Krooninen sairaus

tiivistelmä

Butyraatilla, käymistuote kuitua paksusuolessa, toimii histonideasetylaasi- estäjä (HDACi) ja indusoi apoptoosin paksusuolensyöpä (CC) soluja

in vitro

. Olemme raportoineet, että apoptoottisen vaikutukset butyraatti riippuvat hyperactivation Wnt /beeta-kateniinin reitin. Kuitenkin pitkäaikainen altistuminen CC solujen kasvavilla pitoisuuksilla butyraatti tulosten hankinnassa resistenssin Wnt /beeta-catenin- ja apoptoosin indusoiva vaikutus tämän aineen sekä ristiresistenssiä rakenteellisesti erilaisia ​​HDACis. Kirjoittajat raportoivat, että yksi mekanismi, jonka HDACi vastus syntyy kautta lisääntyminen beeta-kateniinin riippumaton (noncanonical) Wnt signalointia. Verrattuna HDACi herkkiä HCT-116 CC-solut, HDACi kestävä HCT-R-solut osoittavat korkeampaa AKT /PKB solujen eloonjäämistä signalointi, joka on osittain aiheuttama WNT5A n ja sen reseptorin ROR2. Induktion AKT opastinjärjestelmillä HDACis on myös havaittu muissa CC solulinjoissa, vaikkakin vähemmässä määrin kuin lääkkeille vastustuskykyisten HCT-R soluissa. Havainnot ehdotti, että apoptoottinen vaikutus butyraatti ja muiden HDACis CC solut voidaan täydennetty estäjät Pakt. Suostumuksella hypoteesin, yhdistelmä MK2206, joka on Pakt estäjä, ja HDACi (butyraatti tai LBH589) alulle korkeammat apoptoosin CC soluissa verrattuna kuhunkin agentti yksin. Altistuminen molempien aineiden uudelleen myös herkistyneet HCT-R solujen apoptoosin. Lopuksi käsite samanaikaisesti indusoivan kanoninen Wnt aktiivisuutta ja tukahduttamaan AKT signalointi käännettiin yhdistelmä ruokavalio johdettujen aineita. Ruokavalio-johdettu Pakt estäjät (kofeiinihappoa phethyl esterin, sulforaphane, dilallyl trisulfidia) tukahdutti butyraatti aiheuttama tasoja Pakt, ja lisäsi apoptoottista vaikutusta butyraatti sekä huumeiden herkkä ja lääkkeille vastustuskykyisiä CC soluissa.

meidän havainnot voidaan kääntää (a) CC hoito työllistää yhdistelmiä synteettisten HDACis ja inhibiittorit Pakt sekä (b) CC ehkäisy perustuu ruokavalioita, jotka johtavat riittäviä määriä butyraatti ja Pakt estäjiä.

Citation : Bordonaro M, Tewari S, Cicco CE, Atamna W, Lazarova DL (2011) siirtyminen Canonical ja Noncanonical Wnt Signaling sovittelee Drug Resistance in koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 6 (11): e27308. doi: 10,1371 /journal.pone.0027308

Editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 13 lokakuu 2011; Julkaistu: 03 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Bordonaro et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Darina Lazarova tukevat NIH /NCI apurahan # 1R15CA152852-01 ja yhteisörahastoihin The Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Michael Bordonaro tukee AICR avustuksen # 09A002, NIH /NCI-NIDDK # 1R15CA149589-01, ja yhteisörahastoihin The Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Beta-kateniinin – riippuvainen (kanoninen) Wnt signalointi aloitetaan sitoutuminen Wnt-ligandien niiden solun pinnan reseptoreihin, ja tämä sitova laukaisee solunsisäisten tapahtumien johtaa kertyminen Ser-37 /Thr 41 defosforyloituun beeta-kateniinin. Defosforyloitu beeta-kateniini on transkriptionaalisesti aktiivinen, ja se muodostaa komplekseja LEF /TCF-proteiinien ekspression säätelemiseksi satoja geenejä [1] – [3]. Konstitutiivinen aktivointi Wnt signaloinnin vuoksi mutaatioiden sen osia, APC ja /tai beeta-kateniini, edistää tuumorigeneesiä paksusuolessa [4] – [7], ja tällaiset mutaatiot ovat tunnusomaisia ​​suurin osa paksusuolen syövistä (CC). Olemme havainneet, että CC solujen mutaatioita komponenttien kanoninen Wnt signalointia hyper-indusoivat tämän reitin läsnä histonideasetylaasi estäjien (HDACis), kuten butyraatti (käymistuote kuitua paksusuolessa), SAHA, MS275, ja trikostatiini [8], [9]. Nämä HDACis apoptoosia CC-soluissa, ja apoptoottisten tasot ovat riippuvaisia ​​kertainen muutos kanoninen Wnt aktiivisuus: CC-soluja, jotka on alhainen induktio Wnt /kateniinin signaloinnin läsnäollessa HDACis ovat suhteellisen resistenttejä apoptoottisen vaikutusten aineet; kuitenkin, solut, jotka käyvät läpi merkittäviä aktivointi kanoninen Wnt signaloinnin ovat erittäin herkkiä apoptoosin [8]. Olemme todenneet, että kasvu Wnt /kateniinin aktiivisuutta butyraatti käsiteltyjen CC solujen edeltää apoptoottinen tapahtuman jälkeen (a) apoptoosin yleisellä kaspaasiestäjä ei kumota kasvu Wnt /kateniinin aktiivisuus (julkaisematon data), ja (b) virtaussytometria-lajiteltu solufraktiois- korkea kanonisen Wnt signalointia koostuvat sekä elää ja apoptoottisten solujen; kuitenkin, jos apoptoosia oli edellytys induktion Wnt aktiivisuuden, kaikki solut, joilla on korkea Wnt aktiivisuus olisi pitänyt apoptoottisten [8]. Suora suhde kertaiseksi induktio Wnt /kateniinin aktiivisuutta ja aste apoptoosin havaittiin analyyseissä kymmenen ihmisen CC solulinjoja altistettiin butyraatti, ja tämä suhde on kausaalinen alkaen: (a) solut, jotka ilmentävät indusoituva hallitseva negatiivinen TCF4, joka tukahduttaa Wnt /kateniinin signalointi, näytteille laski apoptoosin läsnäollessa butyraatti [8], ja (b) virtaussytometria-lajitellut solufraktiois- korkea kanonisen Wnt aktiivisuus on suurempi suhde apoptoottisten elää soluja kuin solufraktiois- heikosti kanoninen Wnt toimintaa [8]. Havainto, että hyper-aktivointi Wnt /beeta-kateniinin signalointi johtaa korkeita apoptoosin [8], [9] on johdonmukainen raportit joka taittaa muutokset signalointireittien, mutta ei absoluuttista tasoa signalointi, herättämään merkittäviä fysiologinen vastausta soluihin [10] – [12].

analyysien kymmenen ihmisen CC-solulinjat, olemme havainneet, että HCT-116 solut reagoivat butyraatti ja muut HDACis hyper-induktion Wnt /kateniinin signaloinnin ja korkea apoptoosin [8]. Kuitenkin asteittainen altistuminen HCT-116 solujen kasvavia pitoisuuksia butyraatti, me johdettu butyraatti kestävä HCT-R soluissa. Nämä solut kasvavat, kun läsnä oli 5 mM butyraattia, pitoisuus, joka indusoi korkeita apoptoosin vanhempien HCT-116-solut [9]. HCT-R-solut ovat myös ristiresistenttejä rakenteellisesti erilaisia ​​HDACis, kuten TSA, MS-275, SAHA, ja LBH589 [9]. Koska olemme todenneet, että (1) apoptoottisen tulos CC soluissa riippuu induktio kanoninen Wnt toimintaa [8], ja (2) hyper-aktivointi kanoninen Wnt signalointia butyraatti saaneilla CC solut on osittain aloitettu ligandi-reseptori tason [9], me posited että lääkeaine-herkkä ja lääkkeille vastustuskykyisiä CC solut eroavat ilmaus WNT ligandeja, reseptoreja ja /tai positiivisia ja negatiivisia modulaattorit Wnt /kateniinin signalointi at Ligandireseptorikompleksin tason [8], [9]. Esillä olevassa raportissa olemme tutkineet näitä mahdollisuuksia, ja totesi, että CC solujen hengissä altistuminen butyraatti tai muihin HDACis vähentämällä kanoninen Wnt signalointia ja lisäämällä beta-kateniinin – riippumaton (noncanonical) Wnt signalointia.

Tulokset

lisääntynyt ilmentyminen välittäjäaineiden noncanonical Wnt signaloinnin HDACi kestävä CC solujen

Olemme aiemmin raportoitu, että HDACi kestävä fenotyyppi HCT-R-soluja ei ole vähentyneen asetylaatio histoniproteiineista, vaan pikemminkin kyvyttömyys solujen hyper-indusoida kanoninen Wnt signalointia samassa määrin kuin emo HDACi herkkä HCT-116-solut [9]. Havaintomme ehdotti, että tukahduttaminen Wnt /kateniinin aktiivisuutta HDACi-resistenttien solujen johtuu muuttuneen ilmentymisen Wnt ligandien, niiden reseptorien ja /tai modulaattoreiden Wnt signalointia on reseptori-tason [9]. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, analysoimme ilmaisun profiilit jäljitellyistä ja butyraatti käsitellyn HCT-116 (HDACi-herkkä) ja HCT-R (HDACi kestävä) soluihin Wnt-PCR paneelit (SA Biosciences). Analyysit osoittivat, että altistettaessa 5 mM butyraattia, HCT-116 ja HCT-R solut lisäsi merkittävästi ekspressiota

WNT5A

ja

WNT11

mRNA: ta (tuloksia ei ole esitetty), ja olemme vahvistaneet tämä muutos ilmentymisessä proteiinin taso (Fig. 1A). Verrattuna HCT-116-solut, HCT-R solut ilmensivät korkeampia tasoja sekä ligandeja, ja läsnäolo erittyy WNT5A ja WNT11 soluviljelyelatusaineella ehdollistettu CC-solujen vahvistettiin (Fig. 1A) B

(A) edustavia western blot analyysit CC solujen ja niiden elatusaineessa altistumisen jälkeen mock hoitoon (M) tai 5 mM butyraattia (B) 19 tuntia. (B ja C). Hiljentäminen

WNT5A

ja

ROR2

ilmentyminen lisää Wnt /kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta HCT-116 (B) ja HCT-R (C) solut. Solut (50,000 /kuoppa) kotransfektoitiin toimittajille for Wnt /kateniinin transkriptioaktiviteettia (TopFlash tai FopFlash, 50 ng /kuoppa), PRL-TK kontrollina transfektiotehokkuuden, ja valvonta,

ROR2

, tai

WNT5A

siRNA (10 pmol /kuoppa). Nukleiinihapot otettiin käyttöön soluista kautta käänteinen transfektioprotokolla Lipofectamine 2000 96-kuoppalevyillä. 31 tuntia transfektion jälkeen, solut altistettiin 20 tunnin ajan pilkattaa (m) tai 5 mM butyraattia (b) käsittelyä. Wnt transkription aktiivisuus laskettiin suhde aktiivisuuden TopFlash (villin tyypin Lef /Tcf sitoutumiskohdat) ja FopFlash (jossa mutantti Lef /Tcf sitoutumiskohtia). Kukin transfektio suoritettiin rinnakkaiskoekuopissa; Tulokset edustavat keskiarvoa tuloksista kolmesta kokeesta. (D). Yliekspressio WNT5A estää kanoninen Wnt transkriptionaalista aktiivisuutta HCT-116-soluissa. Kotransfektiojärjestelmää HCT-116-solujen (50000 /kuoppa) kanssa Wnt toiminnan toimittajat TopFlash tai FopFlash (50 ng kuoppaa kohti), ja pcDNANeo3.1 tai WNT5A ilmentävän rakentaa (150 ng per kuoppa) toteutetaan käänteinen transfektion Lipofectamine (0,7 ul /kuoppa) 96-kuoppaisilla levyillä. Transfektion jälkeen solut altistettiin mock hoitoon (m) tai 5 mM butyraattia (b) 20 tuntia. Kukin transfektio suoritettiin rinnakkaiskoekuopissa; Tulokset edustavat keskiarvoa tuloksista vähintään kolmen kokeen. (E) Suppression of

ROR

2 ilmentyminen lisää herkkyyttä HDACi vastustuskykyisten HCT-R solujen kasvua estävä vaikutus ja butyraatti. HCT-R-solut (10

6) on nucleofected 175 pmol

ROR2

(Invitrogen) tai kontrolloida siRNA, ja 500000 solua maljattiin kuoppaa kohti 6-kuoppalevylle. 24 tuntia, solut altistettiin mock hoitoon (m) tai 5 mM butyraattia (b) 17 tuntia. 48 tuntia post-nucleofection, solut maljattiin 100 tai 200 kuoppaa kohti kolmena rinnakkaisena. Prosenttia kloonikasvuun laskettiin pesäkkeiden lukumäärä, jotka johtuvat yksittäisten solujen suspensio on 100 solua. Koe toistettiin kolme kertaa, ja tulokset ovat keskiarvo datasta kolmen kokeissa. Tilastollisesti merkittäviä eroja on merkitty tähdillä.

Riippuu reseptorin yhteydessä WNT5A ja WNT11 aiheuttaa joko kanonisen tai noncanonical Wnt signalointia [13] – [17]. Koska WNT5A indusoi noncanonical Wnt aktiivisuuden läsnä reseptorin ROR2, olemme analysoineet ilmentymisen ROR2 kahden CC solulinjat. Western blot-analyysit paljastivat, että molemmat solutyypit ilmaistuna ROR2; kuitenkin, HCT-R-solut osoittivat korkeampia ROR2 kuin HDACi herkkä HCT-116-solut (Fig. 1A). Näin ollen, on mahdollista, että WNT5A toimii noncanonical ligandina butyraatti-käsitellyissä soluissa, ja että HCT-R-solut osoittavat korkeampaa noncanonical Wnt signalointia kuin HCT-116-solut.

Sen varmistamiseksi vaikutuksia WNT5A ja ROR2 on Wnt toimintaa, voimme kotransfektoidaan HCT-116 ja HCT-R solut transkription reportterit Wnt /beeta-kateniinin signalointia (TopFlash tai FopFlash) ja siRNA osoitteeseen

WNT5A

tai

ROR2

. Vähentynyt ilmentyminen WNT5A ja ROR2 HCT-116-solujen lisääntynyt Wnt /beeta-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta tilastollisesti merkittävällä tavalla (Fig. 1 B). Butyraatilla käsitelty HCT-116-solujen tukahdutetaan

ROR2

ja

WNT5A

ilmaus lisäsivät tasot kanoninen Wnt /kateniinin toiminta 233,0 ± 19,8 ja 161,0 ± 32,0 verrattuna kontrolliryhmään-transfektoiduissa soluissa ( 94,8 ± 10,8), P 0,05, in valehoidettujen HCT-R soluissa, tukahduttaminen

ROR2

ja

WNT5A

ilmaisua ei merkittävästi muuttanut Wnt transkription tasoa verrattuna transfektoiduissa soluissa jossa ohjaus siRNA (17,4 ± 4,6 ja 12,8 ± 1,8, verrattuna 15,3 ± 3,7 hallinnassa soluissa, P 0,05) (Fig. 1 C). Kuitenkin butyraatti-käsitelty HCT-R-soluja, tukahduttaminen

ROR2

ja

WNT5A

ilmentyminen johti huomattavasti korkeampi kanonisen Wnt transkriptionaalisen aktiivisuuden, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA (60,2 ± 12,5 ja 53,1 ± 8,4 verrattuna 31,2 ± 7,9 hallinnassa soluissa, P 0,05) (Fig. 1 C). Siksi WNT5A ja sen reseptori ROR2 vastapainoksi induktion Wnt /beeta-kateniinin aktiivisuuden butyraatti saaneilla HCT-116 ja HCT-R soluissa.

Tätä päätelmää tukevat tulokset yliekspressio WNT5A HCT -116 soluja. HCT-116-solut, jotka ilmentävät alempia WNT5A kuin HCT-R-solut (Fig. 1A), kotransfektoitiin Wnt /beeta-kateniinin toimittajat ja tyhjän vektorin, tai WNT5A ekspressiovektoriin. Solut kotransfektoitiin tyhjällä vektorilla kasvattivat Wnt /beeta-kateniinin aktiivisuus (TopFlash /FopFlash) 5,2 ± 1,1-62,2 ± 9,3; kun taas solut yli-ilmentävät WNT5A kasvattivat Wnt /beeta-kateniinin aktiivisuus 3,7 ± 0,1-13,2 ± 0,3 (Fig. 1 D). Ero Wnt /beeta-kateniinin transkriptionaalisen aktiivisuuden välillä ohjaus- ja WNT5A-transfektoitujen solujen läsnä ollessa butyraatti oli tilastollisesti merkittävä (P 0,05).

Koska hiljentämisen

ROR

2 ilmentyminen HCT-R soluissa johti korkeampi Wnt /beeta-kateniinin signalointi, ja olemme aiemmin havaittu, että korkeampi induktio Wnt /beeta-kateniinin CC soluissa vastaa suurempi herkkyys solujen vaikutuksille butyraatti [8 ], olemme analysoineet kloonikasvuun HCT-R soluissa nucleofected kanssa ohjaus siRNA tai

ROR

2 siRNA. Puuttuessa butyraatti, ohjaus siRNA- ja

ROR

2 siRNA-transfektoiduissa soluissa osoitti hieman, mutta tilastollisesti merkitsevä, ero klonaalisen kasvun (75,3 ± 1,4% vs. 67,6 ± 3,4%, P 0,05) . Läsnä ollessa butyraatti, ero klonaalisen kasvun kyky oli jyrkempi; kontrolli-nucleofected HCT-R-solut osoittivat klonaalinen kasvua 71,3 ± 3,8% ja

ROR

2 siRNA-nucleofected solut osoittivat 51,4 ± 5,5% kloonikasvuun (Fig. 1 E).

induktio Akt /PKB selviytymisreittiin mukaan WNT5A ja ROR2 CC soluissa

lisäys WNT5A ilmentymisen butyraatti saaneilla HCT-116 ja HCT-R soluissa kysytään etsiä alavirran efektorien ligandin. Useat noncanonical WNT5A aiheuttama reittejä on tunnistettu, ja ainakin kaksi näistä ovat ROR2 riippuvainen: fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3-K) /AKT signalointi laukaisee fosforylaation AKT-kinaasin [18] – [20], ja JNK-signalointireitin [21] – [23]. Yhdenmukaisesti näiden raporttien havaitsimme, että Serine473-fosforyloidun AKT (Pakt) ilmentyy korkeammilla tasoilla HDACi kestävä HCT-R soluissa verrattuna HCT-116-soluissa, ja molemmissa solulinjoissa, altistuminen voihappoon nostivat Pakt ( kuva 2A).

(A) HDACi kestävä HCT-R-solut ilmentävät korkeampia Pakt kuin HDACi herkkä HCT-116-soluissa. Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille 450000 solua per kuoppa, ja 24 tuntia altistettiin pilkattaa (M) tai 5 mM butyraattia (B) käsittely 17 tuntia. Kokonaisproteiinia lysaatit analysoitiin Western blot-analyysit, ja tasot Ser473-fosforyloitu AKT (Pakt), yhteensä AKT (AKT), ja ACTIN havaittiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B) HCT-R-solut ovat resistenttejä 5-fluorourasiilin (5-FU) aiheuttaman apoptoosin kuin vanhempien HDACi herkkä HCT-116-solut. Solut altistettiin 1,5 mM 5-FU 24 tunnin ajan, ja apoptoottisten määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Prosenttiosuus elävien solujen laskettiin jakamalla elävien solujen kokonaismäärä analysoitiin solujen. (C) vaiennettu ROR2 ilmentymisen HCT-R soluissa vähenee tasot Ser473-fosforyloidun AKT. Yhden miljoonaa solua nucleofected ohjaus- tai

ROR

2 siRNA (175 pmol, Invitrogen), ja maljattiin 500000 kuoppaa kohti 6-kuoppaisille levyille. 24 tuntia transfektion jälkeen solut altistettiin pilkkaatte (M) tai 5 mM butyraattia (B) 19 tuntia. Kokosoluliuotteista analysoitiin western blot; edustava western blot on esitetty. Pylväskaavion alle western blot kuvaa edustaa määrällisesti Pakt tasot kolmessa riippumattomassa kokeessa densitometrialla, ero butyraatti-käsitellyt solut ovat tilastollisesti merkittäviä (P 0,05), (D) .Overexpression rekombinantti WNT5A HCT-116-solut johtaa lisääntyneeseen Pakt tasoilla. HCT-116-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla tai WNT5A ekspressiovektoriin, ja valitaan stabiileja Näiden rakenteiden ilmentymistä. Monista analysoitiin ekspressiotasot WNT5A ja Pakt kuten edellä on kuvattu; edustava western blot on esitetty. Pylväsdiagrammi alla western blot edustaa määrällisesti Pakt kolmessa riippumattomassa kokeessa densitometrialla, P 0,05. (E) tyypillisen western blot -analyysin SW620 ihmisen CC-solut ja SW620R soluja, jotka kasvavat 3 mM butyraattia. Kaksi solulinjoja altistettiin pilkkaatte (m) tai 5 mM butyraattia (b) käsittely 17 tuntia ja analysoitiin kuten 2A. (F). SW620 solut, jotka ilmentävät eksogeenisiä WNT5A näytteille tukahdutti induktion Wnt /beeta-kateniinin transkriptio butyraatti, P 0,05. Transfektio ja analyysit tehtiin kuvatulla kuvassa. 1D.

Koska AKT /PKB on solun selviytymisen koulutusjakson, päättelimme, että korkeat Pakt tasot HCT-R solut voivat suojata soluja ei vain indusoiman apoptoosin HDACis, mutta myös muita apoptoottista ärsykkeille . Arvioida tätä mahdollisuutta, vertasimme vaste HCT-R-soluja ja niiden HDACi herkkä vastineet, HCT-116-soluja, 5-fluorourasiili (5-FU), joka on yleisesti käytetty kemoterapeuttinen aine CC. Pitoisuus 5-FU vaaditaan 50% kasvun inhibitio on raportoitu HCT-116-solut, ja lääkeresistentti johdetut solulinjat HCT-116-solut, ja se on alueella 0,09 mM: sta 2,4 mM [24]; Näin ollen, olemme analysoineet vaste HCT-116 ja HCT-R-soluja 1,5 mM 5-FU: ta (Fig. 2B). Hoito HCT-116-solujen kanssa 5-FU johti merkittävään väheneminen elävien solujen 86,7 ± 8,3-48,1 ± 8,0 (P 0,05); katsoo, sama altistuminen HCT-R-solut eivät merkittävästi muuttaa elävien solujen. Siten valehoidettujen soluissa ilmeni 95,8 ± 2,1% eläviä soluja, ja 5-FU – käsitellyt solut osoittivat 91,6 ± 4,2% eläviä soluja, P 0,05 (Fig. 2B).

Mahdollisuus syy-yhteyttä välillä kohonneita Pakt ja ilmaus WNT5A ja ROR2 testattiin kautta geenien ja geenien yliekspressio kokeiluja. Hiljentäminen

ROR2

ilmentymistä HCT-R soluissa siRNA aiheutti kohtalaisesti hidastuneen Pakt tasoja, ja ero Pakt tasoilla oli tilastollisesti merkitsevä vain välillä butyraatti käsiteltyjä soluja (Fig. 2C), The yliekspressio WNT5A HCT-116-solujen johti kohonneeseen Pakt, ja ero oli myös tilastollisesti merkittävä (Fig. 2D).

Lisätutkimukset ihmisen paksusuolen syöpäsoluja SW620, ja niistä johdetut SW620R soluja, jotka kasvavat 3 mM butyraattia, osoitti, että nämä solut eivät ilmennä havaittavia määriä ROR2 (tuloksia ei ole esitetty); kuitenkin, he ilmaisevat WNT5A, ja altistuminen voihappoon suurentaa Pakt tasoja (kuvio. 2E). Mielenkiintoista, eksogeeninen ilmentyminen WNT5A vuonna SW620-soluissa vaimennetaan Wnt /beeta-kateniinin riippuvaisen transkription jopa ilman havaittavaa ROR2 ilmaisun: läsnäollessa butyraatti Wnt aktiviteettitasoa WNT5A ilmentäviä SW620-soluja 271 ± 32, ja nämä kontrolli-transfektoituja soluja oli 389 ± 35 (Fig. 2F). Siksi lisäksi ROR2, muut reseptorit voivat välittää WNT5A signaali, ja loppupään aktivointi AKT-kinaasin.

vastustamisesta Pakt tasoilla augments apoptoottista vastetta CC solujen HDACis

Koska AKT signalointi on tärkeä solujen eloonjäämistä reitti, päättelimme, että sen estämiseen CC altistuneiden solujen HDACis olisi lisätä apoptoottista vaikutusta näiden aineiden. Me käytetään MK2206, joka on allosteerinen estäjä AKT [25], ja määritettiin, että 5 uM aine estää Pakt tasoilla sekä HCT-116 ja HCT-R-solut (Fig. 3A). Määrittää, kuinka Wnt /beeta-kateniinin signalointi vaikuttaa AKT estäjä MK2206 yksin tai yhdessä HDACi (butyraatti tai LBH589), olemme analysoineet tasoja transkriptionaalisesti aktiivisen (defosforyloidun) beeta-kateniinin HCT-116-solujen käsitelty 8 tai 17 tuntia (Fig. 3B). 8 tuntia, HDACi herkkä HCT-116-solut eivät osoita merkkejä apoptoosin, kuten todettu virtaussytometrialla analyysit anneksiini V (tuloksia ei ole esitetty); kuitenkin, 17 tuntia apoptoosin on jo havaittu, ja beeta-kateniini lohkaistaan ​​sen N- ja C-terminuksesta kaspaasien (katso nuoli toisen paneelin kuvion. 3B). Siksi analyysit transkriptionaalisesti aktiivista beta-kateniinin tasoilla tehtiin 8 tuntia HCT-116 ja HCT-R soluissa (kuviot. 3B ja 3C). Molemmissa solulinjoissa, MK2206 ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia tasoja aktiivista beta-kateniinin verrattuna näytteitä käsiteltiin HDACi yksin kuitenkin, tasot Pakt hiljennettiin MK2206 kaikissa käsittelyissä (Fig. 3d).

(A) vastustamisesta Pakt tasojen CC soluissa allosteric estäjä MK2206. Tyypillisen western blot-analyysi CC soluja altistettiin 17 tunnin pilkattaa (M), 5 mM butyraattia (B), butyraatti ja 1 uM MK2206 (MK1B), tai butyraatti ja 5 uM MK2206 (MK5B). (B) vakaan tilan tasoja kopioinnin suhteen aktiivisia beeta-kateniinin eivät vähentyneet HCT-116-soluissa yhdistetyn käsittelemällä HDACi ja MK2206. Soluja altistettiin 8 tai 17 tuntia ja mock hoitoon (M), 5 mM butyraattia (B), butyraatti ja 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), tai 100 nm LBH589 ja 5 uM MK2206 (LMK). Kokosoluliuotteista analysoitiin vakaan tilan veren kokonaiskolesterolia ja Ser37 /Thr41 defosforyloitiin beeta-kateniinin. Edustavia western blot-analyysi on esitetty. (C) Aktiivinen beeta-kateniinin tasoilla HCT-R-solut altistettiin 8 tunnin ajan pilkattaa (M), 5 mM butyraattia (B), butyraatti ja 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), tai 100 nm LBH589 ja 5 uM MK2206 (LMK). (D) tyypillisen western blot -analyysin Ser473-fosforyloidun AKT (Pakt) ja yhteensä AKT (AKT) tasot CC altistuneiden solujen 17 tunnin pilkattavaksi (M), 5 mM butyraattia (B), butyraatti ja 5 uM MK2206 (BMK) , 100 nm LBH589 (L), tai 100 nm LBH589 ja 5 uM MK2206 (LMK). (E) induktio Wnt /kateniinin riippuvainen transkriptionaalista aktiivisuutta (TopFlash /FopFlash) CC-soluissa HDACi (butyraatti tai LBH589) ei tukahdutti Pakt estäjä. Solut nucleofected on miljoona 1 ug: lla plasmidia (TopFlash tai FopFlash) ja PRL-TK, laimennettiin, ja maljattiin 30500 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. 24 tuntia post-nucleofection, soluja käsiteltiin 8 tunnin ajan kanssa mock (M), 5 mM butyraattia (B), butyraatti ja 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), tai 100 nm LBH589 ja 5 uM MK2206 (LMK). Tulokset edustavat keskiarvoa tuloksista vähintään kolmen kokeen. Tilastollisesti merkittäviä eroja on merkitty tähdellä. (F) Apoptotic tasoilla HCT-116 ja HCT-R solut altistetaan HDACis ja Pakt estäjä. Soluja altistettiin 28 tuntia, jolloin: mock hoitoon (M), 5 mM butyraattia (B), butyraatti ja 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), tai 100 nm LBH589 ja 5 uM MK2206 (LMK). Prosenttia apoptoosin ja nekroosin laskettiin jakamalla apoptoottisten ja nekroottisten solujen kokonaismäärä analysoitiin solujen. Jokainen koe oli triplikaattinäytteet käsittelyä kohti; Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta kokeesta. Tilastollisesti merkittäviä eroja on merkitty tähdellä. (G, H) SW48 ihmisen CC solujen villin tyypin KRAS ovat niin herkkiä kuin HCT-116-solujen KRAS yhdistettyyn käsittelemällä HDACi ja Pakt estäjä. SW48 solut käsiteltiin ja analysoitiin kuvatulla tavalla Figs.3D ja 3F. Edustavia western blotit ja apoptoottisten data, joka edustaa keskiarvoa kolmesta kokeesta, esitetään. Tilastollisesti merkittäviä eroja on merkitty tähdellä.

suoraan mitata Wnt /beeta-kateniinin transkriptio soluissa altistetaan Pakt estäjä ja /tai HDACis, me transfektoitujen solujen reportterina Wnt /beta- kateniinin aktiivisuus (TopFlash) tai kontrolli-reportterin (FopFlash) (Fig. 3E). Wnt /kateniinin transkriptioaktiviteettia (TopFlash /FopFlash) HCT-116-solut altistettiin pilkata tai MK2206 hoitoa oli 3,9 ± 0,4 ja 2,8 ± 0,8, tässä järjestyksessä (P 0,05). HCT-116-solut altistettiin butyraatti tai butyraatti ja MK2206, aktiivisuus nousi 8,73 ± 2,9 ja 12,8 ± 1,3 (molempien hoitojen, P 0,05). Lopuksi, kun HCT-116-solut altistettiin LBH589 tai LBH589 ja MK2206, Wnt /beeta-kateniinin aktiivisuus kasvoi 7,1 ± 0,6 ja 11,3 ± 2,1, vastaavasti, (P 0,05). HCT-R soluissa, altistuminen pilkattavaksi MK2206, butyraatti, butyraatti ja MK2206, LBH589 tai LBH589 ja MK2206 johti Wnt /beeta-kateniinin aktiivisuus 6,1 ± 0,9, 4,6 ± 1,2, 11,7 ± 2,8, 16,0 ± 2,9, 15,2 ± 0,5, ja 17,2 ± 1,2, vastaavasti, (P 0,05 kombinatoristen hoitoja verrattuna hoitoihin HDACi yksin). Siten MK2206 ei tukahduttaa säätelyä Wnt transkription aktiivisuutta HDACis.

yhdistetty vaikutus HDACis ja MK2206 apoptoosiin mitattiin kautta virtaussytometrialla analyysejä. Vaikka ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa apoptoottisten tasoilla mock ja MK2206-käsiteltyjä soluja, lisäämällä MK2206 että butyraatti tai LBH589 tilastollisesti merkittävä apoptoosin lisääntyminen verrattuna hoitoon kullakin HDACi yksinään (Fig. 3F). Siten HCT-116-solut altistettiin pilkata tai MK2206 näytteille apoptoottista tasoilla 12,8 ± 2,2% ja 14,3 ± 3,5%, vastaavasti, (P 0,05). Hoito HCT-116-solujen kanssa butyraatti tai butyraatti ja MK2206 johti 44,2 ± 1,5% ja 64,2 ± 4,4% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05). Kun läsnä on LBH589 tai LBH589 ja MK2206, HCT-116-solut osoittivat 55,7 ± 6,9% ja 73,5 ± 4,7% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05). In, HCT-R soluissa, altistuminen pilkata tai MK2206 hoito johti 11,4 ± 3,6% ja 11,0 ± 4,0% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05); altistuminen butyraatti tai butyraatti ja MK2206 johti 14,4 ± 3,6% ja 25,2 ± 4,1% apoptoosin (P 0,05), ja altistuminen LBH589, tai yhdistelmä LBH589 ja MK2206 johti 31,6 ± 5,3 ja 45,7 ± 4,4% apoptoosin ( P 0,05).

tällä hetkellä Pakt estäjä MK2206 on kliinisessä tutkimuksessa paksusuolen syöpiin villin tyypin KRAS; kuitenkin, yhdistelmä HDACi ja Pakt estäjä oli erittäin tehokas indusoimaan apoptoosin HCT-116-solulinja, joka on

KRAS

-mutant ja uudelleen herkistävä HCT-R solujen apoptoottista vaikutukset HDACis. Verrata tehokkuutta lääkeyhdistelmän CC-soluissa villityypin KRAS, olemme analysoineet apoptoottisen vasteen ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa SW48 soluja. SW48 solut vastasi yhdistelmä HDACi ja MK2206 tilastollisesti merkittävä kasvu apoptoosin (Fig. 3G): pilkata ja MK2206 hoitoja johti 16,6 ± 0,7% ja 16,9 ± 0,7% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05). Hoito SW48 solujen butyraatti tai butyraatti ja MK2206 johti 49,7 ± 4,4 ja 75,6 ± 1,2% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05), ja altistuminen LBH589 tai LBH589 ja MK2206 johti 56,1 ± 6,3% ja 78,3 ± 3,7% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05). Western blot analyysit vahvistivat, että MK2206 luotettavasti tukahdutti HDACi aiheuttama tasoja Pakt vuonna SW48 CC soluissa (Kuva. 3H).

Diet johdettuja aineita, jotka matkivat vaikutukset synteettisten HDACis ja Pakt estäjät

katsoo yhdistelmä synteettisten HDACis ja Pakt estäjiä voitaisiin soveltaa CC terapeuttisia tai ehkäisyyn potilaille, joilla on lisääntynyt riski CC (esim potilaalla on resektoidun CC ja /tai krooninen IBD), ruokavalio- ohjeistuksia, jotka tarjoavat aineenvaihduntatuotteiden kanssa HDAC- ja Pakt -inhibitory toimintoja voisi tulla CC ehkäisy lähestymistapa väestössä. Koska butyraatti on tehokkain ruokavalio-johdettu HDACi tuotettu paksusuolessa [26], CC-ehkäiseviä ruokavalion tulisi sisältää riittävästi tasoja käymiskelpoista kuitua. Löytää Pakt estäjä, joka voi olla peräisin ruokavaliosta, teimme kirjallisuushausta ja löysi julkaisuja sulforaphane, luonnon sphingadienes, valkosipuli johdettuja diallyyli trisulfidia (DATS), kofeiinihapon fenetyyliesteri (CAPE alkaen mehiläisen propolis), curcumin, ja resveratrol, jotka kaikki estävät Pakt tasot eri solutyypeissä [27] – [33]. Olemme kokeilleet joitakin näistä yhdisteistä niiden kyky estää tasot butyraatti-indusoidun Pakt CC-soluissa, ja totesi, että KAP, DATS, ja sulforaphane tukahdutti kasvua Pakt kinaasin tasolla butyraatti-käsitelty HCT-116-solut, ja vain KAP ja DATS olivat aktiivisia HCT-R solut (Fig. 4A). Kolmesta testatut yhdisteet, CAPE oli voimakkain tukahduttamaan butyraatti aiheuttama tasot Pakt molemmissa solutyypeissä; kuitenkin, se ei aiheuttanut apoptoosia kummassakaan näissä soluissa itse (Fig. 4B). Siten HCT-116-solut, mock altistuminen ja käsittely 4 ug millilitraa kohden CAPE johti 12,2 ± 3,1% ja 11,9 ± 0,8% apoptoosin, tässä järjestyksessä; altistuminen butyraatti tai yhdistelmä butyraatti ja CAPE johti 44,8 ± 1,8% ja 78,4 ± 6,5% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05). HCT-R soluissa, mock altistuminen hoito butyraatti, ja hoito CAPE yksinään johti 8,9 ± 1,2%, 12,6 ± 1,7%, ja 10,9 ± 3,0% apoptoosin, vastaavasti (P ​​ 0,05). Kuitenkin, kun HCT-R solut altistettiin yhdistelmä CAPE ja butyraatti, apoptoottinen tasot kasvoi lähes kolminkertaiseksi, 30,6 ± 3,6% (P 0,05) (Fig. 4B). Myöhemmät analyysit paljastivat, että butyraatti hoidetuilla HCT-R soluissa, CAPE vaimentaa fosforyloidun tasoja p55-alayksikön fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi (PI3K), merkittävä ylävirtaan aktivaattori AKT kinaasin (Fig. 4C). Kuitenkin tarkka vaihe, jossa tämä tukahduttaminen tapahtuu ei tiedetä, ja se on painopiste tulevan tutkimuksen. Emme havainneet sopusoinnussa suppressio fosfo-p55 PI3K tasot HCT-116-solut altistettiin KAP ja butyraattia (tietoja ei esitetty).

(A) Diet peräisin olevat yhdisteet estää butyraatti aiheuttama Pakt tasoa CC solut. Tyypillisen western blot solujen altistettiin 14 tuntia, jolloin mock hoitoon (M), 5 mM butyraattia (B), 5 mM butyraattia ja 4 ug /ml KAP (BC), 5 mM butyraattia ja 20 uM sulforaphane (BS), 5 mM butyraattia ja 40 uM DATS (BD). Havaitseminen Pakt yhteensä AKT (AKT), ja ACTIN suoritettiin yhteensä solujen lysaatit. 2B].