Krooninen sairaus

tiivistelmä

Setuksimabilla, kimeerinen monoklonaalinen vasta-aine on kehitetty kohdistaminen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), on ollut intensiivisesti syöpälääkkeitä Metastasoivassa kolorektaalisyöpä ja pään ja kaulan alueen syöpä. Ehjä immunoglobuliini G (IgG) vasta-aine, kuten setuksimabi, on kuitenkin joitakin rajoituksia kuten korkea tuotantokustannusten ja alhainen levinneisyysaste alkaen verisuonistosta kiinteä kasvain massa, koska sen suuri koko. Yrittäessään voittaa nämä rajoitukset, me suunniteltu setuksimabin luoda yhden ketjun vaihtelevan fragmenttien (scFv-CH3; minibody), joka ilmaistiin bakteerien järjestelmässä. Niistä kolme suunniteltu minibodeja, huomasimme, että MI061 minibody, joka koostuu Vaihtelevan raskas- (V

H) ja kevyt (V

L) alue liittyi 18-tähteen peptidilinkkeri, näyttää suurempi liukoisuus ja parempaan saantiin ominaisuuksia bakteerien lysaattia. Lisäksi olemme validoitu että puhdistettu MI061 merkittävästi häiritsee ligandin sitoutumista EGFR ja estää EGFR: n fosforylaatio. Käyttämällä proteiinia microarray koostuu 16368 ainutlaatuinen ihmisen proteiineja, jotka kattavat noin 2400 solukalvon liittyneet proteiinit, kuten reseptoreita ja kanavat, myös osoitti, että MI061 tunnistaa vain EGFR mutta ei muita proteiineja verrattuna setuksimabia. Nämä tulokset osoittivat, että engineered MI061 pitää sekä sitoutumisspesifisyys ja affiniteetti setuksimabi EGFR. Vaikka se oli suhteellisen lyhyt puoliintumisaika seerumissa, on osoitettu olevan erittäin merkittävä antituumorivaikutus estämällä ERK-reitin A431 ksenograftimallissa. Yhdessä nykyisen tutkimus antaa vakuuttavia todisteita siitä, että suunnitellut minibody on tehokkaampaa ja lupaava aine

in vivo

kohdistaminen kiinteiden kasvainten.

Citation: Kim YP, Park D, Kim JJ, Choi WJ, Lee SH, Lee SY, et ai. (2014) Tehokas terapeuttinen lähestymistapa pään ja kaulan alueen syövän rakennetulla minibody kohdistaminen EGFR-reseptorin. PLoS ONE 9 (12): e113442. doi: 10,1371 /journal.pone.0113442

Editor: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 23 lokakuu 2014; Julkaistu: 01 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama tiede, ICT Tulevaisuuden suunnittelu (nro 2011-0030043 2012-R1A1A1013558). Tätä työtä tuki myös osittain avustusta National R molekyylikoon merkki, 1; raakauutteen, 2; liukoiset proteiinit, 3; pelletti, 4; virtaavat, 5; pesu 50 mM imidatsolia, 6; eluoimalla 400 mM imidatsolia, WB; Western blot.

Toiminta ja spesifisyys suunniteltu minibodeja

Perustuu talteenottosaanto kunkin minibody bakteeri- lysaatin, sekä MI053 ja MI061 valittiin lisäselvityksen. Mittaamaan toimintaansa riippuen verkkotunnuksen suunnan vaihtelevien alueiden, me aluksi arvioineet sitoutumisaktiivisuus EGFR. A431-solut ekspressoivat korkean tason EGFR inkuboitiin vasta-aineiden kanssa, ja sen jälkeen fluoresenssin muutoksen signaalin mitattiin laser, joka perustuu virtaussytometria-analyysi. Näin ollen kaikki käsitelty vasta-aineita, siirtymän fluoresenssin signaalia suurempi kuin käsittelemätön kontrolli (kuvio 2A). Niistä setuksimabi osoitti korkeimman sitoutumisaktiivisuutta EGFR. Erityisesti, me vahvisti, että MI061 ja MI053 säilytetään myös suuri affiniteetti ja ne kykenivät vahvaa sitoutumista EGFR. Välinen affiniteetti MI061and EGFR oli voimakkaampi kuin affiniteetti MI053 ja EGFR. Nämä tulokset osoittivat, että domain järjestys vaihtelevista ketjuista liittyy affiniteetti minibody. Vaihtoehtoinen lähestymistapa saada yksilöidysti, kilpailu määritys suoritettiin käyttäen FITC-leimatun EGF-ligandin kanssa käsite, joka häiriö vuorovaikutuksen EGF ja EGFR voisi estää EGFR aktivoitumista ja sen loppupään signalointireitille. Tämän seurauksena, setuksimabia täysin kilpaili EGF, kun taas hoito MI061 osittain inhiboivat EGFR (kuvio 2B). Vahvista estävä valmiudet MI061, analysoimme suhteellinen fosforylaatiota nopeudella EGFR (kuvio 2C). Fosforylaatiota määrä EGFR aiheuttama EGF analysoitiin A431-solujen läsnä ollessa joko setuksimabi Fab-fragmentti (CT Fab), EGFR sitovat alueet setuksimabin tai MI061. Hoito EGF CT Fab tukahdutetaan suhteessa fosforylaation noin 50%. Samoin hoito EGF kanssa MI061 osoitti myös sama vaikutus verrattuna CT Fab. Vaikka niiden sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys olivat suhteellisesti pienempi verrattuna setuksimabi, MI061 pystyi voimakkaasti tunnistamaan EGFR ja tukahduttaa EGFR: n fosforylaatiota solun järjestelmässä. Vahvistaa antigeeniä sitova spesifisyys MI061, käytimme ihmisen proteiinin mikromatriisisiru, joka sisältää 16368 ainutlaatuinen GST-merkitty täyspitkä ihmisen proteiineja (kuvio 3A). Proteiini siru käsiteltiin rinnakkain joko MI061 tai setuksimabi yhtä moolisuhteessa 1 h RT: ssa. Proteiinit sitova vasta-aine havaittiin käyttämällä Alexa-Fluor konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. Siru sitten skannattu käyttämällä GenePix 4100A skanneri. Normalisoida Alexa-Fluor signaali, proteiini siru sitten koetettiin anti-GST-vasta sen jälkeen skannauksen. Vuonna kukin proteiini mikromatriisisiru, sekä MI061 ja setuksimabi osoitti vastaavia sitovia kuvio kahtena saman intensiteetin, vastaavasti (kuvio 3B). Myös suuritehoisen mielestä ne vain sitovat EGFR-proteiinin paitsi ohjaus proteiineja, kuten GST (kuvio 3B, alempi paneeli).

(A) EGFR sitoutumismääritys. Jokainen vasta-ainetta inkuboitiin EGFR-yli-ilmennetään A431cells ja sitten sitoutumisaffiniteetti EGFR analysoitiin FL1-H intensiteetin käyttämällä virtaussytometria (FACS) (B) EGFR kilpailun määritys. FITC-leimatun EGF inkuboitiin A431-solujen ja sen sitova aktiivisuus EGFR seurattiin FACS. Kilpailuun määritystä, EGF inkuboitiin solujen kanssa joko setuksimabi (vasen paneeli) tai MI061 (oikea paneeli). (C) EGFR -fosforylaatiomäärityksessä. Suhteellinen fosforylaatio määrä EGFR indusoiman vasta-aineen kukin arvioitiin ELISA: lla käyttäen anti-EGFR fosfo-vasta-ainetta. EGR käytettiin kontrollina fosforylaatio EGFR kuten on osoitettu. Määrälliset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± s. e. m.

* P 0,05. N.S., ei ole merkittävä.

(A) Kaaviokuva proteiinin microarray prosessin. (B) proteiini hake inkuboitiin joko MI061 tai setuksimabi, ja antigeeni-vasta-vuorovaikutukset havaittiin käyttämällä Alexa-Fluor konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Pesun jälkeen jokainen siru oli skannattu GenePix Scanner 532 nm (Cy3) ja 635 nm (Cy5). Kukin arvo koetin signaaleja saatiin käyttämällä GenePix Pro 6.0-ohjelmisto. Punainen signaali osoittaa antigeenin sitomiseen intensiteetti sekä MI061 ja setuksimabi. Kaikki GST-fuusioproteiinit havaittiin anti-GST-vasta-aineen ja visualisoitu vihreän fluoresenssin kuten. Valkoisen suorakaiteen osoittavat suurennos alue alapaneelin.

antituumorivaikutus on suunniteltu minibody

arvioimiseksi ja karakterisoimiseksi plasma farmakokinetiikkaa (PK) ja MI061, PK parametrejä tutkittiin vierassiirrekokeissa eläin. Sen jälkeen intraperitoneral (ip) injektion MI061 0,3 mg /inj, C (max), T (max), pinta-ala käyrän alla (AUC) ja t

1/2 mitattiin 14,4 mg /l, 1 h , 24,8 mg • h /l ja 4,3 h, vastaavasti (kuvio 4A). Mukaan PK tietojen MI061, antituumorivaikutuksen vaikutus MI061 tarkkailtiin A431 ksenografteissa mallia. Kukin hiiriä käsiteltiin 22 päivää 13

th elinsiirron päivä läpi i.p. injektio Setuksimabihoitoa, CT Fab mukaan 3 päivän välein, tai MI061 päivittäin perusta PK toimintaa. Injektion vasta-aineet eivät vaikuta painonnousun A431 kasvaimen ksenosiirrettyjä hiiriä (Kuva S1C). Kasvaimen koko mitattiin jarrusatulat pinta lähestymistapa. Tuumorin koko vehikkeliryhmässä näytteille nousevat lineaarisesti koko 22 päivän jakson ja oli kooltaan noin 1200 mm

3 (kuva 4B). Injektio setuksimabilla tai MI061 tukahdutti kasvaimen kasvua 300 mm

3. Vaikka MI061 ruiskutettiin useammin kuin muita vasta-aineita, se osoitti merkittäviä anti-kasvain vaikutus kuin setuksimabin. Jokainen kasvain massa nostettiin ksenografti uutettiin hiiristä mitata suhteellinen kasvaimen tilavuus (kuvio 4C). Mielenkiintoista on, että injektio MI061 osaksi ksenosiirrettyjä hiirillä merkittävästi tukahdutti kasvaimen tilavuuden 25% verrattuna vehikkelillä käsitellyn ryhmän (kuvio 4D). Siten MI061 osoittivat samanlaisia ​​antituumorivaikutuksen verrattuna setuksimabin-treat ryhmä

in vivo

. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot tukevat, että puhdistettu MI061 bakteeri-järjestelmää voidaan käyttää kliiniseen käyttöön anti-kasvain aineena.

(A) farmakokinetiikka MI061 minibody. Verinäytteet farmakokinetiikkaa MI061 kerättiin 1, 3, 6, 24 ja 48 tunnin kuluttua alkuperäisestä intraperitoneaalisen injektion (i.p., 0,3 mg /hiiri), ja niiden pitoisuus arvioitiin käyttämällä ei-osaston menetelmiä. (B) aika-kulku muutoksen kasvaimen koon. Kateenkorvattomiin nude-hiiriä hoidettiin ajoneuvon tai setuksimabin tai Setuksimabihoitoa Fab 3 päivän välein, tai minibody päivittäin 10 päivän i.p. injektio (0,25 mg /hiiri). Hoito aloitettiin, kun kasvaimen koko saavutti 100 mm

3 jälkeen ksenografti. Kasvaimen koko mitattiin jarrusatulat aikana kokeen päivää. (C) edustaja havainnot A431 kasvainmassoja. (D). Suhteellinen kasvaimen tilavuus. Koko A431 kasvainmassoja poistetaan kateenkorvattomissa hiirissä käsitelty vasta-aineen kukin mitattiin jarrusatulat ja ilmaistiin suhteellisena määrässä verrataan Setuksimabihoitoa hoidetussa ryhmässä. Määrälliset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± s. e. m.

* P 0,05

vaikutus suunniteltu minibody on EGFR alavirran signaalireitin

ekspressiotasot EGFR ja fosforyloidun-EGFR (p-EGFR) analysoitiin A431 kasvaimen kohdat, kuten on esitetty kuviossa 5A. Verrattuna ajoneuvo ryhmä, värjäytymisvoimakkuuksia sekä EGFR ja p-EGFR oli huomattavasti vähentynyt kaikissa ryhmissä käsitelty vasta-aineella. Saadakseen MI061 vaikutusta EGFR loppupään signaalireitin, kukin kasvain massoja hajotettiin. Ne analysoitiin aktivoinnin tilan alavirran signalointimolekyylien seuraa EGFR aktivointi. Samanlainen immunohistokemia tietojen vastaan ​​EGFR ja p-EGFR, huomasimme, että ekspressiotaso EGFR väheni merkittävästi ryhmässä hoidettiin joko CT Fab tai MI061 (kuvio 5B). Lisäksi tasot sekä p-EGFR ja p-ERK vasta täysin vaimennetaan MI061-hoidetussa ryhmässä, mutta ei toisessa ryhmässä (kuvio 5B). Sen sijaan, CT Fab vain esti fosforylaatiossa AKT: (kuvio 5B). Nämä tiedot osoittivat, että CT Fab ja MI061 saattaa olla mukana eri loppupään signaalireitin, vaikka samanlaisen estävä vaikutus fosforylaatioon EGFR

in vivo

. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että korkeamman kasvaimen vastainen tehokkuus MI061 verrattuna Setuksimabin A431 ksenosiirrettyjä mallissa, tukevat merkitystä lisätutkimuksia käyttöön MI061 toimittaa syöpälääkettä

in vivo

.

(A) fosforylaatio EGFR. Fosforyloidun EGFR jäädytettyjen osan A431 tuumorikudoksen analysoitiin immunohistokemiallisesti värjäämällä, käyttämällä p-EGFR (Tyr 845) vasta-ainetta. Asteikko bar = 200 um (B) EFGR alavirran signalointireitin kasvaimen lysaatti analysoitiin Western blot käyttämällä kutakin vasta-ainetta, kuten on ilmoitettu. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

Kasvain kohdistetut hoitojen avulla ehjänä koko IgG on tutkittu intensiivisesti syöpäpotilaille lukuisissa tutkii ja johti aallon FDA-hyväksytty vasta [6] – [10]. Siten merkittäviä tuloksia on saavutettu syövän hoidossa, mutta vielä on joitakin rajoituksia käyttää koko IgG hoitoon syöpäpotilailla. Näitä ovat erittäin korkeat tuotantokustannukset ja farmakokinetiikkaa verrattuna kudospenetraatio [17], [18]. Jotta voittaa nämä haitat, tutkijat ovat yrittäneet pienentää kokoa vasta tehokkaan tuotannon bakteerien ja helpottaa levinneisyysaste vasta tehokkaan hoidon [16], [19]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme myös luotu kolme minibodeja johdettu Setuksimabia ja tutkitaan ominaisuudet ja antituumorivaikutus niistä

in vitro

ja

in vivo

.

Monia yrityksiä on ollut sitoutunut vasta-aineiden terapeuttiseen käyttöön ih- nisäkässoluissa. Kuitenkin transfektoituja nisäkässoluja eivät ole edullisia, koska ilmentämisjärjestelmä alhaisen ilmentymisen tasoa, hidasta ja kallista ravintoalustalla [20]. Nämä ongelmat voidaan ratkaista käyttämällä

E. coli

ilmaisun järjestelmä tuottaa suuria määriä rekombinanttiproteiinia. Vaikka on olemassa joitakin rajoituksia, kuten solunsisäinen kerääntyminen, mahdollisuuksia tuotteen hajoamista ja tuotannon endotoksiinin, se on laajalti käytetty rekombinanttiproteiinituotantoon koska sen kyky kasvaa nopeasti, suurella tiheydellä halpa alustoille ja suhteellisen yksinkertainen käsittely [20] . Myös eri yhdistelmä-DNA-tekniikat ovat käytössä vasta-ainefragmenttien tuottamiseksi erikokoisia [11], [16], [19], [21]. Minibody (scFv-C

H3), yksi niistä, voidaan ilmaista bakteeri- järjestelmään ja niiden pieni koko ja alhaiset molekyylipainot mahdollistavat nopean ja helpon kudospenetraatio [22]. Huolimatta parantunut teknologian ja raskaat tutkimus kuitenkin vielä rajoituksia koskien tuottavuutta ja lämpöstabiilisuuden minibody [22]. Yleensä scFv: t on alhainen lämpöstabiilisuus ja taipumus denaturoitua tai aggregoitua olosuhteissa kliiniset käytöt johtuen suhteellisen heikko V

H-V

L vuorovaikutusta [22]. Jotta valloitus alhainen vakautta, jotkut tutkijat keskittyivät pituudesta linkkerin, venymään tähteen linkkerin hieman parannettu vakautta scFv: iden [23]. Testasimme myös lämpöstabiilius sekä MI045 ja MI053 ja totesi, että MI053, mikä on 18 tähteet kuten linkkeriin, on vakaampi sijaan MI045 aikana 48 tuntia (Kuva. S1D ja Materiaalit ja menetelmät S1).