Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat tärkeitä säätimiä, jotka ovat avainasemassa kasvainten synnyssä ja syövän etenemiseen. Aikaisempi raportti on osoittanut, että let-7 perheenjäsenet voivat toimia tuumorisuppressoreilla monissa syövissä. Kautta miRNA array, huomasimme, että let-7f säädeltiin vähentävästi vuonna erittäin metastaattista potentiaalia mahasyövän solulinjoissa GC9811-P ja SGC7901-M, verrattuna niiden vanhempien solulinjojen, GC9811 ja SGC7901-NM; kuitenkin, mekanismi ei ollut selvä. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko let-7f toimii tuumorisuppressorina estävän invaasiota ja etäpesäkkeiden mahasyövistä.

Menetelmät /Principal

Reaaliaikainen PCR osoitti alentuneesta let-7f ilmaisun metastaattisessa mahasyövässä kudosten ja solujen linjat, jotka ovat potentiaalisesti erittäin metastaattinen. Soluinvaasiota ja muuttoliike merkittävästi heikentynyt GC9811-P ja SGC7901-M solulinjoissa transfektion jälkeen let-7 f-matkii. Nude hiiriä ksenograftimalleja mahasyövän vahvisti, että let-7f voi estää mahalaukun syövän etäpesäkkeiden in vivo transfektion jälkeen, jonka lentivirus pGCsil-GFP- let-7f. Lusiferaasireporttiterilla analyysit osoittivat, että anna 7F suoraan sitoutuu 3’UTR MYH9, joka koodaa myosiinin IIA, ja reaaliaikainen PCR ja Western blotting ilmoitti lisäksi let-7f vaimentua ilmentymisen myosiinin IIA mRNA ja proteiini tasoilla .

Johtopäätökset /merkitys

tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen let-7f mahasyövän voi estää hyökkäys ja kulkeutumista mahan syöpäsolujen kautta suoraan kohdistettu tuumorietäpesäke liittyvän geenin MYH9. Nämä tiedot viittaavat siihen, että let-7f voi olla uusia terapeuttisia ehdokas mahasyövän, koska sen kyky vähentää solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden.

Citation: Liang S, hän L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, Guo C, et ai. (2011) MicroRNA Anna-7f Estää invaasion ja -metastaasin mukaan kohdistaminen MYH9 Human syöpään. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10,1371 /journal.pone.0018409

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 27 syyskuu 2010; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2011; Julkaistu: 18 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30801330, No. 30871143, nro 81030044)) ja National Basic Research Program of China (nro 2010CB529300, No. 2010CB529306). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yleisin ruoansulatuskanavan maligniteetti Itä-Aasiassa, Itä-Euroopassa, ja osaa Keski- ja Etelä-Amerikassa, ja se on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien [1]. Laajalle levinnyt etäpesäke on ollut suuri syy synkkä tulos GC potilaista. Etäpesäke on monimutkainen, monivaiheinen prosessi, jossa syöpäsoluja kulkeutua ensisijainen kasvain kaukainen sijainti [2]. Prosessi alkaa, kun primaarikasvaimen solut hyökkäävät viereiseen kudokseen, jonka jälkeen solut tulevat verenkiertoon (intravasation), translokaatiota verisuoniston läpi, poistuminen verisuonista (ekstravasaatio) ympäröivään kudokseen peruskudoksen, aloitetaan mikrometastaaseja ja lopulta lisääntyvissä muodostaa makroskooppinen toissijainen kasvaimia [3]. Yksi ratkaisevista säätimiä, jotka osallistuvat prosessiin on microRNA (miRNA) [4].

MikroRNA (miRNA) ovat luokan endogeenisten ja pienten ei-koodaavan sääntelyyn RNA: iden, jotka säätelevät geenien post transkription tasolla [5]. Kypsä miRNA voidaan transkriptoida RNA-polymeraasi II: n ja syntyvät peräkkäisen muokkauksen ensisijainen miRNA transkriptien Drosha ja Dicer; ne sitten toimia posttranskriptionaalisella sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen täydentävien emäspariutumisesta lähetti-RNA: t [6]. Monet raportit osoittavat, että miRNA avainasemassa erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten solujen erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin, stressinsietokyky, rasva-aineenvaihdunta, kasvaimen kehittymisen, ja kasvainmetastaasit [7], [8], [9].

let-7 perhe on konservoitunut perheen miRNA. Anna-7 alunperin havaittiin sukkulamato Caenorhabditis elegans [10], ja neljätoista jäsentä on todettu mennessä [11]. Äskettäin ekspressiotasot monien let-7-perheenjäsenten havaittiin vähennettävä erilaisia ​​syöpiä. Oletetaan esimerkiksi,-7 vaimentua keuhkosyövän, melanooman sekä pään ja niskan levy- karsinooma, kun taas yli-ilmentyminen let-7 voi estää syöpäsolujen kasvua [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Useita onkogeenien kuten RAS, MYC, ja HMGA2, ovat kohdistu suoraa let-7 [19], [20], [21]. Anna-7f on yksi jäsen let-7 perhe. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että let-7f on säädellään ylöspäin ensisijainen rintasyöpä ja edistää angiogeneesiä [22]; downregulation PAH [23] aiheutti krooninen hypoksia tai monocrotaline rotilla, ja taso laski plasman rakkulat NSCLC potilaiden [24]. Lisäksi, anna-7f voi vaikuttaa solujen lisääntymistä kohdistamalla Kallikrein liittyvien peptidaaseja (KLKs), joka on seriiniproteaasien, joiden on osoitettu olevan väärin säädellystä useita maligniteettien, mukaan lukien munasarjasyöpä [25].

lab on aiemmin tunnistettu joukko ilmentyvät eri miRNA välillä GC9811 ja GC9811-P-solujen avulla korkean profiilin microRNA siru analyysit, jotka sisältävät let-7f [26]. Aikana edelleen karakterisointia let-7f erilaisissa syöpäsolulinjoissa, huomasimme, että let-7f toimii etäpesäke vaimennin. Parannettu ilmentyminen let-7f voi estää GC soluinvaasiota ja muuttoliike in vitro ja in vivo. Vuoteen bioinformatiikan analyysi tunnistimme että MYH9, joka koodaa myosiinin IIA raskaan ketjun mukana edistämiseen syöpäsolujen siirtämisestä tai invaasion, koska otaksuttu let-7f tavoite. Tämän jälkeen tehdyt tutkimukset vahvistivat, että let-7f voi downregulate myosiinin IIA ilmaisun kohdistamalla 3’UTR MYH9, joka tarjoaa mahdollisen kohteen GC hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue kokoelma

Ensisijainen mahakasvaimen kudoksia, viereisen ei-kasvain mahalaukun kudosten ja etäinen metastaattinen mahalaukun kudokset saatiin potilailta, joille tehtiin leikkaus on Xijing sairaalan Digestive Diseases Xi’an, Kiina. Kaikki näytteet kliinisesti ja patologisesti osoitettiin kuitenkin merkittävä asianmukaisesti. Potilaat tarjoaa näytteitä tutkimusta varten allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen muotoja.

Soluviljely

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M oli säilynyt omassa laboratoriossa ja viljeltiin RPMI1640 (HyClone), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa 5% hiilidioksidia inkubaattorissa.

RNA ja reaaliaikainen PCR-

qRT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, ilmentymistasojen mahdollisten let-7f kohdegeenien. Kokonais-RNA uutettiin kudoksista tai viljellyistä soluista käyttäen TRIZOL-reagenssia (Invitrogen Life Technologies). Täydentävä DNA (cDNA) synnytettiin käyttäen TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Reaaliaikainen PCR-analyysit suoritettiin TaqMan Micro-RNA Assay Kit (Applied Biosystems). Primer of let-7f hankittiin Ambion (MI0000437). Primer on MYH9 sekvenssi suunniteltiin käyttäen Primer Express (versio 1.5). Aluke-MYH9 järjestyksessä: (Forward) 5’AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 ’(peruutus) 5’TGACCACACAGAACAGGCCTG3’.All protokollia tehtiin mukaan valmistajan ohjeiden. Ilmentymisen taso let-7f normalisoitiin 5S (Forward: 5’GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ”; ​​

Reverse: 5’GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3 ’). Ilmentymisen taso MYH9 oli normalisoitu to18S (Forward: 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ”;

Reverse: 5’GCTGGAATATCCGCGGCT3 ’). PCR: llä ja tiedonkeruu suoritettiin koskevasta iCycler (Bio-Rad). Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena.

vektorirakenteiden ja lentivirustartunnat Production

pri-let-7f sekvenssi rakennettiin seuraavasti: (Forward) HSA-let-7f-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (peruutus) HSA-let-7f-1- BamHI IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Sekvenssi monistettiin ja kloonattiin pGCsil-GFP Vector (GENECHEM) tuottaa pGCsil-GFP- let-7f. Negatiivinen kontrolli oli PGC FU-RNAi-NC-LV. Virus pakkaus suoritettiin HEK 293T-soluissa jälkeen kotransfektiolla 20 ug pGCsil-GFP-let-7f vektorin 15 ug pakkauksen plasmidin pHelper 1,0 Vector ja 10 ug kirjekuoren plasmidin pHelper 2,0 Vector käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virukset kerättiin 48 h transfektion jälkeen, ja viruksen tiitterit määritettiin.

Oligonukleotidi rakentaminen

let-7f jäljittelee, anna-7f estäjä ja negatiivisen kontrollin siRNA oligonukleotidit chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Oy). Oligonukleotidit Näissä tutkimuksissa käytetyt olivat on-let-7f matkii: 5’UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3’and 5’CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ”

Mimics negatiivinen kontrolli: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUT3’and5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 ’, on vuokrattu-7f estäjä: 5’AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ”. MircoRNA estoaine negatiivinen kontrolli: 5’CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 ”.

Solun transfektio

Soluja viljeltiin 80%: sta 90% konfluenssiin jälkeen ympätään 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen , Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ohimeneviä transfektion jälkeen solut kussakin kuopassa 6-kuoppalevyllä transfektoitiin 12,5 ui miRNA estäjää tai 7,5 ui miRNA matkivat oligonukleotideja. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut otettiin talteen edelleen kokeilua. Stabiilisti transfektoituja soluja, solut transfektoitiin lentiviruksen 30% -50%: n konfluenssiin. Kohdesoluja (1 x 10

4), mukaan lukien GC 9811-P ja SGC7901-M-solut, infektoitiin 1 x 10

6 rekombinantti lentivirus-transdusoivaa yksikköä, kun läsnä on 6 ug /ml polybreeniä (GENECHEM) .

Invasion määrityksessä

invasiivisia kyky solujen määritettiin käyttäen siirtoaltaat (8 um huokoskoko, Corning Costar Corp.). Siirtoaltaat pantiin 24-kuoppaisille levyille. Ensimmäinen, 0,1 ml Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences) lisättiin levylle pinnalle ja inkuboitiin 2 tuntia, ja sitten supernatantti poistettiin. Juuri trypsinoitiin ja pestiin solut (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) suspendoitiin RPMI1640, joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia. Sitten 100 ui solususpensiota (1 x 10

5 solua) lisättiin ylempään kammioon kunkin insertin, joka oli päällystetty Matrigel. Seuraavaksi 450 ui RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia lisättiin alempaan osastoon, ja solujen annettiin tunkeutua 24 h-48 h 37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa. Inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 95% absoluuttista alkoholia ja värjättiin kristallivioletilla. Solujen yläpinnan suodattimen poistettiin vanupuikolla ja solut, jotka olivat tunkeutuneet pohjaan suodattimen pinta laskettiin ja kuvattiin alle käännettyä mikroskooppia (Olympus Corp. Tokio, Japani) on x 200 suurennus yli kymmenen satunnaisesti kenttiä kuhunkin kuoppaan. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

solumigraation

kyky GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, ja SGC7901-M-solut siirtymään havaittiin käyttäen siirtoaltaat [8 um huokosia koko, Corning Costar Corp.]. Siirtoaltaat pantiin 24-kuoppaisille levyille. Juuri trypsinoitiin ja pestiin solut suspendoitiin RPMI1640, joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia. 5 x 10

4 solua /kuoppa pantiin alkuun kammiossa kunkin insertin (BD Biosciences, NJ), jossa on ei-päällystetty kalvo. 450 ui RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia lisättiin alakammioissa. Kun oli inkuboitu 24 h-48 h 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa, solut kiinnitettiin 95% absoluuttista alkoholia ja värjättiin kristallivioletilla. Solut kammiossa poistettiin pumpulipuikolla ja solut pohjaan kiinnitetyn membraanin laskettiin ja kuvattiin alle käännettyä mikroskooppia (Olympus Corp. Tokio, Japani) on x 200 suurennus yli kymmenen satunnaisesti kentät kussakin kuopassa . Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

In Vivo etäpesäkkeiden määrityksessä

in vivo etäpesäkkeitä määrityksissä stabiilien solulinjojen GC9811-P ja SGC7901-M kerättiin kudosviljelypulloissa transfektion jälkeen lentivirus pGCsil-GFP- let-7f ja hallita pGCsil-GFP käyttämällä trypsiiniä ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Sitten 2 x 10

6 solut suspendoitiin 0,2 ml: aan seerumitonta RPMI 1640 kunkin hiiren (kuuden kussakin ryhmässä, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 viikkoa ikä), ja solut ruiskutetaan häntälaskimoon. Neljän viikon kuluttua injektio, hiiret tapettiin. Maksakudosta havaittiin paljaalla silmällä, ja näkyvissä olevien kasvaimia maksassa pinnalla laskettiin. Maksa kudokset jaettiin leikesarjojen, kiinteä fosfaattipuskuroidulla neutraali formaliinilla, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja tutkittiin histologisesti. Nude-hiiret manipuloitu ja hoidetaan mukaan NIH Animal Care ja käyttö komitean suuntaviivojen Experiment Animal Centerin neljännen Military Medical University (Xi’an, Shanxi, PR China).

Luciferase Reporter Assay

sen tutkimiseksi, MYH9 ilmentymistä säätelee let-7f, dual-lusiferaasireport- määritys suoritettiin. 3 ’UTR: MYH9 sisälsi let-7f sitoutumiskohdan monistettiin PCR: llä. Monistaminen MYH9 käytettiin seuraavia alukkeita: (Forward) XhoIF: 5’CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 ’(Reverse) NotIR: 5’ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3’

Negatiivisena kontrollina, mutatoitu sitoutumiskohta 3′-sekvenssin, (käyttäen käänteistä komplementtia sitoutumiskohdan) monistettiin käyttäen alukkeita: (Forward) mutlet7MYH9F: 5’TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 ’(Reverse) mutlet7MYH9R: 5’CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3’. Tuotteet takaisin kautta agaroosigeelielektroforeesilla ja kloonattiin lusiferaasireportteri- PsiCHECK vektori (Promega, Madison, WI). Kaikki rakenteet varmistettiin sekvensoimalla. Log vaihe GC9811-P-solut ympättiin 24-kuoppalevyille ja kotransfektoitiin Let-7f estäjiä tai valvontaa, ja lusiferaasi toimittajat käyttävät Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) ohjeiden. 48 tunnin kuluttua inkubaation, tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuus mitattiin kahden lusiferaasireportterigeenin määritys (Promega).

Western Blot

Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja raaputettiin RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptiini, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) kanssa juuri lisätty proteaasiestäjäseostabletit (Roche) 15 minuutin ajan jäillä, sentrifugoitiin sitten 13000 rpm: ssä 10 minuutin ajan, ja supernatantit kerättiin. Kymmenen mikrogrammaa kutakin näytettä erotettiin käyttäen 6% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad, Hercules, CA). Nauhojen inkuboitiin 10% rasvatonta kuivamaitoa Tris-puskuroitu suolaliuos, 0,1% Tween-20 estää epäspesifisten sitoutumiskohtien ja niitä inkuboitiin primäärisen vasta-aine: kanin polyklonaalista anti-ihmis-myosiinin IIA (laimennettu 1:500; Cell Signaling Technology ) yön yli 4 ° C: ssa. Jälkeen rewarming ja toistuvaa pesua kolme kertaa, 15 min kullekin, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kaniini-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology), laimennettu 1:2000 kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Bändit todettiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi (Amersham Biosciences).

immunohistokemia

Kaksi kudosmatriisien ostettiin SHANXI CHAOYING BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Yksi oli mahasyövän kudosten ja sovitettu viereisen normaali mahalaukku kudosta, toinen oli mahasyövän kudosten ja Hyväksytty imusolmuke etäpesäke .Tissue taulukot poistettiin vaha 60 ° C: ssa 2 tuntia, korkea lämpötila antigeeni elpyminen 10 min, uudelleen hydratoituja inkuboitiin 10% normaalia vuohen seerumia 1 h, sitten inkuboitiin kanin polyklonaalista anti-ihmis-myosiinin II A (laimennettu 1:100; Cell Signaling Technology) yön yli 4 ° C: ssa. Objektilasit pestiin PBS: ssä kolme kertaa 5 minuuttia kerrallaan. Kudoksia inkuboitiin vuohen anti-kanin seerumia (DAKO) 1 h ajan, huuhdeltiin PBS: llä. Osiot todettiin käyttäen DAB ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Värjäytymisintensiteettiä oli pisteytetty neljän asteikon (0, 1+, 2+ tai 3+) ja positiivisten solujen prosenttiosuuden arvioitiin kolmella eri patologit (0 = ei mitään, 1 = 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = 70% tuumorisolujen). Yhteensä keskiarvot sitten jakaa neljään ryhmään: negatiivinen (ei havaittavaa värjäytymistä, kun arvioidaan verrattuna epäspesifisen taustan värjäystä, heikko (+), kohtalainen (++) tai vahva (+++) ja verrattiin käyttäen Mann-Whitneyn testi.

tilastollinen analyysi

Studentin t-testiä (kaksisuuntainen), Yksisuuntainen ANOVA ja Mann-Whitneyn testiä käytettiin analysoida in vitro ja in vivo -tiedot SPSS 12.0 ohjelmistoa (Chicago, IL , USA). P-arvo 0,05 määriteltiin tilastollisesti merkitsevä. *

P

0,05; **

P

0,01.

tulokset

taso anna-7f ilmentymistä usein vähentynyt ihmisen GC metastaattisen solulinjoissa ja kudoksissa

Olemme tutkineet mRNA ekspressiotasot let-7f in kaksi paria ihmisen mahasyöpä solulinjoissa, GC9811, GC9811 -P ja SGC7901-NM, SGC7901-M. Kuten on esitetty kuviossa 1A, ilmentyminen let-7f oli pienempi GC-soluissa, GC9811-P ja SGC7901-M, korkea metastaattinen potentiaali, kun taas let-7f on enemmän ilmentyy suuresti GC soluissa, GC9811 ja SGC7901-NM, joilla on alhainen metastaattinen potentiaali. Edelleen vahvistaa roolia anna-7f mahalaukun syöpäsolujen etäpesäkkeiden vertasimme ekspressiotasot let-7f makeassa ihmisen mahasyövän kudosnäytteiden etäpesäkkeitä kahdeksasta yksilöiden (taulukko S1), normaaliin mahalaukun kudoksiin (NG), ensisijainen mahasyövän kudokset (GC) ja etäinen metastaattinen mahasyövän kudokset (MC), tässä järjestyksessä, reaaliaikainen PCR. Kiehtovan, oli merkittävä downregulation let-7f MC ja GC verrattuna let-7f ilmentymisen NG (kuvio 1 B). Havaitsimme, että joko menettävät tai vähentynyt ilmentyminen let-7f kasvaimissa ja metastasoituneeseen kudosten johti parantuneeseen etäpesäke mahasyövässä kudoksissa. Tulokset kaikki ehdotti, että ilmentyminen anna-7f negatiivisesti korreloivat hyvin läheisesti vähentynyt GC etäpesäkkeitä ja saattaa olla tärkeä rooli patologisia muutoksia. Olemme siis säädetty kliininen ja solujen käsitteellinen näyttöä metastaattisen kytkimen syövän kehittymisessä, joka viittaa avainasemassa ilmentymisen anna-7f syövän kehittymisessä.

(A) keskimääräinen fold-muutokset let-7f geeniekspression GC9811 ja GC9811-P (oikealla). Keskimääräinen fold-muutokset let-7f geeniekspression SGC7901-NM ja SGC7901-M (vasemmalla). Studentin t-testi, n = 3 (B) suhteellinen ekspressio let-7f 5S. *

P

0,05. **

P

0,01. yksisuuntainen ANOVA, n = 8. Reaaliaikainen PCR osoittaa, että suhteellinen ekspressio let-7f kahdeksan viereisen ei-syöpä mahalaukun kudosnäytteitä ja mahasyövän solulinjoissa GC9811, SGC7901-NM on korkeampi kuin niiden ensisijainen mahasyövän ja etäinen mahalaukun etäpesäkkeitä yksilöitä ja suuren potentiaalin etäpesäke mahasyövän cell GC9811-P ja SGC7901-M.Each näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja normalisoitiin 5S. Kertainen muutos on laskettu 2-

ΔΔ

Ct.

Anna-7f esti invasiivisen ja metastaattisen kyvyt GC-solujen in vitro

Koska let-7f säädökset kuin sekoittimen hyökkäyksen ja metastaattisen prosesseja, tutkimme vaikutuksia laski let-7f vähemmän etäpesäkkeitä solulinjoissa ja lisääntynyt anna-7f enemmän etäpesäkkeitä solulinjoissa. Tämän saavuttamiseksi, lyhyt häiritsevä RNA (siRNA) oligonukleotidien let-7f rakennettiin ja vietiin GC9811 soluihin ja SGC7901 -nm solujen metastaasin määrityksissä in vitro, kuten GC9811-let-7f-siRNA-solut, SGC7901-NM-let-7f -siRNA soluja ja kontrollisoluja. Samalla matkivat-let-7f ja negatiivinen kontrolli oligonukleotidit myös rakennettu ja viedä GC9811-P-solujen ja SGC7901-M solujen etäpesäke määrityksissä in vitro, kun GC9811-P-let-7f-matkivat soluja, SGC7901-N-on päästänyt -7f-matkivat soluja ja kontrollisoluja. Ehtyminen let-7f merkittävästi heikentynyt kyky GC9811 solujen siirtyä ja tunkeutua läpi Matrigel päällystettyjä kalvoja tai ei-Matrigel pinnoitettu kalvojen kohti seerumia sisältävässä väliaineessa muokatussa Boyden kammion määrityksessä (kuvio 2A). Lisääntynyt ilmentyminen antaa 7F suppressoi merkittävästi kykyä GC9811-P-solujen siirtää ja tunkeutua läpi matrigeeliä päällystettyjä kalvoja tai ei-matrigeeliä pinnoitettu kalvojen kohti seerumia sisältävässä väliaineessa on modifioitu Boyden kammion määrityksessä (kuvio 2B), verrattuna kontrollisoluihin. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin SGC7901-NM-solut (kuvio 3A) ja SGC7901-M-soluissa (kuvio 3B), kun taas let-7f tyrmäys GC solulinjoissa johti korkeampiin invaasiota ja siirtymänopeuksien.

(A) Invasion ja migraatiokokeessa. Edustavia aloilla invasiivisen (ylöspäin) tai muuttoliike (alaspäin) solujen kalvolle (vasemmalla). (Suurennus x 200). Keskimäärin invasiivisia tai muuttoliikkeen solujen määrä per kenttä (oikealla). Invasiivisen tai muuttoliike solujen määrä GC9811 transfektoitujen solujen let-7f-estäjien voimakkaasti kohonneet kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli. * P 0,05, Studentin t-testi, n = 10 (B). Invasiivisen tai muuttoliike solujen määrä GC9811-P transfektoidut solut let-7f-matkii on huomattavasti vähentynyt kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli. * P 0,05, Studentin t-testi, n = 10.

(A) Invasion ja migraatiokokeessa. Edustavia aloilla invasiivisen (ylöspäin) tai muuttoliike (alaspäin) solujen kalvolle (vasemmalla). (Suurennus x 200). Keskimäärin invasiivisia tai muuttoliikkeen solujen määrä per kenttä (oikealla). Invasiivisen tai muuttoliike solujen määrä SGC7901-NM transfektoitu let-7f-estäjien voimakkaasti kohonneet kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli. * P 0,05, Studentin t-testi, n = 10 (B) toinen invasiivisia tai muuttoliike solujen määrä SGC7901-M transfektoidut solut let-7f-matkii on dramaattisesti vähentynyt kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli. * P 0,05, Studentin t-testi, n = 10.

Anna-7f estää syövän leviämisen ja etäpesäkkeiden nude mouse ksenograftimallia

GC9811-P tai SGC7901-M kasvainsolujen transfektoitu lentivirus pGCsil-GFP- let-7f tai negatiivinen kontrolli pGCsil-GFP injektoitiin paljaisiin hiiriin ja hiiret tapettiin neljän viikon kuluttua rokotukset. Metastaasien lukumäärän Nodi väheni dramaattisesti, että nude-hiiriin injektoitiin pGCsil-GFP- let-7f transfektoiduissa soluissa, verrattuna negatiivisiin kontrolleihin (kuvio 4A, 4B). Nämä tiedot tarjoavat vahvoja todisteita siitä, että let-7f voi estää kasvaimen invaasion ja metastaasin in vivo.

GC9811-P ja SGC7901-M-solut transfektoitiin lentivirus pGCsil-GFP-let-7f tai negatiivisen kontrolli lentivirus pGCsil- GFP, ja sitten injektoitiin paljaisiin hiiriin häntälaskimon kautta, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Eläimet tapettiin 4 viikon kuluttua injektion. (A) edustaja anatominen kuvia elämää injektoitujen hiirien GC9811-P- pGCsil-GFP tai GC9811-P- pGCsil-GFP- let-7f (vasemmalla). Keskimääräinen lukumäärä näkyvissä kasvain kyhmyt maksassa (oikealla). P 0,01. Studentin t-testi, n = 6 (B) edustaja anatominen kuvia elämää injektoitujen hiirien SGC7901-M – pGCsil-GFP tai SGC7901-M – pGCsil-GFP- let-7f (vasemmalla). Keskimääräinen lukumäärä näkyvissä kasvain kyhmyt maksassa (oikealla). P 0,01. Studentin t-testi, n = 6.

Anna-7f downregulates myosiinin IIA ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3 ’UTR

edelleen tutkia mekanismia, jolla let-7f tukahduttaa GC invaasio ja etäpesäkkeiden, analysoimme mahdollisia alavirran tuumorietäpesäke liittyviä kohdegeenien in silico. Keskityimme let-7f kohdegeenien, erityisesti ne geenit, jotka olivat muuttoliike ja /tai invaasio liittyviä, ja totesi, että myosiinin IIA, mukana edistämiseen syöpäsolujen siirtämisestä tai invaasio, saattaa olla kohdegeenin let-7f. Yrittäessään selvittää myosiinin IIA säätelee let-7f läpi suoran sitoutumisen sen 3 ’UTR rakensimme täyspitkä villityyppisen ja mutantin fragmenttien MYH9 mRNA 3’ UTR, ja asetetaan ne alueelle välittömästi alavirtaan lusiferaasireportterigeeniin (kuvio 5A). Myöhemmin let-7f matkivat oligoja kotransfektoitiin eri lusiferaasin 3 ’UTR rakentaa osaksi GC9811-P-soluissa. Olemme havainneet, että let-7f laski suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus villityypin 3 ’UTR: MYH9 (kuvio 5B). Kuitenkin lusiferaasiaktiivisuus ei laskenut jyrkästi UTR kanssa mutantti sitoutumiskohtia, verrattuna mut-tyyppinen kollegansa (kuvio 5C). Nämä tulokset tukevat joka MYH9 on välittömänä kohteena let-7f.

(A) Ennustettu duplex muodostuminen ihmisen MYH9 3’UTR (ylhäällä) ja on-anna-7f (alhaalla) ja sekvenssi painetusta kirjaimesta 7f-sitoutumiskohdan sisällä MYH9 3’UTR ja mutantti (mut) MYH9 3’UTR. Lusiferaasin aktiivisuus MYH9 3’UTR (B) tai mut MYH9 (C) 3’UTR reportterigeenin GC9811 infektoidut solut let-7f, let-7f-estäjä, tyhjiä matkivat oligo. Analyysit osoittivat, että lusiferaasiaktiivisuudet ryhmässä oli merkittävästi vähentynyt verrattuna mutantin ja negatiivisen kontrolliryhmiin. * P 0,05. (D): n ekspressio MYH9 analysoitiin qRT-PCR: llä. MYH9 aleni GC9811 soluissa ja SGC7901 transfektoitujen solujen let-7f-jäljittelee verrattuna GC9811 soluihin ja SGC7901 transfektoitujen solujen let-7 f-negatiivinen kontrolli. (E) anna-7f estää endogeenisen proteiinin tasot MYH9, kuten havaitaan Western blot. Vakaa transdusoidut SGC7901-NM ja GC9811 solujen ektooppisesti ilmentävät let-7f käytettiin Western blot -analyysiä. Effect of let-7f on MYH9 in GC9811 soluissa (ylhäällä). Effect of let-7f on MYH9 in SGC7901-NM soluja (alhaalla).

RT-PCR osoitti, että ilmentyminen MYH9 vuonna GC9811 soluissa ja SGC7901-NM transfektoitujen solujen let-7f-matkii on vaimentua verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus konstruktioita (kuvio 5D). Western blotting Tulokset osoittivat ilmentymistä myosiinin IIA GC9811 ja SGC7901-NM transfektoitujen solujen let-7f-jäljittelee ovat alassäädetty verrattuna transfektoitu negatiivinen kontrolli (kuvio 5E). Furthmore, Reaaliaikainen PCR osoittaa, että mRNA suhteellinen ilmentyminen MYH9 GC kudoksissa ja etäinen metastaattinen kudos ovat alassäädetty verrattuna normaalin viereisen ei-syöpä yksilöt (kuvio 6A). Immunohistokemia osoitti, että ilmentyminen myosiinin IIA GC imusolmuke etäpesäke on säädelty verrattuna ensisijaisen GC kudoksen (taulukko 2, kuvio 6C; Kuva S1B), ja se on säädellään ylöspäin GC kudoksessa verrattuna sen Hyväksytty viereiseen normaaliin mahaan kudoksen (taulukko 1, kuvio 6B; Kuva S1A) .Nämä tiedot osoittavat, että let-7f voi alas-säädellä mRNA ilmentymistä MYH9 ja voi tukahduttaa proteiini käännös sille.

(A) Reaaliaikainen PCR osoittaa että suhteellinen ekspressio MYH9 kahdeksan kaukana mahan etäpesäkkeiden yksilöt on korkeampi kuin niiden ensisijainen mahasyövän ja viereisen ei-syöpä mahalaukun kudosnäytteistä. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja normalisoitiin 18S. (B) ilmentäminen MYH9 perusterveydenhuollossa mahasyövässä (Ca) ja sen vieressä normaali mahaan kudosta (N) IHC. (C) Expression of MYH9 perusterveydenhuollossa mahasyövässä (Ca) ja sen sovitetun imusolmuke etäpesäke kudos (M) IHC.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että let-7f ilmentymistä metastaattisessa GC solulinjoissa vaimentua verrattuna päästää-7f ilmentymistä ei-metastasoituneen GC soluissa. Kohdunulkoinen ilmaisun ja siRNA knockdovvn let-7f vahvisti sen hyökkäys-estävä vaikutus in vitro ja in vivo. Lisäksi osoitamme, että MYH9 on suora kohde let-7f ja tämä anna-7f välittämää tukahduttaminen MYH9 riippuu sen 3′-UTR. Näin ollen, nämä tulokset korostavat merkitystä let-7f tuumorisuppressorina solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden kohdistamalla MYH9 mahasyövän.

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että miRNA voivat toimia aktivaattoreita tai inhibiittoreita kasvaimen etäpesäkkeiden [27] . Esimerkiksi microRNA-10b [28], miR-373 ja miR-520c [29], [30] kannustanut syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota rintasyövän. Lisäksi miR-155 voi edistää kasvainten invaasio ja etäpesäkkeiden rintasyövän mukaan vähen- tämisessä kohteeseensa, RhoA [31] ja edistää kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden haimassa kanavassa karsinooma mukaan tukahduttaa ilmaus TP53INP1 [32]. Mirna-200 perhe (miRNA-200a miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141 ja miRNA-429) voi estää kasvaimen invaasiota ja etäpesäkkeiden säätelemällä EMT [33]. MiR-126 havaittiin estävän solun tarttumisen, muuttoliike ja invaasio osittain läpi tukahduttaminen CRK in vitro mallissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [34]. On osoitettu, että miR-29c on merkittävästi vähentynyt erittäin invasiivinen ja metastaattinen nenänielun karsinooma [35]. MiR-218 estää hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden mahasyövän kohdistamalla ROBO1 reseptori [26]. Vaikka monet tutkimukset on tehty tutkia mekanismi miRNA ja kasvaimen etäpesäke, mekanismi ei ole selvä. Tärkeintä on, joitakin tutkimuksia on tehty mekanismeista GC etäpesäkkeiden sääntelyä microRNA.

let-7f geeni sijaitsee 9q22.3, ja on mukana erilaisissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa, mukaan lukien angiogeneesi [36], immunosyytti eriyttäminen [37], monistus vanhenemista [38], kasvun pysähtymisen [39], pulmonaalihypertension ja syövän syntymistä [23]. Anna-7f on vaimentua useissa syöpäsairauksia. Erittäin tunnettu esimerkki on munuaissyövän, jossa let-7f downregulation johti merkittävän laskun kallikreiini (KLK) lauseke [40]. KLKs voidaan kohdistaa päästää-7f munasarjasyövän [25]. Vuonna papillaarisen kilpirauhassyöpä, vähentää ilmentymistä let-7f voisi olla keskeinen molekyyli tapahtuma RET /PTC pahanlaatuisiksi [41]. Kun kyseessä on ensisijainen rintasyöpä, mutta anna-7f on voimistunut verrattuna normaaliin viereiseen tuumorikudosten [22]. Tutkimuksessamme osoitimme, että let-7f on myös vaimentua MC kudoksissa ja GC solulinjoissa korkea metastaattinen potentiaali, ja me tutkia edelleen mekanismi, jonka avulla-7f vähensi kasvainten invaasio ja etäpesäkkeiden.

MYH9 on geeni ei-lihaksen myosiinin raskasketjun IIA (NMHCIIA), jonka mutaatiot ovat vastuussa monimutkainen sairaus nimeltä MYH9 liittyvän sairauden, jolle on ominaista yhdistelmä eri fenotyyppisten ominaisuuksien [42].