Krooninen sairaus

tiivistelmä

Colon syöpä on tappava tauti miljoonat ihmiset ympäri maailmaa. Nykyinen hoito haasteita ovat hallintaa sairauksien sekä parannuksia havaitsemiseksi ja tuumorisolujen. Tunnistaa tauti valtion erityinen pinta-antigeeni allekirjoituksia, yhdistimme loisteputki solu viivakoodaus korkean suoritustehon virtaussytometristen profilointiin primaarinen ja metastaattinen paksusuolen syövän linjat (SW480, SW620 ja HCT116). Meidän multipleksoidun tekniikka tarjoaa parannuksia perinteisiin menetelmiin sallimalla samanaikaisesti ja nopean seulonnan syöpäsolujen vähäisin vaivaa ja kustannuksia. Menetelmässä käytetään proteiinin tason analyysi kaupallisesti saatavilla vasta-eläviä soluja ehjänä epitooppien havaita mahdolliset kasvain-erityisiä tavoitteita, jotka voidaan tutkia tarkemmin niiden kliinistä hyötyä. Multipleksoidun vasta-aineen matriisia voidaan helposti soveltaa muissa elimissä tai patologioita löytö lähestymistapoja kohdistaa tunnistamiseen.

Citation: Sukhdeo K, Paramban RI, Vidal JG, Elia J, Martin J, Rivera M, et al . (2013) Multiplex virtaussytometria Barcoding ja Vasta Arrays tunnistaa pinta-antigeeni Profiilit Primary ja metastasoituneen koolonsyöpäsolulinjaa. PLoS ONE 8 (1): e53015. doi: 10,1371 /journal.pone.0053015

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 22 marraskuu 2012; Julkaistu: 07 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Sukhdeo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Pediatric aivosyövän Foundation Yhdysvalloissa, aivosyövän Society, Goldhirsh Foundation, ja James D. McDonnell Foundation. Tämä työ oli myös rahoittivat National Institutes of Health myöntää CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), Pathway Independence Award CA157948 (JDL), Case Western Reserve Medical Scientist koulutusohjelma T32 GM007250 (KS), ja kansalliset Research Service Award, National Cancer Institute F30 CA165857 (KS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: RIP, JGV, JE, JM, CTC, ja RB maksetaan työntekijöille BD Biosciences. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Colon syöpä joukossa yleisimmistä syövistä kannalta sekä syövän ilmaantuvuus ja syöpää liittyvät kuolemat länsimaissa [1]. Varhaisen vaiheen paksusuolen syöpä voidaan hallita onnistuneesti poistettu kirurgisella; kuitenkin, etäpesäkkeitä on usein reagoinut hoitoon ja vastaavat useimpien sairastuvuutta ja kuolleisuutta. Kliininen päätöksenteko ohjaavat Amerikan sekakomitean Cancer TNM (tuumori-solmu-etäpesäke) pysähdyspaikka, joka on epätäydellinen varten ennuste ja ei ennusta hoitovaste. Kriittinen tarvetta tunnistaa tavoite merkkiaineiden maligniteetin, joita voitaisiin käyttää varhaiseen havaitsemiseen ennustettavuutta, interventio, ja /tai kohdentamalla syöpäsoluja. Esimerkiksi, kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) on käytetty havaitsemiseksi verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) verenkiertoon sekä levittää kasvainsoluja (DTC) luuytimessä ja kyky seurata kasvaimen taakkaa, ennustaa riski etenemisen, ja mitata kemoterapiaa vastausta. Nämä tekniikat ovat kliinisesti hyväksyttyjä tuotteita, kuten CellSearch ™ (Veridex), jotka käyttävät immunologisesti CTC perusteella epiteelisolujen adheesiomolekyyliin (EpCAM) kalvo ilmaisun [2]. Solun pinnan ita erityisesti ovat arvokkaita, koska ne ovat saatavilla systeemisesti toimitetaan kohdennusmolekyylejä (esim vasta-aineet, aptameerit, jne.), Joita voidaan käyttää tuottamaan bioaktiivisia hyötykuormia, suojastusviestintä, tai aktivoi vasta-aineesta riippuvaista soluvälitteistä sytotoksisuutta.

Pyrkimykset tunnistaa ita paksusuolen syövän ja muiden syöpätyyppeihin ovat luottaneet lukuisia tekniikoita, joilla kullakin on omat edut ja rajoitukset [3], [4]. Geenien ilmentyminen mikrosirujen profilointia tai kasvain-cDNA: ilmaisun kirjastojen kanssa potilaiden seerumit (esim Serologinen tunnistaminen ilmentää rekombinanttisesti Kloonit, Serex) perustuvat RNA-tason ilmentymistä. Nämä lähestymistavat voivat olla ongelmallista, koska posttranskriptionaalisella (esim miRNA) ja translaation jälkeiset mekanismit sääntelyn merkittävä vaikutusvalta yli todellisen proteiinin määrää hallussa kunkin kennon yhdessä signaloinnin toiminto solussa [5], [6]. Eli solujen matalan tason transkriptien voivat sisältää suhteettoman korkeita käännetty proteiinin (esim. Pitkä puoliintumisaika) ja päinvastoin. Massaspektroskopia ja proteiini microarray taulukot hyödyntää koko solun tai fraktioitua lysaatit koolonkarsinoomasoluissa havaitsemiseksi differentiaalisesti ilmaisi ita. Nämä proteiini-menetelmiä havaita TAA voidaan vaikuttaa olennaisesti häiriöitä luonnollinen proteiini konformaation näytteen valmistuksen aikana, hallitseva esitys solunsisäisten proteiinien, ja rajoitettu molekyyli- resurssit (ts kaupallisesti saatavia vasta-aineita) nopeasti arvioida mahdolliset ehdokas biomarkkereita.

tunnistaa ita, suoritimme suurikapasiteettisten immunofenotyyppisiä seulontaan primaarinen ja metastaattinen paksusuolen syövän vasta-ainetta käyttämällä array, joka sisältää lähes täydellisen suojan klusterin eriyttämisen (CD) pintamolekyylillä perheen sekä monia muita yhteisiä pinta-antigeenit . Olemme myös multipleksoida vasta array näytön avulla fluoresoivien solujen viivakoodaus. Strategiamme tunnistettu kattava pinta proteiiniprofiileja lukien ita jakaa kaikkialla kasvainnäytteestä sekä ne, jotka olivat taudin valtion erityinen. Pan-kasvain TAA, integriinin α6 (CD49f), validoitiin olevan lausekkeen samankaltainen EpCAM, osoittaa mahdollisuuksia tämän tekniikan tunnistaa ehdokas kasvain biomarkkereita, joita voitaisiin käyttää edelleen tarkentaa havaitsemiseen pahanlaatuisia soluja, kuten CTC /vikakoodit.

tulokset

Multiplex viivakoodi yhdistettynä vasta-array seulonta

Kaksi ensisijainen adenokarsinooma (SW480, HCT116) ja yksi metastaattisen (SW620) koolonsyöpäsolulinjaa valittiin tutkimuksemme. Kaikki kolme riviä on epiteelin alkuperä ja niiden tuumoribiologiassa on hyvin tutkittu kirjallisuudessa. SW480 oli peräisin ensisijainen adenokarsinooma potilaalta, joka myöhemmin uusiutunut kanssa laajalle levinneitä suoliliepeen imusolmukkeiden etäispesäkkeitä, jotka olivat johtamiseen käytetty SW620 solulinjassa [7]. Käyttö potilaan toisiaan joukko solulinjoja vähentää geneettistä vaihtelua ja mahdollistaa entistä kontrolloitua vertailun molekyylimuutokset seuraavat metastasointiin [8], [9].

Kanavointi Kaikkien kolmen näytteen samanaikaiseen merkinnät ja analyysi saatiin aikaan fluoresoivien solujen viivakoodaus. Tässä tekniikassa, solut leimataan erottava solunsisäisen väriaineen ja sitten yhdistettiin ennen vasta-aineen merkintöjä. Jokaisen kyseessä solulinjan kirjataan Virtaussytometrin perusteella fluoresenssi joko violetti (Horizon leviämisen Dye VPD450) tai sinistä (karboksifluoreseiinia sukkinimidyyliesteri; CFSE) heräte laserit, kun taas punainen laser on varattu havaitsemiseen Alexa647 toissijaisella vasta-aineita. SW480-solulinja Barcoded leimaamalla VPD450 kun SW620-soluja leimaamaton ennen yhdistämällä molempien solulinjojen yhdeksi sekoitettu populaatio (kuva 1, katso materiaalit ja menetelmät). Kolmas solulinja, HCT116, oli viivakoodilla käyttäen CFSE ja myös sekoittaa tuottaa yhden altaan koostuu kolmesta eri solulinjoissa. Sitten käytetään yhdistelmä-solujen päälle vasta-joukko, joka koostuu 242-vasta-aineiden ja 9 isotyyppikontrolleja erikseen allokoidaan kolme 96-kuoppaisille levyille (kuvio 1). Vasta-aineet sisältyvät joukko tarjota kattavuus lähes jokaisen klusterin eriyttämisen (CD) molekyyli ja monet muut yhteinen pinta-antigeenejä. Sinänsä, pystyimme koetin laajan pinnan proteiineja ja tuottaa allekirjoitukset kunkin koolonisyöpäsolulinja.

kolme solulinjat leimattiin kanssa tai ilman solunsisäisen väriaineen ennen sekoittamista solujen yhdeksi allas . Sitten solut jaettiin kuhunkin kuoppaan vasta-merkintöjä. Sisältö kunkin kuopan prosessoitiin sitten virtaussytometrillä. Identiteetin kustakin solulinjasta määritettiin perustuen fluoresenssi-intensiteetti. Sopiva portit vedettiin mahdollistaa samanaikaisen analyysin kullekin vasta-aineelle. Histogrammit hiiren IgM isotyyppikontrolli on esitetty.

enemmistö vasta-aineita (158/242) oli joko täysin reagoi tai sitoutuu alle 5% soluista verrattuna vastaaviin isotyyppikontrolli kaikissa kolmessa solulinjat ja siksi ei enempää tutkittu tässä tutkimuksessa (täysi tulokset kuvassa S1 ja taulukot S1, S2 ja S3). Huomasimme, 25 vasta-aineita, jotka reagoivat useimpien ( 50%) ja solujen SW480, SW620 ja HCT116 solulinjoja (taulukko 1 ja kuva S2). Monet näistä vasta saavutti lähes täydellinen ( 95%) merkintöjä syöpäsoluja. Kuten odotettua, proteiinit, jotka liittyvät major histocompatibility complex class I (β2-mikroglobuliinin, HLA-A /A2 /B /C ja MIC-A /B), jotka ovat yleisesti ilmaistu nukleoiduissa ihmisen soluja tunnistettiin. Muut ita luokiteltiin mukaan tunnettujen toiminto, joka tunnistaa useita proteiineja, jotka liittyvät soluväliaineen vuorovaikutuksen ja soluadheesiota, kuten useat integriini perheenjäseniä, sopusoinnussa niiden epiteelin biologiaa. Koska α ja β-integriinien muodostavat multimeerisille transmembraaninen komplekseja keskenään, on mahdollista, että co-integriini α2 (CD49b) ja integriini α6 (CD49f) yhdessä integriinin β4 (CD104) saattaa osoittaa toiminnallista vuorovaikutusta näiden perheenjäsenten tai jaettu sääntelyä paksusuolensyöpä. Havaitsimme myös useita proteiineja, joiden tiedetään toimivat solujen aineenvaihduntaan ja signalointi sekä muut välittävä vuorovaikutus mukautuva ja luonnollinen immuniteetti. Nämä yhteiset tunnisteet voitaisiin tiedottaa tuumoribiologiassa tai edustavat druggable väyliä kohdistaa syöpäsoluihin. Lisäksi koska niiden laaja ilme pinnalla pahanlaatuisia soluja, yleiseurooppalainen kasvaimen antigeenejä tunnistettu tässä näytössä voi olla hyödyllistä merkkiaineita tunnistamisen helpottamiseksi CTC /vikakoodit.

Bioinformatics analyysi

priorisoida lista TAA: iden ehdokkaaksi biomarkkereita, suoritimme rajat vertailuja Oncomine kokoelma geenien ilmentymisen microarray aineistoja paksusuolen syövän sekä vastaavassa normaalissa kudoksessa [10]. Sinänsä pystyimme arvioimaan proteiinien ekspression tunnistettu meidän näytöllä verrattuna RNA profiilit useille tutkijoille, potilasryhmissä, ja kokeiluympäristöjä. Olemme keskittäneet tutkimista TAA ilmentymisen normaalissa paksusuolen kudoksessa, normaali maksa, sekä paksusuolen adenooma ja adenokarsinooman [11] – [14]. Otimme ne geenit, jotka olivat vähintään kaksinkertaisia ​​voimistunut (p 0,05) verrattuna normaaliin kudokseen. Tämä edelleen täsmensimme TAA luettelon yliekspressoitu geenit CD44, integriinin α6 (CD49f), ja integriini β2 (CD49b) kuin parhaiden ehdokkaiden (kuva 2). On huomattava, että näiden geenien ilmentymistä oli merkittävästi suurempi syövän kuin normaalissa maksassa, mikä viittaa mahdolliseen terapeuttinen ikkuna kohdennettuja hoitoja säästää normaalia kudosta.

Oncomine heatmap analyysi 4 julkaistu aineistoja ilmentämiseen tuumoriantigeeneistä on kuvattu Taulukko 1. Vain ne geenit, jotka olivat johdonmukaisesti voimistunut poikki aineistoja kanssa p 0,05 näkyvät. Suluissa ilmaisevat näytteiden määrä analysoidaan. Lyhenteet: normaali paksusuoli, NC; nouseva paksusuoli, AC; laskeva paksusuoli, DC; sigmasuolessa, SC; poikittainen paksusuoli, TC (n = 1).

tuumorimarkkeri validointi

tulosten validointiin meidän vasta-näytön havaita kasvainsoluihin potilasnäytteistä suoritimme immunohistokemia (IHC) ja immunofluoresenssilla (IFC) värjäytymisen arkistoidut ihmisen näytteitä normaalista paksusuolen limakalvolla ensisijainen paksusuolen syövän sekä etäpesäkkeiden maksasta ja imusolmukkeiden (n = 6 kussakin). Valitsimme integriini α6 (CD49f) pohjalta vahvan reaktiivisuus ( 99%) kaikkien kolmen koolonsyöpäsolulinjaa meidän näytön, joka tunnetaan ilmaisu suolistossa, ja säätelyä kasvainten synnyssä [15]. Todellakin, IHC, voisimme havaita integriini α6 värjäytymistä paksusuolen syövän sekä viereisissä uninvolved normaali limakalvo. Lisäksi kaikki maksan ja imusolmukemetastaaseja osoitti integriini α6 värjäytymistä, kun taas ympäröivän strooman oli negatiivinen. Ero värjäytymisen intensiteetti välillä primaarikasvaimen ja normaali oli hienovarainen, mutta lausutaan metastaattisessa näytteissä (kuvio 3). Nämä suuntaukset olivat myös nähdä IFC (kuva S3) käyttämällä erillistä integriiniä α6 vasta-ainetta, jotka toimivat yhdessä leimaamalla solut epiteelin merkki EpCAM referenssinä [16] osoitti, että integriinin α6 lokalisoitu kaikille paksusuolen epiteelisoluihin joka näytteestä (kuvio S3 ). Nämä havainnot vahvistavat hyödyllisyys meidän seulontamenetelmä tunnistamiseksi TAA, joita voitaisiin käyttää havaitsemaan kasvainsolujen potilaan näytteitä ja /tai terapeuttinen kohdistaminen.

A) H 70% konfluentteja. Irtoaminen solujen kudosviljelylevyiltä suoritettiin käyttäen TrypLE (Gibco), mukaisesti valmistajan protokollan (10 minuuttia 37 ° C: ssa). Papaiiniryhmän dissosiaatio pakki saatiin Worthington Biochemical. Solujen elinkelpoisuus tarkistettiin käyttäen trypaanisiniekskluusiolla ja todettu 98%. Kaikki solut kasvatettiin ja käsitellä rinnakkain.

Korkean suoritustehon virtaussytometria-analyysi

korkea koko virtaussytometria-analyysi suoritettiin kolmen solulinjoissa kuvatulla tavalla käyttäen vasta-ainetta, seulonta kehittämä menetelmä BD Biosciences [ ,,,0],27]. Vasta-aineen seulonta tehtiin käyttäen BD Lyoplate ihmisen solunpintamarkkeri seulonta paneeli (560747), joka sisältää lyofilisoitua vasta 96-kuoppalevyformaatissa 0,5 ug /kuoppa. Virtaussytometriaa analyysiä, solujen suspensioita käsiteltiin DNAasia (1 ml PBS, jossa Ca

2+, Mg

2+, 100 yksikköä /ml, 10 ui DNAasia varastossa) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ennen vasta-värjäystä, solulinjat Barcoded eri elinkelpoisuus väriaineet samanaikaista analyysia [28]. SW480-solut leimattiin Horizon Violet leviämisen Dye 450 (BD Biosciences 562158) kohti valmistajan protokollaa 1 uM. HCT116 leimattiin CFSE (Invitrogen, C34554) kohti valmistajan protokollaa 1 uM. SW620 jäi leimaamaton ja havaittu pohjalta on VPD450 ja CFSE negatiivinen. Tehokkuus etiketeissä oli 99%. Sen jälkeen, kun sopivat pesu-, kaikki kolme solulinjaa sekoitettiin ja suspendoitiin uudelleen BD Pharmingen Stain Buffer (BD Biosciences), johon on lisätty 5 mM EDTA: ta, jotta reaggregation. Solut maljattiin 96-kuoppaisille kierroksen pohjalevyt (BD Biosciences) 30000 soluja (10,000 kullekin solulinja) kuoppaa kohti värjäykseen. Solun pinnan värjäys tehtiin vasta-aineiden kanssa liuotetaan 1 x PBS: ää, jonka konsentraatio on 0,5 ug testiä kohti ja solut värjättiin eläviä jäillä 20 minuutin ajan. Solut pestiin kolme kertaa värjäyspuskurilla ja sitten värjättiin lajikohtaisia ​​Alexa647 sekundääriset vasta-aineet (BD Biosciences) 20 minuuttia jäillä. Solut pestiin kolme kertaa enemmän värjäyspuskurissa, sitten uudelleen värjäyspuskuria 7AAD: llä (BD Biosciences) ja elävien solujen määrittämiseksi. Solut analysoitiin FACS Canto järjestelmä (BD Biosciences) varustettu suurikapasiteettisten Sampler (levyllä loader) ja tietoja kootaan kanssa FlowJo ohjelmisto ja Microsoft Excel 2007 -malli BD Biosciences (https://www.bdbiosciences.com /support/resources/stemcell/index.jsp#stemtools) ja lämmön karttoja.

immunohistokemia

kudokset IHC ja IFC saatiin läpi oma kudostenhankintaryhmä sisällä Department of Anatominen patologian Cleveland Clinic. Näytteet IHC fiksoitiin 4% fosfaattipuskuroidussa formaliinilla ja upotetaan parafiini leikkaamista varten. IHC värjäys suoritettiin Ventana Benchmark XT automatisoitu immunostainer hyödyntäen Ventana Optiview DAB IHC Detection Kit CC2 antigeenin haku. Ensisijainen vasta-polyklonaalista kanin anti-ITGA6, (Sigma-Aldrich, HPA012696) laimennettiin 1:10.

Immunofluoresenssikoe

Juuri korjatun kasvain tai normaalia kudosta oli jäädytettiin ja varastoitujen -80 ° C. Gastrointestinaalisen patologi vahvisti histopatologia diagnoosi kunkin yksilön itsenäisesti. Normaali kudos saatiin sivuston kauempana ensisijaisen paksusuolen kasvain. Tuore kudokset leikattiin 6 um paksuus. Leikkeitä kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, kuivattiin ilmassa ja varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Hoidon jälkeen 10% normaalia vuohen seerumia ja 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 45 min, laseja inkuboitiin monoklonaalisen affiniteettipuhdistetulla hiiren anti-humaani-EpCAM (ab20160, Abcam) lopullisessa laimennoksena 1:200 ja monoklonaalinen affiniteettipuhdistettuja rotan anti-ihmisen integriini α6 (MAB1378, Milipore) lopullisessa laimennoksena 1:100 yön yli 4 ° C: ssa, pestiin kolme kertaa PBS: llä ja sen jälkeen inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa vuohen anti-hiiri-lgG1 AlexaFluor 568 (1:1000 laimennus) ja vuohen anti-rotta AlexaFluor 488 (1:1000 laimennus), niin Invitrogen. Levyjä pestiin kolme kertaa PBS: llä ja vastavärjättiin ydin- Hoechst 33342 (1:10000) 2 min. PBS-pesun jälkeen, objektilasit asennettu Fluorsave’lla (Calbiochem).

Western blotting

Solut lyysattiin 50 mM Tris pH 8,0, 120 mN NaCI: a, 0,5% NP-40, proteaasi inhibiittorit (Sigma-Aldrich) ja fosfataasi-inhibiittorit (Sigma-Aldrich). Yhtä suuret määrät solulysaattia ladattiin ja eroteltiin 4-12% Bis-Tris gradienttigeelissä (Life Technologies) ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore). Kalvo samanaikaisesti tutkittiin yli yön 4 ° C: ssa anti-CD10 (hiiri, 1:500, Abcam), ja anti-β-aktiini (hiiri, 1:8000, Sigma). Vuohen anti-hiiri-vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin havaittiin käyttäen parannettu chemilluminescent alustan (1:3000, Santa Cruz).

Kantasolujen merkki analyysi

Muita vasta-aineet monivärinen virtaussytometria CD44 -PE (Miltenyi, 1:1000), EpCAM-FITC (BD Biosciences klooni EBA-1, 1:1000), ja CD133-APC (Miltenyi AC133; 1:1000). Solut valmistettiin kuten edellä on kuvattu. FITC-konjugoitua isotyyppikontrolleja (Santa Cruz) käytettiin erikseen kullekin vasta-aineelle määrittää perustason värjäys ja korvaukset suoritettiin standarditekniikoiden mukaisesti. Multi-väri analyysi, yksi solulinja leimattiin kaikkien kolmen vasta-aineiden yhdessä putkessa, pestiin, ja ladattiin FACS Aria II virtaussytometrillä (BD Biosciences). Gatings ja koealojen konstruoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistopaketti.

Oncomine analyysi

Bioinformatics analyysit suoritettiin käyttäen Oncomine tietokannan (www.oncomine.org). Geenit kohteisiin arvioitiin perustuu p-arvo sulku 0,05 eikä ekspressiotaso suodatinta käytettiin.

Keskustelu

Tuloksellisempi syöpäpotilaille todennäköisesti luottaa uusien havaitsemiseen ja hoitoon menettelytavat ensisijainen ja etäpesäkkeitä. Täällä käytetään uuden korkean suoritustehon tekniikkaa käyttäen viivakoodilla vasta-ainetta array määritellä pinta-antigeenin profiilit paksusuolensyöpä johdetut solulinjat primaarinen ja metastaattinen kasvaimen kudoksessa. Olemme tunnistaneet useita yhteisiä ja ilmentyvät eri pinta-antigeenejä, mukaan lukien kokemukset ja hävisi siirryttäessä taudin pitkälle edenneen (taulukot 1, 2, ja 3). Vilkkaus tässä kuvatun järjestelmän aseiden tutkijoille mahdollisuuden seuloa maailmanlaajuisen proteiinin ilmentymisen poikki sairaustilojen ja /tai solujen vaste tietyille ärsykkeille. Niistä sovellukset tämän lähestymistavan, pinta TAA voitaisiin hyödyntää tautien seuranta ja hoito. Jotkut ita, kuten EpCAM, ovat jo tulleet kliininen valtakunnassa kykyä seurata taudeista. Muita ita pitäisi olla mahdollista lisätä spesifisyyttä ja luotettavuutta havaitsemisessa tuumorisoluissa joko in situ, liikkeessä, tai levittää soluja. Kohdentaminen TAA: iden kanssa monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös tarjota keinoja saavuttaa kasvaininhibitioaktiivisuuden kuten on jo osoitettu käytännössä Setuksimabihoitoa (Erbitux; vastaan ​​EGFR), rituksimabi (Rituxan; kohdistaminen CD20), ja tositumomab (kohdistaminen CD20). HER2-positiiviset kehittyneen eläimen syöpä voidaan estää trastutsumabi emtansine (anti-HER2-vasta-ainetta yhdistettynä mikrotubulusten estäjä) [29]. Lisäksi radioimmunoterapiassa, kuten ibritumomabitiuksetaani (kohdistaminen CD20), käytetään monoklonaalisia vasta-aineita toimittaa säteilyannosten suoraan kasvainkudokseen.

Vertailu meidän ehdokas markkereita tunnistaa proteiinin tason kautta virtaussytometrialla vastaan ​​RNA-pohjainen geeniekspression microarray tietokannat paksusuolensyöpä (Oncomine) tuetun meidän priorisointia. Kuitenkin luontainen biologinen katkaisee välillä RNA-transkriptien ja sisustukseen polypeptidien varoittaa käyttämällä tätä suodatinta lopullisena ratkaiseva tekijä valinnassa TAA: iden [5]. Pikemminkin suosimme validointi tietosisältöä TAA: iden pohjalta lisä- proteiinin tason määrityksissä useampiin potilaan näytteitä (esim. Immunohistokemia kudossiruina). Me validoitu integriini α6 potilaan koepaloja ehdokkaaksi kasvain biomarkkereiden poimittu meidän paneelin vasta-aineita. Lisätyötä on tarpeen käsitellä kliinisesti käyttökelpoisia integriinin α6 sekä muut havaitut pinta-antigeenejä kasvainsolun havaitsemisen ja hoidon suunnitteluun.

Tuloksemme profilointi ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa laajentaa niille, Zhou et al. että käytetään myös multipleksoidun vasta-aineen array [30] – [32]. Heidän Tutkimuksessa käytettiin slide-pohjainen painettu vasta-array (DotScan ™), jossa kattavuus 122 solunpintamarkkereiden. Löysimme johdonmukaisia ​​signaaleja useimmat, mutta eivät kaikki, niiden vasta-aineita, jotka reagoivat SW480 ja SW620 solulinjat, jotka voivat johtua näytteen valmistelua tai analyysimenetelmä. Toisin kuin DotScan vasta-array, vasta array tässä käytetty luotaa lähes kaksi kertaa niin paljon antigeenejä tavallisilla virtaussytometrialla tekniikoita saatavilla useimmissa tutkimuslaitoksissa ilman lisälaitteita tai ohjelmistoja (ts DotReader). Viivakoodaus solulinjoja voidaan edelleen skaalata käyttäen 10-kertaista laimennosta solunsisäisten väriaineita ja /tai kahden-leimattujen solujen [28]. Samanlainen DotScan menetelmällä on kuitenkin meidän vasta-aine array voidaan myös multipleksoida analysoida primaarikasvaimen näytteet, jotka sisältävät useita alapopulaatiot, jotka voidaan tunnistaa fluoresoivasti konjugoiduilla vasta-aineilla (esim epiteelikasvainsolut CEA-FITC ja hematopoieettisten solujen CD45-APC), kun taas vasta-pakassa on merkitty Alexa647. Vaihtoehtoisesti kasvain alapopulaatiot voidaan erottaa pohjalta fyysisten (esimerkiksi puoli väestöstä) tai toiminnallisia (esimerkiksi kantasolujen määritys) ominaisuudet leimaamalla näiden solujen kustannuksella ainakin yksi fluoresoiva kanavan muuten käytetään viivakoodaus. Esimerkiksi Aldefluor määritys on mahdollista leimaamalla ALDH1 ilmentäviä kantasoluja vihreä kanava uhraamalla CFSE viivakoodaus.

Useat tekijät vaikuttavat pinnan profiilin syöpäsoluja. Näistä kuuluu kasvuvaiheen solujen, kulttuuri media, kulttuuri astian alustan, ja tyyppi entsymaattisen irtoamisesta /dissosiaatio, joka voi hajottaa epitooppeja. Esimerkiksi hoito HCT116 koolonkarsinoomasoluissa papaiinilla (entsyymiä käytetään dissosiaatiota joitakin kiinteitä kasvaimia) vähensi havaitsemista CD44 välillä 93,4% alas 0,5% soluista, kun taas EpCAM ja CD133 (AC133) ei vaikuta merkittävästi (kuvio S7) . Siksi varovaisuutta tulisi käyttää suunniteltaessa kokeiluja ja tulkinnassa tietoja vasta-aineisiin perustuvia näyttöjä. Lisäksi meidän 5% cell positiivisuus cut-off voi jättää harvinaisia, mutta biologisesti relevantti solupopulaatioiden ja TAA biomarkkereiden.

Yhdistetty barcoding ja vasta-taulukot käytetty nykyisessä tutkimuksessa voitaisiin laajentaa nopeasti profiilin ylimääräisiä syöpäsolujen paksusuolen ja muiden kudosten tyyppejä. Kyky multiplex reaktioita vähentää kokeellinen vaihtelevuus, vasta-kulutus 10- 100-kertaisesti, ja aikaa suorittaa määrityksen. Lisäksi tämä lähestymistapa voidaan sovittaa samanaikaisesti profiloinnissa potilaasta johdettujen normaali, ensisijainen, ja /tai metastaattinen yksilöitä yhdessä määrityksessä murto aikaa ja kustannuksia. Määräysten sitova tunnettujen epitooppien käyttämällä kaupallisesti saatavia vasta-aineita nopeuttaa käännöstiede, joilla pyritään kehittämään parannettu kliinisiä lähteitä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Täydellinen vasta-array tuloksia. Täydellinen tulokset viivakoodilla vasta-joukko seulonta SW480, SW620 ja HCT116 CRC solulinjoissa. Asema kunkin vasta-levylle on merkitty rivit A-H ja sarakkeet 1-12. Tuottaa lämpökarttana ilmaisun antigeenien, yksittäiset solut värillinen perusteella niiden ilmentymisen arvon 0 (valkoinen) 100 (punainen). Huomaa, että rotta CD326 /EpCAM hyvin F10 hyväksytään ainoastaan ​​hiiren reaktiivisuus valmistajan ja on erilaista vasta kuin käytetty meidän immunofluoresenssimenetelmällä ja monivärinen virtaussytometria.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053015. S001

(DOCX) B Kuva S2.

histogrammit antigeeneistä taulukossa 1. Antigeenien ilmaistuna 50% kaikista soluista kaikissa kolmessa solulinjoissa. Tontti punaisella on vastaava isotyyppikontrolli.