Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Resveratrol, luonnossa esiintyvä phytopolyphenol yhdiste, on herättänyt laajaa kiinnostusta viime vuosina, koska se on erilaisia ​​farmakologisia ominaisuuksia. Vaikka resveratrol hallussaan chemopreventive ominaisuuksia vastaan ​​useita syöpiä, molekyylitason mekanismeja, joilla se estää solujen kasvua ja indusoi apoptoosin ei ole ymmärretty. Tämä tutkimus toteutettiin tutkia PI3K /AKT /FOXO reitin välittää biologisia vaikutuksia resveratrol.

Menetelmät /Principal Havainnot

Resveratroli inhiboi fosforylaatiota PI3K, AKT ja mTOR. Resveratrol, PI3K-estäjien (LY294002 ja Wortmanniini) ja AKT-estäjällä yksinään hieman aiheuttaman apoptoosin LNCaP-soluissa. Nämä inhibiittorit entisestään apoptoosin indusoiva potentiaali resveratrolin. Yli-ilmentymisen villityypin PTEN hieman aiheuttamaa apoptoosia. Villityypin PTEN ja PTEN-G129E parannettu resveratroli indusoiman apoptoosin, kun taas PTEN-G129R ei ollut vaikutusta proapoptoottiset vaikutuksista resveratrol. Lisäksi apoptoosin indusoiva potentiaali resveratrolin parannettiin hallitseva negatiivinen AKT, ja inhiboi villityypin AKT ja konstitutiivisesti aktiivinen AKT. Resveratrol ei ole vaikutusta ekspression FKHR, FKHRL1 ja AFX geenejä. Esto FOXO fosforylaation resveratroli johti sen tumaansiirtymiseen, DNA: ta sitova ja transkription aktiivisuutta. Estyminen PI3K /AKT-reitin indusoi FOXO transkriptioaktiviteettia jolloin induktion Bim, TRAIL, p27

/KIP1, DR4 ja DR5, ja esto sykliini D1. Samoin resveratroli aiheuttama FOXO transkription aktiivisuutta entisestään, kun aktivoitumisen PI3K /AKT-reitin oli tukossa. Yli-ilmentyminen fosforylaation mutantteja on FOXO proteiinien (FOXO1-TM, FOXO3A-TM ja FOXO4-TM) indusoi FOXO transkriptionaalisen aktiivisuuden, joka edelleen parantaa resveratrol. Esto FOXO transkriptiotekijöiden mukaan shRNA tukossa resveratroli aiheuttaman säätelyä Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/KIP1 ja apoptoosin, ja esto sykliini D1 resveratrol.

Päätelmä /merkitys

Nämä tiedot viittaavat siihen, että FOXO transkriptiotekijöiden välittävät antiproliferatiivisia ja proapoptoottisiin vaikutuksia resveratrol, osittain johtuen aktivoinnin ulkoista apoptoosireitin.

Citation: Chen Q, Ganapathy S, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol indusoi kasvun pysähtymisen ja apoptoosin avulla aktivointi FOXO transkriptiotekijöiden eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 5 (12): e15288. doi: 10,1371 /journal.pone.0015288

Editor: Irina Lebedeva, Enzo Life biotieteiden, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1. syyskuuta 2010 Hyväksytty 4 marraskuuta 2010 Julkaistu: 14 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti tukivat tukea (NIH R01CA114469 kohteeseen RKS) National Institutes of Health (www.nih.gov). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä, yksi yleisempiä kasvaimet länsimaissa, syntyy kehittämällä vaiheittain yhden tai useamman ennalta neoplastisia vaurioita osaksi adenokarsinooma, ja myöhemmin etäpesäkkeitä [1]. Viimeaikaiset edistysaskeleet ovat tunnistaneet avain geneettisiä muutoksia, jotka voivat aloittaa eturauhasen syövän synnyn ja parantaa todennäköisyys syövän etenemisen. Eturauhassyöpä solut ovat vain hieman reagoivat tai jopa reagoimatta sytotoksisia vaikutuksia kemoterapeuttisten aineiden tai sädehoidon. Kohonneet pitoisuudet sytotoksisten lääkkeiden ja suuremmat annokset säteilytyksen eivät parantaa hoitovaste, ja se johtaa resistenssin apoptoosia eturauhasen syöpäsoluja. Näin ollen on välttämätöntä tunnistaa syövän vastaisia ​​aineita, jotka ovat myrkyttömiä ja erittäin tehokas apoptoosin edullisesti kasvainsoluissa.

Epidemiologiset tiedot tukevat käsitystä, että luonnossa esiintyviä yhdisteitä ihmisten ruokavaliossa voi olla vailla toksisuutta ja niillä on pitkä pysyviä suotuisia vaikutuksia ihmisten terveyteen. Resveratrolin on osoitettu olevan useita mahdollisia chemoprotective toimintaa solu- ja eläinmalleissa [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], mukaan lukien inhibointi PI3K /AKT-reitin [2], [6], [8], [10]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että RESVERATROLI tehostaa terapeuttista potentiaalia TRAIL säätelemällä kuolemareseptorien (TRAIL /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5) sekä harjoittaa mitokondrioiden koulutusjakson apoptoosin [2], [3]. Poistaminen tai mutaatio PTEN on ollut pääasiallinen syy aktiivisessa muodossa olevaa AKT johtaa eturauhasen syövän syntymistä ihmisessä [11], [12]. Siten resveratroli voi olla potentiaalinen ehdokas kohdesoluihin kanssa PTEN poistamalla tai inaktivoimalla ja tehostetun AKT-vaikutusta precancerous eturauhasen kudosta.

PI3K signalointi on keskeinen rooli solunsisäisessä signaalitransduktioreitteihin mukana solutransformaatioon, solujen kasvua, ja kasvaimien syntyyn. Inaktivointi AKT tuloksia defosforyloinnilla ja aktivointi FOXO transkriptiotekijöiden, raportoitu välittävän solusyklin pysähtymiseen, DNA: n korjaukseen, ja apoptoosin [13], [14]. Nämä transkriptiotekijät, kuuluvat ”O” alaryhmä siivekäs kierteen /forkhead transkription tekijä perheen, pääasiallisesti vain neljä jäsentä FOXO1, FOXO3a, FOXO4, ja FOXO6 [15]. FOXO proteiinit ovat evoluutiossa säilyneitä transkriptiotekijöitä osallisena useissa olennainen solun prosesseja, jotka toimivat päätepisteenä transkription ohjelmien mukana apoptoosin, stressin vastaus ja pitkäikäisyys [16], [17], [18], [19], [20]. Kumoaminen FOXO toiminto havaitaan usein ihmisen syöpään [17], [21], joten mekanismit sääntelyn FOXO proteiinien kiinnitetään yhä enemmän huomiota syöpätutkimukseen. FOXO proteiinit yhdistää sääntely tuotantopanokset eri ylävirran signalointireittien kaikkea vastauksena kasvutekijän ja stressi signalointi [17], [21]. Äskettäin FOXO tekijät on perustettu tuumorisuppressorien, edistää transkriptiota pro-apoptoottisten molekyylien, kuten FasL ja Bim kun PI3K /AKT-reitin on vaimentua vuoksi ravintoaineen tai seerumistarvaatio ja solustressiä [22], [23], [24 ]. Kolmen poistogeeninen hiiri malleissa osoittautunut tuumorisuppressorigeenin ominaisuudet FOXOs, kuten hiiriä samanaikaisesti puuttuu tärkeimmistä jäsenistä nisäkkään FOXO alaperheen, FOXO1, FOXO3a ja FOXO4, ovat alttiita kehittämään hemangioomat ja lymfoproliferatiiviset sairaudet [25]. Sitä vastoin yksittäiset tai pariksi inaktivaation FOXO1, FOXO3a tai FOXO4 johti vähemmän vaikea muoto, joka tukee ajatusta toiminnallinen redundanssi näiden FOXO tekijät [25]. Lisäksi, pakko ilmentyminen FOXO on osoitettu estävän tuumorigeneesiä ksenograftimalleissa nude-hiirissä [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Näin ollen, aktivoituminen FOXO perustuu sen tuumorisuppressorigeenin ominaisuuksia pidetään hyvin houkutteleva syövän strategiaa. Koska FOXO proteiineja on raportoitu olevan kriittisiä välittäjiä apoptoosin indusoiman syöpälääkkeiden, me olettaisi, että FOXO ilmentymistä tai transkriptionaalista aktiivisuutta voisi olla merkittävä tapahtuma vaikutukset välittyvät resveratrol.

tavoitteet Tutkimuksemme oli tutkia vaikutukset PI3K /AKT-reitin sääntelystä FOXO transkriptiotekijöiden ja tavoitteensa geenituotteita, ja arvioida, onko PI3K /AKT /FOXO reitin säätelee antiproliferatiivisia vaikutuksia resveratrol eturauhasen syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että estäminen PI3K /AKT-reitin parannettu FOXO DNA: ta sitovan ja transkriptionaalisen aktiivisuuden, jolloin sääntelyä sen geenituotteiden (TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27

/KIP1 ja sykliini D1). Inhibitio PI3K /AKT reitin tai yliekspressio FKHR, FKHRL1 ja AFX parannettu resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta. Sen sijaan, esto FKHR, FKHRL1 tai AFX estetty resveratrol indusoima TRAIL, DR4, DR5, Bim ja p27, ja inhiboivat ilmentymistä sykliini D1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli indusoi apoptoosia ja kasvun pysähtymisen aktivaation kautta FOXO transkriptiotekijöiden, ja inhibitio PI3K /AKT-reitin aktivoi FOXO transkriptiotekijöiden ja parantaa edelleen antiproliferatiivisia ja proapoptoottiset vaikutuksia resveratrol.

Tulokset

esto PI3K /AKT-reitin parantaa resveratroli aiheuttaman apoptoosin eturauhassyövän soluissa

ensin tarkasteltiin vaikutuksia farmakologinen esto AKT mukaan LY294002, Wortmanniini tai AKT-estäjällä resveratroliin aiheuttaman apoptoosin LNCaP-soluissa (kuvio. 1A). Resveratrol aiheuttama apoptoosin LNCaP. Samoin LY294002, Wortmanniini tai AKT-estäjällä hieman, mutta merkittävästi aiheuttamaa apoptoosia. Esikäsittely LNCaP-solujen LY294002, Wortmanniini tai AKT-estäjällä merkittävästi parannettu resveratroli aiheuttama apoptoosin 48 tuntia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio PI3K /AKT-aktiivisuuden farmakologinen lähestymistapa parantaa resveratrol: n indusoiman apoptoosin.

(A), LNCaP-solut esikäsiteltiin LY294002 (1 uM), Wortmanniini (1 uM) tai AKT-estäjällä (100 nM) 2 tuntia, mitä seuraa käsittely resveratrolin (20 uM) 48 tunnin ajan. Lopussa itämisaika, solut kerättiin ja apoptoosi mitattiin TUNEL-määrityksellä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SE. *, # Ja ** = merkitsevä ero valvontaluetteloihinsa (P 0,05). (B), LNCaP-solut transfektoitiin ohimenevästi tyhjän vektorin, PTEN-WT, PTEN-G129E tai PTEN-G129R. Viljelyväliaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin kanssa tai ilman resveratrolin (20 uM) 48 tunnin ajan, ja apoptoosi mitattiin TUNEL-määrityksellä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SE. *, **,% Ja $ = merkitsevä ero valvontaluetteloihinsa (P 0,05). (C), LNCaP-solut transfektoitiin ohimenevästi tyhjän vektorin, WT-AKT, CA-AKT tai DN-AKT. Viljelyväliaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin kanssa tai ilman resveratrolin (20 uM) 48 tunnin ajan, ja apoptoosi mitattiin TUNEL-määrityksellä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SE. *, **, # Ja% = merkitsevä ero valvontaluetteloihinsa (P 0,05). (D), Resveratrolin ilmentymistä koskevat PI3K, AKT ja mTOR kautta. LNCaP-soluja käsiteltiin resveratrolin (20 uM) eri ajankohtina. Western blotit suoritettiin anti-fosfo-PI3K, fosfo-AKT, anti-AKT ja fosfo-mTOR vasta-aineita. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Tiedot edustavat kolmen kokeen.

tuumorisuppressorigeenin PTEN on usein inaktivoitua ihmisen eturauhasen syövissä. Inaktivointi PTEN voi aiheuttaa konstitutiivinen fosforylaatio ja aktivaatio AKT, joka parantaa solujen kasvua ja syövän etenemiseen. Koska LNCaP-solut ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AKT, pyrimme tutkia roolia PI3K /AKT-reitin resveratroliin indusoiman apoptoosin. LNCaP-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla tai ekspressoivan plasmidin villityypin PTEN, PTEN-G129E tai PTEN-G129R ja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa resveratrolin (Fig. 1 B). Resveratrol indusoi apoptoosin LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. Transfektio LNCaP-solujen villityypin PTEN merkittävästi parannettu resveratroli indusoiman apoptoosin. Yli-ilmentymisen PTEN-G129E tai PTEN-G129R LNCaP-soluissa merkittävästi esti resveratroli aiheuttaman apoptoosin kuin transfektoitu villin tyypin PTEN. Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio AKT-aktiivisuuden yliekspressio PTEN lisää apoptoosia indusoiva potentiaali resveratrol.

Koska yliekspressio PTEN parantaa resveratrol: n indusoiman apoptoosin, me säädellään AKT ilmentymisen villityypin AKT (WT-AKT), konstitutiivisesti aktiivinen AKT (CA-AKT) ja hallitseva negatiivinen AKT (DN-AKT). LNCaP-solut transfektoitiin väliaikaisesti tyhjällä vektorilla, WT-AKT, CA-AKT tai DN-AKT ja käsiteltiin kanssa tai ilman resveratrolin (20 uM). Transfektio LNCaP-solujen tyhjän vektorin, WT-AKT tai CA-AKT ei ollut vaikutusta apoptoosiin (Fig. 1 C). Resveratrol aiheuttama apoptoosin tyhjän vektorin transfektoiduissa soluissa. Yli-ilmentymisen WT-AKT tai CA-AKT LNCaP-soluissa esti resveratroli indusoiman apoptoosin. Yli-ilmentymisen DN-AKT yksin merkittävästi indusoi apoptoosin. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen DN-AKT parannettu resveratrolin: n indusoiman apoptoosin. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio PI3K /AKT-reitin geneettisellä ja farmakologiset keinot lisätä resveratrol indusoiman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa.

resveratrolin inhiboi fosforylaatiota PI3K ja AKT

Koska PI3K /AKT reitti estää resveratrol: n indusoiman apoptoosin, pyrimme vaikutusten tutkimiseksi resveratrolilla fosforylaation PI3K ja AKT (Fig. 1 D). LNCaP-soluja käsiteltiin resveratroli ja tätä fosforylaatiota PI3K ja AKT tutkittiin Western blot-analyysi. Resveratroli esti fosforylaatiota PI3K ja AKT ajassa riippuvaisella tavalla. Fosforylaation näiden kinaasien poistettiin 48 tuntia. Resveratrol ei ollut vaikutusta ilmaisun koko AKT: tä.

Koska mTOR on alas-virta AKT, me vieressä on halunnut tutkia resveratrol myös säätelee fosforylaatio mTOR. Kuten on esitetty kuviossa. 1D, resveratroli inhiboi fosforylaatiota mTOR. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi estää fosforylaatiota molempien PI3K /AKT ja mTOR proteiineja, ja siten on suuri merkitys välittämisessä antiapoptoottisia vaikutuksia resveratrol.

Resveratrol ei ole vaikutusta ilmaisun FKHR, FKHRL1 ja AFX, mutta inhiboi fosforylaatiota FOXO proteiinien

PI3K /AKT-reitin on osoitettu säätelevän fosforylaation FOXO proteiinien [33]. Siksi mitataan ilmentymistä FOXO geenien RT-PCR: llä, ja fosforylaatio FOXO proteiinien Western blot -analyysillä. Resveratrol ei ollut vaikutusta ilmentymistä FKHR, FKHRL1 ja AFX mitattuna RT-PCR: llä (Fig. 2A). Meidän vieressä on halunnut tutkia resveratrol säätelee fosforylaatio FOXO proteiineja. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, resveratrol inhiboi fosforylaatiota FKHR, FKHRL1 ja AFX. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi estää fosforylaation FOXO proteiineja, jotka ovat alas stream AKT: n, ja defosforylaation FOXO jonka resveratrol voi aiheuttaa sen aktivoitumisen kautta tumaansiirtymiseen.

(A), Effects of resveratrol on ilmaus FKHR, FKHRL1 ja AFX. LNCaP-soluja käsiteltiin resveratrolin (10 tai 20 uM) ja 6, 12 tai 24 h. Kokonais-RNA eristettiin ja RT-PCR-analyysi suoritettiin mittaamaan ilmentymisen FKHR, FKHRL1 ja AFX. (B), vaikutukset resveratrolilla fosforylaation FOXO proteiineja. LNCaP-soluja käsiteltiin resveratrolin (20 uM) ja 0-48 h, ja Western blot analyysit suoritettiin mitata ilmentymisen fosfo-FKHR, fosfo-FKHRL1 ja fosfori-AFX. p-Actin käytettiin latauskontrollina. (C), resveratrolin indusoi translokaatio FKHR sen ydin. LNCaP-soluja siirrostettiin osastoa, liukuu ja transfektoitiin GFP-FKHR tai GFP-FKHR-TM (fosforylaation puutteellinen kolminkertainen mutantti). Viljelyväliaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin kanssa tai ilman resveratrolin (20 uM) 24 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja värjättiin DAPI ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. vihreä väri = FKHR, punainen väri = tuma (selvyyden väri ydin muuttui sinisestä punaiseen), keltainen = rinnakkaispaikantumisen of FKHR sen ydin. (D), vasen paneeli, LNCaP-soluja käsiteltiin resveratrolin (20 uM) eri ajankohtina (0-24 h). Valmistettiin tumauutteita ja gelshift koe suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaista 1 = koetin vain, kaistat 2-9 = resveratroli Käsitellyt näytteet, kaista 10 = kylmä koetin (50 x), ja kaista 11 = kylmä SP1 anturi. Tiedot edustavat kolmen kokeen. Oikea paneeli, LNCaP-solut olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin resveratrolin (20 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa LY (1 uM) tai AKT-estäjällä (100 nM) 24 tuntia. Valmistettiin tumauutteita ja gelshift koe suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaista 1 = koetin vain, kaista 2 = kylmä koetin (50 x), kaista 3 = kylmä SP1, kaista 4 = ohjaus, kaista 5 = resveratroli, kaista 6 = LY, kaista 7 = AKT-estäjällä, kaista 8 = resveratroli plus LY, kaista 9 = resveratroli + AKT-estäjällä. Tiedot edustavat kolmea koetta.

resveratrolin parantaa translokaatiota villityypin ja mutantti FKHR sen tumaan ja tehostaa FOXO-DNA vuorovaikutus

vieressä tutkinut ydinvoiman translokaatiota FKHR mukaan resveratrolin käyttämällä villityypin ja mutantti GFP-FKHR konstruktioita. LNCaP-solut transfektoitiin joko GFP-FKHR tai GFP-FKHR-TM (kolminkertainen mutantti) ja käsiteltiin resveratrolin 24 h (Fig. 2C). Translokaatio villityypin ja fosforylaatio puutteellinen mutantti FKHR havaittiin fluoresenssimikroskopialla. Resveratrol indusoi tumaansiirtymiseen sekä villityypin ja mutantti FKHR. Kuitenkin ydinvoiman translokaatiota FKHR-TM oli paljon suurempi kuin villityypin FKHR.

vieressä tutki FOXO-DNA vuorovaikutusta elektroforeettisen liikkuvuuden shift (EMSA). Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) on yleinen affiniteetti niikassa käytetään tutkimaan proteiini-DNA-vuorovaikutus. Hoito LNCaP resveratroilla johti parannettu FOXO-DNA vuorovaikutuksen (Fig. 2D, vasen paneeli). Inkubointi kylmää anturin tumauutteen johti pienentyneeseen FOXO-DNA sitovaa aktiivisuutta. Vertailun vuoksi inkubaatio epäspesifisten kylmä SP1 koetin ei ollut vaikutusta FOXO-DNA: ta sitova. Yhdistelmä LY294002 tai AKT-estäjällä resveratroilla hieman parannettu FOXO-DNA sitova aktiivisuus, kuin ainoana lääkkeenä yksinään (Fig. 2D, oikea paneeli). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi parantaa FOXO tumaansiirtymiseen ja DNA: ta sitova aktiivisuus.

inhibitio PI3K /AKT-reitin ja fosforylaatio mutantteja on FOXO proteiinien parantaa resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalisen aktiivisuuden

seuraava tutkittava, onko inhibitio PI3K /AKT-reitin parantaa resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta lusiferaasireportterigeeniin määrityksessä, joka mittaa FOXO toiminto (Fig. 3A-C). Olemme ensimmäinen otettu farmakologinen lähestymistapa estää PI3K /AKT aktiivisuus käyttämällä Wortmanniini, LY-294002, ja AKT-estäjällä IV. Wortmanniini, LY-294002, AKT-estäjällä IV ja resveratrolin yksin indusoi FOXO transkriptionaalisen aktiivisuuden. Lisäksi yhdistelmähoidon Wortmanniini, LY-294002, tai AKT-estäjällä IV resveratroilla entisestään FOXO aktiivisuutta. Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio PI3K /AKT-reitin toimivat synergistisesti resveratrol aiheuttaa FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta.

(A), farmakologinen inhibitio PI3K /AKT-reitin parannettu resveratrol aiheuttama FOXO aktiivisuus LNCaP-soluissa. LNCaP-solut transfektoitiin ohimenevästi 6X DBE-lusiferaasi ja PRL-TK plasmideja 24 h kuten on kuvattu muualla. Transfektion jälkeen solut esikäsiteltiin Wortmanniini (10 uM), LY-294002 (10 uM) tai AKT-estäjällä IV (1 uM) 2 tunnin ajan, minkä jälkeen seuraa käsittely tai ilman resveratrolin (20 uM) 24 tunnin ajan. Solut kerättiin tulikärpäsen /Renilla Lusiferaasimäärityksiä käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Lusiferaasin määrä normalisoitiin käyttämällä

Renilla

lusiferaasin transfektion ohjaus. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. *, #, ** = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (B), yli-ilmentyminen hallitsevalla negatiivisella AKT parannettu resveratrol aiheuttama FOXO aktiivisuutta. LNCaP-solut transfektoitiin ohimenevästi 6X DBE-lusiferaasia plus PRL-TK plasmidit WT-AKT, CA-AKT tai DN-AKT 24 tuntia. Transfektion jälkeen solut esikäsiteltiin resveratrolin (20 uM) 24 tunnin ajan. Solut kerättiin tulikärpäsen /Renilla Lusiferaasimäärityksiä käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Lusiferaasin määrä normalisoitiin käyttämällä

Renilla

lusiferaasin transfektion ohjaus. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. *, # Ja ** = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (C), asetus resveratrolin aiheuttaman FOXO aktiivisuutta villin tyypin tai mutantti PTEN. LNCaP-solut transfektoitiin ohimenevästi 6X DBE-lusiferaasi ja PRL-TK plasmidit PTEN-WT, PTEN-G129E tai PTEN-G129R: ssa 24 tuntia. Transfektion jälkeen solut esikäsiteltiin resveratrolin (20 uM) 24 tunnin ajan. Solut kerättiin tulikärpäsen /Renilla Lusiferaasimäärityksiä käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Lusiferaasin määrä normalisoitiin käyttämällä

Renilla

lusiferaasin transfektion ohjaus. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. *, , $ ja ** = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (D), fosforylaatio mutantteja on FOXO parantaa resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta. LNCaP-solut transfektoitiin väliaikaisesti tyhjällä vektorilla tai jotka koodaavat FOXO1-TM, FOXO3a-TM, tai FOXO4-TM yhdessä 6X DBE-lusiferaasi ja PRL-TK plasmidit 24 tuntia. Transfektion jälkeen solut pestiin, käsiteltiin resveratrolin (20 uM) 24 tunnin ajan, ja korjataan tulikärpäsen /Renilla Lusiferaasimäärityksiä käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Lusiferaasin määrä normalisoitiin käyttämällä

Renilla

lusiferaasin transfektion ohjaus. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. * Ja ** = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05.

vieressä tutkinut, mitä vaikutuksia AKT resveratroliin aiheuttama FOXO aktiivisuus LNCaP-soluissa (kuvio. 3B). Akt aktiivisuus säätelee villityypin AKT (WT-AKT), konstitutiivisesti aktiivinen AKT (CA-AKT) ja hallitseva negatiivinen AKT (DN-AKT). LNCaP-solut transfektoitiin väliaikaisesti tyhjällä vektorilla, WT-AKT, CA-AKT tai DN-AKT ja käsiteltiin kanssa tai ilman resveratrolin (20 uM). Transfektio LNCaP tyhjällä vektorilla, WT-AKT, tai CA-AKT ei ollut vaikutusta FOXO transkriptioaktiivisuuden. Vertailun solujen transfektio DN-AKT indusoi merkittävää FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta. Resveratrol indusoi FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta transfektoiduissa soluissa tyhjällä vektorilla. Yli-ilmentymisen WT-AKT tai CA-AKT LNCaP-soluissa esti resveratroli aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen DN-AKT parannettu resveratrolin aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio AKT-aktiivisuuden geneettinen lähestymistapa parantaa resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta syöpäsolujen.

Koska LNCaP solut ilmentävät mutantti PTEN seurauksena konstitutiivisen aktivaation AKT, pyrimme tutkia roolia PTEN resveratroliin aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio. 3C). LNCaP-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla tai ekspressoivan plasmidin villityypin PTEN, PTEN-G129E tai PTEN-G129R ja käsiteltiin kanssa tai ilman resveratrol. PTEN-WT hieman indusoidun FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta. Resveratrol indusoi FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. Transfektio LNCaP-solujen villityypin PTEN tai PTEN-G129E merkittävästi parannettu resveratroli aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta. Vertailun vuoksi, yliekspressio PTEN-G129R LNCaP-soluilla oli FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta samanlainen kuin resveratrol käsiteltiin LNCaP /tyhjän vektorin soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio AKT-aktiivisuuden yliekspressio PTEN parantaa FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta.

seuraava tutkittava, onko resveratroli aiheuttaa transkription aktivoituminen FOXO läsnä ollessa tai poissa ollessa FOXO1-TM, FOXO3a-TM, tai FOXO4- TM (fosforylaatio puutteellinen kolminkertainen mutantti) (Fig. 3d). LNCaP-solut transfektoitiin p6xDBE-lusiferaasireportteri konstruktin läsnä ollessa tai ilman ilmentävien plasmidien FOXO1-TM, FOXO3a-TM, tai FOXO4-TM. Transfektion jälkeen solut käsiteltiin resveratrolia 24 tuntia, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Solujen transfektio ilmentävien plasmidien FOXO1-TM, FOXO3a-TM, tai FOXO4-TM indusoi FOXO transkriptionaalinen aktiivisuus verrattuna tyhjällä vektorilla (kontrolli). Resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalisen aktiivisuuden edelleen parantaa, kun läsnä on fosforylaation mutantteja on FOXO1, FOXO3a, ja FOXO4. Nämä tiedot osoittavat, että aktivointi FOXO transkriptiofaktoreiden edelleen parantaa resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta.

inhibitio PI3K /AKT-reitin säätelee Bim, p27

/Kip1, sykliini D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5

vieressä tutkineet estävä vaikutus PI3K /AKT-reitin ilmentymistä koskevat Bim, p27

/Kip1, sykliini D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5. Nämä geenit ovat kohdistu suoraa FOXO transkriptiotekijän. LNCaP-soluja esikäsiteltiin LY-294002 tai AKT-estäjällä IV, jota seuraa käsittely resveratrolin 24 tuntia, ja ilmaus Bim, p27, sykliini D1, TRAIL, DR4 ja DR5 mitattiin Western blottauksella (kuvio. 4). LY-294002 ja AKT-estäjällä IV indusoi ilmentymistä Bim, p27

/Kip1, TRAIL, DR4 ja DR5, ja esti ilmaus sykliini D1. Hoito solun resveratroilla entisestään vaikutuksia LY-294002 tai AKT-estäjällä IV ilmaisun Bim, TRAIL, DR4 ja DR5. Kuitenkin yhdistelmä LY-294002 tai AKT-estäjällä IV resveratroilla ollut enää vaikutusta ilmaisun p27

/KIP1 ja sykliini D1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio PI3K /AKT-reitin voi säädellä ilmentymistä Bim, p27

/Kip1, sykliini D1, TRAIL, DR4 ja DR5, jotka ovat transkription tavoitteita FOXO. Resverarol voi myös säätelemään näiden FOXO transkription tavoitteet.

LNCaP-soluja esikäsiteltiin LY294002 (10 uM) tai AKT-estäjällä (AKT-I, 1 uM) 2 tunnin ajan ja käsiteltiin kanssa tai ilman resveratrolin (20 uM) 48 tuntia. Solut kerättiin mitata ilmaisua Bim, p27

/KIP1, sykliini D1, TRAIL, DR4 ja DR5 mukaan theWestern blot analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

inhibitio FOXO ilmentymisen shRNA estää antiproliferatiivisia vaikutuksia resveratrolin ja esti resveratrol indusoiman kaspaasi-3-aktiivisuus ja apoptoosin

Jos resveratrol indusoi apoptoosia aktivoimalla FOXO transkriptiotekijän, esto FOXO proteiinien pitäisi estää antiproliferatiivisia vaikutuksia resveratrol. LNCaP-solut transfektoitiin shRNA ilmentävien FKHR, FKHRL1 tai AFX ja käsiteltiin resveratrolin (Fig. 5). Resveratrol indusoi apoptoosin LNCaP /FKHR salattu, LNCaP /FKHRL1 salattu ja LNCaP /AFX salattu soluja annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 5A). Esto FKHR, FKHRL1 tai AFX mukaan shRNA estetty antiproliferatiivisia vaikutuksia resveratrol. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli inhiboi solujen elinkelpoisuus säätelyn kautta FOXO transkriptiotekijöiden.

(A), Inhibition of FOXO transkriptiotekijän mukaan shRNA lohkojen antiproliferatiivisia vaikutuksia resveratrol. LNCaP-solut transfektoitiin ohimenevästi ilmentävien plasmidien FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA, AFX shRNA tai vastaavien sekoitetun ohjaus ja käsiteltiin resveratrolin (20 uM) 48 tunnin ajan, ja solujen elinkyky mitattiin. (B), Inhibition of FOXO transkriptiotekijöiden tai ROS (reaktiivisia happiradikaaleja) NAC estää resveratrol: n indusoiman apoptoosin. LNCaP-solut transfektoitiin seoksella ilmentävien plasmidien FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA plus AFX shRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä. Transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja soluja esikäsiteltiin NAC: ssa 2 tuntia, ja sitä käsiteltiin resveratrolin (20 uM) 48 tunnin ajan. Lopussa itämisaika, apoptoosi mitattiin TUNEL-määrityksellä. (C), Inhibition of FOXO transkriptiotekijöiden tai ROS NAC estää resveratrol indusoiman kaspaasi-3-aktiivisuus. LNCaP-solut transfektoitiin seoksella ilmentävien plasmidien FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA plus AFX shRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä. Transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja soluja esikäsiteltiin NAC: ssa 2 tuntia, ja sitä käsiteltiin resveratrolin (20 uM) 48 tunnin ajan. Lopussa itämisaika, kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

vieressä on halunnut tutkia estämällä FOXO ilmentymisen vaikutus resveratrolin aiheuttama kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosia (kuvio . 5B ja C). Resveratrol aiheuttama kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin LNCaP /salattu soluja. Esikäsittely LNCaP /salattu solujen NAC esti resveratrolin aiheuttama kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin. Inhibitio FOXO ilmentymisen shRNA esti resveratroli indusoi kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin. Mielenkiintoista, esikäsittely LNCaP /FOXO shRNA solujen NAC tukossa resveratrolin aiheuttaman kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli indusoi kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosia sukupolven ROS, ja inhibitio FOXO (FKHR, FKHRL1 ja AFX) estää kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin.

asetukseen Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 ja sykliini D1 FOXO geenejä (FKHR, FKHRL1 ja AFX) B

FOXO transkriptiotekijöiden on osoitettu apoptoosia säätelevissä ja solusyklin liittyviä geenejä [14], [34]. Koska resveratrol säännelty ilmaisun Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 ja sykliini D1, me halunnut tutkia näitä vaikutuksia resveratrol välittyvät FOXO transkriptiotekijöitä, jotka estävät shRNA (Fig. 6). Resveratrol indusoi ilmentymistä Bim (Bim

EL, Bim

L ja Bim

S), TRAIL, DR4, DR5 ja p27

/Kip1, ja esti ilmaus sykliini D1 LNCaP /salattu solut. Esto FKHR, FKHRL1 tai AFX by shRNA heikennettyä resveratroli aiheuttama Bim, TRAIL, DR4, DR5 ja p27

/Kip1 ilme. Vertailun vuoksi inhibitio FKHR, FKHRL1 tai AFX mukaan shRNA hieman heikennettyjä estovaikutukset resveratrolin sykliini D1 ilmentymisen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi säädellä apoptoosia (Bim, TRAIL, DR4, DR5) ja solukierron liittyvien geenien (p27

/Kip1, ja sykliini D1) kautta FOXO transkriptiotekijöitä. Mielenkiintoista on, induktio TRAIL ja sen reseptoreihin DR4 ja DR5: tä resveratroli aiheuttaa aktivoitumisen ulkoinen tie apoptoosin.

(A), LNCaP-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka ilmentävät FKHR shRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä. Transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin resveratrolin (0-20 uM) 48 tuntia. Lopussa inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen mitata ilmentymisen Bim, TRAIL, DR4, DR5, P27 ja sykliini D1 Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B), LNCaP-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka ilmentävät FKHRL1 shRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä. Transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin resveratrolin (0-20 uM) 48 tuntia. Lopussa inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen mitata ilmentymisen Bim, TRAIL, DR4, DR5, P27 ja sykliini D1 Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C), LNCaP-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka ilmentävät AFX shRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä. Transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin resveratrolin (0-20 uM) 48 tuntia.