Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti ja on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien takia hoidon vastuksen ja etäpesäke. Ymmärtäminen mekanismin taustalla peräsuolen syövän synty on välttämätöntä diagnosointiin ja hoitoon CRC. MikroRNA (miRNA) voivat toimia joko onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla monissa syövissä. Kasvain vaimennin rooli miR-27b on viime aikoina raportoitu neuroblastoomakasvaimissa, kun taas mitään tietoa miR-27b CRC on käytettävissä. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-27b ilmentyminen väheni useimmissa CRC kudosten ja todennut, että yli-ilmentyminen miR-27b tukahduttaa CRC solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumisen ja kasvaimen kasvu

in vitro

ja

in vivo

. Havaitsimme endoteelikasvutekijä C (VEGFC) uutena kohteena geeni miR-27b ja todennut, että miR-27b toimi estäjänä syövän etenemisen ja angiogeneesissä kohdistamalla VEGFC CRC. Olemme lisäksi todenneet, että DNA hypermetylaatiota miR-27b-CpG-saarekkeiden pienenee miR-27b ilme. Yhteenvetona, anti-kasvain rooli miR-27b ja sen uusi tavoite VEGFC

in vivo

voisi johtaa tuumorinekroositekijä ja antaa perusteet kehittää miR-27b terapeuttisena aineena.

Citation: Ye J, Wu X, Wu D, Wu P, Ni C, Zhang Z, et al. (2013) miRNA-27b Tavoitteet endoteelikasvutekijä C estää kasvaimen etenemiseen ja Angiogeneesi peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (4): e60687. doi: 10,1371 /journal.pone.0060687

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 marraskuu 2012; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2013; Julkaistu: 12 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Ye et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 91019005), Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation of China (nro Y2110034), 151 Talent Project Zhejiangin maakunnassa (HJ) ja Science and Technology Bureau of Zhejiang (nro 2011C37004). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) sijoittuu kolmanneksi yleisin syöpä maailmassa. Huolimatta kliininen toteuttamista lukuisista hoitostrategioita, se on edelleen johtavia syitä syöpään liittyvien kuolemien takia hoidon kestävyys ja etäpesäkkeiden [1] – [3]. Näin ollen, mekanismin ymmärtämisessä taustalla peräsuolen syövän synty on välttämätöntä diagnosointiin ja hoitoon CRC. Välinen vuorovaikutus kasvaimia ja strooman tunnustetaan kriittisiä komponentteja syövän etenemisen CRC [4]. Viime aikoina todisteita, jotka osoittavat, että kemokiinien tuotettu kasvaimen mikroympäristössä, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF), fibroblastikasvutekijä (FGF), verihiutaleista johdetun kasvutekijän (PDGF) on ratkaiseva rooli patogeneesissä CRC kasvaa [5], [6].

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pieni, endogeenisen, ei-koodaavan RNA, joka tärkeitä rooleja säätelyssä kohdegeenien täydentävillä pariksi mRNA 3′ alue (3’UTR), joka johtaa translaation tukahduttamisen tai mRNA: n hajoamisen [7]. miRNA tiedetään toimivan erilaisten biologisten prosessien, kuten kehitystä, solujen proliferaatio, erilaistuminen, apoptoosi ja syöpä aloittamista tai eteneminen [8], [9]. Syövän, miRNA voivat toimia joko onkogeenin tai kasvaimia estävä, mistä on osoituksena miR-130b edistää maksasyövän kantasoluja (CSCS) kasvua ja itseuudistumisen kautta kohdistaminen TP53INP1 [10], miR-34a estävä eturauhassyövän etäpesäkkeiden suoraan tukahduttaa CD44 [11], ja miR-7 tuumorikasvun estämiseen ja etäpesäkkeiden vaikuttamalla phosphoinositoide-3 kinaasi (PI3K) /AKT reitin maksasolukarsinoomassa [12]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että on ratkaisevan tärkeää selventää miRNA toimintoja ja sääntelyn piirejä laatimaan hoitostrategioita.

Hypoteesimme että molekyyli erot CSCS ja eriytetty syöpäsolujen voi tunnistaa avainmolekyyli kasvaimen kasvussa ja etenemisessä, ja tässä tutkimuksessa tutkittiin eroja miRNA ilmaisun välillä CSCS ja eriytetty CRC soluihin käyttäen miRNA mikrosiruja. Huomasimme, että miR-27b ilmentyminen on oleellisesti vähentynyt CSC kaltaisia ​​soluja ja CRC kudoksissa. miR-27b sijaitsee kromosomissa 9 ja on osoitettu toimivan tuumorisuppressori neuroblastooma kautta kohdistaminen peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ (PPARy) [13]. On myös raportoitu, että miR-27b voi toimia angiogeeninen kytkin edistämällä endoteelisolujen kärki solukohtalo- ja itäneet [14], [15]. Kuitenkin tiettyjä toimintoja ja mahdollisia kohteita miR-27b CRC solut ovat tutkimaton. Olemme vahvisti, että verisuonten endoteelin kasvutekijä C (VEGFC), joka on tärkeä rooli syövän etenemiseen, on uusi kohde miR-27b. Useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että ekspression lisäämiseksi VEGFC in primaaristen kasvainten korreloi parannetun levittäminen kasvainsolujen alueellisiin imusolmukkeisiin erilaisissa ihmisen karsinoomien [16] – [18]. Äskettäin sääntelyn rooli VEGFC käynnistämisessä ja tehostava neo-angiogeneesiä oli paljastunut [19]. Olemme havainneet, että miR-27b voi estää CRC-solujen lisääntymisen, pesäkkeiden muodostumisen ja kasvaimen kasvua, ja että se toimii angiogeneesin estäjä kohdistamalla VEGFC ja alas säätelystä DNA hypermetylaatiota. Ymmärtäminen mekanismeja, joilla miR-27b estää kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä perustetaan vahvat perusteet sen kehittämistä terapeuttisena syöpälääkkeen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyttiin Institutional Review Boards Second Affiliated sairaala Zhejiangin yliopistossa School of Medicine. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen suostumuksen tietonsa tallennetaan sairaalan tietokantaan ja käyttää tutkimustarkoituksiin.

Kaikki Eläinten töitä oli tehty noudattaen niitä kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita. Tämä tutkimus hyväksyi Institutional Review Boards Second Affiliated sairaala Zhejiangin yliopistossa School of Medicine.

Solulinjat

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa, SW620, SW480, RKO, HT29 ja 293T hankittiin solusta pankki Kiinan Academy of Medical Science (Kiina). SW620 ja SW480-soluja viljeltiin Leibovitz L15 (Gibco, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco). RKO, HT29 ja 293T-soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä.

miRNA Expression Microarray Analysis

Yhteensä-RNA eristettiin CD133

+ ja CD133

– CRC-soluihin käyttämällä TRIzol® reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Määrä ja laatu RNA arvioitiin käyttämällä Nanodrop spektrofotometrillä (Thermo tieteellinen, Worcester, MA, USA). Mirna ilmentymisen profiili kutakin näytettä arvioitiin käyttämällä Affymetrix miRNA array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA).

Kvantitatiivinen PCR-analyysi

Kokonais-RNA solulinjoissa, tuore CRC kudosten tai Ksenograftikudoksista eristettiin käyttäen TRIzol® reagenssia (Invitrogen). Kokonais-RNA: n parafinoidut kudosten eristettiin RECOVERALL- ™ yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja käsiteltiin RNaasi-vapaata DNaasia I (Qiagen, Valencia, CA, USA) valmistajan ohjeiden . Määrä ja laatu RNA arvioitiin käyttämällä Nanodrop spektrofotometriä. TaqMan miRNA ilmentymisen määrityksissä (Applied Biosystems) käytettiin määrittämään miRNA ilmentymisen käyttäen StepOnePlus ™ -järjestelmän (Applied Biosystems). Kaikki näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena, ja miR-27b tasot kussakin näytteessä normalisoitiin kuin U6.

proliferaatiotestillä

Solut ympättiin tiheydellä 3 x 10

3 solua kuoppaa kohti 96-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi 0,2 ml Leibovitz L15 10% FBS. MTS (3- [4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -5- [3-karboksimetoksifenyyli] -2- [4-sulfofenyyli] -2H-tetratsolium suola) reagenssia (Promega, Madison, WI, USA) (20 ui ) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä mikrolevylukijalla (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja arvioidaan jatkuvasti 7 päivää.

Soft-agar Colony määritys

Solut ympättiin tiheydellä 300 kuoppaa kohti pintakerroksen 0,3% matalan sulamispisteen agaroosia (Sigma, St Louis, MO, USA) 12-kuoppaisilla levyillä, joissa on pohjakerros 0,5% agaroosia Leibovitzin L15, joka sisälsi 10% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä inkubaattorissa 2 viikon kuluttua pesäkkeitä, jotka sisältävät 20-solut visualisoitiin käännettyä mikroskooppia ja laskettiin.

tuumorigeneesiä Pitoisuus

Solut suspendoitiin 100 ul: Leibovitz L15 istutettiin takapuolelle 4-viikkoisen naaras-nude-hiiriin arvioida niiden kyky aloittaa tuumoriksenograftien. Kasvaimet mitattiin viikoittain ja niiden tilavuus laskettiin pituus x leveys x leveys /2.

miR-27b Therapy

SW620-soluja (5 x 10

6) injektoitiin takapuolelle 4 viikon ikäiset naaras NOD /SCID-hiiriin, jotka kaikki kehittyi kasvaimia in 1 viikko, jonka tilavuus on noin 200 mm

3. Viisi hiirtä jaettiin satunnaisesti kullekin negatiivisen kontrollin (NC) ja miR-27b ryhmiä. Kaikki hiiret kasvaimen injektoitiin kolesterolia konjugoidun matkii (1 OD jäljittelee /aika /hiiri) (GenePharma Tech, Shanghai, Kiina) kahdesti viikossa ja kasvainten mitattiin 4 päivän välein. Hiiret lopetettiin katkaisemalla kaula 5 viikkoa sen jälkeen, kun kymmenes injektion, ja transplantable kasvaimet eristettiin ja arvioitiin.

immunofluoresenssimääritystä

Kaikki Ksenograftikudoksista oli formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotettuja leikkaamista varten on Leica mikrotomi. Neljän mikronin leikkeitä valmistettiin ja antigeenin haku suoritetaan keittämällä näytteitä 15 minuutin ajan 100 ° C: ssa 10 mmol /l natriumsitraattia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 0,3% vetyperoksidaasin 20 minuutin ajan, ja näytteet blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 1% FBS: ää. Polyklonaalisia kaniinin anti-hiiri-CD31-lgG (Abcam, Cambridge, MA, USA) laimennettiin 1:200 ja lisättiin ensisijainen vasta-aine; Sitten näytteitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Näytteet viljeltiin sen jälkeen sopivan sekundaarisen vasta-aineen konjugoituna fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) (Multisciences Biotech, Hangzhou, Kiina).

Luciferase Assay

pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspressiovektori (Promega ) sisälsi VEGFC mRNA 3’UTR miR-27b kohdepaikkaan tai mutatoidun miR-27b kohdesivustoa (katso File S1). PRL-TK-plasmidit (Promega) kotransfektoitiin 293T-soluihin joko negatiivisen kontrollin matkivat (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’), miR-27b matkivat (5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3′), tai anti-asennuspalveli- 27b matkivat (5’-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3 ’) (GenePharma Tech, Shanghai, Kiina) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Suhde Firefly on

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) 48 h transfektion jälkeen luminometrissä.

Western-blottaus

Yhteensä proteiini uutetaan soluista lyysattiin M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo) täydennetty proteaasi-inhibiittorit (Sigma). Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween-20 (TBST) ja 60 min, kaivoa inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineiden anti-ihmisen-VEGFC (Cell Signaling tekniikka, Danvers, MA, USA) ( 1:2000) tai anti-ihmisen GAPDH (KangChen, Shanghai, Kiina) liuotetaan 5% naudan seerumialbumiinia TBST yön yli 4 ° C: ssa.

Kliininen CRC Sample Analysis

Näytteet kerättiin välillä 2008,1 ja 2010.12 pidetyssä toisessa Affiliated sairaala, Zhejiangin yliopistossa School of Medicine ja vahvisti patologisesti. Kasvaimet järjestetään käyttäen International Union Against Cancer (UICC) kasvain pysähdyspaikan järjestelmä (taulukko S1).

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvoina ± keskivirhe keskiarvon (SEM). QPCR tulokset pariksi kliinisistä näytteistä analysoitiin kahden hännän pariksi Opiskelijan

t

-testin ja muut tulokset kahden hännän parittomia Studentin

t

-testi.

P

arvojen 0,05 osoitti tilastollista merkittävyyttä.

Muut menetelmät

, kuten solulajittelussa, plasmidikonstruktion, perustaminen miR-27b, anti-miR-27b, tai VEGFC pudotus (VEGFC-shRNA anti-miR-27b vakaan SW620-soluja), ELISA, hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys, ja metylaatiospesifistä polymeraasiketjureaktioissa (MSP) on kuvattu File S1.

tulokset

miR-27b tasojen lasku sekä peräsuolen CSCS ja useimmat Cancer kudokset

CSCS ratkaisevassa asemassa syövän synnyssä ja liittyvät toistuminen, etäpesäkkeitä ja terapia kestävyys [20] – [22]. Useita pinta-markkereita voidaan käyttää CSCS lajitteluun, mukaan lukien CD24, CD44, CD166 ja CD133 [22]. Näiden, CD133 on hyvä CSCS markkeri CRC [5], [22] – [25]. Havaitsimme CSCS ominaisuuksia CD133

+ SW620-soluissa (kuvio S1) ja arvioitu miRNA ilmaisun profiileja CD133

+ ja CD133

– solujen tunnistamiseksi miRNA mukana syövän etenemiseen. Mikrosiruanalyysi havaittu neljä sääteli (miR-1308, miR-720, miR-132-tähti ja miR-181a-tähti) ja 14 alassäädetty (miR-27b, miR-193B, miR-595, miR-27a- tähti, miR-1307, miR-502-3p, miR-652, miR-200b, miR-31, miR-1247, miR-200a, miR-200b-tähti, miR-362-5p, miR-210) miRNA in CD133

+ -soluista (kuvio 1A). Kun nämä tulokset yhdistetään edellisen miRNA microarray tietoja (dataa ei esitetty), vain miR-27b ilmentymisen eroja. Tämä vahvistettiin qPCR, joka osoitti 2,77-kertainen muutos miR-27b ilmentymisen CD133

+

versus

CD133

– soluja (kuvio 1 B).

(A ) Differentially ilmaistuna miRNA in CD133

+ ja CD133

– soluja. Punainen tarkoittaa korkea ja vihreinä alhainen ilmaisun. (B) miR-27b ilmentymisen CD133

+ ja CD133

– soluja arvioitiin qPCR. Y-akseli osoittaa kertainen muutos. (C) miR-27b ilmentymisen arvioitiin qPCR makeassa CRC kudoksissa verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa kuudesta potilaista. Y-akseli osoittaa kertainen muutos. (D) miR-27b ilmentymisen arvioitiin qPCR 80 pariksi parafinoidut CRC ja viereisten normaaleissa kudoksissa. miR-27b tasot normalisoituivat U6 ja ilmaistaan ​​kynnyssykli (C

t) suhde. Virhe palkit ovat keskiarvo ± keskiarvon, *

P

0,05, **

P

0,01.

Lisäksi mitattiin miR-27b ilmentyminen CRC kudosnäytteistä. Vuonna rajoitettu määrä saatavilla tuoretta kudosnäytteistä (n = 6), miR-27b ilmentyminen alassäädetty 1,5-5,5-kertaisesti CRC kudoksissa verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa (kuvio 1 C). Vuonna suurempi määrä pariksi parafinoidut kudoksia, miR-27b U6 kynnyssyklistä (C

t) arvo olivat merkittävästi suuremmat kasvainkudoksissa, mikä osoittaa alempi miR-27b ilmentymisen CRC (kuvio 1 D). Oikeastaan ​​qPCR tiedot 80 pariksi parafinoidut CRC ja viereisten normaaleissa kudoksissa osoitti, että miR-27b ilmentyminen väheni 60%: CRC verrattuna 15% koholla. miR-27b on viime aikoina raportoitu olevan tuumorisuppressori neuroblastooma; Näin olemme keskittyneet loput tutkimustemme määrittämisestä biologisten toimintojen ja sääntelymekanismit Mir-27b CRC.

miR-27b kasvaimen kasvu estyy ja Angiogeneesi CRC

Me perustettiin molemmat asennuspalveli- 27b ja anti-miR-27b SW620 stabiileja solulinjoja (katso File S1) tutkia biologisten toimintojen miR-27b (kuvio 2A) määrittämällä lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostuminen

in vitro

ja kasvaimen kehittymisen

in vivo

. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-27b tukahdutettu solujen lisääntymistä, kun taas estämällä miR-27b pysyvin ilmaus anti-miR-27b sienellä edistänyt solujen lisääntymistä (kuvio 2B). Pehmeä agarissa pesäkkeiden määritys osoitti, että lisääntynyt miR-27b ilmentymisen merkittävästi kielletty pesäkkeiden muodostumista, joka tunnetaan itseuudistumisen, kun taas anti-miR-27b solut muodostivat suurempia ja suurempia määriä pallojen kuin negatiivisen kontrollin (kuvio 2C ja D). Vielä tärkeämpää on, joka tuumorigeneesin määrityksessä aloitettiin ihonalaisella 1 x 10

6 CRC soluja, huomasimme, että miR-27b voisi vahva tukahduttaa kasvaimen kasvua, kun taas anti-miR-27b edistänyt kasvua (kuvio 2E ja F).

(A) miR-27b ilmentymisen negatiivisen kontrollin (NC), miR-27b ja anti-miR-27b SW620 solulinjoja arvioitiin qPCR. Y-akseli osoittaa kertainen muutos. (B) Solujen proliferaation määrä havaitaan mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä MTS-määritys. (C ja D) tulokset on pehmeässä agarissa pesäkkeiden määrityksessä. Pesäkkeet visualisoitiin mikroskopialla sen jälkeen, kun 2 viikkoa inkuboinnin jälkeen. Pesäkkeet, jotka sisältävät 20 solut laskettiin. Mittaviivat = 200 pm. (E) saadut tulokset kasvaimien syntyyn määritystä. Edustava kuva ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä ihon alle 1 x 10

6 CRC soluja. (F) vertailu -ksenografti muodostumisen

in vivo

. Tuumoritilavuudet mitattiin viikoittain. Virhe palkit ovat keskiarvo ± keskiarvon, *

P

0,05.

Tutkimme lisäksi anti-kasvain vaikutus miR-27b

in vivo

vuonna ihmisen CRC-laakeri hiirimallissa. Hiiret jaettiin satunnaisesti negatiivinen kontrolli (NC) tai miR-27b ryhmiä, viisi hiirtä ryhmää kohti. Kolesterolia-konjugoitu NC tai miR-27b jäljittelee injektoitiin kasvaimia. Kaksi hiiret NC ryhmässä kuoli 4 viikon ”hoito; kuitenkin, kuolinsyy ei määritetty. Vuonna miR-27b ryhmä, yksi ksenografti- katosi 4 viikon hoidon jälkeen (kuvio 3A ja B), kun taas muut neljä -ksenografteja pehmeä ja vaikea tuumorinekroosi havaittiin, kun patologinen tutkimus (kuvio 3C). Immunofluoresenssimääritykset paljasti, että vierassiirrännäiset miR-27b ryhmässä oli vähemmän kapillaariverisuonet kuin NC ryhmässä (kuva 3D) ja qPCR Tulokset vahvistivat, että miR-27b tasot olivat koholla merkittävästi miR-27b ksenografteissa (kuvio 3E). Kaikki nämä tulokset tukevat kasvaimen tukahduttava rooli miR-27b CRC ja ehdottaa sen potentiaalia anti-CRC huume.

(A ja B) Paksusuolisyöpä (CRC) laakeri NOD /SCID-hiiriä kasvaimen ruiskutettiin kolesterolia konjugoidun negatiivinen kontrolli (NC) tai miR-27b matkii. Rupia havaittiin neljässä kasvainten miR-27b ryhmä (hieno nuoli). Yksi kasvaimen miR-27b ryhmä kadonneet kokonaan vain rupi jäljellä (paksu nuoli). (C) hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys Ksenograftikudoksista osoittaa nekroottista alueilla miR-27b ryhmä. (D) Edustava immunofluoresenssimäärityksellä osoittavat CD31-proteiinia Ksenograftikudoksista NC ja miR-27b (n = 3). Mittaviivat = 200 pm. (E) miR-27b ilmentymisen ksenografteissa NC ja miR-27b matkii arvioitiin qPCR. Virhe palkit ovat keskiarvo ± keskiarvon, *

P

0,05.

VEGFC on Novel Tavoite miR-27b CRC

miRNA toimivat pääasiassa välittäjiä geenien. Tavoitteita miR-27b CRC analysoitiin myöhemmin käyttäen tietoja ennustaa TargetScan tietokannasta (www.targetscan.org). Satoja ennusti miR-27b tavoitteet tehtiin edelleen rikastamista analyysi solun signalointipolkujen käyttämällä Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) reitin tietokanta (www.genome.jp/kegg/). Tätä lähestymistapaa käyttäen miR-27b ennustettiin kohdistaa syöpään liittyvien signalointireittien, kuten VEGF: n, Wnt ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK). Lopulta keskityimme VEGF signalointi koska Wnt ja MAPK ei ilmeisesti vaikuta CRC (tuloksia ei ole esitetty). Olemme edelleen osoitettu VEGFC toiminnallisena alavirran kohde miR-27b. VEGFC 3’UTR sisältää erittäin konservoituneita miR-27b sitoutumiskohtia (kuvio 4A), jotka reagoivat miR-27b on kaksi lusiferaasireportteri- määrityksessä. Olemme havainneet, että aktiivisuus lusiferaasireport- sisältävä VEGFC 3’UTR laski -70% upon kotransfektioon kanssa miR-27b matkivat, mutta kasvoi -100% upon kotransfektioon anti-miR-27b matkivat. Lisäksi, mitään muutosta ei havaittu, kun kotransfektoimalla mutantti reportteriplasmidilla joko miR-27b tai anti-miR-27b matkii (kuvio 4B). VEGFC proteiini tasot olivat myös vähentynyt soluissa ja viljelyalustassa kun transfektion miR-27b matkivat, kun VEGFC tasoilla ne kasvoivat transfektoitaessa anti-miR-27b matkivat (kuvio 4C ja D).

In vivo

, VEGFC proteiini tasot olivat alhaisempia miR-27b ksenograftien verrattuna NC ryhmässä (kuvio 4E).

(A) VEGFC ennustetaan uutena kohteena miR-27b . (B) 293T-solut ko-transfektoitiin tyhjä pmirGLO Dual-lusiferaasireporttiterilla plasmidit tai VEGFC 3’UTR tulikärpäsen lusiferaasi toimittaja plasmidit ja PRL-TK-lusiferaasi plasmideja yhdessä miR-27b jäljittelee tai anti-miR-27b. 48 tunnin kuluttua, tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus mitattiin ja normalisoitu Renillan lusiferaasin. (C) CRC-solut transfektoitiin NC, miR-27b tai anti-miR-27b matkii ja ilmentyminen VEGFC havainnoitiin Western-blottauksella. (D) CRC-solut transfektoitiin NC, miR-27b tai anti-miR-27b jäljittelee ja VEGFC viljelyalustassa havaittiin ELISA: lla. (E) VEGFC proteiinin ksenografteissa alkaen negatiivisen kontrollin (NC) ja miR-27b matkii havaittiin western blottauksella. Virhe palkit ovat keskiarvo ± keskiarvon, *

P

0,05.

VEGFC Toistaa Kasvaimen edistävää Rooli CRC

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että VEGFC korreloi kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien CRC [16] – [18]. Perustimme VEGFC-Knockdown anti-miR-27b SW620 soluihin ekspressiota inhiboivan shRNA (katso File S1) (kuvio 5A). VEGFC-pudotus tukahdutettu solujen lisääntymistä verrattuna NC-soluihin (kuvio 5B), inhiboi merkittävästi pesäkemuodostusta (kuvio 5C ja D) ja vähentää tuumorin kasvua (kuvio 5E ja F). Yhdessä nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että VEGFC näyttelee roolia stimuloimaan ja edistämään tuumorigeneesiä CRC. Vaikka on olemassa joukko ennustettu miR-27b tavoitteita, VEGFC toiminnallisena alavirran kohde miR-27b voidaan täysin vahvistettu meidän kokeita.

(A) VEGFC Knockdown anti-miR-27b vakaa soluissa oli vahvistettiin western blottauksella. (B) Solujen proliferaatio määrä määritettiin mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä MTS-määritys. (C ja D) tulokset on pehmeässä agarissa pesäkkeiden määrityksessä. Pesäkkeet visualisoitiin mikroskopialla sen jälkeen, kun 2 viikkoa inkuboinnin jälkeen. Pesäkkeet, jotka sisältävät 20 solut laskettiin. Mittaviivat = 200 pm. (E) Tulokset on kasvaimien syntyyn määrityksen. Edustava kuva ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä ihon alle ruiskutetaan 1 x 10

6 CRC soluja. (F) vertailu -ksenografti muodostumisen

in vivo

. Tuumoritilavuudet mitattiin viikoittain. Virhe palkit ovat keskiarvo ± keskiarvon, *

P

0,05.

DNA hypermetylaation Vähentää miR-27b Expression

Sekä transkription ja epigeneettiset polkuja säädellä geeniekspressiota . Epigeneettiset mekanismit ovat DNA: n metylaatio, histoni asetylaatio ja ei-koodaavat RNA: t [26]; hiljentäminen noin miRNA liittyy CpG-saarekkeen hypermetylaation erilaisia ​​syöpiä [27] – [29]. Sen määrittämiseksi, onko epigeneettisiä mekanismien välittämien miR-27b-toiminto, me viljellään soluja, kun läsnä on histonideasetylaasi-inhibiittori trikostatiini A (TSA) (Sangon Biotech, Shanghai, Kiina) tai metyylitransferaasin inhibiittori 5-atsa-dC (5AZA) (Calbiochem, San Diego, CA, USA). miR-27b pysyivät ennallaan soluissa viljeltiin 1 nmol /ml TSA 3 päivää. Kuitenkin hoito 5 nmol /ml 5AZA huomattavasti koholla miR-27b ilmentymistä (kuvio 6A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DNA hypermetylaation tärkeä rooli sääntelyssä miR-27b. Ennustettu promoottori sivusto miR-27b kromosomissa 9 kloonattiin sivektorissa (katso File S1) ja todentaa Lusiferaasimäärityksiä (kuvio 6B). MSP tulokset osoittivat miR-27b-CpG-saarekkeen hypermetylaation useissa CRC solulinjoissa (kuvio 6C).

(A) tasot miR-27b ilmentymistä kolorektaalisyövässä (CRC) solulinjat määritettiin qPCR hoidon jälkeen 5AZA tai TSA 3 päivää. (B) Tulokset lusiferaasiaktiivisuuden määrityksiä transfektion jälkeen ennustetun miR-27b-promoottorin normalisoida PRL-TK Renilla lusiferaasi. (C) MSP analyysi miR-27b CpG saari joukon CRC solulinjoissa. Bändejä ”M” kaistat ovat PCR saatujen tuotteiden metylaatiospesifistä alukkeita ja ne, jotka ovat ”U” kaistat ovat saatujen tuotteiden metyloimatonta alukkeita.

Keskustelu

CSCS hypoteesi on todistettu monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, [20], [21], ja kirjallisuudessa on keskittynyt rooli miRNA ihmisen syövässä. miRNA katsotaan olevan laajalti sääntelyyn aktiivisuus laajaa kehitys- prosesseja ja ovat sekaantuneet erilaisissa sairauksia, kuten syöpää [8].

pyrkimyksistä toiminta miRNA CRC. Oletimme, että molekyyli erot CSCS ja eriytetty syöpäsoluja voi tunnistaa avainmolekyyli vastuussa kasvaimen kasvua ja etenemistä. Molemmat

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa todenneet, että CD133

+ solujen CRC voidaan luokitella CSCS kaltaisia ​​soluja perustuu niiden kantasolujen ominaisuuksia. Tämä CSCS mallia käytettiin seulontaan ja tunnistaa 18 eri tavoin säänneltyjä miRNA. miR-27b oli ainoa miRNA tunnistettu toistuvasti näissä kokeissa; Ei tietoa roolista tämän miRNA CRC on raportoitu. Olemme havainneet, että miR-27b ei vaikuttanut CRC kantasolujen erilaistumista muuttamalla ilmentyminen kantasoluja liittyvät geenit

Nanog, Oct4, Sox2, Bmi1

(tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi tutkimus osoitti vähentynyt miR-27b ilmentymisen useimmissa CRC kudoksissa.

tutkimme seuraavaksi tehtävän miR-27b CRC ja osoittanut, että se voisi merkittävästi tukahduttaa itseuudistumisen

in vitro

ja tuumorigeenisyystesti

in vivo

. Lisäksi tunnistimme VEGFC toiminnallisena alavirran kohde miR-27b käyttämällä useita menetelmiä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus ilmoittaa tietyn toiminnon ja uusi toiminnallinen tavoite miR-27b in CRC. VEGFC kuuluu verihiutaleiden kasvutekijän perhe ja sen ilme korreloi merkittävästi huonompi histologinen, imusuonten invaasio ja laskimoiden hyökkäys [16] – [18], [30], ja viimeaikaiset todisteet viittaavat sillä on tärkeä rooli angiogeneesissä. [19], [31] Useat viimeaikaiset tutkimukset raportoivat, että autokriinisen sääntely syöpäsolujen maahanmuuton kautta VEGFC /VEGFRs on tärkeä indusoija kasvainsoluproliferaation, invaasiota ja etäpesäkkeiden. [30] On myös syntymässä todisteita otaksuttu rooli miRNA kuin tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien, joka voi johtaa kohdennettuja syövän hoitoon strategioita [32], [33]. miR-34a on voimakas anti-kasvain vaikutuksia eturauhasen kasvaimia ja voi edustaa terapeuttista ainetta eturauhassyöpää varten [11]. Kasvaimensisäistä injektio kolesterolia konjugoidun miR-199 /b-3p jäljittelee inhiboi kasvaimen kasvua ja vähentää seerumin AFP tasot maksasolukarsinoomassa [34]. Pahanlaatuisia soluja ovat riippuvaisia ​​poikkeava miRNA ilmaisu; nämä pienet RNA: t tarjoavat merkittäviä mahdollisuuksia kehittää tulevaisuuden miRNA-pohjainen hoitoja [30], [35], [36]. Koska vakavia sivuvaikutuksia perinteisen kemoterapian, tutkimus muita menetelmiä CRC hoitoon, kuten geeniterapian, on houkutteleva.

tuumoriangiogeneesissa on kriittistä kasvaimen kasvua ja ylläpitoa, ja monet tutkimukset ovat osoittaneet, että angiogeneesi estäjät voivat antaa merkittäviä terapeuttisia etu [37], [38]. Kirjoittajat raportoivat, että vakavan kuolion havaittiin ksenografteissa Mir-27b jäljittelee, joka kehitti myös vähemmän kapillaariverisuonet kuin NC ryhmä, ja yhdessä ksenografti- kokonaan hävinnyt vain rupi jäljellä. Nämä tiedot osoittavat, anti-kasvain vaikutus miR-27b

in vitro

ja

in vivo

, mikä viittaa siihen, miR-27b on lupaava kohde CRC hoidon jälkeen tehoa ja turvallisuutta geeniterapian on määritetty.

mekanismit osallistuvat transkription säätelyyn ovat vaihtelevia, ja kun taas taustalla miRNA säätelyhäiriötä syövän eivät ole vielä täysin ymmärretty, miRNA-välitteinen promoottori hypermetylaation on todettu useimmissa kasvaimia. Huomasimme, että miR-27b välittämä geenien CRC johtui palautuvaa hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden eikä histoni asetylaatio.

verisuonten kasvua on tärkeää syövän kasvua ja korjaus. Viimeaikaiset todisteet osoittivat, että kasvaimen angiogeneesi saattaisi indusoida CSCS takia angiogeenisen tekijän ilmentyminen kasvaimen mikroympäristössä [37], [39]. Antiangiogeneettiset terapiassa kohdistaminen VEGF voi heikentävistä kasvaimen verisuoniston ja ablate uudistuva CSCS [37], [40]. Tuloksemme osoittavat, että miR-27b peräisin CSCS CRC ja toimii tärkeänä tuumorisuppressoriproteiinia ja angiogeenisen tekijän kohdistamalla VEGFC. Edelleen tutkimus CSCS tai angiogeneesin helpottaisi kehittää uusia syövän vastaisia ​​hoitostrategioita. miRNA-pohjainen terapeuttiset strategiat voivat myös johtaa parempaan hallintaan kasvaimia ei-niin-kaukaisessa tulevaisuudessa [41], [42]. Nämä tulokset eivät sallivat vain ymmärtää paremmin sääntelymekanismeissa CRC soluissa, mutta myös helpottaa asteittaista kehittymistä tehokkaampaa syövän hoitomuotoja.

tukeminen Information

Kuva S1.

CD133 + SW620-soluilla ominaisuudet CSCS

in vitro

ja

in vivo

. (A) Virtaussytometria dot graafinen esitys, jakelu CD133

+ solujen CRC solulinjassa, SW620. (B ja C) tulokset on pehmeässä agarissa pesäkkeiden määrityksessä. Pesäkkeet visualisoitiin mikroskopialla sen jälkeen, kun 2 viikkoa inkuboinnin ja ne, jotka sisältävät 20 solut laskettiin. Mittaviivat = 200 pm. (D) Tulokset peräisin kasvaimien syntyyn määritystä. Edustava kuva ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä, joihin injektoitiin subkutaanisesti 5 x 10

4 CD133

– tai CD133

+ SW620-soluissa. (E) vertailu -ksenografti muodostumisen

in vivo

. Tuumoritilavuudet mitattiin viikoittain. Virhe palkit ovat keskiarvo ± keskiarvon, *

P

0,05.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0060687.s001

(TIF)

Tiedosto S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0060687.s002

(DOC) B Taulukko S1.

kliinis-CRC potilaista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0060687.s003

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Dr Zhong Shi kielen muokkausta .