Krooninen sairaus

tiivistelmä

anto suun kasvainsolujen indusoi immuunivasteen hypo-vaste tunnetaan suun toleranssi. Olemme aiemmin osoittaneet, että suun toleranssi syövän on kasvain antigeenispesifisten, ei-ristiin reagoiva ja antaa kasvaimen kasvua etu. Tutkimme hyödyntäminen sääntelyn T-solujen (Treg) väheneminen suun toleranssi syövän ja sen kyky hallita kasvaimen kasvua. Balb /C-hiiret olivat letkulla syötetään homogenoidusta kasvainkudoksen – JBS fibrosarkooma (aiheuttaa oraalisen toleranssin on syöpä) tai PBS: ää kontrollina. Kasvu ihonalainen JBS kasvaimet mitattiin; pernakudoksesta leikattiin ja virtaussytometria käytetään määrällisesti ja vertailla systeemisen Tregs ja T efektori (Teff) solupopulaatioiden. Ennen ja /tai kasvaimen ruokinta hiirille intraperitoneaalisesti anti-CD25, inaktivoimiseksi systeeminen Tregs, tai tietyn isotyypin vasta-aineen kontrollina. Hiiret, jotka oli suun kautta tolerised ennen ihonalaisen kasvaimen induktiota, näkyy huomattavasti korkeampi systeeminen Treg tasoja (14% vs 6%), ja nopeampi kasvaimen kasvu kuin kontrolleilla (p 0,05). Täydellinen regressio kasvainten vasta nähty jälkeen Treg inaktivoinnin ja esiintyi kaikissa ryhmissä – tämä ei inhiboi kasvaimen ruokinta. Lääke hinnat Treg inaktivoitumisen oli 60% aikana siedätyk-, 75% kasvaimen kasvun aikana ja 100% aikana inaktivointi sekä siedätyk- ja kasvaimen kasvua. Ehtyminen Tregs johti lisääntynyt määrä Teff soluja. Treg ehtyminen post-siedätyk- ja post-syöpäkasvainten johti täydellisen regression kaikista kasvaimista kasvaimen hiirille. Suun kautta antaminen kasvainkudoksen, annetaan kasvaimen kasvua etu ja mukana on lisääntyminen systeemisen Treg tasoilla. Antaminen anti-CD25 Ab laski Treg numeroita ja aiheutti kasvu Teffs. Selkeimmin Treg solun esto voittaneet perustettu oraalisen toleranssin kanssa seurauksena kasvaimen regressio, erityisen tärkeää foregut syöpien missä oraalisen toleranssin todennäköisesti indusoi vuodattamalla kasvainkudoksen suoleen.

Citation: Whelan MC, Casey G , Larkin JO, Guinn Ba, O’Sullivan GC, Tangney M (2014) Oral sietokyky syöpä voidaan kumottu T Regulatory Cell esto. PLoS ONE 9 (5): e97602. doi: 10,1371 /journal.pone.0097602

Editor: Valli De Re, Centro di Riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italia

vastaanotettu: 14 marraskuu 2013; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2014; Julkaistu: May 15, 2014

Copyright: © 2014 Whelan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoitetaan tutkimuksen apurahan GOS ja MT Cancer Research Irlanti (CRI06OSUG). MW rahoitti apurahan Royal College of Surgeons Edinburgh ja Royal College of Surgeons Irlannissa. Kirjoittajat myöntävät myös tukea Cork Cancer Research Centre. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vaikka otetaan verrattavissa kasvain Esiintymislavat ennustetta kärsivien potilaiden ruokatorven ja mahalaukun syövän pysyy johdonmukaisesti ja merkittävästi huonompi kuin potilailla, joilla on distaalinen ruoansulatuskanavaan syövät, vaikka kehitys diagnostisia, kirurgisten ja adjuvantti hoitojen [1], [ ,,,0],2]. Niistä monista muuttujista, jotka määräävät kasvaimen kasvu ja ennusteita, erot kasvaimen immuunivaste todennäköisesti välillä foregut ja muita syöpiä. Käsittely ruokavalion antigeenejä (Ags) limakalvon immuunijärjestelmän ruoansulatuskanavan johtaa systeeminen Ag erityinen immuuni hypo-vaste kutsutaan oraalisen toleranssin [3]. On todennäköistä, että kasvain Ags peräisin kasvainkudoksen irtoa osaksi suolistossa foregut syöpien olisi käsitellä suoliliitteinen imukudoksissa (GALT), havaitaan pääasiallisesti proksimaalisten ruoansulatuskanavassa, tavalla, joka muistuttaa Ags nautittavaksi limakalvon immuunijärjestelmän luoden kasvain Ag erityinen siedätyshoitoa. Raportoimme aikaisemmin, että suun kautta tuoretta tuumorikudosta aiheuttama kasvain Ag erityinen ei-ristiin reagoiva siedätyshoitoa minkä seurauksena kasvua etu syöpä [4].

mekanismia sietokyvyn nautitaan Ags voi johtua joko aktiivinen vaimennus tai induktion klonaalisen poistamisen /anergiaan [5]. T-solut kloonattiin tolerised hiirillä on katsottu johtuvan ainutlaatuisen osajoukko CD4

+ väestöstä, Th3 solu [6]. T-solureseptorin (TCR) siirtogeenisiä hiiriä, lisääntyi CD4

+ CD25

+ solujen vastauksena suun kautta Ag antoa. Nämä Tregs havaittiin ilmentävän CTLA-4 ja Foxp3 ja olla tukahduttava funktio

in vitro

. CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ Tregs osansa estää autoimmuunitaudin kehittymistä ja on kaksitahoinen omaisuuden sekä anergiseksi ja ehkäisevästä soluja. Merkittävää on, että on osoitettu, että poistamalla osa väestöstä voi aiheuttaa tuumorin vastaista immuuni- aktiivisuus [7] – [10]. Kokeellisissa järjestelmissä, kuten kasvaimet kasvavat, on numeerinen kasvu Tregs immuunijärjestelmän tunkeutuminen sisään on seurauksena paikallisen suppressio kasvaimen vastaisen immuunivasteen. Vasta-aine (Ab) välittämä poistaa nämä Tregs voi unmasks luonnon kasvaimen immuunireaktiivisuutta ja tämä strategia on todettu voimistavan immunoterapeuttisen tuhoaminen kokeellisissa tuumoreissa [10] – [12].

Olemme tutkineet vaikutuksia suun sietokyky JBS kasvaimen kasvaimen kasvu ja koosta lymfosyyttien osajoukkojen Balb /C hiirtä. Erityisesti tutkimme jos oraalisen toleranssin kasvaimiin oli Treg riippuva – ja Treg inaktivaatio voisi kumota oraalisen toleranssin ja estää kasvaimen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Tissue Culture

JBS hiiren fibrosarkooma [13] kasvatettiin kudosviljelykolveissa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2, DMEM (Dulbeccon Minimal Essential Medium -Sigma-Aldrich, Dublin, Irlanti). Kudosviljelyalustaan ​​oli täydennetty 10% rautaa täydennetty luovuttajan vasikan seerumia, 50 ug /ml gentamysiiniä, 300 ug /ml L-glutamiinia ja 10 mM HEPES (1-piperatsiinietaani sulfonihappo, 4- (2-hydroksietyyli) mononatriumsuola ), pH 7,4. Standardihoitotoimenpiteitä trypsinointi, sentrifugoimalla ja suspendoimalla uudelleen soluja käytettiin [13]. Elävien solujen laskenta suoritettiin käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymisen (Sigma, Irlanti).

Ethics lausunto

Kaikki hiiren kokeet hyväksynyt eläin eettinen komitea University College Cork (AERR # 2010 /003). Tutkimus toteutettiin tiukasti suositusten mukaisesti säädetyn Irlannin lapsi- ja terveysministeriön.

Kasvainten induktio

Hiiret saatiin Harlan Laboratories (Oxfordshire, Englanti). Ne pidettiin vakiona huoneenlämmössä (22 ° C), jossa on luonnollinen päivä /yö valosykliä tavanomaisessa eläimen siirtomaa. Peruslaboratoriolaitteisto ruokaa ja vettä tarjotaan

halun

. Ennen kokeita, hiiret saatiin sopeutumisajan 14 päivää. Balb /C-hiiriä molempia sukupuolia ja joilta puuttuu kateenkorva Balb /C HsdOla: MF1-nu hiirille hyvässä kunnossa, paino 16-22 g 6-8 viikon iässä, olivat mukana kokeissa. JBS kasvain induktio, 2 x 10

6 kasvainsolujen, suspendoitiin 200 ul: DMEM, injektoitiin ihon alle kylkeen hiiret. Tämän tilavuus inokulaattia ja sijainti oli vähän pistokohdan ekstravasaatio solususpensiota ja kasvaimen kasvua ja muoto oli yhdenmukainen.

Letkuruokinnalla Feeding

ihon alle rokotus 2 × 10

6 JBS kasvainsolujen Balb /C-hiiriä, kasvaimia kehittyi ja annettiin saavuttaa koko 1-2 cm

3, jossa vaiheessa eläimet tapettiin ja niiden kasvaimet poistettiin. Kasvaimet homogenoitiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) (Sigma, Irlanti) käyttäen FastPrep FP120 homogenisaattoria (Thermo Electron Corp., England). Homogenaatti laajasti pestiin sentrifugoimalla PBS: llä jätteiden poistamiseksi. Kun supernatantti oli makroskooppisesti selvää homogenaatti suspendoitiin uudelleen PBS: ään lopulliseen pitoisuuteen 0,2 g (märkäpaino) ml: aa kohti. Tämä jaettiin eriin ja pakastettiin käyttöön asti. PBS ohjaus oli myös eriin ja pakastettiin. Käyttämällä 18 Fr-teräs-pallo kärjellä ruokinta neula kiinnitetty 1 ml: n ruiskuun, YK-nukutettiin eläimet olivat letkulla syötettiin 200 ui juuri sulatettua JBS kasvain homogenaatti (40 mg kasvain) tai PBS: ää. Eläimet ruokittiin päivittäin 14 päivän ajan. Rehun määrää ja kestoa ruokinnan vastasivat niitä käytettiin aiemmin julkaistu tutkimuksia ryhmämme ja perustuivat kirjallisuuskatsaus, erityisesti mitä tulee tutkimuksiin, jotka käsittelivät toleranssi solujen Ags [4], [14] – [17] . Päivänä 15 eläimet saivat ihonalaisen rokotus kasvainsolujen (2 x 10

6 solua) ja seurattiin kasvaimen kehitystä päivittäin.

Kasvainten Monitoring

Kasvaimet mitattiin 48 tunnin välein digitaalisella tulkki. Kasvaimen tilavuus laskettiin standardikaavan

v

=

ab

2π /6 ja kasvaimen kasvua konstruoitiin. Hiiret humaanisti lopetettiin tapauksissa, joissa kasvain oli 1,5 cm

3 halkaisijaltaan. Ensimmäisessä kokeessa hiirille syötettiin kasvaimen Ag tai PBS: llä ja kasvua ja selviytymistä käyrät valmistettiin. Toisessa kokeessa, systeeminen Tregs olivat pysyvästi inaktivoitiin (kutsutaan köyhdytettyä) käyttäen anti-CD25 Ab: n (klooni PC61- Bio-Express, New Hampshire, USA), väliaikaisesti köyhdytettyä syötön aikana ainoastaan ​​tai ei tyhjentynyt. Lopullisessa kokeessa hiiriä ruokittiin 14 päivää ja tämän jälkeen satunnaistettiin saamaan anti-CD25 Ab: n tai kontrolli Ab konjugoitu anti-piparjuuriperoksidaasi (HPRN), Bio-Express, USA seurata vaikutuksia sc kasvaimen kasvua.

virtaussytometria-analyysi

ACK punasolujen hajotuspuskuria (0,15 M NH

4CL, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM Na

2EDTA, pH 7,4 HCl: lla) valmistettiin käyttämällä reagenssit ostettiin Sigma-Aldrich, Irlanti. Liuos steriloidaan suodattamalla 0,2 um: n suodattimen ja säilytettiin 4 ° C: ssa. FACS-värjäys puskuri valmistettiin Dulbeccon fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (Dulbeccon PBS) hankittiin Sigmalta yhdessä, naudan seerumin albumiinia (BSA), natriumatsidia ja naudan sikiön seerumia. Perna ja kasvainkudoksen poistettiin ja jauhettu erikseen 70 pm nylon solu siivilä (BD Biosciences, UK). Nämä solususpensiot kerättiin, pestiin elatusaineessa, pelletoitiin 300 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja sitten käsiteltiin ACK punasolujen hajotuspuskuria 3 min, jonka jälkeen ne pestiin kahdesti ja suspendoitiin uudelleen FACS-värjäyspuskurilla. Elinkelpoisten solujen määrä määritettiin standardin trypaanisinieksluusiolla testi. Sitten solut laimennettiin pitoisuuteen noin 2-4 x 10

6 ml: aa kohti, ja 100 ui värjäyspuskuria lisättiin per Falcon-putkeen (Becton Dickinson). Solususpensiot ja reagenssit pidettiin 4 ° C: ssa valmistuksen aikana.

solunpintamarkkeri Analyysi

fykoerytriini-Cy5 (PE-Cy5) konjugoituja vasta-aineita hiiren CD25 ja CD3, fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua vasta-aineita hiiren CD25, CD3, CD4 ja CD8 ja PE-anti-hiiri Foxp3 -värjäyspakkausta ostettiin eBioscience, Insight Biotechnology, Englannissa. PE anti hiiren CD4 ja CD3 ostettiin Serotec, Oxford, Englanti. Fluorikromi-konjugoitua isotyyppiä värjäytymistä kontrolleihin (FITC-IgG, PE-IgG2a ja PE-Cy5-IgG isotyyppikontrollilla) hankittiin eBioscience. Konjugoimattoman anti-hiiren CD16 /CD32 (Fcy III /II) monoklonaalinen Ab (Fc-reseptorin esto Ab) hankittiin Serotec.

minimoimiseksi epäspesifisen Ab sitova, anti-CD16 /CD32-Fc-reseptorin esto ab laimennettiin 0,01 ug /ul värjäyspuskuriin, 20 ui kuoppaa kohti, ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 20 min. Fluorikromi-konjugoituja vasta-aineita, solun pinnan markkereita myös laimennettuna valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja lisättiin kuhunkin näytteeseen poistamatta Fc-esto Ab. Soluja inkuboitiin pimeässä 4 ° C: ssa 45 minuuttia, sitten pestään kaksi kertaa 250 ul: ssa värjäyspuskuria ennen sekoittamista, 500 ul värjäyspuskuria välittömästi analysointiin tai fiksatiiviliuosta 0,5% paraformaldehydiä Dulbeccon PBS: ssä. Analyysi suoritettiin 48 tunnin kuluessa käyttäen FACScaliber virtaussytometriä (Becton Dickinson, Oxford, Yhdistynyt kuningaskunta) ja analysoitiin oheisiin CellQuest (BD Biosciences) tietokoneohjelmiston.

In vivo

Ab Administration

Kuten edellä todettiin, anti-CD25 Ab: n (PC61) ja valvonta Ab (isotyyppikontrolli rotta-IgG-HRPN) annettiin sisäisen peritonealy annoksella 1 mg /kg: n kokonaistilavuudessa 200 ui PBS: ää . Ajoitus annosten riippui koesuunnitelmalla mutta kun kaksi annosta olivat annettavaksi ne annettiin neljä päivän välein (Fig. 1). Tämä johti yli 95%: inaktivoinnin Tregs määritettynä virtaussytometrialla.

Ensimmäinen koe mukana hiiriä, jotka oli köyhdytetty Tregs ajaksi kokeen ja saatettiin olevan pysyvän käytön. Kokeita varten, joihin ehtyminen aikana siedätyk-, Treg ehtyminen vain tapahtui kasvaimen ruokintaa eikä silloin, kun kasvaimia aiheuttama. Lopullinen protokolla (ehtyminen post siedätyk-) tarvitaan oraalisen toleranssin perustetaan ennen Treg ehtyminen.

Tilastollinen analyysi

Erot yksittäisten ryhmien testattiin käyttämällä kaksisuuntaisia ​​Opiskelijan

t

-testi varten pariksi arvoja. Erot

p

arvo alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Suun Administration Kasvainten Tissue annetaan Kasvainten Specific Growth Advantage

Olemme aiemmin osoittaneet, että ihonalainen kasvaimia on nopeampi kasvuvauhti hiirillä, jotka syötettiin kasvain ennen kasvaimen induktiota, verrattuna hiiriin, jotka ruokittiin joko PBS: ää tai vaihtoehtoisen kasvain (CarB tai CT26) [4], [13]. Olemme myös osoittaneet, että kasvaimen kasvu käyrän Balb /C-hiiriä approksimoi kasvukäyrän ihonalaisen kasvaimen kateenkorvattomissa nude-hiirissä, joilta puuttuu toimiva T-solut, ja nämä hiiret käytettiin immuunivasteen epäpätevä ohjaus [13]. Tässä tutkimuksessa käytetään samaa ruokinta protokollaa, me validoitu että kasvain ruokinta järjestelmä johti johdonmukaisesti ja merkittävästi lisääntynyt ihonalaisen kasvaimen kasvu Balb /C-hiiriä versus kontrolliryhmiin. Ihonalainen kasvaimia ryhmissä ruokitaan JBS kasvain ilmestyi aiemmin (päivä 5 vs. päivä 6/7) ja kasvoi huomattavasti nopeammin (p 0,05) useissa ajankohtina (Fig. 2).

kasvukäyrät JBS kasvaimia Hiiren letkulla ruokinta 14 päivän jaksoina JBS kasvain homogenaatti tai PBS: llä. JBS kasvaimet kasvoivat huomattavasti nopeammin hiirillä suun kautta tolerised kanssa JBS. Kukin piste edustaa keskiarvoa kasvaimen paneelin kuusi hiirtä. Ero oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,05) päivinä 8, 9, 12 14 kuten on osoitettu tähdellä kuvaajassa.

Virtaussytometrianalyysi lymfosyyttien vastauksena kasvaimen nauttimisen

jälkeen 14 päivän suun kasvain tai PBS antoa, pernan lymfosyyttipopulaatioihin analysoitiin . Oli merkittävä lisäys CD4

+ CD25

+ soluja (p 0,022) kasvaimen annon versus PBS. Lisäksi oli merkittävä lisäys havaitaan CD25-

+ /

Foxp3

+ ilme seuraavan gating CD3

+ CD4

+ lymfosyyttipopulaatiossa (p 0,019) (kuvio . 3). Ei ollut merkittävää kasvua kokonaismäärät CD3

+ CD4

+ tai CD3

+ CD25

+ soluja. Ei myöskään ollut mitään merkittävää kasvua CD8

+ CD25

+ Teff alaryhmä populaatiot jälkeen kasvain ruokinta aikataulu. Ei ollut havaittavissa eroa numero tai suhde Lymfosyyttipopulaatioiden näiden hiiriä, jotka syötettiin PBS: llä ja ne, jotka eivät letkulla syötettiin tämän jakson aikana (dataa ei esitetty).

(a) dot plotit esittävät useita ääreisverenkierron Tregs PBS (i-iv) tai JBS (v-, viii) syötettiin hiirille. Tregs värjättiin CD3, CD4, CD25 ja

Foxp3

vasta-aineita konjugoituna fluorokromeja ja isotyyppikontrolleja ja analysoitiin virtaussytometrillä. Solut eroteltiin CD3

+ ja CD4

+ (ii ja vi) ja isotyyppikontrolleja (i ja v) ja myöhemmät piste tontteja hankittiin tämä portti CD25

+ ja

Foxp3

+ soluja (IV ja VIII) ja isotyyppikontrolleja (iii ja vii). Oli merkittävä lisäys CD4

+ CD25

+ soluja (p 0,022) kasvaimen annon versus PBS. Lisäksi oli merkittävä lisäys havaitaan CD25-

+ /

Foxp3

+ ilme seuraavan gating CD3

+ CD4

+ lymfosyyttipopulaatiossa (p 0,019). (B) Graph edustavat keskiarvoa prosentuaalisia arvoja Treg numeroiden miinus isotyyppikontrolleja sisällä koko reuna-lymfosyytti väestöstä JBS tai PBS syötettiin hiirille. Siellä oli huomattavasti Tregs vuonna pernat hiiriä, jotka ruokittiin homogenoidut kasvain 14 päivää kuin ruokitaan yksinomaan PBS (p 0,002; n = 6).

Lisääntynyt Kasvaimen kasvunopeus liittyy aktiivisuus Tregs

Olemme aiemmin osoittaneet, että anti-CD25 Ab Antomenettely helpottaa 90% inaktivaatio CD25

+ solujen yli 14 päivää [8]. Hiiret satunnaistettiin saamaan joko anti-CD25 Ab alkaessa 14 päivän ruokinta aikataulu, ja jälleen lopussa ruokinta (kutsutaan pysyväksi ehtyminen) tai Ab aikaan alkaa ruokkia vain (kutsutaan ehtyminen aikana siedättävät) tai kontrolli Ab, tai no Ab (Fig. 1).

tuloksena ihonalainen kasvain kasvukäyrät osoitti, että aiemmin havaittu kasvaimen kasvua etu seuraavat ruokinta puuttui hiirillä, joille ehtymiseen aikana siedättävät aikataulussa, jossa aika kasvaimen ulkonäkö ja kasvaimen kasvu samanlainen PBS-ruokitaan hiirillä, mikä osoittaa, vaatimus Tregs aikaan kasvaimen ruokinta varten oraalisen toleranssin (Fig. 4a). Kuten nähdään Fig. 4b, kasvaimia hiiret, jotka saivat anti-CD25 Ab lopulta taantunut kokonaan, niin ehtyminen aikana siedätyk- ja pysyviä ehtyminen ryhmiä. Me ja muut, ovat aiemmin raportoitu havainto, että anti-CD25 hallinto ennen kasvaimen induktiota indusoi täydellisen kasvaimen regression [8].

(a) ei ollut merkitsevää eroa kasvaimen kasvun välillä hiirillä ruokittu kasvain ( tilapäisesti tai pysyvästi) ja valvonta hiirillä. Hiiret, jotka saivat ei anti-CD25 Ab ehtyminen ilmi varsin erilaisia ​​kasvaimen kasvu päivinä 14, 18 ja 22 mukaan, ovatko ne oli syötetty kasvain ja suolaliuoksella (p 0,05). Kukin tietopiste edustaa kasvaimen arvot 10 hiirtä. (B) Survival käyrä hiiriä, jotka olivat pysyvästi, tilapäisesti tai ei tyhjentynyt aikana oraalisen toleranssin. Hiiret, jotka oli pysyvän käytön olivat 100%: sesti niiden ihonalainen kasvain ja pysyi tautivapaasta 100 päivää. 75% niistä, jotka olivat väliaikaisesti köyhdytettyä kun ruokitaan kasvain paranivat, kun taas 66% niistä, jotka olivat väliaikaisesti köyhdytettyä ja ruokitaan PBS kovettunut. Ei ollut mitään merkittävää eroa näiden ryhmien välillä. Kaikki nämä hiirillä, jotka saivat isotyyppikontrolli Ab sortunut kasvaintaakkaa (n = 10).

Muutoksia Lymfosyyttien Alaryhmät Havaittu vastauksena ehtyminen Tregs pysyvästi tai aikana Siedätys

eri ajankohtina, hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin ja niiden pernat analysoitiin systeemistä CD4

+ CD25

+ Treg ja CD8

+ CD25

+ Teff numeroita. Kasvaimen ruokinta merkittävästi suurentua Treg numerot versus PBS ruokitaan ryhmiä, ja tämä ero näkyi myös anti-CD25-Ab annettiin hiirille (Fig. 5a) (p 0,01). Vaikka oli merkitsevästi pienempi määrä Tregs PBS-ruokitaan ryhmissä, jotka saivat anti-CD25 Ab kuin ne, jotka saivat kontrolli Ab (Fig. 5b) (p 0,05), yllättäen, väheneminen yleinen Treg numeroita ei havaittu anti- CD25 Ab, kasvaimen syötetään hiirissä.

(a) Solut värjättiin CD3, CD4 ja CD25. Solut perin eroteltiin CD3- ja sittemmin CD4

+ CD25

+. Pernan Tregs analysoitiin hiirissä, jotka oli käsitelty (i) isotyyppikontrolli-vasta-ainetta ja sen jälkeen PBS: llä ruokinta; (Ii) väliaikaisesti köyhdytettyä anti-CD25-vasta-ainetta, mutta PBS fed (iii) pysyvän käytön anti-CD25-vasta-aineen ja PBS ruokitaan; (Iv) isotyyppikontrolli vasta-hoidon ja kasvaimen ruokitaan, (v) tilapäisesti köyhdytettyä anti-CD25 mutta kasvain syötetään tai (vi) pysyvän käytön ja kasvaimen ruokitaan. Edustavia dot tonteista asiaankuuluvat ryhmät nähdään, kolme hiirtä kustakin hoitoryhmässä analysoitiin; (B) Kaavio, jotka edustavat keskimääräistä datan pistekuvioita (a). On olemassa merkittävä ero näiden hiirten kasvaimen ruokittu tai PBS ruokitaan ja pysyvän käytön anti-CD25 (p 0,01), ehtyminen aikana siedätyk- kun PBS tai JBS fed (p 0,001), ohjaus Ab, kasvain syötetään versus kontrolli Ab PBS ruokitaan (p 0,01). Oli merkitsevä ero näiden hiirten, joita oli käsitelty kontrolli Ab tai PBS ruokitaan ja ne, jotka hoidettiin anti-CD25 Ab milloin tahansa ja PBS ruokitaan, (p 0,05). Ei ollut mitään merkittävää eroa Tregs minkä tahansa näiden hiirten kasvaimen syötettiin koko hoitoryhmissä.

tutki myös vaikutusta oraalisen toleranssin ja anti-CD25 Ab: n systeemiseen käyttöön efektori lymfosyyttipopulaatiossa eli CD8

+ CD25

+ soluja. Lisääntyi määrä Teff soluja, jotka oli pysyvästi loppuun ja syötetään kasvaimen verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin (Fig. 6), ja tämä arvo lähestyy merkitys.

(a) pernat hiirtä kussakin hoitoryhmässä värjättiin määrittämään CD3

+ /CD8

+ ja CD3

+ /CD25

+ numeroita. Ryhmät olivat seuraavat (i) kasvain syötetään, mutta ei vasta-ehtymisestä (Ii) PBS ruokittu eikä vasta-ehtyminen; (Iii) PBS ruokittu ja anti-CD25 käsitelty ja (iv) kasvain ruokittu, anti-CD25 käsitelty. CD8

+ ja CD25

+ tutkittiin sisällä CD3

+ väestöstä. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena; (B) kuviossa esitetään muutoksia Teff numerot kasvaimen ruokinta ja Ab heikentämistä. Kumulatiiviset tiedot pistekuvioita edustettuina (a) (n = 3).

Anti-CD25 Ab Therapy Post-kasvain Ruokinta voittaa aiheuttama Oral Toleranssi

Voit selvittää anti CD25 Ab hoito voi kumota muodostuneen kasvaimen kasvua etu, hiiriä, jotka oli suorittanut suullisen kasvain ruokinta aikataulu jaettiin satunnaisesti ryhmiin saamaan anti-CD25 Ab versus kontrolli Ab tai ei Ab (PBS yksin). Antaminen anti-CD25 Ab heti kasvain ruokinta, poistetaan aiemmin havaittu kasvaimen kasvua etu (Fig. 7a). Tämä todettiin olevan merkittävä verrattuna muihin ryhmiin (p 0,03). Survival tiedot osoittivat, että 100% hiiristä, jotka saivat anti-CD25 Ab paranivat, paranna korko vastaa ryhmää hiiriä ei ruokittu kasvain ja joita käsitellään myöhemmin anti-CD25 Ab: n (Fig. 7b).

( a) Hiirille syötettiin kasvain tai PBS: ää ja jotka satunnaistettiin saamaan anti-CD25 Ab, isotyyppikontrolli Ab tai PBS: ää. Ne, jotka saivat anti-CD25 Ab oli hitaampaa kasvaimen kasvu verrattuna muihin ryhmiin. Merkittävä ero kasvuvauhdin välillä, jotka olivat kasvaimen tai PBS fed ylläpidettiin isotyyppikontrollia Ab eikä Ab ryhmiä tiettyinä ajankohtina (p 0,05); (B) Hiiret, jotka oli tolerised kasvaimen antigeeni kautta suun kautta kasvaimen sittemmin hoidettu anti-CD25 Treg ehtyminen jälkeen ja ne kovetetaan niiden ihonalainen kasvain jäljellä kasvainta varten vähintään 100 päivän ajan.

Treg numerot Kuivunut Hiiret

anti-CD25 Ab hoito ei ollut pitkäaikaisia ​​vaikutuksia Treg numeroita. Hiiret kovettunut niiden kasvaimia kautta anti-CD25 hallinto tutkittiin 30 päivää myöhemmin ja oli samanlainen Treg numeroita naiivi eläimiin riippumatta siitä, olivatko he siitä suullisesti tolerised tai kontrolliryhmiin (Fig. 8).

Sata ja kolmenkymmenen päivän kuluttua on hoito anti-CD25-vasta-aine, hiiret tapettiin ja niiden pernat värjättiin CD4

+ CD25

+ Tregs. Ei ollut merkittäviä eroja nähty prosenttiosuus CD4

+ CD25

+ solujen välillä, hiiriä, jotka oli parantanut heidän kasvain tai naiiveja hiiriä (n = 3 per ryhmä).

keskustelu

Useimmat potilaat, joille kehittyy syöpiä ylemmän ruoansulatuskanavan kuolee välittömänä seurauksena heidän sairautensa. Jopa niille, joilla on kliinisesti paikallinen kasvaimia, jotka joutuvat parantava leikkaus, viiden vuoden uusiutumisen hinnat ovat yleensä yli kuusikymmentä prosenttia [18]. Tuolloin leikkaus, useimmat näistä potilaista on mikrometastaasien eri kudoksissa osoittaa haematogenous syövän leviämisen alkuvaiheessa kasvaimen kehitystä. Tämä jättää potilaiden minimaalinen tautitilan jälkeinen leikkaushoitoa. Hoidossa että voisi helpottaa immuunijärjestelmä tunnistaa kasvaimen Ags systeemisesti olisi ihanteellinen, jos ei poistaa kaikki aiheuttamista sairauksista, niin ainakin luoda tilaan kasvain lepokauden [19], [20].

Olemme aiemmin osoittaneet, että kasvua heikosti immunogeenisten JBS solulinja kylkeen immuunijärjestelmän hiirissä johti kasvuun Treg solumäärät kasvain ympäristössä, mutta ei systeemisesti [8]. Tässä tutkimuksessa olemme mallinnettu läsnä tuumorifragmentteja suolistossa kliininen tilanne letkuruokinnalla ruokinta JBS solujen hiirillä. Me odottaa näitä fragmentteja voidaan käsitellä niitä GALT ja johtaisi systeemisen hypo-reagointikykyä kasvain Ags [13]. Olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että CD4

+ CD25

+ Tregs ovat systeemisesti nousi vastauksena suun kautta koko (JBS) kasvain. Lisäksi olemme osoittaneet, että oraalisen toleranssin kasvaimen antaa kasvuedun syöpään.

Hiiret, joiden Tregs loppuivat anti-CD25 hoitoon, riippumatta kasvaimen tai PBS: ruokinta, osoitti regressio kasvainten ja pitkän aikavälin parannuskeinoja. Ei ollut eroja vasteiden välillä kasvaimen ruokitaan ja kontrolliryhmiin osoittaa, että Treg esto tehokkaasti voittaa yhdistetty oraalisen toleranssin ja kasvaimen kasvua vaikutteita. On todennäköistä, että varhainen induktio Tregs systeemitasolla, saavutetaan tässä tutkimuksessa kasvaimen ruokintaan, on vastuussa kasvaimen kasvun etu havaittu. On kiinnostava että ei ollut eroja määrä CD8

+ T-solujen välillä jonkin ryhmistä viittaa siihen, että vähentäminen Teffs ei tapahdu suun kautta toleranssin. On myös todennäköistä, että oraalisen toleranssin ja varhaisen Treg vastauksia ei estänyt immuuni herkistymistä kasvaimeen mutta esti efektoritoiminto koska ei ollut eroja ajoituksessa tai täydellisyydestä kasvainregressio jälkeen Ab kohtelun kasvaimen ruokitaan tolerised tai PBS kontrolliryhmässä hiirillä. Oli merkitsevä ero kokonaismäärä CD4

+ CD25

+ Tregs hiirillä, jotka saivat anti-CD25 Ab: n ja olivat kasvaimen ruokitaan ja ohjaus suolaliuos syötetään ryhmiä. Tämä havaittiin myös ne ryhmät, jotka olivat väliaikaisesti tyhjentynyt. Yllättäen kuitenkin, ei ollut merkittävää laskua Tregs havaittu ryhmien välillä, jotka olivat kasvaimen syötettiin ja saivat joko annostusohjelman anti-CD25 Ab tai isotyyppikontrollia Ab. Mahdollinen selitys tälle voi johtua analyysin Treg numeroita CD4

+ CD25

+ vasta tässä vaiheessa kokeellisen prosessin vastakohtana tarkempia CD4

+ CD25

+

Foxp3

+. Ei merkittävä lasku Tregs voi itse asiassa liittyä koesuunnitelmalla ja ajoituksesta tutkimista Tregs ja annos anti-CD25Ab, joka valittiin perustuvat aikaisempaan tietoon, että suurin Treg ehtyminen oli 7 päivän kuluessa Ab hallinnon. Annos Ab Tässä tutkimuksessa käytettiin varmistettu 90% pienempi Treg numerot naiivi hiirillä. Yleiseen kasvuun Treg numerot vastauksena ruokinta ei ole otettu huomioon lisääntynyt annoksen Ab. Tästä huolimatta, toiminnallisia eroja eri annosten anti-CD25 Ab: n havaittiin tuloksena kasvukäyrät, mikä viittaa siihen, CD4

+ CD25

+ Treg-solut osallistuvat T-soluvasteen, joka antaa tuumorin kasvua etu seuraavat ruokinta. Tämä voi johtua siitä, että vaikutus poistaa tai funktionaalisesti inaktivoivat Tregs kanssa Ab häviämisen kehittämisen aikana oraalisen toleranssin on riittävän osittaista koulutuksen immuunijärjestelmän ja kehittää anti-kasvain sytotoksisia vasteita. Kiinnostavaa oli enemmän parannuskeinoja nähdään ryhmissä, joille annettiin anti-CD25 Ab aikaan ruokinnan vain ja ruokitaan kasvain (75%) kuin niillä, joita Ab aikaan syöttö- ja syötetään PBS (60%). Voi olla, että Ag lastaus ruokinta ja myöhemmin inaktivaation Tregs kohonneisiin Teff numerot voinut olla vastaavanlaisia ​​havaintoja on osoitettu muualla [21].

klinikalle, potilaita, joilla GALT läsnä jo suullisesti tolerised immuunijärjestelmää, ja se jää ratkaistavaksi, onko suullinen toleranssi voidaan voittaa, kun kasvaimen kasvu on perustettu. Tutkimuksissa toleranssi, on osoitettu, että adoptiovanhemmat siirto Tregs osaksi hiiren malleissa voi voittaa immuniteettisairaus [5]. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko poistaminen Tregs voi sallia kehitystä sytotoksisen T-soluvasteen ja ihonalaisen kasvaimen. Sen jälkeen ruokinta kasvain ja perustamalla oraalisen toleranssin, yhden annostusohjelman anti-CD25 Ab poisti kasvaimen kasvua etu, että normaalisti nähtävissä ilman anti-CD25 Ab hoitoa. Lisäksi hallinnon vastaisen CD25 Ab johti parannuskeinoja kaikkien hiirten kätkeminen ihonalainen kasvaimia. Olemme osoittaneet, että jopa vakiintunut oraalisen toleranssin kasvaimen Ag, ja tuloksena aggressiivisen tuumorin kasvua ja huonompaa selviytymistä, voidaan ratkaista Treg lieventävien terapiassa. Tämä tulos viittaa siihen, että syövät ylemmän maha-suolikanavan olisi mukautuvia hoitoja, jotka yrittävät inaktivoimiseksi vakiintuneita Treg solujen toimintaa. On myös tärkeää huomata, että anti-CD25 Ab hoito ei vaikuttanut systeemistä Treg väestön käsitellyissä hiirissä hoidon jälkeen, verrattuna naiiveja hiiriä. Tämä on tärkeää, koska se rajoittaa mahdollisuutta, että anti-CD25 Ab hoito autoimmuunisairauksien voisi poistaa Tregs kokonaan tai pysyvästi.

Tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen mekanismi suvaitsevaisuuden – T-soluvälitteistä vaimennuksen kun kasvaimen vastainen immuunivaste. Identiteetti kasvaimen Ag (t) on vielä otettava käyttöön; kuitenkin, tämä tutkimus vahvistaa ja laajentaa havaintoihin aiempien raporttien ruokintapaikasta kasvaimen Ags osoitettiin heikentää antituumorivaikutus sytotoksisuutta ja siten tukee oletusta, että kasvain Ags jotka irtoa ylempään ruoansulatuskanavaan ja käsitellään limakalvon immuunijärjestelmä voi johtaa alas