäkuusi koolonsyöpien värjättiin ACVR2, TGFBR2 ja p21. Edustavia esimerkkejä p21 värjäys esitetään: normaali paksusuolikudos kanssa tumavärjäystä (vasen paneeli), paksusuolen syöpä näytteen yllä ydinaseiden p21 värjäytymistä (keskimmäinen paneeli), ja paksusuolen syöpä näyte menetys ydin- p21 värjäyksen (oikea paneeli).

keskustelu

MSI-H paksusuolensyövät, sekä TGFp ja activin signalointi kumonnut vuoksi lukukehysmutaatioita että tyypin II reseptori [26]. Menetys Näiden molempien signalointipolkujen voi hyödyttää sekä lisäaineena kasvaimen kasvua [20], [27], mutta ero vaikutus maahanmuutosta jää epäselväksi. TGF ja aktiviiniproteiinien käyttävät samoja solunsisäisiä Smad proteiineja (Smad2 /3 ja Smad4) lähettämään niiden signaalin. Molemmat ligandi erityisiä reittejä yleisesti inaktivoituvat MSI-H paksusuolensyövät, josta meillä aiemmin havaittu yli 50% päällekkäisiä

ACVR2

ja

TGFBR2

mutaatioita [6]. Kiinnostavaa, ne ovat harvemmin inaktivoituvat MSS paksusuolen syövät, joka on yleensä huonompi ennuste kuin MSI-H koolonsyöpien [9], ja molemmat reitit voidaan kohdistaa itsenäisesti. Tässä osoitamme, että vaikka aktiiviinimolekyylien ja TGFp molemmat voivat aiheuttaa kasvun hidastuminen ja apoptoosin vaihtelevasti, ne myös lisäävät muuttoliike jakoi näin kasvaimen tukahduttava sekä syöpää edistäviä ominaisuuksia. Hienosäätöä näitä vastakkaisia ​​vaikutuksia sekä ero sääntely TGFp vs. aktiviiniin signalointi on todennäköisesti tärkeä prosessi karsinogeneesis- vaikuttavat kohtalo syöpäsoluja. Tämä käsikirjoitus tutkii ero vaikutuksia ja sääntelyn activin ja TGFp signalointia paksusuolen syöpä.

Tässä osoitamme, että paksusuolen syöpäsoluissa, vaikka identtinen alavirran Smad signalointi, activin ja TGFp on vastakkainen vaikutus CDK2-estäjä p21 aiheutuvat erillisiin asetusten kunkin reitin. Vaikka TGFli on vahva ajan sääntelyn vaikutus p21, activin signalointi johtaa lievää laskua p21-proteiinin tasoa. Mielenkiintoista on, että molemmat ligandit indusoivat Smad4-riippuvainen p21-välitteisen solujen kasvun suppression ja solukuolemaa, mutta TGFp näyttää olevan tehokkaampi indusoi kasvun hidastuminen, kun taas aktiiviinimolekyylien toisaalta on tehokkaampi apoptoosin indusoija. Kuten edellä on kuvattu, sekä TGFp ja aktiviini parantaa solumigraatio [20], [22]. Erityisesti me osoittavat nyt, että activin pro-muuttavien vaikutus on säännelty Smad4 riippumaton muodin ja kuvaavat ensimmäisen kerran samanaikainen kasvu p21 ubikinaation ja proteasomaalisten hajoamista. Näin ollen vaikka activin aiheuttama kasvun hidastuminen on riippuvainen p21, activin muuttoliikkeelle mukana vähennetään p21 tasoa ja riippumaton Smad4. Vaikka tiedetään, että UV-indusoitua p21-proteiinin hajoaminen on ubiquitinin-riippuvainen [24], pohjapinta-p21 hajoamisen kautta proteasomi ei ole [25]. Viimeaikaiset tiedot syytöksiä ERK2 välittämisessä ydinvoiman sytosolin siirtää ja seuraava ubiquitinin välittämän hajoamisen p21 [28]. Erilaisia ​​ubikitiinipromoottori ligaasien sisällyttää Ecto ja Smurf-1 on havaittu kohdistaa sekä Smad-riippuvainen ja riippumaton TGFp merkinanto [29]. Erityinen ubikitiinipromoottori ligaasilla vastuussa activin välittämän p21 ubikinaa- ei ole määritetty tasalla.

lisäys tai vähennys p21 tasoilla voisi ajaa solun kohti etuoikeutettu aktivointi joko Smad4 riippuvia tai riippumattomia signalointireitin ja vice päinvastoin, ja siten muokataan yleistä soluvasteen. Lopullisesti, p21 näyttää olevan tärkeä pelaajalle ero sääntelyä Smad4 riippuvaisten ja riippumattomien reittien ohjataan activin ja TGFp (kuva 4).

Itse asiassa näyttää siltä, ​​että molemmat activin ja TGFp Smad ja ei- Smad signalointi tapahtuu samanaikaisesti ja että nettovaikutus on seurausta suhteellisen kontekstisidonnaisia ​​hallitsevuus tietyn ligandin ja /tai kautta. Differential sääntely p21 saattaa olla tärkeä mekanismi valvoa ja hienosäätää etuoikeutettu signalointi riippuvainen tai riippumaton Smad mahdollisten ennustetekijöiden merkitystä. Menetys Smad signalointi on liittynyt lisääntynyt maahanmuutto ja menetys kasvun hidastuminen vuonna paksusuolensyöpä [22], ja nyt näyttää yksi mahdollinen mekanismi paksusuolensyöpä jonka Smad signalointi voidaan ohittaa kautta etuoikeutetut aktiviinin signaloinnin, esittämällä selitys pro -migratory ja pro-proliferatiivisia vaikutuksia mukana menetetään Smad signalointi.

p21 näyttelee monimutkainen rooli syövän. Kasvain tukahduttava ominaisuuksia p21 on kuvattu yhteydessä induktion kasvun pidätys, erilaistumiseen ja vanhenemista ja tutkimukset eri syöpätyyppejä osoitti, että p21 ilmaus korreloi myönteisen diagnoosi [10]. Yhdenmukainen edellä havainnon, useat tutkimukset paksusuolensyöpä paljasti yhdistyksen välillä p21 downregulation ja etäpesäke sekä huono selviytyminen [30], [31], [32] [33], mutta jotkut raportit viittaavat siihen kaksoisrooli useissa syöpiä lisäys p21 korreloi huonon lopputuloksen [34], [35].

Täällä raportoimme huomattava määrä ensisijainen koolonsyöpien menetys ydin- p21, joka korreloi läsnä ACVR2 ja puuttuminen TGFBR2 . Tämä on linjassa

in vitro

tietojen Niissä näytetään downregulation p21 tiiviimpään Smad4 riippumattoman signaloinnin aiheuttama aktiviini. Se on myös yhdenmukaista käsitteen poissaolevan säätelyä p21 jälkeen kumotaan TGFp /Smad4 akseli, joka voidaan selittää knockdovvn Smad4, kuten meidän kokeita, mutta myös puuttuminen TGFBR2, kuten nähdään syöpänäytteissä. Toiminnallinen seuraukset me odottaakin väheni p21 tasojen kanssa säilyttäminen ACVR2 ja menetys TGFBR2 pohjautuvat tiedot lisätä maastamuuttoa kautta Smad4-riippumaton signalointi ja menetys kasvun hidastuminen kautta TGFp /Smad4 /p21-akselilla. Riippumaton vaikutus kasvun hidastuminen, joka yksin on todettu olevan heikko prognostinen markkeri monissa syövissä [36] ACVR2 + /TGFBR2- reseptoristatus liittyy menetys ydin- p21 viittaa pro-metastasoitunut ja siten enemmän aggressiivinen syöpä fenotyyppi. Tämä vastaa aikaisempia havaintoja, jotka osoittavat menetys p21 liittyy huonompi tulos eri syöpätyyppejä [10]. Vaikka muut signaalinvälitysreittien voi ohjata p21 lokalisointi, meidän tiedot lasketaan perusta lisäarvioinnille aktiviinin ja TGFp reseptoristatus yhdessä p21 lokalisointi ennustamiseksi tuloksesta ja hoitovaste paksusuolen syöpä.

Yhteenvetona meidän tiedot osoittavat, että TGF on enemmän indusoi kasvun tukahduttaminen taas activin on enemmän indusoi apoptoosin. Edelleen, kasvun hidastuminen ja apoptoosin molemmat ligandit ovat riippuvaisia ​​Smad4 ja p21. Kuitenkin aktiviinista downregulates ydin- ja yhteensä p21-proteiinin Smad4 riippumaton muodin yhdessä lisääntynyt ubikinaation ja proteasomaalisten hajoaminen liittyy lisätä maastamuuttoa. TGF toisaalta ylössäätelee ydin- p21 on Smad4 riippuvalla tavalla vaikuttamaan kasvuun pidätys ja voi ohittaa p21 vaikuttaa muuttoliike. Edelleen, ensisijainen paksusuolen syövät osoittavat ero p21 ilmaus sopusoinnussa niiden

ACVR2 /TGFBR2

reseptoristatus. Lopullisesti, raportoimme p21 koska differentiaalisesti vaikuttaa activin /TGF kohde ja välittäjänä ligandin ominaisia ​​toimintoja paksusuolen syöpä, joita voidaan hyödyntää tulevia riskejä kerrostuminen ja terapeuttisesta.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of University of North Carolina sairaaloissa. Kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa varten näytteitä osana alle IRB hyväksyntä toteutettiin North Carolina peräsuolen syövän Study (NCCCS) kuin viitattu alla. Tutkimuksen hyväksyi Northwestern University Institutional Review Board (IRB # STU00020989). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta.

Potilasnäytteet

Colon kasvaimia prospektiivisesti mukaisesti kerättyjen sisäisten luottoluokitusten hyväksymisestä osana North Carolina peräsuolen syövän Study (NCCCS), väestöpohjaisen, kotelo -Säätimet tutkimus käsittää 503 potilasta [14], [15]. Tätä tutkimusta varten 15 potilaan näytteet runsaasti kasvaimen ja normaalin kudoksen valittiin satunnaisesti. Tarkastusta, keräsimme ylimääräinen 41 peräkkäisen peräsuolen syövän yksilöitä Northwestern University alle institutionaalisten IRB hyväksynnän (IRB # STU00020989) (taulukko S1). Kaikki kasvaimet olivat formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin ja leikattiin 5 um: n leikkeitä.

Colon Cancer Cell Lines

SW480-soluja (ATCC, Manassas, VA) pidettiin Iscoven muokattu Dulbeccon ja FET solut (antelias lahja Michael Brattain, University of Nebraska, Omaha, NE [16]) F12 /Dulbeccon Modified Eagles väliaineessa (molemmat Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliini G [100 U /ml] /streptomysiiniä [100 ug /ml] (Invitrogen). Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Kaikki solut olivat ilman seerumia 24 tunnin ajan ennen koetta lähentää solusyklin synkronointia. Solut testattiin mykoplasmatulehduksen käyttäen PCR Mycoplasma Detection Set (Takara, Otsu, Japani) ja ETA: STR profiloinnin avulla PowerPlex 1.2 System (Promega, Madison, WI).

Vasta-aineet ja reagenssit

aktiviini A rekonstruoitu PBS: ssä, TGFp 1 4 mM HCl: ää mukaisesti valmistajan ohjeiden (molemmat R & D, Minneapolis, MN) ja käytettiin lopullisissa konsentraatioissa 25 ng /ml ja 10 ng /ml, kuten aiemmin on kuvattu [17], [18], [19], [20]. MG-132 (Calchemie, Darmstadt, Saksa) käytettiin inhibition proteasomin. Immunohistokemialliseen analyysejä, käytimme vuohen polyklonaalinen vasta-aine vastaan ​​ACVR2 (01:50) (ab10595, Abcam, Cambridge, MA), samoin kuin hiiren monoklonaalisia vasta-aineita TGFBR2 (01:50) (ab78419, Abcam) ja p21 (1: 150) (sc-817, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Western blotting, p21 (# sc-469) (1:250) (Santa Cruz Biotechnology), α-tubuliinin (# 3873), H3 histoni (# 9715) (molemmat Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ja GAPDH