Krooninen sairaus

tiivistelmä

HEPARANASE on endoglykosidaasi entsyymien läsnä aktivoitu leukosyyttejä, syöttösolut, istukkakudos neutrofiilit ja makrofagit, ja se osallistuu tuumorimetastaasin ja kudosinvaasio. Se esittelee potentiaalinen kohde syövän hoitomuotoja ja erilaisia ​​molekyylejä on kehitetty yrityksenä estää entsymaattisen toiminnan heparanaasin. Yrittäessään kehittää uusia terapeuttisia, johon liittyy diagnostisen analyysin, olemme aiemmin kuvattu korkean affiniteetin aptameerit valittu vastaan ​​heparanaasin. Tässä työssä olemme osoittaneet, että nämä anti-heparanaasin aptameerit kykenevät inhiboimaan kudosinvaasio kasvainsoluja liittyvän suusyövän ja tarkistaa, että tällainen inhibitio johtuu estää entsyymin eikä johtunut muista mahdollisesti sytotoksisten vaikutuksia aptameereillä. Lisäksi olemme tunnistaneet lyhyt 30 emästä aptameeriin mahdollisena lisätutkimusten, koska tämä osoitti suurempaa kyky estää kudosinvaasio kuin sen pidempään vastine, sekä vähäisempi mahdollisuus kompleksin muodostumisen muiden epäspesifisten seerumin proteiineihin. Lopuksi aptameerin todettiin olevan stabiili, ja näin ollen ovat sopivia käytettäväksi ihmisen malleja, koska se ei osoittanut hajoamista ihmisen seerumin läsnäollessa, joten se on mahdollinen ehdokas sekä diagnostisia ja terapeuttisia käyttöä.

Johdanto-osan: Simmons SC, Jämsä H, Silva D, Cortez CM, McKenzie EA, Bitu CC, et al. (2014) Anti-HEPARANASE Aptameerit mahdollisina Diagnostic ja terapeuttinen Agents for Oral Cancer. PLoS ONE 9 (10): e96846. doi: 10,1371 /journal.pone.0096846

Editor: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 27 syyskuu 2013; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2014; Julkaistu: 08 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Simmons et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Dr. Bonacossa tukivat tohtorintutkinnon apurahan päässä Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, laajuudesta ohjelman Science ilman rajoja MCTI, Brasilia. Dr. Missailidis haluaisi tunnustaa taloudellisen tuen Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, laajuudesta vanhempi vierailevana tutkijana ohjelman FIOCRUZ osan tämän projektin. Tutkimusryhmä Prof. Salo tukivat Akatemia, Suomen Syöpäjärjestöt, Suomen Hammaslääkäriseura Apollonia ja Oulun yliopistollisen sairaalan Kevo avustusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

HEPARANASE on β-1,4-endoglykosidaasi entsyymiä [1], joka osallistuu solunulkoisen matriisin (ECM) hajoaminen ja remodeling [1]. HEPARANASE geeni kloonattiin ensin vuonna 1999 Vlodavsky ja Parish ryhmien uraauurtava seläkkäin Nature Medicine paperit [2], [3].

Syntyvä polypeptidi on 543 aminohapon pre-proentsyymisekvenssiä, joka poistamisen jälkeen signaalipeptidisekvenssiä endoplasmakalvostossa, tapahtuu proteolyyttinen prosessointi lopussa endosomeihin /lysosomeihin katepsiini-L: n kaltaisten proteaasien [4] paikoissa Glu109-Ser110 ja Gln157-Lys158, jolloin saadaan N-päätteen 8 kDa polypeptidiä, joka on C- terminaalista 50 kDa: n polypeptidiä ja niiden välillä 6 kDa: n linkkerin polypeptidi [3]. 50 ja 8 kDa polypeptidit liittää muodostamiseksi heterodimeerisen aktiivista entsyymiä, kun taas 6 kDa: n linkkeri irti ja hajotetaan [5], [6].

HEPARANASE aktiivisuus liittyy aktivoitu leukosyyttejä, syöttösolut, istukkakudos ja makrofagit ja entsyymi erittyy aktivoituneet CD4 + T-solujen [7], [8], [9], verihiutaleita [3], neutrofiilien ja metastaattisen soluihin [10]. Kun eritystä heparanaasin peräisin metastaattisten kasvainsolujen, entsyymi hydrolysoi glykosidisidoksista heparaanisulfaatin ketjujen kiinnitetty proteoglykaanien tuotteeseen 10-20 sokeriyksikköä pituus [11], mikä tunkeutuminen endoteelisolujen verisuonten ja kohde-elimiin kasvainsolu. Vapauttamista sitoutuneen sytokiinien ja kasvutekijöiden sekvestroida heparaanisulfaattia ketjujen kudoksissa [12] edelleen helpottaa kasvaimen kasvua ja edistää angiogeneesiä ja proliferaatiota sekundaarikasvaimia [13]. Tasot HEPARANASE ilmentymisen kasvainsoluissa korreloi metastasoituneeseen potentiaalia; kohonneet heparanaasin mRNA: ta ja proteiinia, on havaittu syöpäpotilailla, jotka ovat merkittävästi lyhyempiä leikkauksen jälkeinen eloonjääminen kertaa kuin potilailla, joiden heparanaasin tasot ovat normaalit [13], [14].

HEPARANASE säätelyyn ylöspäin syöpäsolujen myelooma, lymfoblastoidi ja rintasyöpä heijastuu lisäämisen eksosomi erityksen laajennetussa pitoisuus syndekaani-1, VEGF ja HGF joiden roolit liittyvät läheisesti kasvaimen aggressiivisuus [15]. Sen lisäksi toiminta syövän etenemiseen, heparanaasin entsyymi myös merkittävä rooli tulehduksen

sinänsä

ja syövän syntymistä liittyvät tulehduksellinen prosessi [16]. Entsyymi on havaittu erilaisissa immuunijärjestelmän solujen, mukaan lukien T- ja B-solut, makrofagit, neutrofiilit ja syöttösoluista. On osoitettu välittävän ekstravasaation kautta endoteelin esteen kautta remodeling ECM heparaanisulfaatin, joka sitten sallii kaupan on tulehdus- [10], [17], [18]. Heparanaasin ilmentyminen on yhdistetty tuumorigeneesiä useita eri syöpiä, esimerkiksi, akuutti myelooinen leukemia [19], virtsarakon, aivojen [20], rintojen [21], paksusuolen [22], mahan [23], ruokatorven [24] suun kautta [25], haiman [14], ja kohdunkaulan syöpä [26], mikä viittaa siihen, että se voi olla sopiva kohde lääkehoidon. Tällä hetkellä käytettävissä olevat inhibiittorit heparanaasin kuuluvat neutraloivat vasta-aineet [27], peptidit [28] ja pieniä molekyylejä, [29], [30].

määrä modifioitua hepariinien ja sulfatoitujen oligosakkaridien on myös osoitettu olevan tehokkaita heparanaasin estäjät lupaavia kasvaimen vastainen toiminta ja ovat nyt edennyt kliiniseen testaukseen vaiheissa. Esimerkkejä näistä ovat SST0001, M402, PI-88 ja PG545. SST0001 on täysin N-asetyloitu modifioitu hepariini, joka ei ole antikoagulanttien ja osoitettu olevan selektiivinen heparanaasin estäjä. Se on tällä hetkellä vaiheen I /II kliinisissä kokeissa myelooman hoitoa potilaille. M402 on N-sulfatoitu modifioitu hepariini, joka sitoutuu laajemman kasvutekijöiden verrattuna SST0001. Tämä on edennyt vaiheeseen I /II kliinisissä kokeissa yhdistelmänä hoidon kemoterapian aineen gemsitabiinin metastasoituneen haimasyövän. PI-88 on sulfatoitunut polysakkaridi, jolla on voimakas anti-angiogeenisten ja anti-metastaattisen aktiivisuuden ja vähemmän toivottuja antikoagulanttiaktiivisuus. Se on saavuttanut vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa jälkeiseen resektio maksasyövän. PG545 on tetrasakkaridi joka on ylivoimainen farmakokineettiset ominaisuudet koska sen korkea lipofiilisyydestä. Se on osoittanut voimakkaita antituumorivaikutuksen in PI88 kestävä malleissa kuitenkin faasin I kliiniset kokeet vuoden 2010 lopulla hylättiin johtuu odottamattomaan pistoskohdan reaktioita [31].

Aptameerit ovat lyhyitä DNA- tai RNA-oligonukleotidien kehitetty diagnostisia ja terapeuttiseen käyttöön, jotka näyttävät suuri sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys kohde- molekyylien [32] – [34]. Affiniteetti Aptameerien on verrattu että vasta-aineiden (eli nanomoolialueella), mutta koska aptameerit ovat pienempiä (8-25 kDa verrattuna 150 kDa koko vasta-aineet), ne voivat sekä tunkeutua kudoksiin ja tyhjennetään plasmasta muutaman minuutin laskimoon aiheuttamatta immuunivasteen, joka voi olla hyötyä käytettäessä niitä diagnostisina aineina [35]. Terapeuttiseen käyttöön, ne pystyvät säilyttämään toiminta ja sitovat ominaisuudet niitä muutettaessa muiden osien parantaa vakautta ja liukoisuutta, vähentää samalla niiden myrkyllisyys ja plasmasta [35] – [38], [39] – [41]. Tyypillisesti, aptameerit ovat 22-100 emästä pituudeltaan, ja ne sisältävät alueen muuttuvan sekvenssin, jota reunustavat tunnettuihin sekvensseihin, joita käytetään vahvistusta ja tunnistamista varten. Suuri ohjelmistoon eri sekvenssi yhdistelmien (tyypillisesti alueella 10

15) Keski domain aiheuttaa monia erilaisia ​​taitto järjestelyjä, spesifisyys ja sitoutumisaffiniteetti eri molekyylejä. Aptameerit tuotetaan tyypillisesti perustuvat SELEX (systemaattinen kehitys ligandien eksponentiaalinen rikastamiseen) menettely [42], vaikka useita muita valinnan menetelmiä on tällä hetkellä saatavilla [43] – [45].

Aptameerien aiemmin luotu vastaan ​​aktiivinen ihmisen rekombinantti heparanaasin käyttäen modifioitua SELEX’in ja suola eluointia sarjassa. Valinta tuotti kolme aptameerejä, ”1,5 M lyhyt”, 30 pohja katkaistun version ”1,5 M pitkä” (73 emästä), ja ”3,0 M ’(55 emästä). ELISA ja fluoresenssi titrauksessa erottaa kaksi pidempää Aptameerien kuten osoittaa suurempi affiniteetti ja tunnustamista heparanaasin istukan soluissa, kun taas istukkakudos värjäystä suosinut ”1,5 M pitkä”. Tämä vahvistettiin Matrigel invaasiomääritys käyttäen munasarjakarsinoomasolut aiemmin osoitettu vaatia heparanaasin varten hyökkäys [46]. Kaksi muuta aptameerit, jota kutsutaan ”vaaleanpunainen” ja ”keltaista” valittiin vastaan ​​kytkijäpeptidiä sekvenssin pro-heparanaasin, koska ne voivat olla funktio muodostumisen estämiseksi aktiivisen heterodimeerin entsyymi, estämällä peptidi proteaasin leikkaaminen.

tässä tutkimuksessa pyrittiin edelleen luonnehtia aiemmin valitun aptameerejä ja arvioimaan niiden mahdollisia diagnostisena tai terapeuttisena aineena. Vakaus aptameerin arvioitiin inkuboimalla yli eri ajankohtina, jossa ihmisen ja hiiren seerumin, ja polyakryyliamidigeelielektroforeesi käytetään määrittämään, missä määrin sen hajoamisen nukleaasien läsnä seerumissa. Ylimääräinen invaasiomääritys lisäksi edellisen hiiren EHS-kasvain peräisin matrigeeliä invaasiomääritys, suoritettiin käyttäen ihmisen kohdun sileälihaskasvain kudosten ja heparanaasin ilmentäviä ihmisen suun squamous kohdunkaulan soluissa (HSC-3), koska tämä kokeilu edustaa aidompaa kuva mitä tapahtuu ihmisen kudosta. Lisäksi sytotoksisuuden /solujen lisääntymisen määritys suoritettiin sen varmistamiseksi, että estoa invaasion havaittu ei ollut seurausta sytotoksisuus osa aptameerit. Lopuksi vuorovaikutukset aptameereillä kanssa seerumin proteiineihin tutkittiin sekä tarkistaa spesifisyys aptameerit ja tutkia niiden mahdollisia liikenteen tällaisten proteiinien verenkiertoon. Lisääntyvä kirjallisuutta DNA aptameeriin kenttä on osoittanut, että nämä molekyylit on valtava terapeuttinen potentiaali syövän hoidossa hoitoon ja on jo käytetty ns escort molekyylien toimittaa huumeita syöpäsoluja (tarkistetaan [47]). AS1411 on esimerkki DNA aptameerin, joka on edennyt kliinisiin tutkimuksiin testausta. Aptameeriä tässä tapauksessa kohdistuu erityisesti nukleoliinin proteiinia ja on trialed kanssa metastaattinen, kirkas-solu, munuaissyövän potilailla, jotka eivät olleet johon aiempi tyrosiinikinaasiestäjiksi [48].

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen kielen squamous kohdunkaulan soluissa, HSC-3 (JCRB 0623; Osaka National Institute of Health Sciences, Osaka, Japani), viljeltiin kasvatusväliaineessa: 50% DMEM 50% Hamin F-12 (Sigma Aldrich) ja lisäksi täydennetty 50 ug /ml askorbiinihappoa, 250 ng /ml amfoterisiini B: tä, 5 ug /ml insuliinia (naudan haiman), 0,4 ng /ml hydrokortisonia ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia. Viljelmä täydennys ostettiin Sigma Aldrich. Kaikki soluviljelmät suoritettiin käyttäen esilämmitettyä reagensseja. Soluja inkuboitiin 95% ilma /5% CO

2 37 ° C: ssa. Solut siirrostettiin poistamalla median ja pesemällä HBSS (Sigma Aldrich), sitten lisätään 3 ml 1 x trypsiini-EDTA: ta (Sigma Aldrich) ja inkuboimalla 5 minuutin ajan. Trypsiini-EDTA inaktivoitiin lisäämällä 7 ml kasvualustaa ja poistamalla solujen möhkäleitä. 1 ml solususpensiota (plus 24 ml tuoretta kasvualustaa) säilyi Pullon varastojen ylläpito ja loput 9 ml laskettiin ja käytettiin kokeisiin.

Organotyyppisiä invaasiomääritys ja analyysit estäjien invaasio

organotypic invaasiomääritys ja kvantifiointiin tulokset kuvatussa Nurmenniemi

et al

. (2009) [49]. Lyhyesti, 7 × 10

5 HSC-3-solut suspendoitiin väliaineessa, joka sisälsi sopivan aptameeriin (Etuyhteydetön, 1,5 M lyhyt, 1,5 m pitkä, 3 M, vaaleanpunainen ja keltainen) tai vasta-aine vastaan ​​heparanaasin (HPA Ab, 0,7 mmol) . Myös (2- {4 – [(E) -3- (4-bromifenyyli) akryloyyliamino] -3-fluorifenyyli} bentsoksatsol-5-yyli) etikkahappoa, lyhennettynä BAFB, käytettiin, koska tämä on todettu olevan estäviä vaikutuksia upon HEPARANASE aiemmissa tutkimuksissa [29] (taulukko 1). Kukin aptameeri tai vasta-ainetta lisättiin 1 uM HSC-3 solususpensiota alussa tutkimuksen ja HSC-3 soluviljelyalustoissa koko kokeen ajan. Myoma levyjä ilman HSC-3-soluissa ja HSC-3 soluja ilman estäjää olivat mukana myös määrityksessä verrokkeina. Levyjä inkuboitiin 14 päivää 37 ° C: ssa, 5% CO

2 median kanssa, joka sisältää sopivan inhibiittorit. Media kerättiin, sentrifugoitiin, ja tuoreella väliaineella estäjien muutettiin päivinä 4, 7, 10 ja 14. kerätyistä media supernatantit, hajoamistuotteita myoma kudoksen tyypin III kollageenin analysoitiin käyttämällä SP99 radioimmunomääritys (RIA) ja C- päätelaite telopeptidin (IIICTP), ja N-terminaalinen telopeptidi (IIINTP) epäsuora entsyymi-immunomääritykset (EIA), N-terminaalinen telopeptidi, seuraamalla menetelmiä, jotka on kuvattu Nurmenniemi

et ai

. ([49] RIA ja [50] EIA). Päivänä 14 myoma levyt kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja valmistellaan immunohistologisia analyysiä. Kuusi pm histologisia osia myoma levyt värjättiin monoklonaalisella pancytokeratin vasta-aineella (DAKO, klooni AE1 /AE3 klo 1:150 laimennus) ja tarkastella mikroskoopilla 100-kertaisella suurennuksella. Yhdeksän edustavat kuvat otettiin kunkin kolmen toistojen jokaisen hoidon. Kuvat analysoitiin, kuten on kuvattu Nurmenniemi

et al.

(2009) [49]. Erot hyökkäyksen alueella ja syvyys arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä ja Mann-Whitneyn testi ja p-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Soluproliferaatiomääritys

Voit selvittää vaikutus ”1,5 M lyhyt” aptameeriin on HSC-3 solujen lisääntymistä, käytimme CellTiter 96 Aqueous proliferaatiomääritystä (Promega), MTS-määritys. Noin 1 x 10

4-soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyn 1 uM lyhyen aptameerin. 24, 48 ja 72 h, 20 ml CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Absorbanssi nauhoitettu 490 nm Fluostar Optima levylukijaa käytettiin edustus suhteellisen määrän eläviä soluja viljelmässä.

Serum vakauden määritys

Aptameerit ”1,5 M lyhyt”, ” 1,5 M pitkä ”ja” 3,0 M inkuboitiin konsentraationa 5 uM ihmisen ja hiiren seerumin 30, 60, 120, 180, 240 ja 300 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sitten reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 mM EDTA ja tuotteet juoksi 12% natiivi polyakryyliamidigeelissä, yhdessä 25 emäsparin DNA-markkeri tikkaat. Geelit värjättiin etidiumbromidilla ja katsottu UV-valossa.

seerumialbumiinia sitovan

naudan seerumialbumiinia (BSA) ostettiin Sigma-Aldrich Ltd (Gillingham, Yhdistynyt kuningaskunta, tuotekoodi A7030 10 g ). UV kokeita Bio-Tek Uvikon XL Peltier Thermosystem lämpötilan säätöön ja sekoittaen laitos, liitetään tietokoneeseen käyttämällä Lab Virta Junior ohjelmisto tietojen keruu ja analysointi. Fluorometri käytetyt oli Horiba Jobin Yvon Fluoromax-P varustettu fotoni laskuri ja Peltier järjestelmä lämpötilan valvonta ja sekoittamalla laitos, joka on kytketty tietokoneeseen käyttämällä Datamax ohjelmisto spektrianalyysi. Alkuperäisen mittaukset tehtiin tarkistaa läsnäolo tai puuttuminen fluoresenssiemissiota sekä aptameerit ja eksitaatioaallonpituudella 290 nm (selektiivinen tryptofaanitähteet) ja emissioaallonpituudet välillä 300 ja 400 nm. Molemmat aptameerit titrattiin vettä ja 10 mM fosfaattipuskuria ratkaisuja, pH 7,4, 37 ° C: ssa. 1,5 M lyhyen aptameerin pitoisuus vaihteli 0,3-8,0 uM, ja 1,5 M pitkän aptameerin vaihteli 0,5-8,0 uM, joka esittää luontaisen fluoresenssin näiden aptameerit. Molemmat aptameerit esitteli fluoresenssiemissiospektrit tällä alueella. Aiemmat kokeet osoittivat, että aptameerin pitoisuuksina 0,1 ug /ml ja 8 ug /ml ei häiritse arviointia albumiinin sammutusta [51]. Sammutusta mittaukset tehtiin 1 ml: aan 6 uM albumiinien fosfaattipuskuriin, pH 7,4. Emissiospektrit rekisteröitiin 300-400 nm: n aallonpituudella, reaktioajan jälkeen 90 sekuntia kustakin aptameerin lisäksi. Sekä päästöjen ja heräte kaistanleveys asetettiin 3 nm. Aptameeriin lisättiin väkevästä kantaliuoksesta jotta volyymi kasvu oli vähäinen. Kokeet suoritettiin 37 ° C: ssa, pH 7,4.

Arvioidaan kaikki nykyiset pää- ja /tai toissijaisen sisäsuodattimen vaikutuksia (IFES), korjaus menettelyt absorbanssimittausten perusteella ratkaisuja tehtiin heräte ja emissioaallonpituudet albumiinin . Tämä vaikutus koostuu imeytymiseen jännittävä ja /tai säteilyn liuenneen lajeja, kuten fluorofori itse [52]. Absorbanssimittausta Aptameerien /albumiiniliuoksista virityksellä ja emissioaallonpituudet albumiinin osoittivat, että sisempi suodatin aiheuttamaa absorption säteilyn oli vähäinen.

Tulokset

Anti-HEPARANASE Aptameerien estävät karsinooma soluinvaasiota

hyökkäys HSC-3-soluissa tutkittiin ihmisen myoma organotypic malli [49] paljastaen karsinoomasoluista eri aptameerejä (Etuyhteydetön, 1,5 M lyhyt, 1,5 m pitkä, 3 M, vaaleanpunainen, ja keltainen) tai heparanaasin vasta-ainetta (Hpa Ab) (Fig. 1A). Vaikutukset näiden yhdisteiden verrattuna kontrolli (ei inhibiittoria) on invaasio ala (lasketaan um-alueella invasiivisia soluja) ja syvyys invaasion (etäisyys alapinnan noninvasive solun kerroksen syvin hyökkäsi solu) oli analysoidaan (Fig. 1 B ja C). Aptameeri 1,5 M Short laski merkittävästi koko hyökkäyksen ala (p = 0,0001) samanlainen Hpal Ab, jota käytettiin positiivisena hyökkäys estäjä ohjaus [27]. Päinvastoin, mitään muita yhdisteitä, oli vaikutusta HSC-3 invasion (kuvio 1). Invaasio syvyys väheni merkittävästi vasta Hpa Ab hoidon (p = 0,0001) (kuvio 1 C). Perustuen meidän aiempia havaintoja, hajoamista tyypin III kollageenin HSC-3-soluissa mitattuna RIA piikit päivää 7.-11 [49]. Samoin media analysoitiin RIA päivästä 4 ei osoittanut eroja millään näistä käsittelyistä (ei esitetty). Median vaihdon päätyttyä kokeen päivänä 14 oli vain tilastollinen merkitsevyys käsittelyssä, jossa ei ole soluja lisätään (p = 0,001; ei esitetty). Hajoamista tyypin III kollageenin ilman inhibiittorit oli korkeimmillaan päivää 7 (ei esitetty) ja 10 (kuvio 2A-D). Päivänä 10, käsittely heparanaasin vasta-aine inhiboi merkittävästi hajoaminen verrattuna etuyhteydettömille ohjaus (p = 0,07 RIA, ja p = 0,03 EIA). Päivänä 10 oli merkittävä inhibitio 1,5 M Short (p = 0,004 RIA, ja p = 0,007 EIA) ja 1,5 m pitkä (p = 0,02 RIA, ja p = 0,03 EIA) verrattuna HSC-3 ohjaus . Kuitenkin 3 M, vaaleanpunainen, ja keltainen aptameerit sekä BAFB ei esiintynyt merkittävää laskua määrän kollageenin hajoamistuotteita, mikä osoittaa, että ne eivät olleet onnistuneita estäjiä hyökkäystä.

V: parafinoidut 14- päivä myoma organotypic leikkeet värjättiin pancytokeratin markkeri AE1 /AE3 analysoida HSC-3 invaasio erilaisten käsittelyjen jälkeen: ei inhibiittoria, Hpa Ab (polyklonaalinen heparanaasin vasta-aine positiivisena kontrollina), jotka eivät liity aptameerin, (valittuna, kun tavoitteena osallisena Alzheimerin tauti), anti-heparanaasin aptameerien 1,5 M Short, 1,5 m pitkä ja 3 M; kytkijäpeptidiä aptameerit Pink ja keltainen. Mittakaava on 100 pm. Erot invaasiota alue (B) ja invaasio syvyys (C) erilaisten käsittelyjen jälkeen (n = 27 /hoito). Tilasto tehtiin kuin kahden otoksen

t

-testin ja Mann-Whitney testi.

V: EIA (IIINTP epäsuora entsyymi immunomäärityksissä) havaitsemaan N-terminaalista telopeptidi tyypin III kollageenista hajoamistuotteiden päivänä 10 median muutoksen. Lisääntyvä absorbanssi tarkoittaa vähemmän kollageenin hajoamistuote läsnä. Hpa Ab (p = 0,03), 1,5 M Short (p = 0,007) ja 1,5 m pitkä (p = 0,03) osoitti merkittävää kasvua absorbanssin verrattuna ei inhibiittoria, ikään kuin he ovat esti hyökkäyksen HSC-3-soluissa. B: Kaavio osoittaa edellinen EIA arvot oikaistu negatiivisen kontrollin päivänä 10 median muutoksen. C: RIA (radioimmunoassay tyyppi III kollageenin) havaitsemaan C-terminaali telopeptidi päivänä 10 median muutoksen. Lisääntyvää tarkoittaa vähemmän kollageenin hajoamistuote. Hpa Ab (p = 0,07), 1,5 M Short (p = 0,004) ja 1,5 m pitkä (p = 0,02). D: RIA on vahvistanut YVA jotka osoittavat huomattavasti pienempi kollageenin hajoamistuotteiden kuin kudoksia ilman estäjää lisättiin, mikä osoittaa, että he onnistuivat estäjiä hyökkäystä.

Lyhyen anti-heparanaasin aptameeriin ei ole havaittavissa sytotoksisuus

sytotoksisuus valitun aptameerit on HSC-3-soluissa tutkittiin sen varmistamiseksi, että inhibitio hyökkäyksen havaittu organotyyppisissä malli oli seurausta inhibition heparanaasin, kuten aikaisemmin on todennettava [46] ja ei solun sytotoksisuutta. MTS-määritys suoritettiin yli 72 tuntia, jossa on yksi lisäämällä aptameerin alussa määrityksen, ja mittaukset aikana välein 24, 48 ja 72 tuntia. Mitään muutosta solun elinkelpoisuuden ja solujen kasvua havaittiin solujen välillä, jossa aptameeri lisättiin ja ohjaus (katso kuva 3). Vain aptameerit, että estivät hyökkäyksen testattiin sytotoksisuus, tutkia, jos estovaikutus havaittiin johtui sytotoksisuuden tai estämiseksi heparanaasin. Aptameerit jotka eivät estävät solujen invaasiota selvästikään ole vaikutusta soluihin ja siksi ei ollut mitään syytä edelleen tutkittu sytotoksisuuden.

Läsnäolo Aptameerin 1 mM pitoisuuden havaittiin olevan mitään vaikutusta solujen kasvua verrattuna kontrolliin.

lyhyen anti-heparanaasin aptameeriin ei sitoudu merkittävästi seerumin proteiineihin

lyhyet ja pitkät aptameerien 1,5 M alun perin titrattiin vaiheittain veteen ja fosfaatti puskuriliuosta, pH 7,4 37 ° C: ssa tutkia niiden luontaisen fluoresenssin. Molemmat aptameerit on luontainen fluoresenssi, jossa on piikit 380 nm, mikä lisää fluoresenssin voimakkuudessa, kun vastaava lisäys aptameeriä pitoisuus; Lyhyen osoittaa vähemmän fluoresenssia kuin pitkän aptameeri (kuvio 4A ja B). Vettä käytettiin laimentimena osoittaa, että aptameerin ja ei fosfaattipuskuria oli syynä fluoresenssin, vaikka fluoresenssin lyhyen aptameeri kasvoi, kun käytetään fosfaattipuskuriliuosta laimentimena. Tämä johtui todennäköisesti erilainen pH kuin fluoresenssispekroskopian pH muutoksilla on merkittävä vaikutus tuloksiin.

Fluoresenssi lisääntyy, kun pitoisuuden lisääminen Aptameerin sekä fosfaattia ja vettä, joka osoittaa, että vaikka fluoresenssi on korkeampi fosfaatti, aptameeriä on itse asiassa syy ja pH ero vedessä ja PBS on todennäköisin syy kasvu fluoresenssin aptameerin PBS: ssä.

lyhyen aptameerin pystyi sammuttaa fluoresenssin HSA 37 ° C: ssa 1,5% (± 0,03%) ja 9% (± 1,2%) on 1:100 ja 01:10 moolisuhteita vastaavasti sammutuksen 10% saavutetaan molaarinen konsentraatio 9,1 kertaa pienempi kuin HSA (kuva 5). Pitkä aptameerin pystyy sammuttamaan fluoresenssin HSA 10% pitoisuudessa 18,2 kertaa pienempi kuin HSA, ja 2,4% (± 0,1%) ja 16% (± 0,6%) klo 1:100 1:10 moolisuhteissa. Tulokset osoittavat, että molemmat aptameerien kykenevät sammuttamaan fluoresenssin HSA, vaikka pitkät aptameeri oli tehokkaampi. HSA sammutusta osoittaa, että Aptameerien saavuttaa sub domain II A, jossa sen yksi tryptofaani sijaitsee. Tämä tryptofaaniryhmän sijaitsee päällä 214 aliverkkotunnuksena II A, jonka sisällä on suuri hydrofobinen onkalo monien arginiinitähteitä lähellä pintaa [53], jotka on esitetty eri tutkimuksissa palvelemaan ankkuri pistettä Aptameerien [54].

Viritysaallonpituus 290 nm, [HSA] = 6 uM. Eksitaatioaallonpituus 290 mM natrium- fosfaattia. Data on keskiarvo kuudesta arvojen näkyvissä mitään suurempaa keskihajonta kuin 11%. Sammuttava vaikutus on huomattava pitkään kuin lyhyet aptameeriin.

saada enemmän tietoa siitä, millaista vuorovaikutusta välillä oleva aptameerejä ja HSA, UV spektrometria titrauksia suoritettiin titraamalla kasvavia konsentraatioita lyhyitä ja pitkä aptameerit ja 6 uM HSA laimennettiin fosfaattipuskuriin, pH 7,4, kuten on esitetty kuviossa 5. lisäksi molempien aptameerien on fosfaattipuskuri ja HSA lisääntynyt koko absorbanssi, joka osoittaa, että aptameerin oli vastuussa tämän korotuksen sijaan HSA. Lisäys oli selvempi pitkän aptameeri lyhyellä aptameeri, ja molemmat tuottivat siirtymä maksimi absorbanssi vasemmalla lisättäessä kasvavien pitoisuuksien aptameerin.

Siirtyminen havaittiin lyhyt aptameeri (kuvio 6A ) muutti 6 nm vasemmalle, mikä viittaa siihen, että vain pieni konformaatiomuutoksen proteiini oli tapahtumassa [55] ja siksi, HSA vaimentaa tällä aptameeriin on todennäköisesti johtuu dynaamisen sammutusta. Kuitenkin, kun kyseessä on pitkä aptameerin (kuvio 6B), ei ollut ainoastaan ​​siellä merkittävää siirtymää maksimaalisen absorption 20 nm vasemmalle, mutta täydellinen muutos muotoinen huippu havaittiin, joissa huippu 260 nm aptameerin, mikä viittaa siihen, että yksi kompleksi muodostuu ja että sammutus johtui staattinen sammutusta ilmiö pitkä aptameerit [55]. Siten UV titrauksessa ehdotti, että lyhyellä aptameeriin ei muodostanut kompleksin HSA ja että vuorovaikutukset johtuivat dynaaminen sammutusta, kun taas pitkä aptameerin ehdotettiin muodostamiseksi perustilan monimutkainen HSA, toisin kuin muiden aptameerejä aikaisemmin tutkittu, joka myös osoittaa spesifisyyden ja kompleksin muodostumista vain niiden kohdeproteiiniin [56]. Tämä työ on laajennettu ja vuorovaikutukset aptameereillä kanssa seerumin proteiineihin ja erityinen asema niiden vuorovaikutus on laskettu ja julkaistu erikseen, koska se ei ollut puitteissa tämän artikkelin [57].

aptameerit ovat stabiileja ihmisen seerumin

arvioimiseksi aptameerien soveltuvuutta terapeuttisina aineina, oli välttämätöntä saada käsitys siitä, miten vakaa muuntamattoman aptameerien olisi ruumiin, verenkiertoon yksin, on monet nukleaasit, joka kykenee hajottamaan aptameerit. Näin ollen, sen varmistamiseksi, vakautta aptameerit ihmisen seerumissa, olemme tunnettu tahansa hajoamistuotteiden geelielektroforeesilla. Vertailu bändejä geelit 1,5 M lyhyitä aptameeriin inkuboidaan eri ajankohtina ihmisen ja hiiren seerumin, kanssa, Aptameerin vain osoitti, että 1,5 M lyhyt aptameeriin ei kuulunut nukleaasihajotukselle ihmisen seerumia nauhojen ei osoittanut mitään tahroja tai koko pienenee tai intensiteetti verrattuna aptameerin vain, ja näin ollen ole eritelty aptameerin pienemmiksi fragmenteiksi havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Hiirellä seerumi, oli kuitenkin väheneminen ensisijaisen kaistanvoimakkuus viiden tunnin inkubointiaika, mikä viittaa siihen, että nukleaasien ovat huonontunut aptameeriä siihen mennessä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tutkitaan mahdollisuuksia aikaisemmin valitun aptameereillä vastaan ​​heparanaasin niin lupaavia diagnostisia ja terapeuttisia aineita vastaan ​​suun syöpä. Aptameerejä oli aiemmin osoitettu olevan voimakas affiniteetti vastaan ​​heparanaasin ja olivat toiminnallisia Matrigel määrityksessä. Näillä alkuvaiheen tutkimuksissa todettiin, että mitä kauemmin Aptameerien oli suurempi affiniteetti heparanaasin ja he olivat suoriutuneet hyvin fluoresenssimikroskopialla ja Matrigeliä invaasio määrityksissä. Kun kuitenkin tutkinut nämä aptameerit annetun organotypic invaasiomääritys ja analysoidaan niiden mahdollisia estää invaasio, todettiin, että lyhyen aptameeriin oli paljon pysty tähän, verrattuna pitkän kollegansa. Tämä varmistettiin myös analyysin mukaan RIA ja EIA n hajoamistuotteita myoma kudoksen, nimittäin tyypin III kollageenin C- ja N-päätteen telopeptidi vastaavasti. 1,5 M Short ja 1,5 m pitkä aptameerit koostuvat samoista vaihtelevan alueen ja itse asiassa lyhyt on katkaistu versio pitkä. Vaikuttaa kuitenkin siltä, ​​että vaikka pitkä on hieman suurempi affiniteetti, luultavasti johtuen lisääntyneestä vuorovaikutukset proteiinin ja aluke osat aptameerin, nämä pienenisi kyky näiden aptameerien estää kudosinvaasiossa. Läsnäolo eri proteiinien todellinen kudoksessa verrattuna Matrigel kokeessa aikaisemmin suoritettu, voi olla syy tähän, koska pitkän aptameeriä voivat muodostaa muita vuorovaikutus tällaisia ​​proteiineja, tai aluke hännät voi olla steerinen este vaikutus kudos, joka ei ole näkyvää, että yksinkertaisempi Matrigel mallia. Tämä itse asiassa vahvisti vuorovaikutusten tutkimista kahden aptameerejä ja seerumin proteiineihin. Näissä tutkimuksissa todettiin, että pitkän aptameeri muodostettu kompleksi ihmisen seerumialbumiinia, kun taas lyhyt aptameeri ei muodosta monimutkainen ja osoitti vain rajallinen dynaaminen sammutusta. Eräässä toisessa tutkimuksessa [57], olemme mallinnettu vuorovaikutusta lyhyellä ja pitkällä aptameerejä kanssa HSA ja ovat havainneet, että todellakin pitkä aptameeriin muodostaa kompleksin seerumialbumiinit yhdessä sitoutumiskohdan, lähellä Trp 214 HSA tai 212 BSA, aliverkkotunnuksen IIA näiden proteiinien, joka positiivisesti varautuneet onkalo vuorattu lysiini ja arginiini jäämiä [57]. On osoitettu, että lyhyitä aptameeriin laji puuttuu kyky muodostaa komplekseja seerumin proteiineihin ja näyttelyt siten suurempi spesifisyys sen tavoitteen, joka oikeuttaa valinta käyttää sitä millään muiden terapeuttisten tai diagnostisten kehitystä ja on yhtä mieltä myoma esitetyt tiedot tässä työssä. Eräs toinen tärkeä piirre tässä tutkimuksessa on osoitus jälkeisen SELEX muutokset voivat olla hyödyllisempi aptameeriin valinnassa kuin alkuperäisen vasta-selektiovaiheita, jos se on mahdollista. Sarjassa tutkimuksia eri menetelmien havaitsemista, aptameerin affiniteetti niiden tavoite on verrattu että albumiiniin.