Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tavoite

transkriptiotekijä E2A on ratkaisevan tärkeää normaalin kehityksen ja erilaistumisen B- ja T-lymfosyytit. Häiriöstä E2A johtaa leukemia ja kasvaimen kehittymisen sekä joitakin kiinteitä kasvaimia. Ilmaisu ja kliininen merkitys E2A sekä sen roolia peräsuolen syöpä (CRC) ovat vielä tuntemattomia. Tutkimuksen tavoitteena on arvioida E2A ilmentymisen CRC kudoksissa, arvioida sen ennustearvoa, ja tutkia sen roolia paksusuolen syöpäsolujen kasvua.

Methods

E2A ilmentymistä CRC kudoksissa ja normaali limakalvo havaittiin immunohistokemiallinen värjäys; Kaplan-Meier selviytymisen käyrä ja Coxin regressiomallia käytettiin arvioimaan ennusteen arvioinnissa E2A. Lentivirukselle käytettiin määritettäessä E2A vakaasti tippuu alas soluissa. MTT-määritystä käytettiin havaitsemaan solujen lisääntymistä muutos; solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla; ja chromatin immunosaostus (chip) määritystä käytettiin vahvistamaan ennustettu sitova tavoite E2A.

Tulokset

Expression of E2A oli alhaisempi CRC kudoksissa kuin normaali limakalvo; alhainen E2A ilme korreloi kehittynyt TNM ja suurempia kasvaimen kokoa, ja ennustettu huono ennuste CRC potilaista. E2A Knockdown lisännyt solujen lisääntymisen korko ja solusyklin kiihtyvyys. ChIP testi osoitti miR-320a oli välittömänä kohteena E2A ja ylössäätely miR-320a in E2A vaimentua soluissa voisi kääntää solujen lisääntymisen ja solukierron aiheuttamia muutoksia E2A puutos.

Johtopäätökset

E2A on riippumattoman ennustetekijä CRC potilaille ja tavoitteet miR-320a säätelemään solujen lisääntymistä koolonkarsinoomasoluissa.

Citation: Huang A, Zhao H, Quan Y, Jin R, Feng B, Zheng M (2014) E2A ennustaa ennuste peräsuolen syövän Potilaat ja säätelee syöpäsolun kasvuun Targeting miR-320a. PLoS ONE 9 (1): e85201. doi: 10,1371 /journal.pone.0085201

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 syyskuu 2013; Hyväksytty 25 marraskuuta 2013 Julkaistu: 13 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai taloudellista tukea National Natural Science Foundation of China (NSFC, 30873000). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nisäkkään E2A-geeni sijaitsee kromosomissa 19, ja se on ei-kudosta, erityisesti ja ekspressoituvat monenlaisia ​​solutyyppejä. Vaihtoehtoisten silmukoinnin, E2A geeni koodaa kaksi isoformia, E12 ja E47 (joita kutsutaan kuten E2A proteiinit), jotka molemmat ovat perus-Helix-Loop-Helix (bHLH) domain ja voi säädellä geenin transkriptiota sitoutumalla E-box-DNA sekvenssit, CAGGTG. Vaikka laajalti ilmaisi, E2A ei ole välttämätöntä joissakin organogeneses kuten luuston tai sydämen myogeneesin, erytropoieesin kondrogeneesiin, ja neurogenesis [1], mutta on tärkeä rooli kehityksen ja erilaistumista B [2], [3] ja T-lymfosyytit [4 ]. E2A hiirillä osoittivat pidätys pro-B-solujen vaiheen aikana B-solujen kehitystä [3] ja Siirtogeeniekspression joko E12 tai E47 voi osittain pelastaa B lymfopoieesin aloittamista; Samoin E2A puute johti lohkon varhaisessa vaiheessa T-solujen kehitystä [4] ja häiriintynyt tymosyyttiantigeeneista positiivinen valinta [5]. Lisäksi E2A on todettu olevan mukana joissakin solujen toimintaa kuten solujen erilaistumista [6], leviämisen [7], apoptoosin [8], solusyklin [9] ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [10].

sen lisäksi keskeinen rooli normaalissa B- ja T-solujen kehitystä, E2A osallistuu myös kasvainten synnyssä. Tutkimukset oli raportoitu vakiintunutta asemaa E2A in leukemogenesis: kaksi fuusioproteiinia, E2A-HLF [11] ja E2A-PBX1 [12], jotka molemmat sisältävät transaktivaatiodomeenin E2A ja DNA-sitovan domeenin HLF tai PBX1, voisi johtavat pro-B-solujen akuutti lymfaattinen leukemia (ALL) nuorilla ja pre-B-solujen ALL lapsilla vastaavasti [13]. Lisäksi E2A on todettu olevan mukana synnyssä kiinteiden kasvainten, joko onkogeeni tai kasvaimen estävä geeni. Läsnäolo E2A-PBX1 fuusioproteiinin keuhkosyöpä äskettäin raportoitu ja se korreloi eloonjäämisaste potilaiden keuhko adenokarsinooma in situ [14]. Lisääntynyt ilmentyminen E2A havaittiin rintasyövässä [15], [16] ja eturauhassyövän [17], joka todettiin edistää kasvaimen synnyssä. Kuitenkin hiiret, joilla mutaatiota E2A olivat herkkiä spontaanisti kateenkorvan lymfoomien [18] ja menetys E2A on ensisijainen nestekertymä lymfooma johti apoptoosin resistenssin [19], mikä viittaa siihen, vaihtoehtoinen tehtävä E2A, kuten kasvain-estävä geeni. Lisäksi E2A ilmentyminen on ehdotettu olevan diagnostista arvoa tiettyjen alatyypin mahalaukun MALT (limakalvon liittyvä imukudos) lymfooma [20]. Yhdessä E2A voi toimia kasvaimeen vaimennin geeni tai onkogeenin eri syöpiä.

Ilmaisu E2A kolorektaalisyövässä (CRC) ja sen ennusteen arvioinnissa ei ole käsitelty, ja se on edelleen tiedetä E2A edistää tai tukahduttaa kehittymistä CRC. Tässä tutkimuksessa tietojemme mukaan ensimmäistä kertaa selvitimme kliinistä merkitystä E2A CRC ja löysi sen hyödyllisyyttä ennustetyövälineenä merkki; Lisäksi löysimme E2A tukahdutti kasvaimen kasvua kohdistamalla miR-320a paksusuolen syöpäsoluissa, mikä osoittaa sen kasvain heikentävän rooli CRC.

Methods

Potilaiden ja kliinisissä näytteissä

kaikkiaan 98 kolorektaalisyövän potilasta osallistui; potilaita hoidettiin leikkauksen kesäkuun 2007 ja tammikuussa 2008 Shanghai vähän invasiiviset Surgery Center. Potilaat suljettiin pois, jos he: saaneensa neoadjuvant kemosädehoito; oli leikkaushoitoon kolorektaalisyövissä; oli kasvaimia muissa elimissä; oli epätodennäköistä kuultaviksi aikana seurannan. Demografiset ja kliinis tiedot uutettiin kaavio tarkastelu. Potilaat haastateltiin puhelimitse kolmeksi kuukaudeksi, kuusi kuukautta, ja sitten vuosittain leikkauksen jälkeen. Kasvaimen näytteet leikattiin välittömästi kirurgisista näytteistä ”poisto toimien aikana ja sen jälkeen kiinnitetään formaliinilla ja säilytettiin 4 ° C: ssa kaksi viikkoa ennen ensi hoidon; normaaleissa kudoksissa määriteltiin limakalvon sijaitsee vähintään 5 cm päässä kasvain marginaalin ja leikkaus, kiinteä, säilötyt ja käsiteltiin kuten edellä. Tämä tutkimus suoritettiin kirjallisen tietoon perustuva suostumus kaikista otetuista potilaista ennen leikkausta ja pöytäkirjan mukaisesti hyväksymän eettisen komitean Ruijin Hospital Shanghai Jiao Tong-yliopiston School of Medicine.

immunohistokemia ja pisteytys

Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin kuten protokolla on aiemmin kuvattu [21]. Lyhyesti, kun kiinnitys formaliinilla, kudokset upotettu parafiiniin, leikkaus, ja kiinnitetty dioja. Sitten levyjä pestiin ksyleenillä parafiini, jossa lajitellut etanolilla turpoavat, inkuboidaan sitraattipuskurilla hakea antigeeni, ja blokattiin 3% H

2O

2 inaktivoimaan endogeeninen peroksidaasi. Laseja inkuboitiin E2A-primaarisen vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA, 1:200 laimennos) 4 ° C: ssa yön yli, jonka jälkeen inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta (Santa Cruz) 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Monimutkaiset visualisointi tehtiin 2 Solution DAB Kit (Invitrogen). Negatiiviset kontrollit saatiin korvaamalla E2A ensisijainen vasta-aine kanin esi seerumia.

Kalvot tutkittiin kaksi tutkijaa (Huang ja Quan) itsenäisesti. Pisteytys käytetyt kriteerit olivat, kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutoksin. Värjäys intensiteetti pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (kohtalainen värjäytyminen), ja 3 (voimakas värjäytyminen); positiiviset solut kussakin osassa pisteytettiin 0 (alle 10%), 1 (10% -25%), 2 (26% -50%), ja 3 ( 50%). Lopullinen pistemäärä oli tuote kymmenien intensiteetin ja positiivinen solu kunkin dian. Diat 0-3 määriteltiin heikkoa ilmentymistä ja 4-9 korkean ilmentymisen.

Soluviljely

koolonsyöpäsolulinjaa LOVO, HCT116, Caco-2, HT29, SW480, ja SW1116 saatiin American Type Culture Collection (ATCC), ja niitä siirrostetaan ja säilötty Shanghai Institute of Digestive Surgery; normaalin ihmisen paksusuolen limakalvon epiteelin solujen NCM460 oli ystävällisesti lahjoittanut Jingqing Zeng (Ruijin sairaala, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, lahjoittajan osti NCM460 solulinjaan INCELL Corporation, LLC, San Antonio, TX, USA). LOVO viljeltiin F-12K ravinneseoksen Medium (Corning Cellgro®, MA, USA), HCT116 ja HT29 McCoyn 5A (Corning Cellgro®), SW480 ja SW1116 Leibovitzin L-15 (Corning Cellgro®), ja NCM460 vuonna DMEM (Corning Cellgro®). Kaikki elatusaineessa edellä on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Caco-2 viljeltiin Minimum Essential Medium (Corning Cellgro®), jossa 20% FBS. Solut sijoitettiin inkubaattoriin (Heracelles, Saksa) 37 ° C: ssa, kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2.

Proteiinin uutto ja Western blot

Solut kerättiin yhtymäkohdassa 80% RIPA (Solarbio, Peking, Kiina) ja proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA) mittaamalla OD

562 käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Epoch, BioTek, Winooski, USA) . Western blot suoritettiin aiemmin raportoitu protokollaa [22] ja ensisijainen käytetyt vasta olivat E2A (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA). GAPDH (Kangchen, Shanghai, Kiina) käytettiin latauskontrollina.

RNA ja microRNA eristys, qRT-PCR

Yhteensä solun RNA: t uutettiin käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen) ja kokosolu MikroRNA ( miRNA) uutettiin Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RNA käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time (TaKaRa, Shiga, Japani). MRNA taso E2A (eteenpäin: 5′-CCACT TCACT GAGTC GCACAG-3 ’; taaksepäin: 5′-GTCTC TCCCG AAGGA GGCATA-3′), arvioitiin qRT-PCR: llä käyttämällä SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems); RNA-tasolla ja GAPDH (eteenpäin: 5’-GGAGC Gagat CCCTC CAAAAT-3 ’; taaksepäin: 5′-GGCTG TTGTC ATACT TCTCA TGG-3’) käytettiin normalisointi. Ekspression miR-320a arvioitiin qRT-PCR: llä käyttäen Taqman microRNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), TaqMan MicroRNA Määritykset (Applied Biosystems), ja Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden; U6 miRNA taso käytettiin normalisointi.

Lentivirusvektorikonstruktit transfektion stabiilin ekspressioklooneilla

E2A /shRNA-eGFP-lentivirus hiukkasia ja E2A /sh-negatiivinen kontrolli (shNC) -eGFP-lentivirukselle hiukkasia eli E2A /shRNA-LV ja E2A /shNC-LV, ostettiin Novobio (Shanghai, Kiina). shNC syntetisoitiin samalla perustaa shRNA mutta salattu sekvenssin. Lentiviruksen transfektio ja solujen seulonta suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden perustaa E2A stabiilisti vaimentua ja stabiilisti NC transefected SW480 klooneja, eli SW480 /shE2A ja SW480 /shNC. Transfektiotehokkuutta arvioitiin silmämääräisen tarkastuksen prosenttiosuuden eGFP ilmentävien solujen alle fluoresenssimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani), western blot, ja qRT-PCR.

Ohimenevä transfektio

Plasmidit, PEZ-M29-E12 (plasmidi koodaus isoformin E12), pez-M29-E47 (plasmidi koodaus isoformin E47), pez-M29-NC (plasmidi negatiivinen kontrolli sekvenssi) ja vektori valvonta ostettiin Genecopoeia (Rockville, MD, USA) ja vahvistanut sekvensointi; miRNA-320a matkii (double-RNA-molekyylien matkien miR-320a) ja jäljittelee NCS (negatiivinen kontrolli sekvenssit perustuvat C. elegans MikroRNA minimaalinen identtisyys ihmisen) ostettiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Soluja log-vaiheen kerättiin ja istutettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 4 * 10

5 solua /kuoppa, 24 tuntia ennen transfektiota. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) käytettiin transfektiota varten, mukaisesti valmistajan ohjeiden. Tehokkuutta lyhytaikaisella transfektiolla tutkittiin western blot tai qRT-PCR. Solut, jotka on transfektoitu vektoreilla, käytettiin kontrollina.

Soluproliferaatiomääritys

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japani). Lyhyesti, solut hajotettiin trypsiinillä (Beyotime, Shanghai, Kiina), pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kahdesti, suodatetaan siivilä (BD Falcon), suspendoitiin uudelleen RIPA 1640 väliaineessa, laskettiin ja laimennettiin lopulliseen pitoisuuteen 5 solua /pl. Sitten solut ympättiin 96-kuoppalevyille, 200 ui (1000 solua) per kuoppa, in sixplicate, ja laitettiin inkubaattoriin 6 päivää. Elävät solut kvantitoitiin jokaisena 24 tunnin välein kanssa CCK8 mukaisesti valmistajan protokollan, ja absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin käyttämällä mikrolevyjen lukijaa (Epoch, BioTek).

Solusyklianalyysiä

Ennen analyysiä varten solut (2 x 10

6) kerättiin 48 tunnin kuluttua lyhytaikaista transfektiota, sekä vastaavat säätimet. Sitten solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, kiinnitettiin 75% etanolilla ja varastoitiin 4 ° C: ssa yön yli. Kun analysoidaan, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja käsiteltiin RNaasi 37 ° C: ssa tunnin ajan, mitä seurasi värjäys propidiumjodidia 30 minuutin ajan pimeässä. Solusyklianalyysiä sitten suoritettiin virtaussytometrillä (FACSCalibur, Becton Dickinson, MD, USA).

Kromatiini immuunisaostustesti

EZ-chip ™ Kromatiini Immunosaostaminen Kit (Millipore, Billerica, MA, USA ) hankittiin suorittaa chIP määrityksen mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, yksi 15 cm soluviljelylevy of SW480-solujen (noin 80% yhtymäkohta) kiinnitettiin 1% PFA (Sigma). Sitten solut hajotettiin, sonikoitiin leikkausvoimien DNA ja immunosaostettiin anti-E2A (Santa Cruz) ja kontrollivasta-aineella (IgG). Sen jälkeen proteiini /DNA ristisidosyhdisteiden oli päinvastainen ja DNA puhdistettiin seuraaville PCR käyttäen Takara Ex Taq Hot Start Version (Takara).

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttämällä SPSS 15.0 ohjelmistolla. Korrelaatio kliinisten tekijöiden kanssa E2A ilmentymistä tutkittiin Pearsonin korrelaatio analyysi. Vaikutus E2A eloonjäämiseen arvioitiin käyttäen Kaplan-Meierin käyrä ja log-rank-testi. Yhden ja usean Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin arvioitaessa vaikutuksia E2A ilmaisun ja kliinis parametrit 5 vuoden OS ja DFS, vastaavasti. Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan eroja kahden ryhmän ja yksisuuntaista ANOVA käytettiin tapauksessa koostui enemmän kuin kaksi ryhmää. Kahden pyrstö arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression of E2A korreloi CRC patologinen vaiheissa

Ensinnäkin arvioimme ilmentymistä E2A-proteiinia CRC kudoksissa ja normaali limakalvo immunohistokemialla (kuvio 1). Peräsuolen kasvain näytteet on saatu 98 CRC potilaista ja normaali limakalvo saatavana 43/98 potilasta tutkittiin. Väestörakenteen ja kliinis parametrit kaikki mukana potilaita on esitetty taulukossa 1. Niistä 98 potilasta, korkea ilmentyminen E2A havaittiin 35/43 normaali limakalvo ja 39/98 tuumorikudoksia (

P

0,01) . Värjäytymistä E2A normaalissa limakalvon esitetty tumassa ja sytoplasmassa molemmat, mutta syövän kudoksissa, E2A värjäytyminen oli pääasiassa ydinvoiman (kuvio 1). Vielä tärkeämpää on, ekspressio E2A laski CRC etenee (kuvio 1E-H). Sitten teki korrelaatioanalyysiä tutkia yhdistyksen välillä E2A ilmaisun ja kliinis tekijöistä. Kuten taulukosta 2, alhainen ilmentyminen E2A oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan TNM (

P

0,01) ja suurempi kasvaimen kokoa (

P

= 0,035), mutta ei liittynyt vanhemmille potilaille (

P

= 0,761), sukupuoli (

P

= 0,655), kasvainhistologiaa (

P

= 0,985), tai kasvain sivusto (

P

= 0,120). Näin E2A oli todennäköisesti mukana kehittämässä ja etenemiseen CRC.

Kuvat ovat IHC näkyvät: (A) HE värjäys normaalin limakalvon; (B) HE värjäys CRC kudoksen; (C) korkea E2A lauseke (ruskea väri) esitetään ydin- ja sytoplasman värjäytymistä normaalissa limakalvolla; (D) alhainen E2A ilmentymistä normaalissa limakalvolla; (E-H) vaiheen I (E) II vaiheen (F), III (G), ja IV (H) CRC kudosten eri E2A värjäytymisvoimakkuuksia; E2A esiintyi pääasiassa tumassa. Kuvat on otettu alle 200-kertainen suurennus.

Alhainen ilmentyminen E2A ennusti huonon ennusteen CRC potilaiden

tutkimiseksi ennusteen arvioinnissa E2A, käytimme Kaplan -Meier 5 vuoden pysyvyys käyrä näyttää erot tulosten välillä matala ja korkea E2A ilmaisun CRC potilaille. Kuten kuvassa 2, potilaalla on korkea E2A ilme oli enää 5 vuoden yleinen (OS) ja sairauksien elinaika (DFS) kuin potilailla, joilla on alhainen ilme. 5 vuoden OS ja DFS suuren E2A ilmaisun potilaat olivat 84,6% ja 82,1%, ja potilaille, joilla on alhainen E2A ilme olivat 47,5% ja 42,4% (

P

= 0,000, OS ja DFS molemmat). Seuraavaksi käytimme Coxin regressiomallin tutkia ennusteen arvioinnissa E2A. Vuonna univariate analyysi, TNM ja E2A ilmaisun havaittiin ennustavan OS ja DFS; kun taas Monimuuttuja-analyysissä, molemmat tekijät ennusti myös huonompi kliinisiä tuloksia (taulukko 3). Siksi E2A ilme näytti olevan käyttökelpoinen ennustava tekijä ennusteen CRC potilaista.

(A) OS korkean ja matalan E2A ilmaisun potilaita; (B) DFS korkean ja matalan E2A ilme potilaille. Potilaat, joilla on korkea E2A ilme on suotuisampi OS ja DFS (

P

= 0,000, OS ja DFS molemmat).

inhibitio soluproliferaation E2A CRC soluissa

Koska kliinistä merkitystä E2A, halusimme kysyä E2A ollut merkitystä kehittämisessä CRC. Kuusi koolonsyöpäsolulinjoissa, LOVO, HCT116, Caco-2, HT29, SW480, ja SW1116 ja normaaleihin ihmisen paksusuolen limakalvon epiteelin solujen NCM460 seulottiin E2A ilmentymistä käyttäen western blot (kuvio 3A). Seitsemästä solulinjoissa, NCM460 osoitti paljon korkeampi E2A ekspressiotaso kuin kaikki muut syöpäsolut. Yhdessä kanssa sen ilmentymistä CRC potilailla, E2A merkittävästi vaimentua CRC kudosten ja solujen.

(A) ilmentyminen E2A normaaleissa ihmisen paksusuolen limakalvon epiteelin solujen NCM460 ja CRC-solujen linjat osoitettiin Western blot. GAPDH käytettiin lastaus valvonta; (B) ja (D) Solut, joissa vaimentua E2A ilme (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) osoitti korkeampia soluproliferaatioon nopeudella kuin negatiivisen kontrollin (SW480 /shNC, Caco-2 /shNC) ja villin tyypin (SW480 /WT, Caco-2 /WT-solut); (C) ja (E) Vanhempien soluja (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) kotransfektoitiin kanssa E12 tai E47-plasmidi (SW480 /shE2A_E12 ja SW480 /shE2A_E47, Caco-2 /shE2A_E12 ja Caco-2 /shE2A_E47) palauttaa E2A ilme. Co-transfektoiduissa soluissa osoitti vähentynyt soluproliferaation nopeus kuin vanhempien tai vektorisäätö (SW480 /shE2A_VC, Caco-2 /shE2A_VC) transfektoitujen solujen. Kaikki tiedot edustettuina keskiarvona ± SD 3 erilliselle kokeelle. (*,

P

0,05).

suoraan tutkimiseksi funktio E2A rakensimme E2A vakaasti tippuu alas klooni, SW480 /shE2A soluja, ja negatiivisen kontrollin klooni, SW480 /shNC soluja, jossa E2A /shRNA-LV ja E2A /shNC-LV vastaavasti. Knockdown tehokkuutta validoitiin Western blot ja qRT-PCR (Kuva S1 A). Sitten me havaittu solujen lisääntymisen muutokset SW480 /shE2A ja SW480 /shNC solujen MTT-määritystä, käyttäen villityypin SW480-soluja (SW480 /WT) kontrollina. Kuten kuviossa 3B, SW480 /shE2A osoitti korkeampi leviämisen nopeudella kuin SW480 /shNC ja SW480 /WT soluja, mikä osoittaa tukahduttava roolia E2A in leviämisen. Edelleen osoittaa anti-leviämisen rooli E2A, suoritimme kotransfektiojärjestelmää vakaissa SW480 /shE2A solujen kaksi plasmidia, pez-M29-E12 (koodaa isoformin E12) ja pez-M29-E47 (koodaa isoformin E47) kompensoimaan downregulation vaikutus shE2A. Kotransfektioon pelasti E2A ilmaus SW480 /shE2A solujen normaalille tasolle (kuva S1 A) ja palautti myös leviämisen korko (kuvio 3C). Lisäksi transfektoimalla E12 tai E47 osaksi villityypin SW480-soluissa voisi merkittävästi estää soluproliferaatiota ja eston aiheuttamia E12 ja E47 eivät osoittaneet mitään eroja (kuva S1 B). Jos haluat jättää solun linjariippuvia mahdollisuus rakensimme Caco-2 /shE2A ja Caco-2 /shNC klooneja toista edellä kokeissa ja tulokset osoittivat E2A oli sama anti-leviämisen rooli Caco-2-solut (kuva 3D E) . Lisäksi olemme manipuloitu E2A ilmentymistä NCM460 soluissa. E2A hiljentäminen ja palauttaminen vaikutti myös NCM460 solujen kasvua estävää tavalla (kuva S1 C). Lopullisesti, E2A saattaa olla negatiivinen säätelijä proliferaation koolonkarsinoomasoluissa.

E2A säädellä solusyklin etenemistä SW480-solujen

Seuraavaksi halusimme tietää mekanismeja, joilla E2A säänneltyjen SW480-solujen lisääntymisen. Aiemmissa julkaisuissa E2A oli raportoitu osallistuvan solusyklin säätelyssä [9], [23], [24]. Niinpä teimme solusyklin analyysi virtaussytometrialla havaita mahdolliset muutokset jälkeen E2A downregulation ja palauttaminen. Johdonmukaisesti, muutos solusyklin selitetty muutos solujen lisääntymisen: kuten on esitetty kuviossa 4A, solusyklin SW480 /shE2A solujen poikkesi SW480 /shNC ja SW480 /WT-solut, joissa on enemmän soluja eteni S-vaiheeseen, mikä viittaa solujen lisääntymisen. Kun SW480 /shE2A solut kotransfektoitiin joko E12 tai E47-plasmidi, solusyklin normalisoitui, mikä oli kanssa palauttaminen soluproliferaation (kuvio 4B). Lisäksi transfektoimalla E12 tai E47 osaksi villityypin SW480 pienensi S vaiheessa olevien solujen (kuvio S1 D). Samanlaisia ​​sääntelyn vaikutuksia havaittiin myös NCM460 soluissa (kuvio S1 E). Siten E2A voi säädellä solusyklin kontrolloida soluproliferaatiota.

(A) alassäätely E2A in SW480-soluissa johti lisäystä solujen S-vaiheeseen ja samanaikaisesti laskua solujen G1 /G0 vaihe; (B) ektooppinen ilmentyminen E12 tai E47 lisääntynyt solujen G1 /G0 vaiheessa SW480 /shE2A solujen ja vähentää S-vaiheessa olevien solujen. Data edustaa keskiarvoja ± SD 3 erilliselle kokeelle. (*,

P

0,05).

E2A ohjataan solukierron kohdistamalla miR-320a

Edellä esitetty vielä johti meidät tutkimaan, kuinka E2A säännelty solusyklin muutos. Viime vuosikymmeninä MikroRNA (miRNA) on todettu olevan osallisena patogeneesissä ihmisen sairauksia kuten syöpää [25]. Yllättäen löysimme yksi miRNA, miR-320a, joka oli aggressiivisuutta vähentävänä [26], on säännelty E2A. In SW480 /shE2A solujen ilmentymisen miR-320a säädeltiin vähentävästi (kuvio 5A) ja transfektio joko E12 tai E47 tähän ryhmään soluja (kuvio 5B) tai osaksi villityypin SW480-soluja (kuvio S1 F) voi säädellä lisäävästi miR-320a . Sen tutkimiseksi, miR-320a oli tavoite suoraan säännelty E2A, suoritimme kromatiinin immunosaostuksella (chip) määritys. Tulokset osoittivat, että E2A voisivat sitoutua E-box (GCAGGTG, at -138bp, ylävirtaan miR-320a stemloop) Mir-320a, mikä viittaa E2A voi säätelemään miR-320a kohdistamalla sen promoottorisekvenssi suoraan (kuvio 5C) .

(A) miR-320a ilmentyminen väheni SW480 /shE2A soluista kuten on esitetty qRT-PCR; (B) Co-transfektion E12 tai E47 osaksi SW480 /shE2A solut voitaisiin normalisoida ilmaus miR-320a; (C) Ylempi paneeli: sekvenssi miR-320a-geeni, joka esittää E-box, ennustettu sitoutumiskohta E2A; alempi paneeli: ChIP testi osoitti E2A sidottu miR-320a sen E-box, GCAGGTG; Kotransfektoimalla miR-320a jäljittelee päinvastaiseksi solusyklin muutokset (D) ja solujen kasvua (E) SW480 /shE2A soluja; (F) Co-transfektointi miR-320a matkii laski soluproliferaatiota nopeudella Caco-2 /shE2A soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD 3 erilliselle kokeelle. (*,

P

0,05).

Sitten kysyimme miR-320a oli tavoite, jonka kautta E2A säänneltyä solujen lisääntymistä. Transfektoimalla miR-320a matkii osaksi SW480 /shE2A soluja, löysimme solusyklin etenemisen aiheuttamia E2A Knockdown pidätettiin ja soluproliferaatiota oli pienentynyt (kuvio 5D (B) transfektointi E12 tai E47 estyy SW480 /WT solujen kasvua; (C) E2A säätelee solujen kasvua NCM460 soluissa; (D) transfektointi E12 tai E47 lisääntynyt G

0 /G

1 vaiheen SW480 /WT soluja ja vähensi S-vaiheeseen; (E) E2A säätelee solusyklin etenemisen NCM460 soluissa; (F) transfektointi E12 tai E47 voimistunut ilmentyminen miR-320a, verrattuna negatiiviseen kontrolliin.