Krooninen sairaus

tiivistelmä

Preoperatiivisen diagnostiikka munasarjan kasvaimet luottaa ultraääni kuvantaminen ja seerumin biomarkkerit CA125 ja HE4. Nämä merkit voidaan koholla epäneoplastisis- olosuhteissa ja voi epäonnistua tunnistaa useimmat ei-vakavien epiteelin syöpä alatyyppejä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää histotype erityisiä seerumin biomarkkereita mucinous munasarjasyöpä. Ehdokas geenejä mucinous histotype erityisilmaus profiili tunnistettiin julkisesti saatavilla geenien ilmentymisen tietokantoja ja edelleen in silico data mining tehtiin hyödyntäen MediSapiens tietokantaan. Ehdokas biomarkkereiden validointi tehtiin käyttäen qRT-PCR, Western blotting ja immunohistokemiallisella värjäyksellä kasvaimen kudossiruina. Ilmaisu taso kandidaattigeenin seerumissa verrattiin seerumin ca125 ja HE4 tasot potilaalla kohortin takautuvasti kerättyjen kehittyneen munasarjasyövän. Tietokannan hakuja tunnistettiin REG4 mahdollisena biomarkkeri spesifisyyttä mucinous munasarjasyöpä alatyyppi. Erityisten ekspressio munasarjan epiteelin kasvaimissa vahvistettiin lisäksi mRNA-analyysillä. Immunohistokemiallinen värjäys munasarjakasvain kudosmatriisien osoitti erottuva sytoplasmista ilmentämiskuviota vain mucinous karsinoomia ja ehdotti ero ilmaisun välillä hyvän- ja pahanlaatuisten mucinous kasvaimet. Lopuksi ELISA perustuu seerumin biomarkkereiden määrityksessä osoitti voimistunutta ilmentymistä vain potilailla, mucinous munasarjasyöpä. Tutkimuksessa yksilöidään REG4 mahdollisena seerumi biomarkkeri histotype-havaitsemiseen mucinous munasarjasyövän ja ehdottaa seerumin REG4 mittauksen ei-invasiivisia diagnostinen työkalu leikkauksen jälkeisen seurannan sairastavien potilaiden mucinous munasarjasyöpä.

Citation: Lehtinen L, Vesterkvist P, Roering P, Korpela T, Hattara L, Kaipio K, et ai. (2016) REG4 ilmenee vahvasti mucinous Munasarjasyöpä: Mahdolliset Novel Serum biomarkkereiden. PLoS ONE 11 (3): e0151590. doi: 10,1371 /journal.pone.0151590

Editor: Kwong-Kwok Wong, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 19 marraskuu 2015; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2016; Julkaistu: 16 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Lehtinen ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Sigrid Juseliuksen säätiö, https://www.sigridjuselius.fi/foundation, LL, TK, KK; Suomen Syöpäyhdistys, https://www.cancersociety.fi/grants/, LL, PR, TK, KK; TYKS Research Fund, https://www.vsshp.fi/en/toimipaikat/tyks/Pages/default.aspx, LL, PR, KK; Euroopan aluekehitysrahasto (A31859), https://ec.europa.eu/regional_policy/EN/funding/erdf/, LL, PR, KK, PV, LH, KI, HS, OC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on kaikkein vaarallisin gynekologinen syöpä [1]. Vaikka uudet hoitomuodot ovat pidensi elinaikaa viime vuosikymmenten aikana, yleinen ennuste ei ole parantunut [2,3]. Oireita, kuten vatsakipu, lisääntynyt vatsan kokoa, turvotus tai pahoinvointi, ovat usein epäspesifisiä myöhään taudin etenemiseen, mikä taudinmääritys. Useimmat potilaat diagnosoidaan edennyt pitkälle ja käsitellään kirurgisesti yhdistettynä platina-taksaania kemoterapiaa. EOC koostuu kuudesta tärkeimmistä histologisia alatyyppejä (histotypes); huonolaatuisen vakavien karsinooma (LGSC), korkea-asteen vakavien karsinooma (HGSC), kirkas cell carcinoma (CC), endomet- karsinooma (EY), mucinous karsinooma (MC) ja siirtymäkauden cell carcinoma (TC), jossa erilliset geneettiset profiilit, biologista käyttäytymistä ja lopputulos.

diagnoosi munasarjasyövän vetoaa kliiniset piirteet, ultraääni- kuvantaminen ja seerumin biologisten merkkiaineiden Cancer antigeenin 125 (CA125). Lisäksi uusi seerumin biomarkkereiden Human lisäkives 4 (HE4) voi tuoda lisätietoja erotusdiagnostiikkaan naisten lantion massa [4]. Nämä biomarkkerit eivät kuitenkaan ole täysin luotettavia diagnosoinnissa kuin vakavasta histotypes. CA125-arvot on osoitettu olevan pienempi potilailla, joilla MC verrattuna potilaisiin, joilla SC [5,6]. Koska diagnoosi ei voi perustua nykyiseen seerumin biomarkkereita, useimmiten oikeaan diagnoosiin on todettu ainoastaan ​​kun kirurginen toimenpide. Maailmanlaajuisesti mucinous karsinoomien osuus ~ 11%: EOC [7]. Vaikka ennuste on yleensä suotuisa joissakin tapauksissa karsinoomia uusiutua ja edistyksen aggressiivisesti [8,9]. Lisäksi mucinous munasarjojen kasvaimia, on osoitettu olevan pienempi vaste platinapohjaiseen kemoterapiaan verrattuna HGSC [5,6]. Yhä useammat tutkimukset osoittavat, että eri munasarjasyöpä histotypes olisi pidettävä erillisenä sairauksia ja edellyttävät siksi erilainen kohtelu [10]. Ei-invasiivisia diagnostisia menetelmiä, kuten histotype erottaa seerumin testejä, voisi olla arvokas optimoimiseksi hoidon strategia ennen leikkausta.

Tutkimuksen tavoitteena oli tunnistamiseen mucinous histotype erityisiä seerumin biomarkkereita munasarjasyöpä. Perustuen

in silico

analyyseissä, tutkimme ilmaus uudistava Islet peräisin olevaa proteiinia IV (REG4) on joukko mucinous munasarjasyövän kudosten potilaiden seerumit ja askites nesteitä. Lisäksi, REG4 mitattiin aikasarjan seeruminäytteitä määrittää korrelaation kasvaimen taakkaa. Lisäksi tutkimme CA125, HE4 ja REG4 samalla näytteiden verrata suorituskykyään.

Materiaalit ja menetelmät

In silico

data mining

MediSapiens tietokanta (www.medisapiens.com) levitettiin tutkimiseksi geeni-ilmentymisen tasot kaikissa normaaleissa ja neoplastisissa ihmisen kudoksissa [11]. Näytteet Tietokannan sisältämien on analysoitu Affymetrix alustalle ja, koska ainutlaatuinen normalisoinnin ja tietojen laadun tarkastukset, geeniekspressioprofiilien kerätty eri tutkimukset voidaan yhdistää tuottamaan yleiskuva ilmaisun profiilin ihmisen kudoksissa. Tiedot normaalista munasarjasta (n = 10) ja munasarjasyöpä näytteitä (n = 288) saatavilla MediSapiens tietokannassa hyödynnetty kudosspesifisiä ilmentymisanalyysiä.

Kliininen aineisto

Tutkimuksissa, joissa kliininen materiaali on tehty noudattaen eettisiä standardeja vahvistettu 1975 Helsingin julistuksen. Munasarjojen kudos microarray (TMA) rakennettiin kirurginen kerätyt näytteet kudoksesta arkistosta Patologian osasto, TYKS kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Käyttö yksilöiden hyväksyttiin Eettinen komitea sairaanhoitopiirin Varsinais-Suomessa. Potilaan seerumit ja osa jäädytetyn kasvaimen kudosnäytteet kerättiin saaneilla potilailla Turun yliopistollisessa sairaalassa. Seerumi näytteet ovat molemmat hoitamattomilla preoperative näytteet ja pitkittäinen näytteitä hoidon aikana. Käyttö kaikkien kliinisten materiaalia hyväksyttiin Eettinen komitea sairaanhoitopiirin Varsinais-Suomen (ETMK, 53/180/2009 § 238) ja Kansallisen valvontaviranomaisen Sosiaali- ja terveysministeriön (Valvira, DNRO 6550 /05.01.00.06 /2010 ja STH507A). Muita tuore mucinous munasarjakasvain aines saatiin Oslon yliopistollisessa sairaalassa, Norja. Tutkimus hyväksyntä antoivat alueneuvoston Medical Research Ethics Norjassa ja tietoon perustuvan suostumuksen allekirjoittivat Norja potilaat.

Tissue microarray ja immunohistokemia

TMA sisälsi 185 näytettä 100 Munasarjasyöpäpotilaiden kasvaimet ; vakavien cystadenomas (n = 16), vakavien rajatapaus kasvain (n = 27), vakavien karsinoomat (n = 47), mucinous cystadenomas (n = 14), mucinous karsinoomat (n = 36), endometroid karsinoomat (n = 45). TMA värjättiin hiiren monoklonaalisella REG4 vasta-ainetta [13], kuten on kuvattu [14]. REG4 Immunovärjäys itsenäisesti arvioitiin kaksi tutkijaa (TK ja OC); tapauksessa disconcordance yksimielisyys pisteet käytettiin lisäarviointia.

kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin jäädytetyistä munasarjakasvain näytettä (10 mg kpl) ja ensiöparit käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan protokollan ja käsitellään cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA). Taqman hankittiin Universal Probe Kirjasto (Roche Diagnostics, Espoo, Suomi) ja alukkeet tilattiin Oligomer (Helsinki, Suomi) REG4 (eteenpäin: atgcggctgctcctattg; käänteinen: taaaaccatccaggagcaca) ja GAPDH (eteenpäin: tggctctaccttagaaccctga; käänteinen: ttttgctctttgccgtacct) . Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) suoritettiin ABI Prism 7900 (Applied Biosystems). Kvantifiointi suoritettiin RQ Manager 1.2 ohjelmisto käyttämällä

ΔΔCT menetelmä (Applied Biosystems). Kolme tai useampia samanlaiset näytteet käytettiin tutkimaan mRNA ilmaus REG4 ja GAPDH. Keskimääräinen ilmentyminen kontrollinäytteistä pidettiin laskettaessa taitteen muutokset ja GAPDH käytettiin endogeenista ohjaus. Kolme tai useampia samanlaiset näytteet tutkittiin mRNA: n ilmentymisen. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testiä, ja p-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi.

Western blotting

proteiinin lysaatit, noin 20 mg paloja leikattiin jäädytetty kasvaimia ja lyysattiin sonikoimalla RIPA-lyysipuskuria. Proteiinikonsentraatiot mitattiin käyttäen BioRad-proteiinimääritys mukainen pakkaus, valmistajan ohjeiden mukaisesti (Bio-Rad Laboratories, CA). Näytteet valmistettiin sekoittamalla sopivia määriä proteiinia lysaattia 5 x Laemmli-puskuria ja keitettiin 5 min. Yhtä suuret määrät proteiinia (20 ug) erotettiin 15% SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (huokosten leveys 0,2 um). Equal lastaus vahvistettiin Ponceau värjäystä. Membraanit blokattiin 5% maitoa TBST ja tutkittiin polyklonaalisilla REG4 vasta-aineella (1: 1000, AF1379, R 500 missä tahansa näyte) ja niiden vastaavat terveiden kudosten (kuvio 1B). Korkea ilmaus

REG4

mRNA havaittiin pahanlaatuisten mahalaukun, peräsuolen ja haiman kudoksista sekä terveillä peräsuolen ja haiman kudoksista. Korkein

REG4

mRNA ilmentyminen nähtiin mucinous munasarjasyöpä, kun taas ilmentymistaso oli erittäin vähäinen terveillä munasarjojen kudosta. Tarkempi analyysi

REG4

mRNA: n ekspression terveillä munasarja (n = 10) ja pahanlaatuinen (n = 288) munasarjakudoksessa eri histologialtaan, vahvisti mucinous histotype ekspressio profiili (p 0,001, kuvio 1C). Muissa munasarjasyöpä histotypes,

REG4

mRNA ilmaisu pysyi tasolla terveiden kudosten.

(A) pahanlaatuiset kudoksista korkealla REG4 mRNA: n ilmentymisen (exp. Arvon 500, n = 14 ). (B) REG4 mRNA: n ekspression, joka vastaa terveiden kudosten (jos se on käytettävissä, n = 8). (C) Yksityiskohtainen analyysi REG4 mRNA ilmaisun terveillä ja pahanlaatuisia munasarjojen kudoksiin. Laatikko viittaa kvartiiliin jakeluun (25-75%) alue, jossa mediaani esitetty pystysuora viiva (vihreä terveillä näytteissä, punaisina pahanlaatuinen). Data havainnot jotka sijaitsevat yli 1,5 * välisten neljännekseen alue suurempi kuin kolmas kvartiili, pidetään harha ja ilmoitetaan erikseen.

REG4 ilmentyy voimakkaasti Tuumorinäytteissä peräisin mucinous munasarjasyöpä

in silico

analyysi osoitti erityinen ilmaisu

REG4

mRNA mucinous histotype munasarjojen kasvaimia. Voidakseen vahvistaa nämä tiedot,

REG4

mRNA ja proteiinin ilmentyminen tutkittiin näytteistä mucinous (MUC) ja korkea-asteen vakavien (SER) munasarjojen kasvaimia.

REG4

mRNA-ekspressiota tutkittiin qRT-PCR käyttäen mRNA serous kasvaimista negatiivisena kontrollina. Tulokset on koottu kuvioon 2A. REG4 mRNA näytti korkea yleinen ilmentymistä mucinous karsinoomat (MUC_C_4-10, kuvio 2A), kun taas ei ekspressiota havaittiin korkealaatuista vakavien kasvaimet (SER_1-3). Mielenkiintoista,

REG4

ei ilmaistu mucinous cystadenoma (MUC_A_1) ja osoitti merkitsevästi pienempi mRNA ekspressiotasot myös mucinous rajatapaus kasvaimet (MUC_B_2-3). REG4 proteiinin ilmentyminen samassa joukko Tuumorinäytteissä arvioitu western blotting. Tulokset osoittivat korkeita REG4 proteiinia tasot

REG4

mRNA kasvaimissa (kuvio 2B). Kaiken REG4 proteiinin ekspressio oli erittäin korkea tai erittäin alhainen näissä näytteissä, kun taas mRNA analyysi havaitsi näytteitä keskinkertainen tai matala ilme. Nämä tulokset validoivat havainnot

in silico

analyysi ja osoittavat, että REG4 ilme on spesifinen mucinous munasarjasyöpä histotype.

(A) Quantitative RT-PCR-analyysi REG4 mRNA ilmaisun serous karsinoomat (SER_C), mucinous cystadenomas (MUC_A), mucinous rajatapaus kasvaimet (MUC_B) ja mucinous karsinoomat (MUC_C). (B) Western blot-analyysi REG4 proteiinin ilmentymistä samalla näytesarja. Proteiinin kokonaismäärästä kunkin näytteen oli 20 ug ja yhtäläiset lastaus vahvistettiin Ponceau värjäystä.

REG4 ilmaistaan ​​pikari kaltaisten solujen pahanlaatuisten mucinous munasarjakasvaimia

REG4 ekspressiokuviota tutkittiin TMA sisältävien kliinisten näytteiden munasarjakasvaimia eri histotypes. Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 1 ja kuviossa 3. mukaillen edellisen analyysit, mitään värjäytymistä ei havaittu vakavien (n = 90) tai endomet- kasvaimet (n = 45), kun taas positiivinen REG4 värjäytyminen havaittiin 83%: n (30 /36) mucinous karsinoomien. Tämä osoittaa, että REG4 ilmentyminen on spesifinen mucinous histotype. Kaikissa REG4 positiivista näytettä värjäytyminen oli erittäin vahva. Mucinous kudosnäytteitä varmistettiin olevan ensiarvoisen munasarjakasvain alkuperää tutkimalla pituussuunnassa sähköisten terveyskertomusjärjestelmien tiedot kunkin potilaan viitaten erityisesti aiempien diagnoosien, diagnostisten tutkimusten ja laparotomy asema, sekä CK7 /CK20 värjäystä. TMA sisälsi myös näytteitä hyvänlaatuisen mucinous cystadenomas (n = 14). Tärkeää on, ei REG4 ekspressiota havaittiin näiden näytteiden. Korrelaatio värjäys tuloksia potilaan tiedot eivät osoittaneet yhdistyksen REG4 ilmaisun muille kuin mucinous histotype. Vahva REG4 värjäytyminen havaittiin yhtä matalan ja korkean asteen mucinous karsinoomat. Tarkemmat tarkastelu REG4 värjäyskuvion paljasti vahvin värjäytymisen sisällä ja välillä mucinous sulkeumia pikari kaltaisia ​​syöpäsoluja. Lisäksi REG4 sijaitsi yksinomaan apikaalisella pinnalla kasvainsolujen, kun strooman oli negatiivinen.

immunohistokemiallinen värjäys REG4 on TMA pahanlaatuisten munasarjakudoksessa. Esimerkkejä vakavien karsinooma (AB), endomet- karsinooma (CD) ja mucinous karsinooma (EF) esitetään.

Eritettyä REG4 voidaan havaita seerumista ja askites on mucinous syöpäpotilaiden

analysoimiseksi potentiaalin REG4 kuin seerumin biomarkkeri mucinous munasarjasyöpä, käytimme REG4 erityinen sandwich-ELISA-määrityksessä. Näytteet ovat seerumit ja askitesneste potilailta, joilla vakavien tai mucinous munasarjojen kasvaimia. Yksityiskohtainen näyte kuvaus ja tulokset on esitetty S2 taulukossa. Seerumi otettiin ennen (ennen leikkausta) ja jälkeen (leikkauksen jälkeinen) kirurgian useissa aikapisteissä seurannan aikana. Askitesneste kerättiin leikkauksen aikana. Arvioida spesifisyyden REG4 varten mucinous munasarjasyöpä histotype, analysoimme CA125, HE4 ja REG4 pitoisuudet ennen leikkausta seeruminäytteistä munasarjasyöpää sairastavien potilaiden korkealaatuisesta vakavien (n = 4) tai mucinous (n = 3) syöpiä. Kaikki preoperative seerumit olivat potilailta, joilla levitetään (III-IV) tauti. Tulokset on esitetty kuviossa 4A. Jotta voi suoraan verrata ELISA-määrityksissä eri mittayksiköt, tulokset esitetään kertamuutosta (FC) vastaavien maligniteetin osoittaa raja-arvon (35 kU /l CA125 ja 150 pM HE4 ). Valittu cut-off-arvot perustuvat voimassa oleviin suosituksiin. Numeeriset arvot on esitetty S2 taulukossa. Sillä REG4 cut-off-arvo asetettiin 2 ug /l perustuu korkeimpaan REG4 pitoisuus saadaan terveen miehen ja suurempi joukko ei-mucinous seerumikontrollit (S3 taulukko). Fc-arvon 1 pidetään positiivinen tulos viittaavia maligniteettiriski,

i

.

e

. suurempi merkki pitoisuus kuin normaalisti läsnä terveillä henkilöillä. FC arvot ≤ 1 katsotaan negatiivisia tuloksia. Yleisesti käytetty seerumin biomarkkereita CA125 ja HE4 osoitti kohonneita pitoisuuksia seerumeista korkealaatuisesta vakavien syöpäpotilailla (FC 1), kun taas REG4 pitoisuus jäi alle cut-off-arvo (FC 1) (kuvio 4A). Seerumeista mucinous syöpäpotilaita, pitoisuus CA125 ja HE4 pysyi alhaisena. Näissä kolmessa näytteitä REG4 taso oli 10-70 kertainen yli raja-arvon. Vaikka näytteiden määrä oli alhainen, nämä tulokset osoittavat, että REG4 on spesifinen mucinous tyypin kasvaimet ja voidaan havaita suurilla pitoisuuksilla potilaiden seerumeista, joilla levitetään mucinous syöpä. Lisäksi seeruminäytteistä, REG4 mitattiin soluvapaissa Askitesnesteet kahdella potilaalla, joilla mucinous kasvaimia (M1 ja M2, S2 taulukko). Molemmat näytteet olivat positiivisia (33 pg /ml ja 187 pg /ml, vastaavasti) ja REG4 proteiini osoittaa, että mucinous kasvainsolut erittävät REG4 myös askites-nesteestä.

(A) ELISA-analyysi REG4 proteiinipitoisuus sera potilaiden diagnosoitu vakavien (SER) tai mucinous (MUC) munasarjojen karsinoomat. (B) REG4 proteiinin pitoisuudet sarjassa ennalta (päivä -1) ja leikkauksen jälkeinen seerumi näytteitä yksi potilas, jolla diagnosoitiin mucinous syöpä.

Sen määrittämiseksi korrelaatio REG4, CA125 ja HE4 pitoisuuksina tuumorikuorma, seeruminäytteet mitattiin useana ajankohtana potilaalta (M1) hoidettiin levitetty mucinous karsinooman (katso S4 Taulukko yksityiskohtaiset tulokset). Tulokset (FC cut-off-arvo, kuvio 4B) osoittivat, että korkea pitoisuus REG4 (FC = 73,6) havaitaan ennen leikkausta näyte (päivä 0) heikkeni nopeasti leikkauksen jälkeen (päivä 13; FC = 4,9) ja oli edelleen alhainen vaikkakin korkeampi kuin raja-arvo 2 ug /l. Pitoisuus CA125 ilmoitettu syöpään kolme ensimmäistä kertaa pistettä (47 kU /l, 67 kU /l ja 43 kU /l), jonka jälkeen se putosi alle cut-off-arvo 35 kU /l, kun taas tasot HE4 jäi alle cut-off-arvo 150 pM kaikissa näytteissä. Tämä viittaa siihen, että REG4 pitoisuus korreloi kasvaintaakkaa paremmin kuin CA125 tai HE4 in mucinous munasarjasyöpä. Vaikka CA125 mittaus osoitti maligniteetti ennen leikkausta näytteen HE4 mittaus ei havainnut kasvain seeruminäytteistä.

Keskustelu

Munasarjojen kasvaimet eroavat geneettiset profiilit, biologinen käyttäytyminen ja tulokset, ja sen pitäisi olla käsitellä erillisinä tauteja jo kirurgisen toimenpiteen. Siten tietyn ennen leikkausta diagnoosi on ratkaiseva valinta optimaalisen hoidon strategian. Tällä hetkellä ei ole menetelmiä ennen leikkausta syrjintä munasarjasyöpä alatyyppejä ja erityisiä diagnoosi saavutetaan vain leikkaussalin jääleike tai postoperatiivinen histopatologista analyysiä. Täällä suosittelemme REG4 lupaavana seerumi biomarkkereiden erottamiseen mucinous syövät muista epiteelin munasarjasyöpä alatyyppejä. Saamiemme tulosten, seerumin REG4 analyysi voi myös olla potentiaalia erotella hyvänlaatuisia ja pahanlaatuisia mucinous kasvaimet ja seurantaan mucinous munasarjasyöpä potilaille.

erityinen mucinous sukujuuret ilmaus REG4 sisällä munasarjan kasvaimet osoitettiin monta tapaa. Ensimmäinen näyttöä saatiin

in silico

analyyseissä, mikä osoitti hyvin mRNA ilmaisun profiilia REG4 vuonna mucinous syöpien joukossa eri munasarjakasvain alatyyppejä. REG4 ilmentyminen vielä validoitu qRT-PCR ja western blotting tuoreesta jäädytetty munasarjojen kasvain kudosnäytteitä peräisin vakavasta ja mucinous alatyyppejä. Kuten odotettua, joka perustuu

in silico

tietojen REG4 oli hyvin ilmaista vain pahanlaatuinen mucinous munasarjojen kasvaimia. Lopuksi, immunohistokemiallinen värjäys on kasvainkudoksen microarray koostuu 185 kasvain ytimien hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset vakavasta, endometroid ja mucinous kasvaimet vahvisti rajoitettu ilmaisun mucinous linjaa. Mielenkiintoista on, että ei ole REG4 ekspressiota havaittiin mucinous cystadenomas viittaa siihen, että immunohistokemiallista REG4 analyysiä voidaan käyttää lisäksi menetelmän välinen ero hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset mucinous munasarjojen kasvaimia. Kaikki mucinous näytteet varmistettiin olevan ensisijainen munasarjakasvain alkuperää. Meidän näytesarja eivät sisältäneet näytteet harvinaisia ​​tyyppejä mucinous munasarjakarsinooma-; kuten endocervical /seromucinous tai foveolar tyyppejä. Siksi, jotta voidaan määrittää todellisen potentiaalin REG4 kuin immunohistokemiallinen merkki, lisätutkimuksiin kanssa laajemman erilaisia ​​näytteitä tarvitaan.

Seerumi biomarkkereita CA125 ja HE4 käytetään munasarjasyövän diagnostiikan ja seurannasta up. Näillä merkeillä lähinnä havaita serous syöpiä [4,18,19], mutta ovat epäluotettavia diagnosointiin ei-vakavien histotypes, erityisesti mucinous alatyypin [20,21]. Täällä vertasimme seeruminäytteistä potilaalla on korkealaatuisesta vakavien tai mucinous munasarjasyöpä. Tuloksemme tukevat aikaisempien tutkimusten jälkeen meidän Näytejoukolla sekä CA125 ja HE4 merkittävästi koholla ennen leikkausta seeruminäytteistä vakavien kohdunkaulan potilaiden, mutta pysyi alhaisena mucinous karsinoomat. Sen sijaan kaikissa kolmessa mucinous syöpäpotilaiden seerumit, REG4 taso oli kohonnut yli kymmenen kertaa yli korkeimman arvon kontrolliseerumit. Seerumi REG4 taso ei ollut koholla tahansa vakavien syöpäpotilaiden seeruminäytteistä. Siten yhdistelmä REG4 kanssa CA125 ja HE4 voisi tarjota kattavampi Markkeripaneelin ennen leikkausta diagnoosi mahdollisesti neoplastisten munasarjojen massoja, ja mahdollistaa ero mucinous munasarjasyövän muista munasarjasyöpä histotypes. Koska jotkut pahanlaatuiset kasvaimet eivät osoittaneet positiivista REG4 värjäytymistä, emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että osa mucinous syövistä voisi jäädä havaita seerumissa REG4 analyysiin. Koska meidän seeruminäytteessä kokoelma rajoittui, jatkotutkimuksia tarvitaan täysin määrittää roolin REG4 seerumin mittauksen ennen leikkausta menetelmä mucinous munasarjasyöpä diagnoosi.

REG4 on aiemmin merkitty seerumin biomarkkereiden maha- , peräsuolen ja eturauhasen syöpä [22-24]. Näin ollen, REG4 seerumin analyysi yksin ei välttämättä pysty erottamaan ensisijaisen mucinous munasarjasyöpä ja munasarjojen etäpesäkkeitä peräisin maha-suolikanavasta. Toisaalta, lisäämällä REG4 analyysi seerumista puolella CA125 ja /tai HE4 voisi tarjota mahdollisuus leikkauksen jälkeisen seurannan mucinous munasarjasyöpä potilaille, joilla on diagnosoitu. Osoitus tästä tuli pitkittäinen sarja seeruminäytteitä potilaalta, jolla mucinous syöpä. Tässä potilasryhmässä, korkea ennen leikkausta seerumin REG4 pitoisuus pieneni nopeasti leikkauksen jälkeen ja pysyivät matalina vuoden tapahtumaköyhä seurantajakson aikana. Saada osoitetuksi hyödyllisyyttä seerumin REG4 taudinvalvontatilanteessa kuitenkin enemmän potilailla, joilla on pitkittäinen seeruminäytteiden pitäisi testata.

Funktio REG4 munasarjasyövän ymmärretään huonosti ja ei ole laajalti tutkittu. Tuore tutkimus osoittaa, että REG4 moduloi leviämisen, apoptoosin, muuttoliike ja invaasion munasarjasyöpäsoluja, ja sillä on tärkeä rooli varhaisessa munasarjojen syövän synnyn [25]. Tämä tutkimus raportoi myös immunohistokemiallisella värjäyksellä REG4 eri munasarjasyöpä alatyyppejä. Seerumin REG4 arvoja ei ole määrällisesti missään munasarjasyövän alatyyppejä. Toisin kuin meidän tuloksia, positiivisia REG4 värjäytyminen (heikosta voimakkaaseen) löydettiin myös vakavasta näytteistä. Meidän materiaali REG4 proteiinin ekspressio oli erittäin korkea tai erittäin alhainen, eikä väli värjäytymistä ei havaittu. Kuitenkin qRT-PCR-analyysi REG4 mRNA-ilmentymisen tuore mucinous munasarjojen kasvaimia tunnistettuja näytteitä välituotteen tai heikkoa ilmentymistä, mutta ilmentymistä ei havaittu näytteissä vakavasta munasarjojen kasvaimia. Tämä saattaa johtua eroista vasta-spesifisyys ja skaalaus värjäystä vahvuus.

Yhteenvetona tunnistimme REG4 mahdollisena biomarkkeri alatyypin erityisiä diagnoosi mucinous munasarjasyövän sekä sairauden seurantaan. Mukaan tuloksemme REG4 proteiini erittyy liikkeeseen mucinous munasarjojen kasvainsolujen ja voidaan havaita ELISA-pohjainen testi. Mittasimme kolme biomerkkiaineissa potilaiden seerumit; CA125, HE4 ja REG4 ja todettu korkeita pitoisuuksia REG4 vuonna ennen leikkausta näytteitä mucinous munasarjasyöpä potilaille, kun taas CA125 ja HE4 jättänyt vakuuttavasti havaitsemaan pahanlaatuisen näistä näytteistä. Tutkimuksemme osoittaa, että yhdistämällä REG4 kanssa CA125 ja HE4 voisi tarjota lisäarvoa ennen leikkausta diagnostiikka munasarjojen massojen potentiaalisia neoplastisten alkuperää, ja mahdollistaa ero mucinous munasarjasyövän muista munasarjasyöpä alatyyppeihin noninvasiivisilla menetelmillä.

tukeminen tiedot

S1 Taulukko. Geenejä mucinous erityinen ilmaus profiili kliinisissä munasarjasyövän näytteistä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0151590.s001

(XLSX)

S2 Taulukko. Yksityiskohtainen näyte kuvaus ja tulokset ELISA-analyysissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0151590.s002

(DOCX)

S3 Taulukko. REG4 cut-off-arvo on määritetty perustuen korkeimman REG4 pitoisuus saadaan terveen miehen ja suurempi joukko ei-mucinous seerumikontrollit.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0151590.s003

(DOCX)

S4 Taulukko. Yksityiskohtaiset tulokset seerumin ELISA-analyysi useana ajankohtana yhdestä potilaasta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0151590.s004

(DOCX)

S1 Fig.

In Silico

analyysi

REG4

mRNA ilmaisun MediSapiens tietokannassa poikki pahanlaatuinen ihmisen kudosnäytteitä (n = 15392).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0151590.s005

(PDF)

S2 Kuva.

In Silico

analyysi

REG4

mRNA ilmaisun MediSapiens tietokannassa poikki terveen ihmisen kudosnäytteitä (n = 3082).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0151590.s006

(PDF) B

Kiitokset

Haluamme kiittää Sinikka Kollanus ja Piia Mikkonen erinomaisen teknistä tukea. Tohtori Kaisa Huhtinen on kiitti ohjausta data-analyysi.